CN113413384A - 烟酸在制备治疗和/或预防肥胖女性生育障碍的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了烟酸在制备治疗和/或预防肥胖女性生育障碍的药物中的应用，属于医药技术领域。本发明通过体内补充或体外添加烟酸可以有效提高肥胖女性的生育力，降低成熟卵子中减数分裂装置的异常组装比例和氧化应激的水平，促进受精后的早期胚胎发育至囊胚阶段，这对于预防和/或治疗肥胖引起的女性不孕不育问题具有重大意义。烟酸作为机体中一种重要的内源性物质，其结构与性质十分稳定，价格低廉且易于获得，体内补充或体外添加均能发挥作用，因此作为药物或生物制剂的实用性很高。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及烟酸在预防和/或治疗肥胖女性卵子和胚胎质量下降中的应用。
背景技术
世界卫生组织的统计数据显示，截止2016年全世界约有13％的成年人(女性人群中15％) 患有肥胖症。中国的肥胖人群规模在2019年已经达到2.5亿以上，这种由多因素引起的慢性代谢疾病，已经成为当今社会的一个重大健康问题。而且大量研究表明，育龄人群中的肥胖女性容易出现妊娠失败、流产早产和胎儿出生缺陷等生殖问题。其中，卵母细胞与早期胚胎质量下降是一个重要原因。肥胖会使卵子以及受精后的早期胚胎出现多种异常表型，这包括减数分裂装置的异常、线粒体功能紊乱、氧化应激损伤以及早期胚胎的发育阻滞。
烟酸(nicotinic acid,NA)也被称为尼克酸，是一种重要的水溶性维生素，在维持机体健康和稳态中具有重要作用。此外，烟酸在体内可作为前体物质参与合成NAD+(nicotinamide adenine dinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，后者作为辅酶参与能量代谢等多个生物学过程中。在正常生理状况下，生物体内NAD+的产生与消耗会保持动态平衡，而且NAD+含量的下降也被认为是多种疾病的诱因。烟酸可以显著提升大脑等组织细胞内的NAD+水平，并且相比于烟酰胺等前体物质，肝脏、肾脏和肠等器官更能有效利用烟酸来合成NAD+。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明要解决的技术问题是：针对肥胖等代谢疾病引起的卵子和早期胚胎质量下降等女性生育问题；提供一种烟酸的新用途：烟酸在预防和/或治疗肥胖女性卵子和胚胎质量下降中的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
烟酸在制备治疗和/或预防肥胖女性生育障碍的药物中的应用。所述烟酸的结构式如式Ⅰ所示：
作为本发明的一种优选，烟酸在制备治疗和/或预防肥胖女性卵子和/或胚胎质量下降的药物中的应用。
作为本发明的一种优选，烟酸在制备提高肥胖女性卵子中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸含量的药物中的应用。
作为本发明的一种优选，烟酸在制备减少肥胖女性卵母细胞纺锤体形态异常、染色体排列紊乱和非整倍体发生的药物中的应用。
作为本发明的一种优选，烟酸在制备降低肥胖女性卵母细胞氧化应激水平的药物中的应用。
烟酸在制备改善肥胖女性卵母细胞和/或早期胚胎质量的体外培养液中的应用。
一种卵母细胞体外培养液，其特征在于包含10～100μΜ的烟酸。
作为本发明的一种优选，所述的卵母细胞体外培养液包含50μΜ的烟酸。
作为本发明的进一步优选，所述的卵母细胞体外培养液为添加10～100μΜ烟酸的M16培养液。
作为本发明的更进一步优选，所述的卵母细胞体外培养液为添加50μΜ烟酸的M16培养液。
一种胚胎体外培养液，其特征在于包含20～200μM的烟酸。
作为本发明的一种优选，所述的胚胎体外培养液包含75μM的烟酸。
作为本发明的进一步优选，所述的胚胎体外培养液为包含20～200μM烟酸的KSOM培养液。
作为本发明的更进一步优选，所述的胚胎体外培养液为75μM烟酸的KSOM培养液。
本发明提供了改善肥胖个体卵母细胞和早期胚胎质量的注射剂，其特征在于腹腔注射烟酸溶液200～600mg/kg体重/天，连续注射7～14天。最佳剂量为540mg/kg体重/天，连续注射10 天。
本发明所用的试剂药品均市售可得。
同时，本发明以饲喂HFD(high fat diet，高脂饲料)的肥胖小鼠作为研究模型发现，烟酸对肥胖个体的生育力具有以下有益效果：
(1)体外成熟培养过程中添加烟酸，可显著提高肥胖个体卵子内NAD+(nicotinamide adenine dinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的含量，见图1。
(2)体外成熟培养过程中添加烟酸，可显著减少肥胖个体卵子减数分裂装置的异常率，见图2。
(3)体外成熟培养过程中添加烟酸，可显著降低肥胖个体卵子中ROS(Reactiveoxygen species，活性氧)的水平，见图3。
(4)体外成熟培养过程中添加烟酸，可显著提高肥胖个体卵子受精后的发育能力，见图 4。
(5)胚胎体外培养过程中添加烟酸，可以显著增加肥胖个体的受精胚胎发育至二细胞和囊胚阶段的比例，见图5。
(6)以腹腔注射等方式进行烟酸的体内补充，可显著提高肥胖个体卵子内NAD+的含量，见图6。
(7)以腹腔注射等方式进行烟酸的体内补充，可显著减少肥胖个体卵子减数分裂装置的异常率，见图7。
(8)以腹腔注射等方式进行烟酸的体内补充，可显著降低肥胖个体卵子中ROS的水平，见图8。
(9)烟酸作为机体中一种重要的内源性物质，其结构与性质十分稳定，价格低廉且易于获得，体内补充或体外添加均能发挥作用，因此作为药物或生物制剂的实用性很高。
附图说明
图1为体外添加烟酸提高肥胖小鼠卵子内NAD+含量的结果，统计数据表示为平均值±标准差，*表示差异显著性，其中**P<0.01，***P<0.001；
图2为体外添加烟酸减少肥胖小鼠卵子减数分裂装置异常率的结果；图2A为各组卵母细胞纺锤体和染色体免疫荧光染色的典型图片，箭头标示出纺锤体形态异常和染色体排列紊乱，标尺30μm；图2B为各组卵母细胞减数分裂装置异常率的统计结果，数据表示为平均值±标准差，*表示差异显著性，其中*P<0.05，***P<0.001；
图3为体外添加烟酸降低肥胖小鼠卵子中ROS水平的结果；图3A为各组卵母细胞ROS 免疫荧光染色的典型图片，标尺50μm；图3B为各组卵母细胞ROS荧光值的统计结果，数据表示为平均值±标准差，*表示差异显著性，其中*P<0.05，***P<0.001；
图4为体外添加烟酸提高肥胖个体卵子受精后发育能力的结果；图4A为各组卵子受精后发育至二细胞和囊胚阶段的典型图片，*表示受精后发育异常的胚胎，标尺100μm；图4B为各组卵子受精后发育至二细胞阶段的统计结果，图4C为各组卵子受精后发育至囊胚阶段的统计结果，数据表示为平均值±标准差，*表示差异显著性，其中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001， n.s.表示无显著差异；
图5为体外添加烟酸促进肥胖个体胚胎发育的结果；图5A为各组受精胚胎发育至二细胞和囊胚阶段的典型图片，*表示培养过程中发育异常的胚胎，标尺100μm；图5B为各组受精胚胎发育至二细胞阶段的统计结果，图5C为各组受精胚胎发育至囊胚阶段的统计结果，数据表示为平均值±标准差，*表示差异显著性，其中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n.s.表示无显著差异；
图6为体内补充烟酸提高肥胖小鼠卵子内NAD+含量的结果，统计数据表示为平均值±标准差，*表示差异显著性，其中***P<0.001；
图7为体内补充烟酸减少肥胖小鼠卵子减数分裂装置异常率的结果；图7A为各组卵母细胞纺锤体和染色体免疫荧光染色的典型图片，箭头标示出纺锤体形态异常和染色体排列紊乱，标尺30μm；图7B为各组卵母细胞减数分裂装置异常率的统计结果，数据表示为平均值±标准差，*表示差异显著性，其中***P<0.001，n.s.表示无显著差异；
图8为体内补充烟酸降低肥胖小鼠卵子中ROS水平的结果；图8A为各组卵母细胞ROS 免疫荧光染色的典型图片，标尺50μm；图8B为各组卵母细胞ROS荧光值的统计结果，数据表示为平均值±标准差，*表示差异显著性，其中***P<0.001，n.s.表示无显著差异；
具体实施方式
下文将结合具体实施例及附图对本发明进行进一步阐述，但并不以此来限制本发明的范围与实施方式。下列实施例仅用于示例，可在不超出本发明范围内进行改变或修饰。若无特别指名，以下实施例中所涉及的药品试剂均可通过商业途径获得。
实施例1构建肥胖小鼠模型
将3周龄的雌性ICR小鼠随机分为两组，分别饲喂高脂饲料(high fat diet,HFD)和标准饲料(normal diet,ND)，自由采食饮水。饲养16周后，HFD小鼠的平均体重显著高于ND小鼠(54.3±4.9g vs.38.3±2.7g，P<0.05)，且HFD小鼠的空腹血糖水平显著高于ND小鼠(8.8±1.4mM vs.4.6±0.9mM，P<0.05)，这表明肥胖小鼠造模成功。ND小鼠作为对照。
实施例2卵母细胞体外成熟培养液的配置
肥胖小鼠卵母细胞的体外成熟培养液，是在M16培养液(Sigma，货号M7292)的基础上添加浓度为50μΜ的烟酸(nicotinic acid,NA)。不添加烟酸的M16培养液作为对照。
实施例3肥胖小鼠卵母细胞的获取与体外成熟培养
肥胖小鼠在腹腔注射5IU孕马血清促性腺激素48小时后，将其进行安乐死并取出卵巢。使用针尖戳破卵巢表面的有腔卵泡从而获得GV期卵母细胞，将其在实施例2中所述的培养液中培养14小时。
实施例4体外添加烟酸提高肥胖小鼠卵子内NAD+的含量
收集实施例3中体外培养的成熟卵子，使用商品化试剂盒(Sigma，货号MAK037)检测卵内的NAD+含量，并通过单因素方差分析进行数据统计。
结果如图1所示：ND组中每个卵子的NAD+含量为3.20pmol，而HFD组中每个卵子的含量仅为0.52pmol，即肥胖小鼠卵中的NAD+含量显著减少(P<0.001)；而在成熟培养过程中添加烟酸(HFD+NA)能够使NAD+含量达到1.65pmol，与HFD组相比显著增加(P<0.01)。由此可见，体外添加烟酸能够有效提高肥胖小鼠卵子内NAD+的含量。
实施例5体外添加烟酸减少肥胖小鼠卵子减数分裂装置的异常率
收集实施例3中体外培养的成熟卵子进行免疫荧光染色：卵母细胞在4％的多聚甲醛中室温固定30分钟后，在0.5％的TritonX-100/PBS中透膜15分钟，随后在1％的BSA/PBS中室温封闭1小时。FITC-α-tubulin抗体(Thermo，货号65-6111)按照1:200稀释后，4℃孵育过夜。用碘化丙啶对染色体进行标记染色，铺片后在LSM710蔡司激光共聚焦显微镜下观察纺锤体形态和染色体的排列，并通过单因素方差分析对各组的异常率进行统计分析。
结果如图2所示：图2A为各组免疫荧光染色的典型图片，ND组中的卵母细胞纺锤体多呈现“双极桶状”形态，染色体整齐排列在赤道板上；而HFD组中纺锤体无法正常组装且染色体排列紊乱；成熟培养过程中添加烟酸(HFD+NA)能够使多数卵子的纺锤体形态与染色体排列恢复正常。图2B为各组卵中纺锤体异常比例的统计图，ND组的异常率为11.8％，而HFD组的异常率为36.1％，即肥胖小鼠卵子的纺锤体异常比例显著上升(P<0.001)；而在成熟培养过程中添加烟酸(HFD+NA)能够使异常率降至21.0％，与HFD组相比显著降低(P<0.001)。由此可见，体外添加烟酸能够有效降低肥胖小鼠卵子减数分裂装置异常率，减少染色体错位的发生率，阻止非整倍体性的发生。
实施例6体外添加烟酸降低肥胖小鼠卵子中ROS的水平
收集实施例3中体外培养的成熟卵子进行ROS水平检测：将卵子在含有5μΜ CM-H2DCFDA探针(Invitrogen，货号C6827)的M16培养液中孵育30分钟，随后将其移至活细胞观察皿中，使用LSM710蔡司激光共聚焦显微镜观察荧光信号。使用ImageJ软件对荧光强度进行计算，并通过单因素方差分析对各组的荧光强度值进行统计分析。
结果如图3所示：图3A为各组ROS荧光染色的典型图片，图3B为各组荧光强度值的统计结果。ND组中ROS荧光信号较弱，氧化应激水平较低；而HFD组的ROS荧光强度显著上升(P<0.001)，氧化应激水平较高；而在成熟培养过程中添加烟酸(HFD+NA)能够使ROS 荧光信号下降约50％，与HFD组相比显著降低(P<0.001)。由此可见，体外添加烟酸可有效降低肥胖小鼠卵子中ROS的水平，减少氧化应激所造成的损伤。
实施例7体外添加烟酸有效提高肥胖小鼠卵子受精后的发育能力
将各组所获得的成熟卵子与获能后的精子在HTF培养液中共同孵育6小时，从而完成体外受精。得到的受精胚胎在KSOM培养液中继续培养，在受精后1.5天观察并记录发育至二细胞胚胎的比例，在受精后3.5天观察并记录发育至囊胚的比例，通过单因素方差分析对各组的二细胞率和囊胚率进行统计分析。
结果如图4所示：图4A为各组卵子受精后发育至二细胞和囊胚阶段的典型图片。图4B 为各组卵子受精后发育至二细胞阶段的统计结果，ND组卵子受精后发育至二细胞阶段的比例为94.2％，HFD组发生了显著下降(***P<0.001)，为71.2％，而体外成熟过程中添加烟酸 (HFD+NA)组的二细胞率为89.4％，相比于HFD组显著上升(***P<0.001)。图4C为各组卵子受精后发育至囊胚阶段的统计结果，ND组卵子受精后发育至囊胚阶段的比例为87.1％， HFD组发生了显著下降(**P<0.01)，为55.5％，而体外成熟过程中添加烟酸(HFD+NA)组的囊胚率为81.2％，相比于HFD组显著上升(**P<0.01)。由此可见，体外成熟过程中添加烟能够有效促进肥胖个体卵子受精后的发育能力。
实施例8胚胎体外培养液的配置
肥胖小鼠胚胎的体外培养液，是在KSOM培养液(Millipore，货号MR106D)的基础上添加浓度为75μΜ的烟酸(nicotinic acid,NA)。不添加烟酸的KSOM培养液作为对照。
实施例9体外添加烟酸促进肥胖小鼠胚胎的正常发育
肥胖小鼠首先腹腔注射5IU孕马血清促性腺激素，48小时后腹腔注射5IU人绒毛膜促性腺激素，14小时后进行安乐死并取出输卵管壶腹部，使用镊子划破后得到体内成熟的卵子。将所获得的体内成熟卵子，与获能后的精子在HTF培养液中共同孵育6小时，完成体外受精从而得到受精胚胎。将其在实施例8中所述的培养液中进行培养，在第1.5天观察并记录发育至二细胞胚胎的比例，在第3.5天观察并记录发育至囊胚的比例，通过单因素方差分析对各组胚胎的二细胞发育率和囊胚发育率进行统计分析。
结果如图5所示：图5A为各组受精胚胎发育至二细胞和囊胚阶段的典型图片，ND组中的二细胞胚胎卵裂球形状规则、大小基本相同，囊胚的形态十分典型，HFD组中的胚胎出现发育停滞、胞质碎裂等异常表型，而培养过程中添加烟酸(HFD+NA)能够使胚胎发育基本恢复正常。图5B为各组胚胎发育至二细胞阶段的统计结果，ND胚胎的二细胞发育率为88.4％， HFD胚胎的二细胞发育率为62.2％，发生了显著下降(***P<0.001)，而添加烟酸组(HFD+NA) 的二细胞发育率为82.1％，相比于HFD组显著上升(***P<0.001)。图5C为各组胚胎发育至囊胚阶段的统计结果，ND胚胎的囊胚发育率为75.8％，HFD胚胎的囊胚率为49.5％，发生了显著下降(**P<0.01)，而添加烟酸组(HFD+NA)的囊胚率为70.9％，相比于HFD组显著上升(**P<0.01)。由此可见，培养过程中添加烟能够有效促进肥胖个体胚胎的正常发育。
实施例10肥胖小鼠体内补充烟酸的具体方案
肥胖小鼠腹腔注射烟酸溶液，剂量为540mg/kg体重/每天，连续注射10天。肥胖小鼠以及正常小鼠腹腔注射溶剂作为对照，注射剂量和周期与上述一致。在腹腔注射烟酸溶液或溶剂的第8天，每只小鼠腹腔注射5IU孕马血清促性腺激素，在第10天腹腔注射5IU人绒毛膜促性腺激素，14小时后进行安乐死，从输卵管壶腹部得到体内成熟的卵子。
实施例11体内补充烟酸提高肥胖小鼠卵子内NAD+的含量
收集实施例10中体内成熟的卵子，使用商品化试剂盒(Sigma，货号MAK037)检测卵内的NAD+含量，并通过单因素方差分析进行数据统计。
结果如图6所示：ND组中每个卵子的NAD+含量为2.91pmol，而HFD组中每个卵子的含量仅为0.51pmol，即肥胖小鼠体内获得的成熟卵中NAD+的含量显著减少(P<0.001)；而肥胖小鼠经体内补充烟酸后(HFD+NA)，其成熟卵子中的NAD+含量能够达到1.75pmol，与HFD组相比显著增加(P<0.001)。由此可见，肥胖小鼠体内补充烟酸能够有效提高成熟卵子内NAD+的含量。
实施例12体内补充烟酸减少肥胖小鼠卵子减数分裂装置的异常率
收集实施例10中体内成熟的卵子进行免疫荧光染色，方法步骤与实施例5中所述相同，在LSM710蔡司激光共聚焦显微镜下观察纺锤体形态和染色体的排列，并通过单因素方差分析对各组的异常率进行统计分析。
结果如图7所示：图7A为各组免疫荧光染色的典型图片，ND小鼠体内成熟卵子的纺锤体多呈现“双极桶状”形态，染色体整齐排列在赤道板上；但HFD小鼠体内成熟卵子的纺锤体形态异常且染色体排列紊乱；而肥胖小鼠补充烟酸后(HFD+NA)，其多数成熟卵子中的纺锤体形态与染色体排列恢复正常。图7B为体内成熟卵子中纺锤体异常比例的统计图，ND组的异常率为7.9％，而HFD组的异常率为39.7％，即在肥胖小鼠排出的卵子中，纺锤体异常比例显著增加(P<0.001)；而肥胖小鼠补充烟酸后(HFD+NA)，其异常率降至17.2％，与HFD组相比显著降低(P<0.001)。由此可见，肥胖小鼠体内补充烟酸可以有效降低成熟卵子中纺锤体异常的比例。
实施例13体内补充烟酸降低肥胖小鼠卵子中ROS的水平
收集体内成熟的卵子进行ROS水平检测，方法步骤与实施例6中所述相同，使用LSM710 蔡司激光共聚焦显微镜观察ROS荧光信号。使用ImageJ软件对荧光强度进行计算，并通过单因素方差分析对各组的荧光强度值进行统计分析。
结果如图8所示：图8A为各组ROS荧光染色的典型图片，图8B为各组荧光强度值的统计结果。ND小鼠体内成熟卵子的ROS荧光信号较弱，氧化应激水平较低；而HFD的ROS 荧光强度显著上升(P<0.001)，说明氧化应激水平较高；而肥胖小鼠补充烟酸后(HFD+NA)，成熟卵子的ROS荧光信号下降约50％，与HFD组相比显著降低(P<0.001)，与ND组相比无显著差异。由此可见，肥胖小鼠体内补充烟酸能够有效降低成熟卵子中ROS的水平。
综上所述，体外培养过程中添加烟酸或通过腹腔注射体内补充烟酸，都可以改善肥胖个体卵子和胚胎质量的下降，降低成熟卵子中减数分裂装置的异常组装比例和氧化应激的水平，促进受精后的早期胚胎发育至囊胚阶段。
上述实施例仅是本发明的优选实施方式，并非是对本发明实施方式的限制。其他任何在本发明原理和精神实质下所进行的替换、简化、组合，也应包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.烟酸在制备治疗和/或预防肥胖女性生育障碍的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于烟酸在制备治疗和/或预防肥胖女性卵子和/或胚胎质量下降的药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于烟酸在制备提高肥胖女性卵子中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸含量的药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于烟酸在制备减少肥胖女性卵母细胞纺锤体形态异常、染色体排列紊乱和非整倍体发生的药物中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于烟酸在制备降低肥胖女性卵母细胞氧化应激水平的药物中的应用。
6.烟酸在制备改善肥胖女性卵母细胞和/或早期胚胎质量的体外培养液中的应用。
7.一种卵母细胞体外培养液，其特征在于包含10～100μΜ的烟酸；优选包含50μΜ的烟酸。
8.根据权利要求7所述的卵母细胞体外培养液，其特征在于所述的卵母细胞体外培养液为添加10～100μΜ烟酸的M16培养液。
9.一种胚胎体外培养液，其特征在于包含20～200μΜ的烟酸；优选包含75μΜ的烟酸。
10.根据权利要求9所述的胚胎体外培养液，其特征在于所述的胚胎体外培养液为添加20～200μΜ烟酸的KSOM培养液。
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