FR3025426A1 - Extrait d'algue rouge particulier et son utilisation pour le traitement de la peau - Google Patents
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Abstract
L'objet de l'invention est un extrait d'algue rouge constitué par des molécules de poids moléculaire inférieur à 5000 Da, comprenant au moins des mycosporines et des acides aminés. L'invention vise également des compositions l'incluant, son utilisation sur la peau et son procédé d'obtention.
Description
1 EXTRAIT D'ALGUE ROUGE PARTICULIER ET SON UTILISATION POUR LE TRAITEMENT DE LA PEAU La présente invention se rapporte à un extrait d'algue rouge particulier et à son utilisation comme produit à application topique pharmaceutique ou cosmétique pour le traitement de la peau, en particulier pour ses propriétés stimulatrices de la régénération cellulaire et tissulaire de l'épiderme.
L'épiderme est la couche la plus externe de la peau et constitue la principale barrière de perméabilité sans laquelle la vie des mammifères terrestres serait impossible. Cette barrière est constamment renouvelée par la différenciation des kératinocytes qui constituent 90% des cellules de l'épiderme. Les kératinocytes se divisent au niveau de la couche basale et migrent progressivement pour terminer leur différenciation au niveau du stratum corneum, la couche la plus externe de la peau, qui forme l'élément majeur de la fonction barrière. La fonction barrière de la peau a un rôle protecteur vis-à-vis de l'environnement extérieur, ainsi qu'un rôle régulateur de l'hydratation. La barrière cutanée est le premier rempart face aux agressions extérieures. Les couches supérieures de la peau sont ainsi continuellement soumises aux agressions du quotidien (frottements, lavages répétitifs, froid, etc.) qui peuvent entraîner une altération de la fonction barrière. L'épiderme doit donc être parfaitement entretenu pour remplir ses fonctions essentielles. De même, avec l'âge la fonction barrière se modifie et l'épiderme s'amincit considérablement. Une fonction barrière altérée impacte à la fois l'hydratation des tissus et constitue une porte d'entrée aux bactéries et autres éléments antigéniques. Ces éléments exogènes peuvent déclencher une réponse immunitaire qui, selon l'ampleur, se manifeste par des irritations. L'entretien et le renouvellement d'une barrière cutanée efficace est un enjeu permanent qui permet de se prémunir contre les irritations du quotidien. Si la barrière cutanée est altérée, il est important de la restaurer pour éviter l'installation de rougeurs et de démangeaisons pouvant s'entretenir et perdurer. La fonction barrière de la peau est également impliquée dans des pathologies dermatologiques résultats d'un désordre inflammatoire, comme les 3025426 2 dermatites atopiques qui sont la manifestation d'une inflammation entretenue par des éléments exogènes franchissant une barrière cutanée altérée et inefficace. Différentes stratégies destinées à améliorer la qualité de la peau et à restaurer la fonction barrière s'illustrent de manière particulièrement explicite par leur usage dans le traitement 5 de l'eczéma (dermatite atopique). Une crème réparatrice idéale devrait remplir trois fonctions principales: diminuer la perte d'eau transépidermale, restaurer la qualité de la barrière lipidique de la couche cornée et finalement restaurer l'intégrité de la peau pour assurer une fonction barrière optimale. Un moyen de lutte contre la perte d'eau transépidermale consiste à administrer des 10 molécules hygroscopiques de manière topique telle que l'urée qui agit en augmentant la capacité de fixation de l'eau de la couche cornée. L'usage de fortes concentrations d'urée peut cependant provoquer une activité kératolytique trop importante et favoriser l'irritation cutanée. D'une autre manière, le maintien des taux d'hydratation cutanés est généralement assuré par l'usage d'émollients de type vaseline, huiles animales, beurre de cacao, lanoline, 15 lipides, huiles minérales et beurre de karité. D'autre part, une fonction barrière optimale nécessite la présence de lipides extracellulaires en quantité suffisante pour constituer une couche cornée efficace. L'administration de céramides de manière topique aide à lutter contre une carence. Ces quelques stratégies largement appliquées et aux bienfaits reconnus restent néanmoins des traitements d'appoints ne procurant pas un traitement curatif de 20 fond des défauts de fonction barrière. Dans le cas d'irritations chroniques résultant d'une barrière cutanée altérée, il peut être nécessaire de contrôler et réduire l'inflammation par l'usage de corticostéroïdes ou d'inhibiteurs de calcineurine topique. Les risques potentiels d'un usage à long terme de stéroïdes topiques comprennent un amincissement et une fragilisation de la peau, des 25 infections fongiques, l'impétigo, des verrues virales et l'herpès simplex. L'usage des corticostéroïdes constitue un traitement symptomatique non curatif et l'arrêt du traitement peut provoquer un rebond des irritations. Les effets secondaires des inhibiteurs de calcineurine topiques comprennent une sensation de brûlure particulièrement en début de traitement.
L'objectif de l'invention est de proposer un principe actif différent, d'origine naturel, obtenu avec un procédé spécifique sans solvant d'origine chimique, capable d'être utilisé dans des 3025426 3 produits cosmétiques ou pharmaceutiques pour agir efficacement en particulier sur la régénération cellulaire et tissulaire de l'épiderme. A cet effet l'invention vise un extrait d'algue rouge particulier, à savoir un extrait d'algue rouge constitué par des molécules de poids moléculaire inférieur à 5000 Da, comprenant au 5 moins des mycosporines et des acides aminés. Les algues rouges sont connues pour leur utilisation dans différents domaines, notamment en cosmétique, mais aucun des extraits existants ne possède une efficacité sur la fonction barrière. Les algues rouges sont principalement utilisées comme source d'hydrocolloïdes polysaccharidiques de type carraghénanes et agaroses aux propriétés épaississantes et 10 gélifiantes. L'extrait d'algue rouge particulier objet de l'invention diffère des extraits existants car il est constitué uniquement par des molécules de poids moléculaire inférieur à 5000 Da, notamment des mycosporines et des acides aminés, qui lui confèrent une efficacité importante pour améliorer l'état de la peau. Il présente des propriétés stimulatrices de la 15 régénération et de la maturation des kératinocytes de l'épiderme, et peut être utilisé pour diverses applications pharmaceutiques ou cosmétiques notamment pour restaurer la peau et la fonction barrière, pour prévenir et lutter contre les manifestations visibles du vieillissement cutané, pour prévenir et lutter contre les dermatites atopiques, pour prévenir et lutter contre les effets secondaires liés à l'usage de traitements cutanés à base de 20 corticoïdes, pour prévenir et traiter les vergetures. L'invention vise donc aussi l'utilisation de l'extrait d'algue rouge pour le traitement de la peau, ainsi que les compositions le contenant. Enfin, l'invention a pour objet un procédé d'obtention d'extrait d'algue rouge ne faisant pas intervenir l'utilisation de solvant chimique, comprenant une double macération dans un 25 solvant hydrique tamponné suivi d'un fractionnement par filtration pour filtrer les molécules de taille inférieure à 5000Da. Avantageusement, ce procédé peut être mis en oeuvre à l'échelle industrielle et utilise des techniques respectueuses de l'environnement et de la santé. En outre, une ultrafiltration à 5000Da permet d'obtenir un extrait bactériologiquement stérile.
30 L'invention est à présent décrite en détails, en regard notamment des figures 1 à 5 qui représentent : 3025426 4 Figure 1A : une image de l'examen au microscope du marquage par immunofluorescence de la protéine nucléaire Ki67, sur une culture de fibroblastes non traités avec l'extrait selon l'invention Figure 1B : une image de l'examen au microscope du marquage par 5 immunofluorescence de la protéine nucléaire Ki67, sur une culture de fibroblastes traités avec l'extrait selon l'invention Figure 2A : une image de l'examen au microscope de la colonisation de l'aire de cicatrisation obtenue sur une culture de fibroblastes non traités avec l'extrait selon l'invention 10 Figure 2B : une image de l'examen au microscope de la colonisation de l'aire de cicatrisation obtenue sur une culture de fibroblastes traités avec l'extrait selon l'invention Figure 3 : une image de l'examen au microscope de coupes de peau humaine colorée au trichome de Masson, traitée avec X% d'extrait selon l'invention, à J3 et J10 15 Figure 4: une image de l'examen au microscope de coupes de peau humaine après immunomarque de la cytokératine-10, de la cytokératine-14 et de l'intégrine(34, traitée avec X% d'extrait selon l'invention, à J10 Figure 5: une représentation de l'évaluation de l'intensité de fluorescence de l'immunomarque de la cytokératine-10, de la cytokératine-14 et de l'intégrine(34, traitée 20 avec X% d'extrait selon l'invention. L'invention a donc pour objet un extrait d'algue rouge constitué par des molécules de poids moléculaire inférieur à 5000 Da, comprenant au moins des mycosporines et des acides aminés. Par algue rouge au sens de l'invention on entend toute algue appartenant à la division des 25 Rhodophyta. Préférentiellement l'extrait selon l'invention est obtenu à partir d'une algue rouge choisie parmi les Gelidiaceae (en particulier Gelidium sesquipedale homonyme de Gelidium corneum, Gelidium amansii, Gelidium coulteri, Gelidium johnstonii, Gelidium pusillum), les Bangiaceae (en particulier Porphyra perforata, Porphyra umbilicalis, Porphyra thuretii, Porphyra yezoensis, Porphyra rosengurttii) les Phorphyridiaceae (en particulier 30 Porphyridium cruentum, Porphyridium purpureum), les Gigartinaceae (en particulier Chondrus crispus, Gigartina lessoni), les Gracilariaceae (en particulier Garcilaria armata, Garcilaria brasiliensis, Garcilaria canaliculata, Garcilaria latifolia, Garcilaria gracilis, 3025426 5 Garcilaria cornea), les Solieriaceae (Eucheuma uncinatum, Eucheuma dichotonum, Eucheuma spinosum, Eucheuma muricatum) et les Corallinaceae (Corallina officinalis, Corallina armata). Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, l'extrait selon l'invention est obtenu à partir de Gelidium sesquipedale.
5 Par extrait d'algue rouge au sens de l'invention on entend un ensemble de molécules obtenu à partir d'algue rouge par tout procédé adapté. Très préférentiellement, l'extrait d'algue rouge est obtenu par la mise en oeuvre d'un procédé n'utilisant pas de solvant chimique, polluant ou dangereux pour la santé. Selon un mode de réalisation adapté, l'extrait est obtenu par un procédé comprenant une double macération et au moins une étape de 10 filtration pour ne conserver que les molécules de taille inférieure à 5000 Da, préférentiellement au moins une étape d'ultrafiltration sur filtre 5000 Da. L'extrait selon l'invention est constitué exclusivement de molécules de taille inférieure à 5000Da. Il comprend au moins des mycosporines et des acides aminés. Les mycosporines ou MAA (« Mycosporine-like Amino Acids ») sont des dérivés d'acides 15 aminés qui absorbent fortement dans les longueurs d'ondes ultraviolettes et sont dotées d'activités antioxydantes. Il s'agit de petites molécules d'environ 300 Da soluble dans l'eau. Il existe différents types de mycosporines, notamment : mycosporine-taurine, mycosporineglycine, palythine, palythine-thréonine, palythine-sérine, mycosporine-méthylaminethréonine, mycosporine-méthylamine-sérine, palythine-thréonine sulfate, palythine-sérine 20 sulfate, mycosporine-2-glycine, shinorine, palythinol, asterina, porphyra, (Z)-palythenic acid, (E)-palythenic acid, usujirene, palythène, mycosporine-glycine-valine, mycosporine-glutamic acid-glycine, euhalotece. Ces mycosporines sont caractérisées et présentent une absorption maximale allant de 309 à 362 nm. L'extrait selon l'invention comprend au moins une mycosporine particulière, et 25 préférentiellement un mélange de différentes mycosporines. Si l'extrait selon l'invention est obtenu à partir de Gelidium sesquipedale il comprend au moins une mycosporine choisie parmi asterina (absorbance maximale à 330nm), shinorine (absorbance maximale à 334nm), et palythine (absorbance maximale à 320nm) ou un mélange de deux ou trois de ces mycosporines. Préférentiellement il comprend au moins la 30 mycosporine asterina et peut comprendre shinorine et/ou palythine. De même, selon un mode de réalisation adapté, asterina représente au moins 50% des mycosporines de l'extrait selon l'invention obtenu à partir de Gelidium sesquipedale.
3025426 6 Les mycosporines et les acides aminés libres représentent au moins 8,3mg/g d'extrait sec. La concentration en mycosporines de l'extrait sec est d'au moins 1,3mM (exprimé en équivalent Asterina-330). La concentration en acides aminés libres est d'au moins 43,9mM (exprimée en équivalent tyrosine).
5 Le principe actif selon l'invention peut contenir également des peptides et de petites protéines, des oligonucléotides et de petites séquences d'acides nucléiques, des oligosaccharides et petits polysaccharides (fragment d'agaroses notamment). La présence de peptides, acides aminés et oligosaccharides améliore encore l'effet du principe actif selon l'invention en contribuant à absorber, retenir et fixer l'eau au niveau de la couche cornée de 10 l'épiderme. Ils constituent des facteurs naturels d'hydratation des couches cutanées. En particulier les acides aminés libres sont catabolisés en acide lactique, acide carboxylique sodium pyrrolidone, acide urocanique et en urée, principaux composants des NMF ou Natural Moisturizing Factors. Les NMF sont essentiels pour maintenir un taux d'hydratation optimal du stratum corneum grâce à leurs propriétés hygroscopiques. Ces molécules 15 hydratantes naturelles contribuent à maintenir et renforcer l'efficacité de la barrière cutanée. L'extrait d'algue rouge selon l'invention est préférentiellement obtenu par un procédé comprenant une double macération dans un solvant hydrique tamponné suivi d'un fractionnement par filtration pour récupérer les molécules de taille inférieure à 5000Da.
20 L'invention vise donc également un procédé d'obtention d'un extrait d'algue rouge comprenant la mise en oeuvre des étapes suivantes : - une première macération de l'algue dans une solution constituée d'un acide et d'une base, par exemple d'acide citrique et de phosphate disodique, puis récupération de l'algue d'une part et d'un premier macérât d'autre part, 25 - une deuxième macération de l'algue récupérée à l'étape précédente dans une solution constituée d'un acide et d'une base, par exemple d'acide citrique et de phosphate disodique, puis récupération de l'algue d'une part et d'un deuxième macérât d'autre part, - mélange des deux macérâts, 30 - filtration pour filtrer les molécules de taille inférieure à 5000Da, - récupération du filtrat qui constitue l'extrait.
3025426 7 Préférentiellement l'algue est broyée avant la première macération pour obtenir une poudre de granulométrie inférieure à 500iim. Cette étape de broyage nécessite généralement le séchage préalable de l'algue par déshydratation partielle ou totale, et peut être réalisée par cryobroyage.
5 Selon un mode de réalisation préféré, le pH de macération est compris entre 6 et 7. Les concentrations et proportions d'acide et de base doivent être ajustées pour atteindre ce pH. Le mélange acide citrique et phosphate disodique est préféré car il respecte les prérogatives de certification biologique. Effectivement, d'autres mélanges acides/bases pourront être utilisés. Par exemple la solution de macération est constituée entre 20 et 35% d'acide 10 citrique 0,1M et entre 65 et 80% de phosphate disodique 0,2M. Pour des pH allant de 3,0 à 6,2, un tampon citrate pourra être utilisé associant acide citrique et citrate trisodique. Pour des pH allant de 5,8 à 8,0, un tampon phosphate pourra être utilisé associant phosphate de sodium dibasique et phosphate de sodium monobasique. Pour des pH allant de 9,2 à 10,8, un tampon carbonate pourra être utilisé associant 15 bicarbonate de sodium et carbonate de sodium. Pour les macérations, la masse de solvant est préférentiellement comprise entre 1 et 50 fois la masse d'algue. De façon préférée, les macérations sont réalisées à température ambiante (22°C plus ou moins 4°C) dans une cuve de mélange. La première macération est réalisée pendant 2 à 24 20 heures et la deuxième pendant 2 à 24 heures. Après récupération, les macérâts peuvent être conservés à température ambiante jusqu'à ce qu'ils soient réunis avant filtration. L'étape de filtration comprend préférentiellement une ultrafiltration. Elle est mise en oeuvre sur filtre de porosité 5000 Da. La filtration permet de séparer les molécules récupérées dans 25 les macérâts et de récupérer : - un rétentat, riche en protéines, pigments de type phycoerythrines, polysaccharides de type agarose et carraghénanes, ainsi que toutes autres molécules solubilisées de taille supérieure à 5kDa, - un filtrat, constitué de molécules de taille inférieure à 5kDa, contenant des 30 mycosporines et des acides aminés. L'étape de filtration peut préalablement comprendre une ou plusieurs filtrations grossières et une étape d'ultracentrifugation, préférentiellement entre 2500 et 20000t/min.
3025426 8 Le filtrat (l'extrait selon l'invention) peut être conservé sous forme de solution notamment en y ajoutant un mélange d'acide citrique, de benzoate de sodium et de sorbate de potassium. Le pH de cette solution est compris entre 3.5 et 5. L'extrait peut également être concentré par déshydratation ou entièrement déshydraté pour 5 obtenir une poudre. Avantageusement, le procédé selon l'invention est utilisable à l'échelle industrielle et ne fait pas appel à des solvants chimiques polluants et nocifs pour l'environnement et la santé. L'extrait obtenu par la mise en oeuvre de ce procédé est certifiable « biologique ». L'extrait selon l'invention est préférentiellement intégré dans une composition adaptée à 10 une utilisation pharmaceutique ou cosmétique pour une application topique. Elle peut se présenter sous toute forme adaptée à une application topique, notamment sous formes aqueuses (lotions, gels, solutions micellaires, solutions), sous formes anhydres (sticks, baumes, poudres, huiles, pommades), sous formes de dispersions (émulsions, suspensions, aérosols, mousses, systèmes véhiculaires, sérums), sous formes de dispositifs médicaux 15 (pansements, compresses imbibées). La composition comprend préférentiellement entre 0,5 et 5% en poids de l'extrait selon l'invention. Préférentiellement la composition contient : - entre 65 et 6501.1g/L de mycosporines, et/ou - entre 1,145 et 14,15 mg/L d'acides aminés.
20 La composition selon l'invention peut également contenir tout excipient adapté, tels que des - Emulsionnants naturels (Huile dans Eau, Eau dans Huile...) - Facteurs de consistance (ex alcool gras, acides gras, cires végétales...) - Gélifiants, épaississants naturels (ex gomme de xanthane, alginates...) - Ingrédients de phase grasse : Huiles végétales biologiques ou naturelles (ex : huile 25 de tournesol, huile d'amandes douces, huiles de noix de coco...), Beurres végétaux biologiques ou naturels (ex : beurre de karité), Emollients / esters d'origine naturelle - Ingrédients de phase aqueuse : eau, eaux florales, humectants (ex glycérine...) - Principes actifs naturels (extraits végétaux, composés lipidiques, vitamines...) - Additifs : Conservateurs, agents séquestrants, agents modificateurs de pH, 30 antioxydants, poudres de toucher, pigments et charges minérales, parfums naturels L'ensemble des molécules de l'extrait selon l'invention, de taille inférieure à 5000Da, et en particulier les mycosporines et les acides aminés, lui confère son efficacité sur la peau et ses 3025426 9 propriétés stimulatrices de la régénération et de la maturation des kératinocytes de l'épiderme. Avantageusement, l'extrait selon l'invention présente également une efficacité sur la prolifération et le renouvellement des fibroblastes. La présence d'acides aminés, de taille moyenne de 110 Da, permet aussi d'améliorer l'hydratation de la peau.
5 L'extrait selon l'invention et les compositions le contenant peuvent être utilisées pour différentes applications cosmétiques en application topique, en particulier : - pour améliorer la fonction barrière de la peau en général, - pour stimuler la cicatrisation et la réparation des peaux irritées, - pour prévenir et/ou lutter contre les rougeurs cutanées et/ou réparer les 10 irritations cutanées, notamment pour lutter contre les rougeurs résultants de frottements, d'échauffements, du froid, de l'utilisation récurrente de produits détergents, etc... - pour prévenir et/ou lutter contre les manifestations cutanées du vieillissement de la peau : notamment en contrecarrant la diminution de l'activité mitotique, 15 en réduisant la durée de migration des cellules vers le stratum corneum, et en améliorant la densité du réseau de collagène dans le derme papillaire, - pour prévenir et/ou lutter contre les manifestations cutanées résultant des effets secondaires liés à l'usage de glucocorticoïdes sur la peau, - pour prévenir et/ou lutter contre l'apparition de vergetures.
20 En effet, l'extrait selon l'invention est capable d'agir sur le renouvellement des kératinocytes, sur l'épaisseur de l'épiderme et par conséquent sur la fonction barrière de la peau. Les propriétés régénératrices de l'épiderme de l'extrait selon l'invention permettent donc de l'utiliser comme produit de réparation de la peau, de cicatrisation et de lutte contre les irritations cutanées de la vie quotidienne.
25 En outre, il peut être utilisé pour lutter contre les manifestations visibles du vieillissement cutané. Le vieillissement de la peau est un processus continu pouvant être accéléré par l'exposition au soleil. On distingue le vieillissement intrinsèque qui survient naturellement avec le temps et le vieillissement extrinsèque qui résulte de l'influence de facteurs environnementaux, tels que l'exposition au soleil, la fumée, la pollution, l'alimentation, le 30 rythme du sommeil, etc. Au cours du vieillissement, l'épiderme s'amincie de 10 à 50% de l'âge de 30 ans à 80 ans. Cette atrophie concerne surtout les cellules de la couche basale de l'épiderme. Les cellules de la couche basale présentent une hétérogénéité de taille des 3025426 10 cellules avec une augmentation générale de leur volume. Ce phénomène d'atrophie est caractérisé par une diminution de l'activité mitotique (division cellulaire, renouvellement), une augmentation de la durée du cycle cellulaire et de la durée de migration des cellules basales vers le stratum corneum. La jonction dermo-épidermique s'aplanie. Les altérations 5 principales du derme consistent en un réarrangement fibrillaire par dégénérescence. Le réseau se désorganise et les proportions d'élastine et de collagène se modifient. Avantageusement l'extrait selon l'invention permet de contribuer à la régénération des couches cellulaires de la peau en contrecarrant la diminution de l'activité mitotique et en réduisant la durée de migration des cellules vers le stratum corneum. Il agit également sur la 10 densité du réseau de collagène dans le derme papillaire. Selon un autre aspect, l'extrait selon l'invention peut être utilisé pour prévenir et/ou lutter contre les manifestations cutanées résultant des effets secondaires liés à l'usage de glucocorticoïdes sur la peau. Les glucocorticoïdes constituent la famille d'anti-inflammatoires la plus utilisée pour traiter des maladies dermatologiques d'origine inflammatoire. Or, leur 15 usage sur la peau à long terme s'accompagne d'effets secondaires, en particulier l'atrophie de la peau, souvent irréversible. L'atrophie de la peau se manifeste par une peau transparente de consistance "papier de cigarette" d'une fragilité accrue, sensible aux déchirures, aux ecchymoses, etc. et la fonction barrière est directement affectée. D'un point de vue histologique, un traitement aux glucocorticoïdes provoque un aplanissement de la 20 jonction dermo-épidermique, une réduction de l'épaisseur de l'épiderme, une diminution de la taille des kératinocytes, une diminution du nombre de fibroblastes, un réarrangement du réseau fibrillaire et une réduction des lipides intercellulaires du stratum corneum. Les glucocorticoïdes réduisent la taille et la prolifération des kératinocytes. La peau et la perméabilité cutanée augmente.
25 Avec son action ré-épithélialisante et régénératrice de la fonction barrière, l'extrait selon l'invention permet de prévenir et diminuer les symptômes observés résultants des effets secondaires liés à l'usage de glucocorticoïdes. Par ailleurs, l'extrait selon l'invention peut être utilisé pour la prévention de l'apparition de vergetures et pour leur traitement. Les circonstances d'apparition des vergetures sont 30 variables, mais sous-tendues par des phénomènes physiopathologiques communs. La grossesse est l'évènement le plus fréquent, mais d'autres circonstances comme la puberté, l'obésité, la pose d'implants mammaires, le syndrome de Cushing et de Marfan, la 3025426 11 prématurité, un traitement topique ou général par des stéroïdes, etc. peuvent également entraîner l'apparition de vergetures. Une vergeture correspond à une cicatrice atrophique résultant d'un processus multifactoriel de réparation incomplète. L'utilisation d'un extrait d'algue rouge selon l'invention, permet de stimuler la régénération 5 cellulaire des kératinocytes de l'épiderme et des fibroblastes du derme, et de densifier les réseaux de collagène au niveau du derme papillaire. Ces différentes actions permettent de prévenir l'apparition et/ou lutter contre les vergetures. Selon un dernier aspect, l'extrait selon l'invention et les compositions le contenant peuvent être utilisées pour différentes applications pharmaceutiques en application topique, en 10 particulier pour prévenir et/ou lutter contre les dermatites atopiques. La dermatite atopique est une condition dermatologique inflammatoire commune. Les signes cliniques qui la caractérisent sont des plaques sèches de type eczéma, prurigineuses et récurrentes. Ces symptômes sont attribués à un défaut acquis et/ou inné de la barrière épidermique. Une barrière épidermique affectée favorise la pénétration et la réactivité aux microbes et aux 15 autres allergènes/antigènes pouvant provoquer et/ou entretenir une réaction inflammatoire chronique. L'utilisation d'un extrait d'algue rouge selon l'invention, permet de contribuer à limiter et corriger la réactivité des peaux à dermatite atopique, notamment à eczéma, en particulier grâce à son action régénératrice de la fonction barrière de la peau.
20 Le principe actif selon l'invention, en activant directement la division cellulaire au niveau du stratum basale, source même des kératinocytes de l'épiderme, permet la reconstitution d'un épiderme complet en l'activant à sa base. Le stratum basale activé prolifère et les kératinocytes migrent en se différenciant pour constituer les différentes couches cellulaires de l'épiderme. La couche cornée constitue l'ultime forme de différenciation des 25 kératinocytes de l'épiderme et dépend directement de la qualité des couches cellulaires que forment les kératinocytes au cours de leur migration vers les couches externes de l'épiderme. Le principe actif selon l'invention agit comme un traitement de fond pour réactiver et reconstituer l'ensemble des couches de l'épiderme permettant in fine d'assurer une fonction barrière complète et efficace.
30 L'invention est à présent illustrée par un exemple non limitatif d'extrait d'algue selon l'invention et de composition le contenant, et par des résultats de tests in vitro et in vivo démontrant son efficacité.
3025426 12 Exemple d'extrait selon l'invention Un exemple d'extrait selon l'invention particulièrement adapté peut être obtenu par la mise en oeuvre des étapes suivantes : - déshydratation de 150 g de Gelidium sesquipedale à 15-20% puis cryobroyage pour 5 obtenir une poudre de granulométrie inférieure à 5001.1m, - préparation d'un tampon d'extraction constitué d'acide citrique 0,1M et de phosphate disodique 0,2M ajusté à un pH compris entre 6 et 7, - première macération de l'algue broyée dans une masse de tampon d'extraction équivalent à entre 7 et 8 fois la masse d'algue cryobroyée, à température ambiante pendant 10 3 à 5 heures dans une cuve de mélange, - récupération de l'algue et conservation du premier macérât à température ambiante en attente, la récupération de l'algue pouvant se faire sur filtre chaussette ou par essorage électrique par exemple, - deuxième macération de l'algue récupérée, dans une masse de tampon d'extraction 15 équivalent à entre 7 et 8 fois la masse d'algue, à température ambiante pendant 3 à 5 heures dans une cuve de mélange, - récupération et conservation du deuxième macérât à température ambiante, la récupération de l'algue pouvant se faire sur filtre chaussette ou par essorage électrique par exemple, 20 - réunion des deux macérâts, - ultracentrifugation du mélange à 15000t/min, - ultrafiltration sur filtre 5kDa, - récupération totale du filtrat (extrait). L'extrait est ensuite conservé sous forme de solution en y ajoutant 1,45% d'acide citrique 25 (équivaut à 2% final vu que la solution tampon contient déjà de l'acide citrique qui reste dans le filtrat), 0,3% de benzoate de sodium et 0,15% de sorbate de potassium, les pourcentages étant donné en pourcentages massiques. Le pH de cette solution est de 4,3 +/0,25. L'extrait obtenu contient au moins 451.J.M de mycosporines, et au moins 1,5mM d'acides 30 aminés. Il s'agit d'un mélange homogène des acides aminés communs. Il contient 3 mycosporines différentes : shinorine-334, palythine-320 et asterina-330.
3025426 13 La concentration minimale en équivalent asterina-330 est de 131.1g/ml. La concentration est calculée selon la formule suivante : o 7 '1,sterl na3 g trL A.... MW d ,10- SOU A330 : Absorbance mesurée à une longueur d'onde de 330 nm ; MW: masse moléculaire (g.mol-1); d: facteur de dilution pour la mesure du spectre (en général 10) ; £ : coefficient d'extinction molaire (L.mo1-1.cm-1) et 103 comme facteur de correction. L'absorbance à 330nm minimale est de 2. Le procédé selon l'invention avec double macération permet d'atteindre des rendements 5 d'extraction supérieurs à 250 lig d'équivalent asterina par gramme de matière sèche. Ce rendement est au moins aussi important que celui obtenu avec des protocoles analytiques impliquant l'usage de solvants organiques. L'extrait présente en outre une bonne stabilité moléculaire et microbienne. En effet l'extrait obtenu a été soumis à un vieillissement accéléré à 40°C. Après 3 mois à 10 l'étuve, les mycosporines n'ont pas montré de dégradation particulière en comparaison avec un extrait conservé à 4°C. Il est considéré que 3 mois à 40°C équivalent à un vieillissement de 3 ans à température ambiante. Les mycosporines font preuve d'une grande stabilité moléculaire. Par ailleurs, un screening US a été réalisé pour valider la solution de conservation. L'extrait a 15 été ensemencé avec des quantités connues de souches bactériennes et fongiques (S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, C. albicans, A. piger brasiliensis). Aucun développement des souches ensemencées n'a pu être observé après 7 et 14 jours à une température de développement bactériologique. L'extrait est donc parfaitement stable d'un point de vue bactériologique. EFFICACITE IN VITRO 20 Renouvellement de fibroblastes : analyse du marqueur Ki-67 L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet de l'extrait d'algue selon l'invention sur la prolifération cellulaire et le renouvellement d'une couche de fibroblastes humains ensemencés à faible densité. L'étude est réalisée par immunofluorescence à l'aide d'un anticorps dirigé contre la protéine 25 nucléaire Ki67 en parallèle d'un marquage des noyaux à l'iodure de propidium. La protéine Ki67 est exprimée tout au long du cycle cellulaire, mais est absente dans les cellules quiescentes (phase GO). d o 3025426 14 Le Ki-67 est un biomarqueur de prolifération cellulaire qui n'est présent que dans les cellules en phase de multiplication. Il est détecté dans plusieurs phases du cycle cellulaire : G1 (Gap1), S (synthèse), G2 et M (mitose). Pendant la phase G1, l'expression du Ki67 est très faible. L'expression de ce biomarqueur augmente pendant les phases S et G2 pour atteindre 5 un maximum à la phase M. Les résultats obtenus sont présentés sur les figures 1A (marquage de la protéine Ki67 dans des fibroblastes cultivés en absence de extrait selon l'invention) et 1B (marquage de la protéine Ki67 dans des fibroblastes cultivés en présence de l'extrait selon l'invention), ainsi que dans le tableau ci-dessous : Cellules/cm2 Cellules/cm2 % expression % de Jour 0 Jour 3 Ki67 croissance Contrôle négatif 5000 33000 - 100 (milieu de culture) Contrôle positif 5000 46250 143 140 (FGF-b) 10 pg/mL 5000 44750 175 136 50 pg/mL 5000 44500 177 135 Contrôle positif: Fibroblast Growth Factor à 10 ng/mL 10 On constate que l'extrait stimule et augmente significativement le pourcentage de cellules en phase de prolifération pour toutes les concentrations étudiées par rapport au témoin négatif. En effet à 10 p.g/mL le taux de cellules actives atteint un maximum de 76%. Cet effet reste stable à 50 p.g/mL et diminue légèrement à 100 pg/mL. Ainsi, l'extrait d'Alga sendatu selon l'invention stimule fortement le renouvellement 15 cellulaire, en particulier pour les doses 10 et 50 p.g/mL dans les conditions expérimentales utilisées. Prolifération et migration des cellules cutanées in vitro : scratch test Un second essai a été réalisé pour compléter ces premiers résultats obtenus sur le marqueur Ki-67. Cet essai consiste à étudier l'effet de l'actif sur la prolifération et la migration des 20 cellules in vitro, en visualisant la recolonisation de lésions induites dans des cultures cellulaires de fibroblastes humains ensemencées à faible densité. Après 36 heures de traitement, les cellules ont été fixées puis colorées au Giemsa pour dénombrer, en 3025426 15 microscopie, les cellules ayant colonisé l'aire de cicatrisation. Cet essai est aussi connu sous l'appellation « Scratch Test ». Les figures 2A et 2B illustrent la colonisation de l'aire de cicatrisation obtenue par stimulation avec l'extrait selon l'invention. Sur la figure 2A, il s'agit de l'aire de cicatrisation 5 obtenue en absence d'Alga sendatu et sur la figure 2B la stimulation de la prolifération et de la migration cellulaire obtenue en présence d'Alga sendatu. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci-après : Moyenne Ecart type % de stimulation Test de Student des (p <0,05) cellules (n=10x3) Contrôle négatif 68.6 0.3 Contrôle positif 138.5 11.2 102 0.009 (PDGF-AB 10 ng/m L) 10 ug/m L 75.3 8.8 10 NS 50 ug/m L 129.7 4.2 89 0.001 Contrôle positif: Platelet Derived Growth Factor AB à 10 ng/mL Ces résultats montrent que l'extrait selon l'invention, à la concentration de 50 ug/mL stimule de manière importante la migration des cellules dans l'aire de cicatrisation. Ce taux est 10 presque identique à celui observé en présence du témoin positif. L'extrait selon l'invention stimule ainso fortement la cicatrisation évaluée par la migration cellulaire, en particulier à une concentration de 50 ug/mL dans les conditions expérimentales utilisées. EFFICACITE EX VIVO 15 Cette étude a pour but d'évaluer l'activité de l'extrait selon l'invention sur explants de peau humaine ex vivo à des concentrations représentatives de formulation. L'activité a été évaluée par une expertise histologique de la morphologie générale de la peau, ainsi que par immuno-marquage de marqueurs moléculaires spécifiques de l'épiderme. Des explants d'un diamètre d'environ 11 mm (± 1 mm) ont été préparés à partir d'une 20 plastie abdominale d'une femme âgée de 43 ans de type caucasien. Les explants ont été mis en survie en milieu BEM (B10-EC's Explants Medium) à 37°C en atmosphère humide, enrichie de 5 % de CO2.
3025426 16 Les expiants ont été traités de manière topique à raison de 2 mg/cm2 d'actif dilué à 1% et 5% dans un gel de carboxymethyl cellulose tous les 2 jours. Après 3 et 10 jours, des prélèvements ont étés effectués. La moitié a été fixée, déshydratée, imprégnée en paraffine et coupée en microtomes de 5 um. L'autre moitié a été congelée et coupée en microtomes 5 de 7 um en vue des immuno-marquages subséquents. Examen de la morphologie générale : Les coupes en paraffine sont colorées au trichrome de Masson, variante de Goldner. Un examen au microscope est réalisé pour évaluer la morphologie générale des structures dermiques et épidermiques.
10 Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 3 et dans le tableau ci-après : Epaisseur de l'épiderme vs Témoin + Elément d'essai J3 +17%* J10 +17%* * : significativité pour p<0.05 - Student t-test On constate que l'extrait selon l'invention appliqué de manière topique à 1% induit une augmentation significative de l'épaisseur de l'épiderme (acanthose hyperplasique et hypertrophique) de 17% dès le troisième jour d'essai sur expiant de peau. Au bout de 10 jours, cet épaississement est maintenu et n'évolue pas. On observe aussi une nette 15 densification du réseau de collagène dans le derme papillaire par rapport au témoin non traité. lmmunomarguage Les kératines sont des protéines structurales qui forment les filaments intermédiaires au sein de tous les tissus épithéliaux. Chez l'homme, les kératines sont le produit d'une large famille 20 de gènes regroupant 54 membres différents. Elles sont subdivisées sur la base de leurs propriétés biochimiques, à savoir le poids moléculaire et le point isoélectrique, en kératines acides ou kératines de type I et en kératines basiques ou kératines de type II. Elles sont rassemblées en hétéropolymères avec un ratio kératine de type I - kératine de type II de 1 :1. 3025426 17 - La cytokératine 14 (CK14) La cytokératine 14 (CK14) est un marqueur des kératinocytes de la couche basale. Elle est impliquée dans le maintien de la forme cellulaire et assurent ainsi des propriétés de résistance vis-à-vis du stress thermique. La CK14 est considérée comme un marqueur de 5 prolifération des couches basales de l'épiderme. - La cytokératine 10 (CK10) Le processus de différenciation kératinocytaire est caractérisé par un changement d'expression des kératines : Les CKs basales CK5 et CK14 sont substituées par les CKs superbasales, dont la CK10. En recherche dermo-cosmétique, la CK10 est considérée comme 10 un des marqueurs central de la différenciation des kératinocytes de l'épiderme. - L'intégrine 6-4 Les intégrines sont des récepteurs d'adhésion cellulaire, faisant partie du complexe moléculaire de la jonction dermo-épidermique. Les intégrines sont constituées d'une sous-unité alpha et d'une sous-unité bêta. La plupart d'entre elles se lient aux molécules de la 15 matrice extracellulaire et aux microfilaments d'actine via un certain nombre de protéines de liaison qui s'associent à leur région intracellulaire, dont les plectines ou encore la laminine-5. Le dimère a6134 constitue les hémi-desmosomes au sein de la couche basale de l'épiderme. Les intégrines jouent un rôle très important dans la fixation de l'épiderme à la jonction dermo-épidermique.
20 Les résultats obtenus pour ces trois marqueurs sont présentés sur les figures 4 et 5. L'immunomarquage de la cytokétatine-10 montre qu'une application topique de l'actif concentré à 5% induit une augmentation de 10 à 15% de l'expression de ce marqueur de différenciation des kératinocytes. L'immunomarquage de la cytokératine-14 montre qu'une application topique à 1 et 5% de 25 l'actif induit une augmentation respective de 15 et 30% de ce marqueur de prolifération des kératinocytes de la couche basale de l'épiderme. L'immunomarquage de l'intégrine-134 montre qu'une application topique à 1 et 5% de l'actif induit une augmentation de 10 à 15% de l'expression de ce marqueur d'adhésion cellulaire de la jonction dermo-épidermique.
Claims (24)
- REVENDICATIONS1. Extrait d'algue rouge constitué par des molécules de poids moléculaire inférieur à 5000 Da, comprenant au moins des mycosporines et des acides aminés.
- 2. Extrait selon la revendication 1, caractérisé en ce que les mycosporines et les acides aminés représentent au moins 8,3 mg/g d'extrait sec.
- 3. Extrait selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un extrait obtenu à partir d'une algue rouge choisie parmi les Gelidiaceae, les Bangiaceae, les Phorphyridiaceae, les Gigartinaceae, les Gracilariaceae, les Solieriaceae et les Corallinaceae.
- 4. Extrait selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un extrait obtenu à partir de Gelidium sesquipedale.
- 5. Extrait selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend au moins des mycosporines Asterina.
- 6. Extrait selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend également au des mycosporines Palythine et/ou des mycosporines Shinorine.
- 7. Composition comprenant entre 0,5 et 5% en poids d'un extrait selon l'une des revendications 1 à 6.
- 8. Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle contient entre 65 et 650gg/L de mycosporines.
- 9. Composition selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce qu'elle contient entre 1,145 et 14,15 mg/L d'acides aminés.
- 10. Composition comprenant un extrait selon l'une des revendications 1 à 6, pour son utilisation pour traiter la dermatite atopique.
- 11. Composition selon l'une des revendications 7 à 9, pour son utilisation pour traiter la dermatite atopique.
- 12. Composition selon l'une des revendications 7 à 9, pour son utilisation en application topique pour améliorer la fonction barrière de la peau.
- 13. Composition selon l'une des revendications 7 à 9, pour son utilisation en application topique pour lutter contre les rougeurs cutanées et/ou réparer les irritations cutanées. 3025426 19
- 14. Composition selon l'une des revendications 7 à 9, pour son utilisation en application topique pour stimuler la cicatrisation et la réparation des peaux irritées.
- 15. Composition selon l'une des revendications 7 à 9, pour son utilisation en application topique pour lutter contre les manifestations cutanées du vieillissement de la peau.
- 16. Composition selon l'une des revendications 7 à 9, pour son utilisation en application topique pour lutter contre les manifestations cutanées résultant des effets secondaires liés à l'usage de glucocorticoïdes sur la peau.
- 17. Composition selon l'une des revendications 7 à 9, pour son utilisation en 10 application topique pour prévenir l'apparition de vergetures et/ou traiter des vergetures existantes.
- 18. Procédé d'obtention d'un extrait selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en oeuvre des étapes suivantes une première macération de l'algue dans une solution constituée d'un acide 15 et d'une base, puis récupération de l'algue d'une part et d'un premier macérât d'autre part, une deuxième macération de l'algue récupérée à l'étape précédente dans une solution constituée d'un acide et d'une base, puis récupération de l'algue d'une part et d'un deuxième macérât d'autre part, 20 mélange des deux macérâts, filtration pour filtrer les molécules de taille inférieure à 5000Da, récupération du filtrat qui constitue l'extrait.
- 19. Procédé d'obtention selon la revendication 18, caractérisé en ce que la solution de macération constituée d'un acide et d'une base est constituée d'acide citrique et 25 de phosphate disodique.
- 20. Procédé selon l'une des revendications 19, caractérisé en ce que la solution de macération est constituée entre 20 et 35% d'acide citrique 0,1M et entre 65 et 80% de phosphate disodique 0,2M.
- 21. Procédé selon l'une des revendications 18 à 20, caractérisé en ce qu'avant la première macération, l'algue est broyée pour obtenir une poudre de granulométrie inférieure à 5001..tm. 3025426 20
- 22. Procédé selon l'une des revendications 18 à 21, caractérisé en ce que l'étape de filtration consiste à réaliser au moins une ultra-filtration sur filtre 5000 Da.
- 23. Procédé selon l'une des revendications 18 à 22, caractérisé en ce que l'étape de filtration consiste à réaliser au moins une ultra-centrifugation à 15000 t/min et une ultrafiltration sur filtre 5000 Da.
- 24. Procédé selon l'une des revendications 18 à 23, caractérisé en ce que l'extrait obtenu est conservé dans une solution de conservation, ou concentré par déshydratation ou entièrement déshydraté pour obtenir une poudre.
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