WO2023012115A1 - Principe actif comprenant des oligo-glucanes issus de la fraction cytosolique de saccharomyces cerevisiae et ses utilisations cosmetiques - Google Patents

Principe actif comprenant des oligo-glucanes issus de la fraction cytosolique de saccharomyces cerevisiae et ses utilisations cosmetiques Download PDF

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WO2023012115A1
WO2023012115A1 PCT/EP2022/071576 EP2022071576W WO2023012115A1 WO 2023012115 A1 WO2023012115 A1 WO 2023012115A1 EP 2022071576 W EP2022071576 W EP 2022071576W WO 2023012115 A1 WO2023012115 A1 WO 2023012115A1
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active principle
cosmetic
extract
principle according
saccharomyces cerevisiae
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PCT/EP2022/071576
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Jean Paufique
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Societe Industrielle Limousine D'application Biologique
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    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae

Definitions

  • the invention relates to an active principle comprising oligo-glucans, obtained from the cytosolic fraction of a yeast of the species Saccharomyces cerevisiae, a cosmetic composition comprising it and its cosmetic uses, in particular for improving regeneration skin and fight against skin aging.
  • the regeneration process for example of the skin, is a dynamic and complex process involving many cellular actors, during which a new tissue develops to restore previously damaged areas and thus ensure its healing.
  • the skin tissue is now recognized as a complex organ comprising in particular fibroblasts which play the pivotal role between these three systems to act on epidermal renewal, matrix remodeling, but also on vascularization, thus allowing the regeneration of the damaged tissue.
  • the vascular system allows, among other things, the transport of nutrients, mediators and cells, which are essential for skin regeneration. To do this, the endothelial cells migrate to group together in a cohesive manner, in order to form an organized and regular vascular network.
  • the fibroblasts secrete growth factors which will act on these systems by activating the proliferation, migration and cell differentiation pathways. These factors act in a paracrine way on the metabolism of surrounding fibroblasts but also on the metabolism of other cell types present in the skin tissue.
  • PRP platelet-rich plasma
  • the inventor has thus studied the metabolism of aged fibroblasts, but also the metabolism of keratinocytes, endothelial cells and macrophages in the presence of the secretome of aged fibroblasts and observed:
  • the inventor has identified a specific active ingredient obtained from a cytosolic fraction of the yeast of Saccharomyces cerevisiae which makes it possible to act on the entire process of skin regeneration.
  • yeast hydrolysates from S. cerevisiae. Mention may thus be made of a cosmetic composition comprising mannoproteins derived from the cell wall of yeasts such as Saccharomyces described in EP2567688. Said extract is obtained from a chemical, enzymatic or physicochemical hydrolysis of the wall of the yeasts.
  • Application WO 2009/101503 also discloses the use of S. cerevisiae yeast hydrolyzate consisting of proteins from the wall of hydrolyzed yeasts whose molecular weight is between 1 and 5 kDa.
  • the solutions already known are particularly aimed at a hydrolyzate of S. cerevisiae and more particularly a hydrolyzate obtained from the wall of the yeast of S. cerevisiae.
  • This hydrolyzate is rich in proteins, known to fight against skin aging.
  • a yeast is a eukaryotic microorganism, composed of a cell wall surrounding the plasma membrane. This wall consists of an outer layer of mannoproteins associated with glucans and an inner layer of glucans associated with chitins.
  • the cytoplasmic membrane is composed mainly of phospholipids and protein complexes. The contents of the cell, including the nucleus and the cytoplasmic organelles, are contained in a liquid phase called the cytosol.
  • yeast of Saccharomyces cerevisiae is a unicellular eukaryote well known to those skilled in the art, which is in the form of isolated, ovoid to rounded cells. It has been used since antiquity for the manufacture of fermented drinks. However, it was isolated and identified only in the middle of the 19th century to replace traditional bakers' sourdough through its use in a more reliable and faster fermentation process than sourdough.
  • the inventor has surprisingly discovered the effects associated with an extract obtained specifically from the cytosolic fraction of a Saccharomyces cerevisiae yeast.
  • Said extract comprising oligo-glucans with a molar mass of between 2 and 5 kDa.
  • the invention relates to an active ingredient comprising at least one extract of Saccharomyces cerevisiae, said extract corresponding to the cytosolic fraction comprising oligo-glucans with a molar mass of between 2 and 5 kDa.
  • said extract consists of the cytosolic fraction of a Saccharomyces cerevisiae yeast. More preferentially, the extract is a cytosolic fraction obtained by a mechanical lysate of Saccharomyces cerevisiae.
  • the invention also relates to a method for preparing the active ingredient according to the invention, comprising in particular a solubilization of Saccharomyces cerevisiae in water by mechanical homogenization, that is to say a mechanical lysate making it possible to to break yeast membranes to extract the cytosolic fraction, separation of the soluble and insoluble phases, ultrafiltration followed by recovery of the filtrate and molecular sorting by ion chromatography or membrane filtration.
  • the active principle according to the invention is of natural origin and advantageously exhibits an improvement in skin regeneration.
  • the active principle according to the invention promotes the interconnectivity of the cutaneous, vascular and immune system. It acts on these three systems which makes it possible to fight against skin aging by providing a global solution.
  • the active ingredient reduces dark circles, wrinkles and improves the radiance of the complexion. It thus responds to the problems of the prior art.
  • the active principle according to the invention can be used for cosmetic applications, preferentially when it is incorporated into a cosmetic composition, preferentially a composition in a form suitable for topical application.
  • the invention therefore also relates to a cosmetic use of a composition comprising at least 0.1% by weight of the active principle according to the invention, in particular for improving skin regeneration.
  • the invention improves the interconnectivity of the cutaneous, vascular and immune systems.
  • FIG. 1 represents the effect of the active ingredient according to the invention on the capacity for skin regeneration, after 14 days of twice-daily application.
  • FIG. 2 represents the effect of the active principle according to the invention on the biomechanical properties of the skin after 21 and 42 days of twice-daily treatment.
  • cosmetic active principle within the meaning of the invention, is meant an extract comprising at least one molecule, preferably a set of molecules having a cosmetic effect on the skin.
  • the cosmetic effect on the skin is an anti-aging effect, in particular a regenerating effect on the skin.
  • regenerating effect is meant in the sense of the invention, the ability of living organisms to repair themselves and in particular the ability of the skin to reconstitute itself in response to an attack (burn, scratch, cut) or to natural degradation. This is mainly an overall effect which acts on the cutaneous, vascular and immune system by improving the interconnectivity of said systems.
  • inter-connectivity within the meaning of the invention, is meant the exchanges between the different systems (cutaneous, vascular and immune) inside the cutaneous tissue.
  • the fibroblast plays a pivotal role in regeneration by interconnecting the three systems via the secretion of a pool of growth factors.
  • system is meant a set of interdependent elements constituting it.
  • the vascular system is made up of arterioles, capillaries and venules.
  • the cutaneous system is the surface in contact with the external environment and includes the epidermis, the dermis, the hypodermis.
  • the immune system is made up of several types of immune cells: in particular dendritic cells, T lymphocytes, macrophages and mast cells.
  • mechanical lysate within the meaning of the invention, is meant the product resulting from mechanical lysis, that is to say the destruction of the membrane of a biological cell by a physical agent such as a means mechanical as opposed to a chemical or biological agent such as temperature or an enzyme or even the natural autolysis of the cell.
  • “mechanical lysate of Saccharomyces cerevisiae” within the meaning of the invention is meant any active principle derived from the yeast Saccharomyces cerevisiae, obtained by a method comprising at least one stage of solubilization of Saccharomyces cerevisiae consisting of mechanical homogenization.
  • Mechanical lysis that is to say the destruction of the membrane of a biological cell, is carried out by a physical technique such as a mechanical means as opposed to a chemical or biological agent such as an enzyme, temperature or even natural autolysis of the cell.
  • the term “mechanical lysate” excludes molecules produced solely by fermentation of Saccharomyces cerevisiae but also resulting from enzymatic or chemical hydrolysis.
  • oligo-glucan within the meaning of the invention, is meant a glucan fraction.
  • Glucans and oligo-glucans are polysaccharides made up exclusively of glucose. These glucose molecules can be linear or branched.
  • an oligo-glucan is a glucose oligomer of small size, that is to say less than or equal to 5 kDa.
  • the present invention therefore relates to a cosmetic active principle comprising at least one yeast extract of the species Saccharomyces cerevisiae, particularly useful for improving skin regeneration.
  • the active ingredient according to the invention comprises at least one extract of Saccharomyces cerevisiae, said extract corresponding to the cytosolic fraction comprising oligo-glucans with a molar mass of between 2 and 5 kDa.
  • said extract excludes any other part or element of the yeast such as the wall or the membranes of the yeast.
  • said extract consists of the cytosolic fraction of Saccharomyces cerevisiae yeast.
  • the extract is a mechanical lysate of Saccharomyces cerevisiae.
  • said extract can be obtained by a process comprising the following steps: a. solubilization of at least 50 g/L of Saccharomyces cerevisiae in water, by mechanical homogenization, b. separation of the soluble and insoluble phases, c. ultrafiltration and filtrate recovery, and d. molecular sorting, in particular by membrane filtration.
  • the extract is obtained from the soluble phase.
  • the extract constituting the cosmetic active ingredient according to the invention has been characterized by the inventor. This comprises trace glucans which preferably represent between 10% and 35% by weight of dry matter of the extract.
  • the extract according to the invention consisting of the cytosolic fraction of yeast, it does not include membranes and therefore said extract contains little mannose. Even more preferentially, the extract according to the invention comprises a glucose/mannose ratio greater than 60%.
  • the extract according to the invention also comprises a protein fraction.
  • the distribution and quantity of the protein fraction can be determined by measuring total nitrogen according to the KJELDHAL method (reference: Official method of analysis of the A.O.C., 12th ed. W Horwitz, E.D., New-York, 15- 60, 1975).
  • the extract comprises between 45 and 55% of peptides by weight of dry matter of the extract according to the KJELDHAL method, 96% of which are peptides having a molecular mass of less than 2000 Da.
  • the inventor has also determined the ash content.
  • the ash content can be determined by weighing the residues resulting from the incineration of the samples of the active principle according to the invention at 550° C. in an electric muffle furnace.
  • the active principle according to the invention has an ash content of between 10% and 22% by weight of dry matter of the active principle.
  • the extract according to the invention also comprises between 0 and 31% by weight of dry matter of other cellular metabolites present in the cytosol such as organic acids, DNA, etc.
  • the cosmetic active principle according to the invention can be in liquid form, in solid form or in film form.
  • the active ingredient according to the invention when in liquid form, it consists exclusively of the extract of the cytosolic fraction of the yeast of Saccharomyces cerevisiae, optionally accompanied by stabilizer and/or preservative system.
  • the extract in liquid form is preferably in the form of a clear liquid aqueous solution, with a characteristic odor and a light yellow color. It can however be more colored and/or be bleached by any method known to those skilled in the art.
  • the dry matter content can be determined by weighing the residues resulting from the drying of the extract according to the invention at 105° C. in an oven until a constant weight is obtained.
  • the extract according to the invention in liquid form has a dry matter content of: 10 g/L to 50 g/L, even more preferably from 15 g/L to 35 g/L.
  • the active principle according to the invention can also be presented in the form of a film.
  • the extract of the cytosolic fraction of Saccharomyces cerevisiae preferably represents at least 0.1% by weight of the film.
  • the active ingredient comprises: a. at least the lysate of the cytosolic fraction of Saccharomyces cerevisiae according to the invention, and b. at least one mineral filler, and/or c. at least one polymer of natural origin, and/or d. at least one plasticizer, and/or e. at least one surfactant.
  • the polymer of natural origin can be chosen from: Pectin, tamarind gum, alginate, pullulan, psyllium, xanthan, guar, tara, carob, agar, gum arabic, gellan, dextran, carrageenan, cellulose, konjac and chitosan.
  • the plasticizer can be chosen from: Glycerol, Sorbitol, Sucrose, Erythritol, Urea, Propylene glycol and Butylene glycol.
  • the mineral filler can be chosen from: Calcium carbonate, green clay, kaolin, perlite, talc, magnesium silicate, mica, diatomaceous sericite, silica, calcium sulphate, calcium chloride, potassium chloride, iron oxide and zinc oxide.
  • the active principle may further comprise a pigment to color the film.
  • the active principle according to the invention is in solid form, it is preferably constituted by the extract of the cytosolic fraction of the yeast of Saccharomyces cerevisiae as previously described and by a support chosen from maltodextrin, gum arabic , soy lecithin or isomalt.
  • the extract represents at least 10% by weight of the active principle and the support at most 90% by weight of the active principle.
  • the support In the case of a solid form in which the active principle is combined with a support, the sugar, protein fraction and ash contents in the active principle are modified, the support generally consisting mainly of sugars.
  • the extract constituting or contained in the active principle according to the invention can be obtained by any process comprising at least one stage of extraction of the cytosolic fraction of the yeast of Saccharomyces cerevisiae, in particular a stage of mechanical lysis.
  • the active principle according to the invention is obtained by implementing the following steps: a. solubilization of at least 50 g/L of Saccharomyces cerevisiae in water, by mechanical homogenization, b. separation of the soluble and insoluble phases, c. ultrafiltration and filtrate recovery, and d. molecular sorting, in particular by membrane filtration.
  • Mechanical homogenization is carried out by any means known to those skilled in the art, for example by mechanical grinding using a homogenizer.
  • the separation of the soluble and insoluble phases is carried out by any means known to those skilled in the art, for example by centrifugation, filtration or decantation.
  • the separation of the soluble and insoluble phases is carried out by centrifugation, thus allowing the recovery of the soluble phase containing, among other things, the fractions sugars and soluble proteins.
  • the method comprises an ultrafiltration step after the recovery of the soluble phase to perform molecular sorting, for example by ion chromatography or membrane filtration.
  • this ultrafiltration step allows the purification of the recovered soluble phase. It is carried out in order to eliminate molecules of high molecular weight (enzymes and polymers, elements of the wall, membranes, etc.), that is to say molecules of molecular weight greater than 10kDa.
  • the lysate obtained at this stage can optionally be further concentrated and/or purified, preferably by successive ultrafiltration stages through filters with different cut-off thresholds, keeping the filtrates at each stage and/or by a method chromatographic type.
  • the product obtained after lysis and ultrafiltration, before or after concentration and sterilizing filtration is a lysate of the cytosolic fraction of Saccharomyces cerevisiae, and constitutes the first form of the active ingredient according to the invention, then in liquid form.
  • the lysate obtained can then be dried and associated with a support, to be in solid form.
  • This phase can be achieved by implementing the following steps: a. an atomization medium, preferably maltodextrin, is added to the product in liquid form, at most 90% (by mass/volume), b. this solution is then concentrated under vacuum; vs. any bacteria present is eliminated by heat treatment or filtration; d. atomization makes it possible to obtain a powder.
  • an atomization medium preferably maltodextrin
  • the active principle according to the invention can be integrated into a cosmetic composition, in particular a composition comprising at least 0.1% by weight of said active principle.
  • Said cosmetic composition according to the invention preferably comprises a physiologically acceptable medium, preferably a cosmetically acceptable medium, that is to say which does not cause feelings of discomfort for the user such as redness, tightness or tingling.
  • the composition can be in various galenic forms, suitable for topical application to the skin.
  • compositions can be in particular in the form of oil-in-water emulsions, water-in-oil emulsions, multiple emulsions (Water/Oil/Water or Oil/Water/Oil) which can optionally be microemulsions or nanoemulsions, or in the form of solutions, suspensions, hydrodispersions, aqueous gels, powders, or foundation. They can be more or less fluid and have the appearance of creams, emulsions, gels, masks or any other aspect of healthy skin care cosmetics.
  • compositions comprising at least 0.1% of the liquid active principle according to the invention, preferably between 0.5 and 10% or comprising at least 0.01% of a powder active principle according to 'invention.
  • compositions according to the invention may contain, as adjuvant, at least one compound chosen from: a. oils, which may be chosen in particular from silicone oils, linear or cyclic, volatile or non-volatile, b. waxes, such as ozokerite, polyethylene wax, beeswax or carnauba wax, c. silicone elastomers, d. surfactants, preferably emulsifiers, whether nonionic, anionic, cationic or amphoteric, e. co-surfactants, such as linear fatty alcohols, f. thickeners and/or gelling agents, g. humectants, such as polyols such as glycerine, h. colorants, preservatives, fillers, i. the tensors, j. sequestrants, k. perfumes, l. and mixtures thereof, without this list being exhaustive.
  • oils which may be chosen in particular from silicone oils, linear or cyclic, volatile or non-vol
  • compositions are intended to be used on healthy skin, in particular mature skin, in particular to improve skin regeneration and obtain an overall anti-ageing effect, preferably an anti-wrinkle effect and/or to improve the radiance of the complexion. and/or reduce dark circles.
  • the invention therefore also relates to a cosmetic process for treating the skin to improve skin regeneration, in particular to improve the radiance of the complexion and/or to reduce dark circles and/or to reduce wrinkles, which consists of topical application to the skin of a healthy person of such an active principle according to the invention or of such a composition according to the invention.
  • the active principle according to the invention or the composition according to the invention has characteristics which allow its use in cosmetics and in particular to limit the natural effects associated with skin aging and thus improve skin regeneration and obtain an anti-aging effect. overall age, preferentially reducing wrinkles and/or reducing dark circles and/or improving the radiance of the complexion.
  • the active principle or the composition according to the invention improves the interconnectivity of the cutaneous, vascular and immune systems.
  • the active principle or the composition according to the invention increases the synthesis and the secretion of the growth factors KGF, EGF, IGF, FGF, PDGF, TG F-0 and VEGF.
  • KGF keratinocyte growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • IGF insulin growth factor
  • PDGF platelet derived growth factor
  • TGF- transforming growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the active principle according to the invention by increasing the synthesis and the secretion of KGF, EGF, IGF, FGF, PDGF, TGF-
  • the active ingredient stimulates matrix renewal. This translates in vivo into an improvement in the structure of the dermis: the quality of the matrix is increased by 32% and the quality of the fibers is increased by 20%, compared to the placebo. In the epidermis, the active ingredient also stimulates keratinocyte migration (+99%), essential for epidermal dynamics.
  • the immune system by promoting the pro-regenerating population (+132%), capable of interacting in return with the fibroblasts, it promotes matrix remodeling.
  • the vascular system by restoring the migration of endothelial cells and their cohesion (+93% and +77% respectively), the active promotes the formation of the vascular network (+55%).
  • the active principle according to the invention thus exhibits an overall anti-ageing action.
  • wrinkles and dark circles are significantly reduced, the microvascular network becomes homogeneous again, the skin is firmer and the complexion's radiance is revived. It is particularly suitable for mature healthy skin.
  • Example 1 Active ingredient according to the invention
  • the active ingredient is obtained by implementing the following steps: a. Solubilization by mechanical homogenization (lysis) of Saccharomyces cerevisiae yeasts, b. Separation of soluble/insoluble phases, c. Ultrafiltration, d. Filtrate recovery, e. Molecular sorting by membrane filtration, intended to select the molecules, f. Discoloration and Deodorization, and g. Filtrations and sterilizing filtration.
  • the extract constituting the active principle according to the invention consists of the cytosolic fraction of the yeasts of S. cerevisae, the membranes are eliminated and there remains almost no mannose in said extract (the mannose level of the glycosidic fraction is less than 2%).
  • the glycosidic fraction of the active principle obtained is more particularly made up of 10% of monosaccharides with a molar mass of less than 180 Da and 90% of oligosaccharides with a molar mass of between 360 Da and 5000 Da. More particularly, the glycosidic fraction is composed of approximately 0.5% glucosamine, 1.7% galactose, 1.4% mannose and 96.4% glucose. That is a glucose/mannose ratio of 68.9%.
  • the sugars present in the active principle are in the form of oligo-glucans, preferably of size between 2 and 5 kDa.
  • the active ingredient is obtained by implementing the following steps: a. Solubilization of Saccharomyces cerevisiae yeasts in a basic aqueous medium at a rate of at least 200g/L, b. Enzymatic hydrolysis, c. Separation of soluble and insoluble phases by centrifugation, decantation or filtration, d. Sterilizing filtration
  • the active principle according to Example 2 consists of 34% sugars including 5% disaccharide and 95% saccharides of sizes greater than 1440 Da. And a glucose/mannose ratio of 14.0%.
  • the active principle is obtained by carrying out the following steps: a. Solubilization of Saccharomyces cerevisiae yeasts in a slightly basic aqueous medium at a rate of at least 20% with optional addition of an alcohol in order to promote the solubilization of the yeasts, b. hydrolysis of proteins in a basic medium, c. agitation from 8 to 52 hours, d. first filtration to separate the soluble and insoluble phases, e. washing against water in order to purify the active fraction, f. successive concentrations and filtrations, and g. sterilizing filtration.
  • the active principle according to Example 3 is thus mainly composed of mannans.
  • the active principle is obtained by implementing the following steps: a. Solubilization by mechanical homogenization (lysis) of Saccharomyces cerevisiae yeasts, b. Separation of soluble/insoluble phases, c. Recovery of the soluble phase, d. Molecular sorting by membrane filtration, intended to select the molecules, e. Discoloration and Deodorization, and f. Filtrations and sterilizing filtration.
  • Example 5 Active ingredient outside the invention
  • the active principle is obtained by implementing the following steps: a. Solubilization by mechanical homogenization (lysis) of Saccharomyces cerevisiae yeasts, b. Separation of soluble/insoluble phases, c. Ultrafiltration, d. Filtrate recovery, e. Molecular sorting by membrane filtration, intended to select the molecules, f. Retentate recovery, g. Discoloration and Deodorization, and h. Filtrations and sterilizing filtration.
  • the active principle obtained is composed of molecules of size greater than 5 kDa.
  • the active ingredient is obtained by implementing the following steps: a. Solubilization by mechanical homogenization (lysis) of Saccharomyces cerevisiae yeasts, b. Separation of soluble/insoluble phases, c. Ultrafiltration, d. Filtrate recovery, e. Molecular sorting by membrane filtration, intended to select the molecules, f. Filtrate recovery, g. Discoloration and Deodorization, and h. Filtrations and sterilizing filtration
  • the active principle obtained is composed of molecules of size less than 2 KDa.
  • Example 7 Composition according to the invention
  • An example of a formulation comprising the active principle according to the invention in the form of an anti-ageing gel-cream characterized by a fresh and unctuous texture is presented in Table 1 below. After.
  • Example 7 can in particular be obtained by the following process: a. Add A2 in Al with stirring and homogenize for 20 minutes. b. Add B then C to A with vigorous stirring. Shake for 20 minutes. vs. Add D and E with moderate agitation. The composition is then in the form of a thick, shiny, off-white cream gel.
  • Example 8 Composition according to the invention
  • Example 8 can in particular be obtained by the following process: a. Add A2 in Al with moderate stirring, stir until a homogeneous gel is obtained and heat to 80°C, b. Place B under magnetic stirring and heat to 80°C, c. Emulsify B in A under shearing agitation for 10 minutes, d. At 30°C, with moderate stirring, add C, and e. Adjust pH to 5.0 - 5.5 with D.
  • composition is then in the form of a supple and shiny, off-white gelled cream.
  • Example 9 can in particular be obtained by the following process: a. Add A2 in Al with stirring, stir until homogeneous and heat to 80°C, b. Place B1 under stirring and heat to 80°C. Add B2 to B1 just before the emulsion, c. Emulsify B in A under shearing agitation for 10 minutes, d. At 50°C, with moderate stirring, add C then D, E and F, and e. At room temperature, add G with very gentle stirring.
  • composition is then in the form of a flexible, shiny, pale gray emulsion with gray particles in suspension.
  • Example 10 Composition According to the Invention
  • Table 4 An example of a formulation comprising the active principle according to the invention in the form of a regenerating night cream is presented in Table 4 below.
  • Example 10 can in particular be obtained by the following process: a. Add A2 in Al with moderate stirring, stir until a homogeneous gel is obtained and heat to 80°C, b. Place B under magnetic stirring and heat to 80°C, c. Emulsify B in A under shearing agitation for 10 minutes, and d. At 50°C, with moderate stirring, add C then D.
  • composition is then in the form of a flexible, shiny, pale beige emulsion.
  • pH is equal to 5.4 and the viscosity is equal to (C/5rpm) 57400 cP.
  • Test 1 Effect of the active ingredient according to the invention on its ability to restore the regenerating fibroblast complex.
  • the objective of this test is to evaluate the impact of aging on the expression and synthesis of growth factors: TGF-(31, KGF, VEGF, FGF2, EGF, IGF1 and PDGFA present within the fibroblast regenerating complex.
  • EGF EGF
  • IGF1 IGF1
  • PDGFA phospholipase-like growth factor
  • TGF-p1 TGF-p1
  • KGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the young and old human fibroblasts are seeded and incubated at 37° C. in an atmosphere containing 5% CO2.
  • the cells are treated with the extracts at 0.25% and 1.00% (V/V). They are then incubated at 37°C in an atmosphere containing 5% CO2.
  • the fibroblasts are recovered and the total RNA extracted.
  • RNAs were reverse-transcribed and the complementary DNAs obtained were analyzed by the quantitative PCR technique. Internal reference control mRNAs were analyzed alongside EGF, IGF1 and PDGFA mRNAs.
  • the supernatants are recovered and stored at ⁇ 80° C. awaiting the ELISA assays of TGFp1, KGF, VEGF, FGF2.
  • the objective of this study is to evaluate the effect of the examples according to the invention on the expression of the growth factors: EGF, IGF1 and PDGFA of the fibroblast regenerating complex.
  • the active principle according to the invention significantly restores the synthesis of growth factors, whereas the examples outside the invention do not show an effect on all of the growth factors studied.
  • the active ingredient according to the invention significantly restores the expression or synthesis of growth factors: EGF by 98%, IGF1 by 75%, PDGFA by 76%, TGFpl by 135 %, 48% KGF, 73% VEGF, and 49% FGF2.
  • the active principle according to the invention thus makes it possible to enrich the fibroblast regenerating complex of aged cells in growth factors.
  • Test 2 Effect of the active ingredient according to the invention on the migration of fibroblasts.
  • the objective of this study is to evaluate the effect of the active ingredient according to the invention on the migration of aged human fibroblasts.
  • the effect is measured by evaluating the capacity of the cells to recolonize an injured zone.
  • the young and old human fibroblasts are seeded and incubated at 37° C. in an atmosphere containing 5% CO2.
  • the injured area is performed after four days.
  • the cells are treated with the extracts at 0.25% and/or 1.00% and/or 2% (V/V). They are then incubated in an atmosphere containing 5% CO2 at 37°C.
  • the visualization of the migration of the fibroblasts is carried out in “time-lapse” thanks to an entirely automated system which makes it possible to follow the migration of the cells during the culture.
  • the cell migration rate within the wound is calculated using an image analysis script developed in-house. The results are expressed in pm 2 /min.
  • the migration rate of aged human fibroblasts is significantly reduced by 27% compared with young human fibroblasts.
  • the active principle according to the invention thus promotes faster recolonization of the aged injured dermis, a key stage in skin regeneration.
  • Test 3 Effect of the active principle according to the invention on the differentiation into myofibroblasts.
  • the objective of this study is to evaluate the effect of the active ingredient according to the invention on the synthesis of alpha-Smooth muscle actin (a-SMA), actin microfilaments characteristic of myofibroblasts, in a injured area.
  • a-SMA alpha-Smooth muscle actin
  • fibroblasts are activated and differentiate into myofibroblasts, which contract and participate in healing by reducing the size of the wound and by secreting proteins from the extracellular matrix.
  • the study was carried out by immunocytofluorescence, on human fibroblasts obtained from face plasties, young and old.
  • the wound is made.
  • the cells are treated with the active principle according to the invention at 0.25% and 1.00% (V/V) for 72 hours. They are then incubated in an atmosphere containing 5% CO2 at 37°C.
  • the immunocytological labeling of ⁇ -SMA is carried out by fixing and permeabilization using a primary antibody and a secondary antibody coupled to a fluorophore.
  • Visualization is carried out using a microscope coupled to a camera and to an image analysis system.
  • the intensity of the labeling of a-SMA is proportional to the intensity of staining (fluorescence) present in the cytoplasm of the fibroblasts. The greater the fluorescence, the higher the rate of a-SMA synthesis.
  • a-SMA a characteristic marker of myofibroblasts
  • the active principle according to the invention significantly stimulates the synthesis of ⁇ -SMA by 40%.
  • the active principle according to the invention thus allows the transformation of fibroblasts into myofibroblasts, key players in dermal regeneration.
  • Test 4 Effect of the active principle according to the invention on the migration of keratinocytes.
  • the objective of this study is to evaluate the impact of the aged fibroblast regenerating complex treated with the active ingredient according to the invention on the migration of aged human keratinocytes.
  • the wound is performed.
  • the cells are treated with secretomes from young (SFJ) or old (SFA) fibroblasts in the presence or absence of the active principle according to the invention at 0.25% and 1.00% (V/V).
  • the cells are then incubated in an atmosphere containing 5% CO 2 at 37°C.
  • the cell migration rate within the wound is calculated using an image analysis script developed in-house. The results are expressed in pm 2 /min.
  • the migration of aged human keratinocytes is significantly reduced by 45% compared with young human keratinocytes.
  • the secretome obtained from aged human fibroblasts pretreated with 1.0% of the active principle according to the invention significantly restores the rate of cell migration by 99%. Whereas in the presence of example 2 outside the invention, the cell migration rate is only restored by 39%.
  • the active principle according to the invention thus accelerates keratinocyte migration, a key step in skin regeneration.
  • Test 5 Effect of the active principle according to the invention on the immune system and the polarization of macrophages.
  • the objective of this study is to evaluate the impact of the aged fibroblastic regenerating complex treated with the active principle according to the invention on the polarization of the proregenerating macrophages.
  • the immune system is involved in the defenses against pathogens but also participates in tissue homeostasis.
  • the regeneration phase is notably guided by a population of pro-regenerating macrophages with anti-inflammatory action and capable, among other things, of stimulating matrix remodeling.
  • the activity of these macrophages decreases, with in particular a less strong reactivity to external stimuli resulting in poorer differentiation and a reduction in the expression of certain surface receptors necessary for their functionality.
  • Human monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and are seeded in a differentiation medium for macrophages before being incubated at 37°C in an atmosphere containing 5% CO2.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the macrophages are then treated with secretomes from young (SFJ) or old (SFA) fibroblasts in the presence or absence of the active principle according to the invention at 0.25% and 1.00% (V/V).
  • the cells are then incubated in an atmosphere containing 5% CO2 at 37°C.
  • the macrophages are recovered and labeled with conjugated antibodies specific for CD163 and HLA-DR.
  • the cells are then fixed in a 1% paraformaldehyde solution before being analyzed on a flow cytometer fitted with analysis software.
  • the rate of synthesis of CD163 and HLA-DR is evaluated via the median fluorescence associated with each of these markers and is expressed in arbitrary units (AU).
  • the supernatants are sampled and stored at ⁇ 80° C. until analysis by ELISA assay for TNF ⁇ .
  • the secretome of young or old fibroblasts treated or not with the active principle according to the invention does not modify the rate of synthesis of HLA-DR and does not induce synthesis of TNF ⁇ .
  • the secretome from human fibroblasts promotes the generation of proregenerating macrophages without inducing pro-inflammatory macrophages.
  • the level of synthesis of CD163, a specific receptor participating in the functionality of pro-regenerating macrophages, is reduced by 23% in the presence of secretome obtained from aged human fibroblasts compared to the secretome obtained from young human fibroblasts.
  • the secretome from aged human fibroblasts pretreated with 0.25% of the active principle according to the invention restores the surface expression of CD163 by 132%.
  • the active principle according to the invention thus reinforces the functionality of the proregenerating macrophages, essential elements of skin regeneration.
  • Test 6 Effect of the active ingredient according to the invention on the vascular system and the migration of endothelial cells.
  • the objective of this study is to evaluate the effect of the active ingredient according to the invention on the migration of aged human endothelial cells.
  • endothelial cells making up the skin micro-vessels are normally quiescent in the capillaries. Nevertheless, in response to a stimulus from the microenvironment (hypoxia, injury), endothelial cells are activated, migrate and are able to remodel the vascular network in order to meet the needs of the injured tissue. With age, senescent endothelial cells are dysfunctional leading to defects in vascular remodeling as well as a decrease in the number of capillaries in the skin.
  • the young and old endothelial cells (HUVEC: Human umbilical vein endothelial cells) are seeded and incubated at 37° C. in an atmosphere containing 5% CO2.
  • the wound zone is created.
  • the cells are treated with secretomes from young (SFJ) or old (SFA) fibroblasts in the presence or absence of the active principle according to the invention at 0.25% and 1.00% (V/V).
  • the cells are then incubated in an atmosphere containing 5% CO 2 at 37°C.
  • the visualization of the migration of the endothelial cells is carried out in “time-lapse” thanks to an entirely automated system which makes it possible to follow the migration of the cells during the culture.
  • the cell migration rate within the wound is calculated using an image analysis script developed in-house. The results are expressed in pm 2 /min.
  • the migration of aged human endothelial cells is significantly reduced by 47% compared with young endothelial cells.
  • the secretome obtained from aged human fibroblasts pretreated with 1.0% of the active principle according to the invention significantly restores the rate of migration of the endothelial cells by 93%.
  • the active principle according to the invention thus accelerates the migration of aged endothelial cells, which is essential for the regeneration of the (injured) vascular network.
  • Test 7 Effect of the active principle according to the invention on the vascular system and the cohesion of the endothelial cells.
  • the objective of this study is to evaluate the effect of the active ingredient according to the invention, within the regenerating fibroblastic complex, on the synthesis of ZO-1 (Zonula Occludens -1), protein of junctions between the endothelial cells.
  • vascular integrity is ensured by the establishment of adherent and tight junctions between the endothelial cells. These junctions allow selective vessel permeability.
  • ZO-1 is a constituent component of endothelial tight junctions. With age, endothelial cells are dysfunctional and show a decrease in the expression and membrane addressing of tight junction components inducing increased permeability.
  • the young and old human endothelial cells (HUVEC: Human umbilical vein endothelial cells) are seeded and incubated at 37° C. in an atmosphere containing 5% CO2.
  • the cells are treated with secretomes from young (SFJ) or old (SFA) fibroblasts in the presence or absence of the active principle according to the invention at 0.25% and 1.00% (V/V). They are then incubated in an atmosphere containing 5% CO2 at 37°C.
  • the immunocytological labeling of ZO-1 is carried out by fixation and permeabilization using primary antibody and secondary antibody coupled to a fluorophore.
  • Visualization is carried out using a microscope coupled to an image analysis system.
  • the fluorescence surface corresponding to the ZO-1 labeling, is proportional to the establishment of tight junctions between the endothelial cells.
  • a quantitative analysis of the images was carried out thanks to an image analysis script developed internally in Python language. The results are expressed in arbitrary units (AU).
  • ZO-1 a constituent protein of intercellular junctions
  • the active principle according to the invention thus makes it possible to reinforce cell cohesion.
  • Test 8 Effect of the active principle according to the invention on the vascular system and the formation of the vascular network.
  • the objective of this study is to evaluate the effect of the active ingredient according to the invention on the formation of a capillary network of aged endothelial cells.
  • angiogenesis The remodeling of the cutaneous vascular network in adults in response to a stimulus (hypoxia, injury) takes place via an angiogenesis mechanism. This process is defined as the formation of vessels from pre-existing vessels. It is the result of specification, migration and proliferation of endothelial cells. Physiological angiogenesis allows the skin to heal properly. With age, the formation of capillaries by angiogenesis is altered and prevents proper healing and tissue homeostasis.
  • the cells are treated with the 1.00% (V/V) extracts then incubated at 37° C. in an atmosphere containing 5% CO2.
  • the young and old human endothelial cells (HUVEC: Human Umbilical Vein Endothelial Cells) are seeded on the mats of young or old fibroblasts and incubated at 37° C. in an atmosphere containing 5% CO2.
  • the cells are then treated with a 1.00% (V/V) extract and incubated at 37° C. in an atmosphere containing 5% CO2.
  • the immunocytological labeling of CD31 is carried out by fixation and permeabilization using primary antibody and secondary antibody coupled to a fluorophore.
  • Visualization is carried out using a microscope coupled to a camera and to an image analysis system.
  • the fluorescence surface corresponding to the CD31 labeling is proportional to the extent of the vascular network formed by the endothelial cells.
  • the active principle according to the invention makes it possible to significantly restore the formation of a capillary network by 101%. While example 3 outside the invention has a lower efficiency.
  • the active principle according to the invention thus promotes angiogenesis.
  • Test 9 Student's of the biological activity of the active ingredient according to the invention in vivo.
  • the objective of this study is to evaluate in vivo the biological activity of the active principle according to the invention formulated at 2.5% in emulsion, in comparison with a placebo formula, on Caucasian and Asian volunteers.
  • the Caucasian panel is composed of 19 healthy female volunteers, aged 70 to 78, with crow's feet wrinkles and a dull complexion.
  • the Asian panel consisted of 33 people aged 60 to 69 and the placebo group of 32 people aged 60 to 68.
  • the effect of the active principle according to the invention was evaluated at the level of the forearms on the Caucasian panel by studying its ability to accelerate cell renewal after 14 days of twice-daily application.
  • DHA dihydroxyacetone
  • a gel containing 8% DHA is applied to the surface of the skin of the volunteers. Monitoring of the color obtained after application of the DHA gel starts 72 hours after coloring on untreated areas, treated twice daily with a placebo formula or treated twice daily with a formula containing 5% of the active ingredient according to the invention. The evaluation is carried out using photographs of the skin taken at regular intervals over 14 days, using a dermatoscope.
  • the active principle according to the invention formulated at 2.5% in emulsion, promotes epidermal dynamics by increasing the capacity of the skin to eliminate DHA.
  • the coloring with DHA is eliminated by more than 80%, against 11 days for the zone treated with the placebo.
  • the active principle according to the invention formulated at 2.5% significantly improves the quality of the matrix of Caucasian volunteers by 32% compared with the placebo.
  • the active principle according to the invention formulated at 2.5% significantly improves the quality of the fibers of Asian volunteers by 20% compared to the placebo. This effect was observed in 97% of Asian subjects. This effect is prolonged after 42 days of treatment.
  • the objective of this study is to evaluate in vivo the cosmetic benefits of the active principle according to the invention formulated at 2.5% in emulsion, in comparison with a placebo formula, in Caucasian and Asian volunteers.
  • the effect of the active principle according to the invention was evaluated after 21 and 42 days of twice-daily application.
  • the Caucasian panel is made up of 19 healthy female volunteers, aged 70 to 78, with crow's feet wrinkles and a dull complexion.
  • the Asian panel consists of 33 people aged 60 to 69 and the placebo group of 32 people aged 60 to 68.
  • the active ingredient according to the invention increases by:
  • the active principle according to the invention formulated at 2.5% in emulsion exhibits an anti-wrinkle effect, by significantly reducing the stage of wrinkles on the paws by 10%. 'goose. This effect is observed in 74% of volunteers.
  • the active principle according to the invention formulated at 2.5%, reduces the visibility of the dystrophic vessels in the cheeks (-6%).
  • the active principle according to the invention improves the cutaneous vascularization.
  • the active principle according to the invention formulated at 2.5% in emulsion limits dark circles by reducing the b* parameter by 2.9% from 21 days of application and continues until the end of study.
  • Parameter b* represents the range from blue to yellow during colorimetric measurements; it is characteristic of cutaneous melanic yellow pigmentation. The more this parameter decreases, the more the skin clears up.
  • the active principle according to the invention formulated at 2.5% in emulsion: o gives a brighter and fresher complexion by significantly increasing the radiation of the skin from 9% and the color pink, 15%. Effect observed in 74% and 84% of volunteers respectively. o significantly decreases the olive color by 7% and the state of eye fatigue by 6%. Effect observed in 79% and 89% of volunteers respectively
  • the active principle according to the invention formulated at 2.5% in emulsion exhibits an anti-wrinkle effect in Asian volunteers, by significantly reducing the stage of wrinkles by 6%. crow's feet. This effect is observed in 58% of volunteers. This effect is prolonged after 42 days of treatment.
  • the active principle according to the invention formulated at 2.5% in emulsion, provides cosmetic benefits from 21 days of treatment which continue after 42 days of treatment.
  • the active ingredient according to the invention allows: an improvement in the biomechanical properties of the skin a reduction in wrinkles in Caucasian and Asian volunteers an improvement in the vascularization of the skin, by reducing dystrophic microvessels as well as dark circles a improvement in the radiance of the complexion.

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Abstract

La présente invention concerne un principe actif comprenant des oligo-glucanes, obtenu à partir de la fraction cytosolique d'une levure de l'espèce Saccharomyces cerevisiae, une composition cosmétique le comprenant et ses utilisations cosmétiques, en particulier pour améliorer la régénération de la peau et lutter contre son vieillissement.

Description

PRINCIPE ACTIF COMPRENANT DES OLIGO-GLUCANES ISSUS
DE LA FRACTION CYTOSOLIQUE DE SACCHAROMYCES
CEREVISIAE ET SES UTILISATIONS COSMETIQUES
[0001] Domaine technique
[0002] L'invention concerne un principe actif comprenant des oligo-glucanes, obtenu à partir de la fraction cytosolique d'une levure de l'espèce Saccharomyces cerevisiae, une composition cosmétique le comprenant et ses utilisations cosmétiques, en particulier pour améliorer la régénération de la peau et lutter contre le vieillissement cutané.
[0003] Etat de l'art
[0004] Le processus de régénération, par exemple cutané, est un processus dynamique et complexe mettant en œuvre de nombreux acteurs cellulaires, au cours duquel un nouveau tissu se développe pour restaurer des zones préalablement endommagées et ainsi assurer sa cicatrisation.
[0005] Au niveau du tissu cutané, trois systèmes sont impliqués dans le processus de régénération tissulaire, le système cutané, vasculaire et immunitaire.
[0006] Le tissu cutané est aujourd'hui reconnu comme un organe complexe comprenant notamment des fibroblastes qui jouent le rôle pivot entre ces trois systèmes pour agir sur le renouvellement épidermique, le remodelage matriciel, mais également sur la vascularisation, permettant ainsi la régénération du tissu endommagé.
[0007] Au niveau du système cutané, le renouvellement de l'épiderme est sous la dépendance des kératinocytes qui arrêtent d'adhérer à la membrane basale pour migrer, proliférer et se différencier en cornéocytes fonctionnels. Dans le derme, le remodelage matriciel est réalisé par les fibroblastes, après qu'ils aient migré et se soient différenciés en myofibroblastes.
[0008] Le système vasculaire permet entre autres le transport des nutriments, des médiateurs et des cellules, indispensables à la régénération cutanée. Pour ce faire, les cellules endothéliales migrent pour se regrouper de manière cohésive, afin de former un réseau vasculaire organisé et régulier.
[0009] Enfin, au niveau du système immunitaire, il existe une population de macrophages dite pro-régénérante capable d'interagir avec les fibroblastes permettant de stimuler le remodelage matriciel et de favoriser la vascularisation. [0010] Au cours du processus de régénération, les fibroblastes sécrètent des facteurs de croissance qui vont agir sur ces systèmes en activant les voies de prolifération, de migration et de différenciation cellulaire. Ces facteurs agissent de manière paracrine sur le métabolisme des fibroblastes environnants mais également sur le métabolisme des autres types cellulaires présents dans le tissu cutané.
[0011] Cependant, au cours du vieillissement, le métabolisme cellulaire ralentit. La capacité des fibroblastes à sécréter des facteurs de croissance pour interagir avec leur environnement diminue. Le processus endogène de régénération ralentit alors et les dommages successifs que notre peau subit ne sont plus correctement réparés. La qualité du renouvellement épidermique diminue, la matrice dermique s'affaisse et le réseau vasculaire se désorganise.
[0012] Les premiers signes du vieillissement cutané apparaissent alors. Le teint devient terne, perd en uniformité, la peau est plus sujette aux rougeurs et les rides s'accentuent. Or, l'éclat du teint mais encore les rides traduisent la santé de la peau. Un teint terne donne un air fatigué et peut accentuer les signes de l'âge, ce qui peut avoir un impact important sur l'estime de soi et l'image que l'on renvoie.
[0013] De nombreux produits cosmétiques visent à lutter contre les signes du vieillissement cutané, par exemple pour lutter contre les rides, améliorer l'hydratation de la peau, ou améliorer l'éclat du teint. Or, ces ingrédients cosmétiques agissent sur l'un des systèmes et ne visent pas une action globale sur l'ensemble du processus de régénération.
[0014] L'apport exogène de facteurs de croissance dans le cadre de la régénération tissulaire a certes démontré son efficacité. Cependant, cette solution repose sur des techniques de médecine régénérative qui sont jugées très invasives. Elle ne peut donc pas s'inscrire dans une routine de beauté.
[0015] Une autre technique de rajeunissement appelée PRP (platelet-rich plasma), consiste en une injection intradermique d'un concentré autologue de facteurs de croissance présents dans les PRP, préalablement obtenu à partir d'un prélèvement sanguin du patient. Là encore, cette technique est controversée de par son caractère invasif et son efficacité qui est limitée par la concentration initiale du patient en PRP.
[0016] Faciliter les processus de régénération de la peau tout en minimisant l'impact pour le patient reste un enjeu majeur pour les industries du secteur dermatologique et cosmétique.
[0017] L'inventeur a ainsi étudié le métabolisme des fibroblastes âgés, mais également le métabolisme des kératinocytes, des cellules endothéliales et des macrophages en présence du sécrétome de fibroblastes âgés et a observé :
- un ralentissement de la migration des fibroblastes et de leur différenciation en myofibroblastes, conduisant à une réduction de la synthèse du réseau de collagène I ;
- une diminution de la migration kératinocytaire, étape clé du renouvellement de l'épiderme ;
- une diminution de la population immunitaire pro-régénérante, impliquée dans le remodelage matriciel ;
- une réduction du métabolisme des cellules endothéliales, entraînant un défaut de formation du réseau vasculaire.
[0018] Le métabolisme du système cutané, immunitaire et vasculaire est donc réduit ne permettant pas une régénération optimale.
[0019] A cet effet, il a été identifié par l'inventeur un actif spécifique obtenu à partir d'une fraction cytosolique de la levure de Saccharomyces cerevisiae permettant d'agir sur l'ensemble du processus de la régénération cutanée.
[0020] Certes, on connaît déjà des principes actifs cosmétiques obtenus à partir de Saccharomyces cerevisiae. On peut notamment citer une solution anti-âge contenant un lysat de culture de S. cerevisiae permettant de stimuler la biosynthèse des cellules de la peau (US5019391).
[0021] D'autres solutions cosmétiques anti-âge et hydratante reposent sur des hydrolysats de levure, notamment des hydrolysats de levure de S. cerevisiae. On peut ainsi citer une composition cosmétique comprenant des mannoprotéines issues de la paroi des cellules des levures telles que Saccharomyces décrite dans EP2567688. Ledit extrait est obtenu à partir d'une hydrolyse chimique, enzymatique ou physicochimique de la paroi des levures.
[0022] La demande WO 2009/101503 divulgue également l'utilisation d'hydrolysat de levure de S. cerevisiae constitué de protéines issues de la paroi des levures hydrolysées dont le poids moléculaire est compris entre 1 et 5 kDa.
[0023] Ainsi, les solutions déjà connues visent particulièrement un hydrolysat de S. cerevisiae et plus particulièrement un hydrolysat obtenu à partir de la paroi de la levure de S. cerevisiae. Cet hydrolysat est riche en protéines, connues pour lutter contre le vieillissement cutané.
[0024] Il existe donc un besoin pour une solution alternative cosmétique non-invasive, naturelle et permettant également d'agir sur le système cutané, vasculaire et immunitaire simultanément afin de stimuler les capacités endogènes de la peau pour améliorer ses capacités de régénération.
[0025] Résumé de l'invention
[0026] C'est l'objectif de la présente invention qui, à cet effet, propose un nouveau principe actif obtenu à partir de la fraction cytosolique de la levure de Saccharomyces cerevisiae.
[0027] Une levure est un micro-organisme eucaryote, composée d'une paroi cellulaire entourant la membrane plasmique. Cette paroi est constituée d'une couche externe de mannoprotéines associées à des glucanes et une couche interne de glucanes associés à des chitines. La membrane cytoplasmique est quant à elle composée principalement de phospholipides et de complexes protéiques. Le contenu de la cellule dont le noyau et les organites cytoplasmiques, est compris dans une phase liquide appelée cytosol.
[0028] La levure de Saccharomyces cerevisiae est un eucaryote unicellulaire bien connue de l'homme de l'art, qui se présente sous forme de cellules isolées, ovoïdes à arrondies. Elle est utilisée depuis l'antiquité pour la fabrication de boissons fermentées. Toutefois, elle a été isolée et identifiée qu'au milieu du XIXe siècle pour remplacer le levain traditionnel des boulangers à travers son utilisation dans un procédé de fermentation plus fiable et plus rapide que le levain.
[0029] Des utilisations comme médicament pour certaines maladies gastro-intestinales ont également été rapportées, mais également comme actif cosmétique, comme cité précédemment.
[0030] Or, l'inventeur a découvert de façon surprenante les effets associés à un extrait obtenu spécifiquement à partir de la fraction cytosolique d'une levure de Saccharomyces cerevisiae. Ledit extrait comprenant des oligo-glucanes de masse molaire compris entre 2 et 5 kDa.
[0031] Ainsi, l'invention concerne un principe actif comprenant au moins un extrait de Saccharomyces cerevisiae, ledit extrait correspondant à la fraction cytosolique comprenant des oligo-glucanes de masse molaire compris entre 2 et 5 kDa.
[0032] Préférentiellement, ledit extrait est constitué de la fraction cytosolique d'une levure de Saccharomyces cerevisiae. Plus préférentiellement, l'extrait est une fraction cytosolique obtenu par un lysat mécanique de Saccharomyces cerevisiae.
[0033] L'invention se rapporte également à un procédé de préparation du principe actif selon l'invention, comprenant notamment une solubilisation de Saccharomyces cerevisiae dans l'eau par une homogénéisation mécanique, c'est-à-dire un lysat mécanique permettant de casser les membranes des levures pour extraire la fraction cytosolique, une séparation des phases soluble et insoluble, une ultrafiltration suivie de la récupération du filtrat et un tri moléculaire par chromatographie ionique ou filtration membranaire.
[0034] Le principe actif selon l'invention est d'origine naturelle et présente avantageusement une amélioration de la régénération cutanée. Pour y parvenir, le principe actif selon l'invention favorise l'interconnectivité du système cutané, vasculaire et immunitaire. Il agit sur ces trois systèmes ce qui permet de lutter contre le vieillissement cutané en apportant une solution globale. Ainsi, le principe actif permet de réduire les cernes, les rides et améliorer l'éclat du teint. Il répond ainsi aux problématiques de l'art antérieur.
[0035] Le principe actif selon l'invention peut être utilisé pour des applications cosmétiques, préférentiellement lorsqu'il est intégré dans une composition cosmétique, préférentiellement une composition sous une forme adaptée à une application topique.
[0036] L'invention se rapporte donc également à une utilisation cosmétique d'une composition comprenant au moins 0,1% en poids du principe actif selon l'invention, en particulier pour améliorer la régénération cutanée. Préférentiellement, l'invention améliore l'interconnectivité des systèmes cutanés, vasculaires et immunitaires.
[0037] D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l'invention et des exemples qui vont suivre.
[0038] Brève description des Figures
[0039] [Fig. 1] représente l'effet du principe actif selon l'invention sur la capacité de régénération cutanée, après 14 jours d'application biquotidienne.
[0040] [Fig. 2] représente l'effet du principe actif selon l'invention sur les propriétés biomécaniques de la peau après 21 et 42 jours de traitement biquotidien.
[0041] Description détaillée de l'invention
[0042] Définition
[0043] Par « principe actif cosmétique » au sens de l'invention, on entend un extrait comprenant au moins une molécule, préférentiellement un ensemble de molécules présentant un effet cosmétique sur la peau. Préférentiellement, l'effet cosmétique sur la peau est un effet anti-âge, en particulier un effet régénérant de la peau.
[0044] Par « effet régénérant », on entend au sens de l'invention, la capacité du vivant à se réparer et en particulier la faculté de la peau à se reconstituer en réponse à une agression (brûlure, griffure, coupure) ou à la dégradation naturelle. Il s'agit notamment d'un effet global qui agit sur le système cutané, vasculaire et immunitaire en améliorant l'inter-connectivité desdits systèmes.
[0045] Par « inter-connectivité » au sens de l'invention, on entend les échanges entre les différents systèmes (cutané, vasculaire et immunitaire) à l'intérieur du tissu cutané. Dans le cadre de l'invention, le fibroblaste joue un rôle pivot dans la régénération en interconnectant les trois systèmes via la sécrétion d'un pool de facteurs de croissance.
[0046] Par « système », on entend un ensemble d'éléments interdépendants le constituant. Dans le contexte de l'invention, on peut citer le système cutané, vasculaire mais également immunitaire. Le système vasculaire est constitué d'artérioles, de capillaires et de veinules. Le système cutané est la surface en contact avec l'environnement extérieur et comprend l'épiderme, le derme, l'hypoderme. Le système immunitaire est quant à lui constitué de plusieurs types de cellules immunitaires : notamment des cellules dendritiques, des lymphocytes T, des macrophages et des mastocytes.
[0047] Par « lysat mécanique » au sens de l'invention, on entend le produit résultant de la lyse mécanique c'est-à-dire la destruction de la membrane d'une cellule biologique par un agent physique tel qu'un moyen mécanique par opposition à un agent chimique ou biologique tel que la température ou une enzyme ou encore l'autolyse naturelle de la cellule.
[0048] Par « lysat mécanique de Saccharomyces cerevisiae » au sens de l'invention, on entend tout principe actif issu de la levure Saccharomyces cerevisiae, obtenu par un procédé comprenant au moins une étape de solubilisation de Saccharomyces cerevisiae consistant en une homogénéisation mécanique. La lyse mécanique c'est-à-dire la destruction de la membrane d'une cellule biologique est réalisée par une technique physique tel qu'un moyen mécanique par opposition à un agent chimique ou biologique tel qu'une enzyme, la température ou encore l'autolyse naturelle de la cellule. Le terme « lysat mécanique » excluent les molécules produites uniquement par fermentation de Saccharomyces cerevisiae mais également issue d'une hydrolyse enzymatique ou chimique.
[0049] Par « oligo-glucane » au sens de l'invention, on entend une fraction de glucane. Les glucanes et les oligo-glucanes sont des polysaccharides constitués exclusivement de glucose. Ces molécules de glucose peuvent être linéaires ou ramifiées. En particulier, un oligo-glucane est un oligomère de glucose de petite taille c'est à dire inférieure ou égale à 5 kDa.
[0050] Principe actif selon l'invention
[0051] La présente invention a donc pour objet un principe actif cosmétique comprenant au moins un extrait de levure de l'espèce Saccharomyces cerevisiae, particulièrement utile pour améliorer la régénération de la peau.
[0052] Le principe actif selon l'invention comprend au moins un extrait de Saccharomyces cerevisiae, ledit extrait correspondant à la fraction cytosolique comprenant des oligo-glucanes de masse molaire compris entre 2 et 5 kDa.
[0053] Ainsi, ledit extrait exclu tout autre partie ou élément de la levure telle que la paroi ou les membranes de la levure. Préférentiellement, ledit extrait est constitué de la fraction cytosolique de la levure de Saccharomyces cerevisiae. Avantageusement, l'extrait est un lysat mécanique de Saccharomyces cerevisiae.
[0054] Selon un objet particulièrement préféré, ledit extrait est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant les étapes suivantes : a. solubilisation d'au moins 50 g/L de Saccharomyces cerevisiae dans l'eau, par homogénéisation mécanique, b. séparation des phases soluble et insoluble, c. ultrafiltration et récupération du filtrat, et d. tri moléculaire, en particulier par filtration membranaire.
[0055] Préférentiellement, l'extrait est obtenu à partir de la phase soluble.
[0056] L'extrait constituant le principe actif cosmétique selon l'invention a été caractérisé par l'inventeur. Celui-ci comprend des oligo-glucanes qui représentent préférentiellement entre 10% et 35% en poids de matières sèches de l'extrait.
[0057] Préférentiellement, l'extrait selon l'invention étant constitué de la fraction cytosolique de la levure, celui-ci ne comprend pas de membranes et par conséquent ledit extrait comprend peu de mannose. De façon encore plus préférentielle l'extrait selon l'invention comprend un ratio glucose/mannose supérieur à 60%.
[0058] De façon préféré, l'extrait selon l'invention comprend également une fraction protéique. La répartition et la quantité de la fraction protéique peut être déterminée par le dosage de l'azote total selon la méthode de KJELDHAL (référence : Official method of analysis of the A.O.C., 12th ed. W Horwitz, E.D., New-York, 15-60, 1975). Préférentiellement, l'extrait comprend entre 45 et 55% de peptides en poids de matières sèches de l'extrait selon la méthode de KJELDHAL, dont 96% sont des peptides ayant une masse moléculaire inférieure à 2 000 Da.
[0059] L'inventeur a également déterminé la teneur en cendres. La teneur en cendres peut être déterminée par la pesée des résidus issus de l'incinération des échantillons du principe actif selon l'invention à 550°C dans un four à moufle électrique. Préférentiellement, le principe actif selon l'invention présente une teneur en cendres comprise entre 10% et 22% en poids de matières sèches du principe actif.
[0060] En outre, l'extrait selon l'invention comprend également entre 0 et 31% en poids de matière sèche d'autres métabolites cellulaires présents dans le cytosol tels que des acides organiques, de l'ADN etc.
[0061] Le principe actif cosmétique selon l'invention peut se présenter sous forme liquide, sous forme solide ou sous forme de film.
[0062] Lorsque le principe actif selon l'invention se présente sous forme liquide, il est exclusivement constitué par l'extrait de la fraction cytosolique de la levure de Saccharomyces cerevisiae, éventuellement accompagné de stabilisant et/ou système de conservation.
[0063] L'extrait sous forme liquide se présente préférentiellement sous forme d'une solution aqueuse liquide limpide, avec une odeur caractéristique et une couleur jaune clair. Il peut toutefois être plus coloré et/ou être décoloré par tout procédé connu de l'homme du métier. [0064] La teneur en matières sèches peut être déterminée par la pesée des résidus issus du séchage de l'extrait selon l'invention à 105°C dans une étuve jusqu'à l'obtention d'un poids constant. Préférentiellement, l'extrait selon l'invention sous forme liquide a une teneur en matières sèches de : 10 g/L à 50 g/L, encore plus préférentiellement de 15 g/L à 35g/L.
[0065] Le principe actif selon l'invention peut aussi être présenté sous forme d'un film. Dans ce cas, l'extrait de la fraction cytosolique de Saccharomyces cerevisiae représente préférentiellement au moins 0,1% en poids du film.
[0066] Lorsqu'il se présente sous forme de film, le principe actif comprend : a. au moins le lysat de la fraction cytosolique de Saccharomyces cerevisiae selon l'invention, et b. au moins une charge minérale, et/ou c. au moins un polymère d'origine naturelle, et/ou d. au moins un plastifiant, et/ou e. au moins un tensio-actif.
[0067] Le polymère d'origine naturelle peut être choisi parmi : Pectine, Gomme tamarin, Alginate, Pullulane, Psyllium, Xanthane, Guar, Tara, Caroube, Agar, Gomme arabique, Gellane, Dextran, Carraghénane, Cellulose, Konjac et le Chitosan. [0068] Le plastifiant peut être choisi parmi : Glycérol, Sorbitol, Saccharose, Erythritol, Urée, Propylène glycol et le Butylene glycol.
[0069] La charge minérale peut être choisie parmi : Carbonate de calcium, argile verte, kaolin, perlite, talc, silicate de magnésium, mica, sericite diatomée, silice, sulfate de calcium chlorure de calcium, chlorure de potassium, oxyde de fer et l'oxyde de zinc. Le principe actif peut comprendre en outre un pigment pour colorer le film.
[0070] Lorsque le principe actif selon l'invention se présente sous forme solide il est préférentiellement constitué par l'extrait de la fraction cytosolique de la levure de Saccharomyces cerevisiae tel que précédemment décrit et par un support choisi parmi la maltodextrine, la gomme arabique, la lécithine de soja ou l'isomalt. Selon un mode de réalisation, particulièrement adapté, l'extrait représente au moins 10% en poids du principe actif et le support au plus 90% en poids du principe actif.
[0071] Dans le cas d'une forme solide dans laquelle le principe actif est associé à un support, les teneurs en sucres, en fraction protéique et en cendres dans le principe actif sont modifiées, le support étant généralement constitué majoritairement de sucres.
[0072] Procédé d'extraction
[0073] L'extrait constituant ou contenu dans le principe actif selon l'invention peut être obtenu par tout procédé comprenant au moins une étape d'extraction de la fraction cytosolique de la levure de Saccharomyces cerevisiae, en particulier une étape de lyse mécanique.
[0074] Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, le principe actif selon l'invention est obtenu par la mise en œuvre des étapes suivantes : a. solubilisation d'au moins 50 g/L de Saccharomyces cerevisiae dans l'eau, par homogénéisation mécanique, b. séparation des phases soluble et insoluble, c. ultrafiltration et récupération du filtrat, et d. tri moléculaire, en particulier par filtration membranaire.
[0075] L'homogénéisation mécanique est réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier, par exemple par broyage mécanique à l'aide d'un homogénéiseur.
[0076] La séparation des phases soluble et insoluble est réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier, par exemple par centrifugation, filtration ou décantation. Préférentiellement la séparation des phases soluble et insoluble est réalisée par centrifugation, permettant ainsi la récupération de la phase soluble contenant entre autres les fractions sucres et protéiques solubles.
[0077] Le procédé comprend une étape d'ultrafiltration après la récupération de la phase soluble pour réaliser un tri moléculaire, par exemple par chromatographie ionique ou filtration membranaire. Ainsi, cette étape d'ultrafiltration permet la purification de la phase soluble récupérée. Elle est réalisée afin d'éliminer les molécules de haut poids moléculaire (les enzymes et les polymères, les éléments de la paroi, les membranes...), c'est-à-dire les molécules de poids moléculaire supérieur à lOkDa.
[0078] Le lysat obtenu à ce stade peut éventuellement être encore concentré et/ou purifié, préférentiellement par des étapes d'ultrafiltrations successives à travers des filtres de seuils de coupure différentes, en conservant les filtrats à chaque étape et/ou par une méthode de type chromatographique.
[0079] Le produit obtenu après lyse et ultrafiltration, avant ou après concentration et filtration stérilisante, est un lysat de la fraction cytosolique de Saccharomyces cerevisiae, et constitue la première forme du principe actif selon l'invention, se présentant alors sous forme liquide.
[0080] Le lysat obtenu peut ensuite être séché et associé à un support, pour se présenter sous forme solide. Cette phase peut être réalisée par la mise en œuvre des étapes suivantes : a. un support d'atomisation, de préférence la maltodextrine, est ajouté dans le produit sous forme liquide, d'au plus 90% (en masse/volume), b. cette solution est ensuite concentrée sous vide ; c. une élimination des bactéries éventuellement présentes est réalisée par traitement thermique ou filtration ; d. l'atomisation permet d'obtenir une poudre.
[0081] Les étapes des procédés décrits ci-avant, prises individuellement sont usuelles dans le domaine des extractions d'actifs à partir de matières premières naturelles et l'homme du métier est à même d'en ajuster les paramètres sur la base de ses connaissances générales.
[0082] Composition
[0083] Le principe actif selon l'invention peut être intégré dans une composition cosmétique, notamment une composition comprenant au moins 0,1% en poids dudit principe actif.
[0084] Ladite composition cosmétique selon l'invention comprend préférentiellement un milieu physiologiquement acceptable, préférentiellement un milieu cosmétiquement acceptable, c'est-à-dire qui ne provoque pas de sensations d'inconfort pour l'utilisateur telles que des rougeurs, tiraillements ou picotements. [0085] La composition peut se présenter sous différentes formes galéniques, adaptées à une application par voie topique sur la peau.
[0086] Ces compositions peuvent se présenter notamment sous forme d'émulsions huile- dans-eau, émulsions eau-dans-huile, émulsions multiples (Eau/Huile/Eau ou Huile/Eau/Huile) qui peuvent être éventuellement des microémulsions ou des nanoémulsions, ou sous forme de solutions, suspensions, hydrodispersions, gels aqueux, poudres, ou fond de teint. Elles peuvent être plus ou moins fluides et avoir l'aspect de crèmes, émulsions, gels, masques ou tous autres aspects des cosmétiques de soin de la peau saine.
[0087] Il peut s'agir de compositions comprenant au moins 0,1% du principe actif liquide selon l'invention, préférentiellement entre 0,5 et 10% ou comprenant au moins 0,01% d'un principe actif poudre selon l'invention.
[0088] Les compositions selon l'invention peuvent contenir comme adjuvant au moins un composé choisi parmi : a. les huiles, qui peuvent être choisies notamment parmi les huiles de silicone, linéaires ou cycliques, volatiles ou non volatiles, b. les cires, telles que l'ozokérite, la cire de polyéthylène, la cire d'abeille ou la cire de carnauba, c. les élastomères de silicone, d. les tensioactifs, de préférence émulsionnants, qu'ils soient non ioniques, anioniques, cationiques ou amphotères, e. les co-tensioactifs, tels que les alcools gras linéaires, f. les épaississants et/ou gélifiants, g. les humectants, tels que les polyols comme la glycérine, h. les colorants, les conservateurs, les charges, i. les tenseurs, j. les séquestrants, k. les parfums, l. et leurs mélanges, sans que cette liste soit limitative.
[0089] Des exemples de tels adjuvants sont cités notamment dans le Dictionnaire CTFA (International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook publié par le Personal Care Product Council).
[0090] Bien entendu, l'homme du métier veillera à choisir les éventuels composés complémentaires, actifs ou non-actifs, et leur quantité, de telle sorte que les propriétés avantageuses du mélange ne soient pas, ou sensiblement pas, altérées par l'adjonction envisagée.
[0091] Ces compositions sont destinées à être utilisées sur des peaux saines, notamment des peaux matures, en particulier pour améliorer la régénération cutanée et obtenir un effet antiâge global, préférentiellement un effet anti-ride et/ou pour améliorer l'éclat du teint et/ou réduire les cernes.
[0092] L'invention a donc également pour objet un procédé cosmétique de traitement de la peau pour améliorer la régénération cutanée, en particulier pour améliorer l'éclat du teint et/ou réduire les cernes et/ou réduire les rides qui consiste en l'application topique sur la peau d'une personne saine d'un tel principe actif selon l'invention ou d'une telle composition selon l'invention.
[0093] Utilisation
[0094] Le principe actif selon l'invention ou la composition selon l'invention présente des caractéristiques qui permettent son utilisation en cosmétique et en particulier pour limiter les effets naturels liés au vieillissement cutané et ainsi améliorer la régénération cutanée et obtenir un effet anti-âge global, préférentiellement réduire les rides et/ou réduire les cernes et/ou améliorer l'éclat du teint.
[0095] Pour y parvenir, le principe actif ou la composition selon l'invention améliore l'interconnectivité des systèmes cutanés, vasculaires et immunitaires. Préférentiellement, le principe actif ou la composition selon l'invention augmente la synthèse et la sécrétion des facteurs de croissance KGF, EGF, IGF, FGF, PDGF, TG F-0 et VEGF.
[0096] Or, au niveau du système cutané, dans l'épiderme : le KGF (kératinocyte growth factor) est connu pour stimuler la migration kératinocytaire, étape indispensable au renouvellement épidermique. De même, l'EGF (epidermal growth factor) favorise la prolifération des cellules épithéliales. Enfin, l'IGF (insulin growth factor) promeut la prolifération, la migration et la différenciation kératinocytaire. Dans le derme, le remodelage matriciel est induit par quatre principaux facteurs de croissance. Ainsi, l'IGF présente un rôle mitogène sur les fibroblastes, le FGF-2 ou bFGF, membre de la famille FGF (fibroblast growth factor) promeut la prolifération et la migration des fibroblastes. Le PDGF (platelet derived growth factor) stimule également la survie des fibroblastes et leur synthèse de collagènes. Enfin, le TGF- (transforming growth factor) stimule la prolifération des fibroblastes et induit leur différenciation en myofibroblastes. [0097] Au niveau du système immunitaire, le TGF-0 libéré par les fibroblastes est capable d'activer les macrophages résidents en macrophages pro-régénérants. Ils secrétent alors de nombreux facteurs de croissance, tels que le TGF-p.
[0098] Au niveau du réseau vasculaire : le VEGF (vascular endothelial growth factor) promeut la formation de nouveaux capillaires par les cellules endothéliales.
[0099] Le principe actif selon l'invention en augmentant la synthèse et la sécrétion de KGF, EGF, IGF, FGF, PDGF, TGF-|3 et VEGF permet ainsi de respectivement stimuler la migration kératinocytaire, la prolifération des cellules épithéliales, la différenciation kératinocytaire, promouvoir la prolifération et la migration des fibroblastes, stimuler la survie des fibroblastes et la synthèse de collagène, stimuler la prolifération des fibroblastes et induire leur différenciation en myofibroblastes et ainsi activer les macrophages résidents en macrophages pro-régénérants.
[0100] Par conséquent, le principe actif selon l'invention agit sur :
• le système cutané : en améliorant significativement la migration des fibroblastes (+97%), leur différenciation en myofibroblastes, acteurs essentiels de la régénération cutanée (a-SMA augmentée de 40%) et en favorisant la synthèse du réseau de collagène 1 (+53%), l'actif stimule le renouvellement matriciel. Cela se traduit in vivo par une amélioration de la structure du derme : la qualité de la matrice est augmentée de 32% et la qualité des fibres est augmentée de 20%, en comparaison au placebo. Dans l'épiderme, l'actif stimule également la migration kératinocytaire (+99%), indispensable à la dynamique épidermique.
• le système immunitaire : en favorisant la population pro-régénérante (+132%), capable d'interagir en retour avec les fibroblastes permet de favoriser le remodelage matriciel.
• le système vasculaire : en restaurant la migration des cellules endothéliales et leur cohésion (+93% et +77% respectivement), l'actif promeut la formation du réseau vasculaire (+55%).
[0101] En restaurant l'ensemble des facteurs de croissance, le principe actif selon l'invention présente ainsi une action anti-âge globale. Par conséquent, les rides et cernes sont significativement réduites, le réseau micro-vasculaire redevient homogène, la peau est plus ferme et l'éclat du teint ravivé. Il est particulièrement adapté aux peaux saines matures.
[0102] L'invention est à présent illustrée par des exemples non limitatifs de compositions selon l'invention et par des résultats d'essais.
[0103] Exemples
[0104] Exemple 1 - Principe actif selon l'invention
[0105] Le principe actif est obtenu par la mise en œuvre des étapes suivantes : a. Solubilisation par homogénéisation mécanique (lyse) des levures Saccharomyces cerevisiae, b. Séparation des phases soluble/insoluble, c. Ultrafiltration, d. Récupération du filtrat, e. Tri moléculaire par filtration membranaire, destinée à sélectionner les molécules, f. Décoloration et Désodorisation, et g. Filtrations et filtration stérilisante.
[0106] L'extrait constituant le principe actif selon l'invention est constitué de la fraction cytosolique des levures de S. cerevisae, les membranes sont éliminées et il ne subsiste quasiment aucun mannose dans ledit extrait (le taux de mannose de la fraction glycosidique est inférieur à 2%).
[0107] Le principe actif obtenu présente les caractéristiques analytiques suivantes :
- un taux de matière sèche : 24,4 g/L,
- une teneur en fraction protéique selon la méthode de Kjeldah 1 : 12,4 g/L (50,8%),
- une teneur en sucres totaux : 4 g/L (16,4%),
- un taux de cendres : 4,3 g/L (17,6%),
- métabolites cellulaires, acides organiques, ADN, etc. (15,20%).
[0108] La fraction glycosidique du principe actif obtenu est plus particulièrement constituée de 10% de monosaccharides de masse molaire inférieure à 180 Da et 90% d'oligosaccharides de masse molaire comprise entre 360 Da et 5 000 Da. Plus particulièrement, la fraction glycosidique est composée d'environ 0,5% de glucosamine, 1,7% de galactose, 1,4% de mannose et 96,4% de glucose. Soit un ratio de glucose/mannose de 68,9%.
[0109] Les sucres présents dans le principe actif sont sous forme d'oligo-glucanes, préférentiellement de taille comprise entre 2 et 5 kDa.
[0110] Exemple 2 - Principe actif hors invention
[0111] Le principe actif est obtenu par la mise en œuvre des étapes suivantes : a. Solubilisation de levures Saccharomyces cerevisiae dans un milieu aqueux basique à raison d'au moins 200g/L, b. Hydrolyse enzymatique, c. Séparation des phases solubles et insolubles par centrifugation, décantation ou filtration, d. Filtration stérilisante
[0112] Le principe actif obtenu présente les caractéristiques analytiques suivantes :
- un taux de matière sèche : 54,6 g/L,
- une teneur en protéine selon la méthode de Lowry : 23,2 g/L (42%),
- une teneur en sucres totaux : 18,3 g/L (34%),
[0113] Le principe actif selon l'exemple 2 est constitué de 34% de sucres dont 5% de disaccharide et 95% de saccharides de tailles supérieures à 1440Da. Et un ratio glucose/mannose de 14,0%.
[0114] Exemple 3 - Principe actif hors invention
[0115] Le principe actif est obtenu par la mise en oeuvre des étapes suivantes : a. Solubilisation de levures Saccharomyces cerevisiae dans un milieu aqueux légèrement basique à raison d'au moins 20% avec éventuellement l'ajout d'un alcool afin de favoriser la solubilisation des levures, b. hydrolyse des protéines en milieu basique, c. agitation de 8 à 52h, d. première filtration afin de séparer les phases soluble et insoluble, e. lavage contre eau afin de purifier la fraction active, f. concentrations et filtrations successives, et g. filtration stérilisante.
[0116] Le principe actif obtenu présente les caractéristiques analytiques suivantes :
- un taux de matière sèche : 42,7 g/L,
- une teneur en protéine selon la méthode de Lowry : 10,4 g/L (24%),
- une teneur en sucres totaux : 25,7 g/L (60%),
[0117] Le principe actif selon l'exemple 3 est ainsi majoritairement composé de mannanes.
[0118] Exemple 4 - Principe actif hors invention
[0119] Le principe actif est obtenu par la mise en oeuvre des étapes suivantes : a. Solubilisation par homogénéisation mécanique (lyse) des levures Saccharomyces cerevisiae, b. Séparation des phases soluble/insoluble, c. Récupération de la phase soluble, d. Tri moléculaire par filtration membranaire, destinée à sélectionner les molécules, e. Décoloration et Désodorisation, et f. Filtrations et filtration stérilisante.
[0120] Le principe actif obtenu présente les caractéristiques analytiques suivantes :
- un taux de matière sèche : 22g/L,
- une teneur en fraction protéique selon la méthode Kjeldahl : 12,2g/L (56%),
- une teneur en sucres totaux : 8,lg/L (37%),
- un taux de cendres : 6, 4g/L (17%).
[0121] Exemple 5 - Principe actif hors invention
[0122] Le principe actif est obtenu par la mise en oeuvre des étapes suivantes : a. Solubilisation par homogénéisation mécanique (lyse) des levures Saccharomyces cerevisiae, b. Séparation des phases soluble/insoluble, c. Ultrafiltration, d. Récupération du filtrat, e. Tri moléculaire par filtration membranaire, destinée à sélectionner les molécules, f. Récupération du rétentat, g. Décoloration et Désodorisation, et h. Filtrations et filtration stérilisante.
[0123] Le principe actif obtenu présente les caractéristiques analytiques suivantes :
- un taux de matière sèche : 29,7g/L,
- une teneur en fraction protéique selon la méthode de Kjeldahl : 6,2g/L (21%),
- une teneur en sucres totaux : 29,5g/L (99%),
- un taux de cendres : 7, 9g/L (16%).
[0124] Le principe actif obtenu est composé de molécules de tailles supérieures à 5 kDa.
[0125] Exemple 6 - Principe actif hors invention
[0126] Le principe actif est obtenu par la mise en œuvre des étapes suivantes : a. Solubilisation par homogénéisation mécanique (lyse) des levures Saccharomyces cerevisiae, b. Séparation des phases soluble/insoluble, c. Ultrafiltration, d. Récupération du filtrat, e. Tri moléculaire par filtration membranaire, destinée à sélectionner les molécules, f. Récupération du filtrat, g. Décoloration et Désodorisation, et h. Filtrations et filtration stérilisante
[0127] Le principe actif obtenu présente les caractéristiques analytiques suivantes :
- un taux de matière sèche : 35, 6g/L, - une teneur en fraction protéique selon la méthode de Lowry : 9g/L (25%),
- une teneur en sucres totaux : 9,9g/L (28%),
- un taux de cendres : 4, 7g/L (8%).
[0128] Le principe actif obtenu est composé de molécules de tailles inférieures à 2 KDa.
[0129] Exemple 7 - Composition selon l'invention [0130] Un exemple de formulation comprenant le principe actif selon l'invention sous forme de gel-crème anti-âge caractérisé par une texture fraîche et onctueuse est présenté dans le tableau 1 ci-après.
[0131] [Tableauxl]
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000019_0001
0132] La composition de l'exemple 7 peut notamment être obtenue par le procédé suivant : a. Ajouter A2 dans Al sous agitation et homogénéiser pendant 20 minutes. b. Ajouter B puis C dans A sous forte agitation. Agiter pendant 20 minutes. c. Ajouter D et E sous agitation modérée. [0133] La composition est alors sous forme d'un gel crème épais et brillant, blanc cassé.
[0134] Exemple 8 - Composition selon l'invention
[0135] Un exemple de formulation comprenant le principe actif selon l'invention sous forme de crème de jour réparatrice est présenté dans le tableau 2 ci-après.
[0136] [Tableaux2]
Figure imgf000019_0002
Figure imgf000020_0001
[0137] La composition de l'exemple 8 peut notamment être obtenue par le procédé suivant : a. Ajouter A2 dans Al sous agitation modérée, agiter jusqu'à obtention d'un gel homogène et chauffer à 80°C, b. Placer B sous agitation magnétique et chauffer à 80°C, c. Emulsionner B dans A sous agitation cisaillante pendant 10 minutes, d. A 30°C, sous agitation modérée, ajouter C, et e. Ajuster le pH à 5,0 - 5,5 avec D.
[0138] La composition est alors sous forme d'une crème gélifiée souple et brillante, blanc cassé. [0139] Exemple 9 - Composition selon l'invention
[0140] Un exemple de formulation comprenant le principe actif selon l'invention sous forme de crème hybride, mi-soin, mi-fond de teint est présenté dans le tableau 3 ci-après.
[0141] [Tableaux3]
Figure imgf000020_0002
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[0142] La composition de l'exemple 9 peut notamment être obtenue par le procédé suivant : a. Ajouter A2 dans Al sous agitation, agiter jusqu'à homogénéité et chauffer à 80°C, b. Placer Bl sous agitation et chauffer à 80°C. Ajouter B2 dans B1 juste avant l'émulsion, c. Emulsionner B dans A sous agitation cisaillante pendant 10 minutes, d. A 50°C, sous agitation modérée, ajouter C puis D, E et F, et e. A température ambiante, ajouter G sous agitation très douce.
[0143] La composition est alors sous forme d'une émulsion souple, brillante, gris pâle avec particules grises en suspension.
[0144] Exemple 10 - Composition selon l'invention [0145] Un exemple de formulation comprenant le principe actif selon l'invention sous forme de crème de nuit régénérante est présenté dans le tableau 4 ci-après.
[0146] [Tableaux4]
Figure imgf000021_0002
Figure imgf000022_0001
[0147] La composition de l'exemple 10 peut notamment être obtenue par le procédé suivant : a. Ajouter A2 dans Al sous agitation modérée, agiter jusqu'à obtention d'un gel homogène et chauffer à 80°C, b. Placer B sous agitation magnétique et chauffer à 80°C, c. Emulsionner B dans A sous agitation cisaillante pendant 10 minutes, et d. A 50°C, sous agitation modérée, ajouter C puis D.
[0148] La composition est alors sous forme d'une émulsion souple, brillante, beige pâle. A 1 mois, le pH est égal à 5,4 et la viscosité est égale à (C/5rpm) 57400 cP.
[0149] Evaluation de l'effet cosmétique du principe actif selon l'invention [0150] Essai 1 - Effet du principe actif selon l'invention sur sa capacité à restaurer le complexe régénérant fibroblastique.
[0151] L'objectif de cet essai est d'évaluer l'impact du vieillissement sur l'expression et la synthèse des facteurs de croissance : TGF-(31, KGF, VEGF, FGF2, EGF, IGF1 et PDGFA présents au sein du complexe régénérant fibroblastique.
[0152] Pour cette étude, les paramètres suivants ont été analysés sur des fibroblastes humains issus de plasties visages, jeunes et âgés.
[0153] L'expression de EGF, IGF1 et PDGFA a été évaluée par QPCR et la synthèse de TGF-pl, KGF, VEGF et FGF2 a été évaluée par dosage ELISA.
[0154] Le protocole opératoire de l'étude est décrit en suivant.
[0155] Les fibroblastes humains jeunes et âgés sont ensemencés et incubés à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.
[0156] Puis les cellules sont traitées avec les extraits à 0,25% et 1,00% (V/V). Elles sont ensuite incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.
[0157] Les fibroblastes sont récupérés et les ARN totaux extraits.
[0158] Les ARN ont été reverse-transcrits et les ADN complémentaires obtenus ont été analysés par la technique de PCR quantitative. Les ARNm de témoins internes de référence, ont été analysés en parallèle des ARNm de EGF, IGF1 et PDGFA.
[0159] L'incorporation de fluorescence (SYBR Green) est mesurée en continu à l'aide d'un thermocycleur. L'analyse des Ct (quantification relative) est réalisée à l'aide d'un logiciel.
[0160] Les surnageants sont récupérés et stockés à -80°C en attente des dosages ELISA du TGFpl, KGF, VEGF, FGF2.
[0161] L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet des exemples selon l'invention sur l'expression des facteurs de croissance : EGF, IGF1 et PDGFA du complexe régénérant fibroblastique.
[0162] Les résultats sont donnés dans le tableau 5.
[0163] [Tableaux5]
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
[0164] En comparaison à des fibroblastes jeunes, les fibroblastes âgés présentent une capacité réduite à exprimer : l'EGF de -44% ; l'IGF-1 de -42% ; le PDGFA de -41%.
[0165] Le vieillissement entraîne un appauvrissement significatif des facteurs de croissance du complexe régénérant fibroblastique. [0166] Le principe actif selon l'invention quant à lui, restaure significative l'expression des facteurs de croissance : EGF, IG Fl et PDGFA.
[0167] Cet essai a également été effectué afin d'évaluer l'effet du principe actif selon l'invention sur la synthèse des facteurs de croissance : TGF01, VEGF, KGF et FGF2 du complexe régénérant fibroblastique. [0168] Les résultats sont donnés dans le tableau 6.
[0169] [Tableaux6]
Figure imgf000024_0002
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[0170] En comparaison à des fibroblastes jeunes, les fibroblastes âgés présentent une capacité réduite à synthétiser : le TGF-|31 de -19% ; le VEGF de -36% ; le KGF de -44% ; le FGF2 de -29%. [0171] Le vieillissement entraîne un appauvrissement significatif des facteurs de croissance du complexe régénérant fibroblastique.
[0172] Le principe actif selon l'invention restaure significativement la synthèse des facteurs de croissance tandis que les exemples hors invention ne présentent pas un effet sur l'ensemble des facteurs de croissance étudiés.
[0173] Testé à 1% sur fibroblastes humains âgés, le principe actif selon l'invention restaure significativement l'expression ou la synthèse des facteurs de croissance : EGF de 98%, IGF1 de 75%, PDGFA de 76%, TGFpl de 135%, KGF de 48%, VEGF de 73%, et FGF2 de 49%.
[0174] Le principe actif selon l'invention permet ainsi d'enrichir le complexe régénérant fibroblastique des cellules âgées en facteurs de croissance.
[0175] Essai 2 - Effet du principe actif selon l'invention sur la migration des fibroblastes.
[0176] L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet du principe actif selon l'invention sur la migration des fibroblastes humains âgés.
[0177] En réponse à un stress mécanique, les cellules se déplacent au sein du tissu afin de se localiser au niveau de la zone de pression. A ce niveau, des forces de contraction sont alors générées afin de maintenir l'intégrité de la peau. Avec l'âge, la capacité migratoire des cellules est réduite.
[0178] Cette étude a été réalisée par un test de migration cellulaire en « time-lapse » sur des fibroblastes humains issus de plasties visages, jeunes et âgés.
[0179] L'effet est mesuré en évaluant la capacité des cellules à recoloniser une zone blessée. [0180] Les fibroblastes humains jeunes et âgés sont ensemencés et incubés à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2. [0181] La zone blessée est réalisée après quatre jours. Les cellules sont traitées avec les extraits à 0,25% et/ou 1,00% et/ou 2% (V/V). Elles sont ensuite incubées dans une atmosphère contenant 5% de CO2 à 37°C.
[0182] La visualisation de la migration des fibroblastes est réalisée en « time-lapse » grâce à un système entièrement automatisé qui permet de suivre la migration des cellules lors de la culture.
[0183] La vitesse de migration des cellules au sein de la blessure est calculée grâce à un script d'analyse d'images développé en interne. Les résultats sont exprimés en pm2/min.
[0184] Les résultats sont donnés dans le tableau 7.
[0185] [Tableaux7]
Figure imgf000026_0001
[0186] La vitesse de migration des fibroblastes humains âgés est significativement diminuée de 27% par rapport aux fibroblastes humains jeunes.
[0187] Testé à 1,0% sur fibroblastes humains âgés, le principe actif selon l'invention restaure significativement la vitesse de migration de 97%. Contrairement à l'exemple 2 hors invention qui présente une vitesse de migration lente.
[0188] Le principe actif selon l'invention favorise ainsi une recolonisation plus rapide du derme blessé âgé, étape-clé de la régénération cutanée.
[0189] Essai 3 - Effet du principe actif selon l'invention sur la différenciation en myofibroblastes.
[0190] L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet du principe actif selon l'invention sur la synthèse de l'alpha-Smooth muscle actin (a-SMA), microfilaments d'actine caractéristiques des myofibroblastes, dans une zone blessée.
[0191] Dans les tissus lésés, les fibroblastes sont activés et se différencient en myofibroblastes, qui se contractent et participent à la cicatrisation par la réduction de la taille de la plaie et par la sécrétion de protéines de la matrice extracellulaire. [0192] L'étude a été réalisée par immunocytofluorescence, sur des fibroblastes humains issus de plasties visages, jeunes et âgés.
[0193] Le protocole opératoire de l'étude est décrit en suivant. Les fibroblastes humains jeunes et âgés sont ensemencés et incubés à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2 et cultivés pendant plusieurs jours.
[0194] La blessure est réalisée. Les cellules sont traitées avec le principe actif selon l'invention à 0,25% et 1,00% (V/V) pendant 72h. Elles sont ensuite incubées dans une atmosphère contenant 5% de CO2 à 37°C.
[0195] Le marquage immunocytologique de l'a-SMA est réalisé par fixation et perméabilisation à l'aide d'un anticorps primaire et d'un anticorps secondaire couplé à un fluorophore.
[0196] La visualisation est réalisée à l'aide d'un microscope couplé à une caméra et à un système d'analyse d'images.
[0197] L'intensité du marquage d'a-SMA est proportionnelle à l'intensité de coloration (fluorescence) présente dans le cytoplasme des fibroblastes. Plus la fluorescence est importante, plus le taux de synthèse d'a-SMA est élevé.
[0198] Une analyse quantitative des images a été réalisée grâce à un script d'analyse d'images développé en interne. Les résultats sont exprimés en unités arbitraires (UA).
[0199] Les résultats sont donnés dans le tableau 8.
[0200] [Tableaux8]
Figure imgf000027_0002
Figure imgf000027_0001
[0201] La synthèse d'a-SMA, marqueur caractéristique des myofibroblastes, est significativement réduite de 75% dans un modèle blessé chez les cellules âgées par rapport aux cellules jeunes. [0202] Testé à 1% sur fibroblastes âgés, le principe actif selon l'invention stimule significativement la synthèse d'ot-SMA de 40%.
[0203] Le principe actif selon l'invention permet ainsi la transformation des fibroblastes en myofibroblastes, acteurs-clefs de la régénération dermique.
[0204] Essai 4 - Effet du principe actif selon l'invention sur la migration des kératinocytes.
[0205] L'objectif de cette étude est d'évaluer l'impact du complexe régénérant fibroblastique âgé traité avec le principe actif selon l'invention sur la migration des kératinocytes humains âgés.
[0206] En réponse à un stress mécanique, les cellules se déplacent au sein du tissu afin de se localiser au niveau de la zone de pression. A ce niveau, des forces de contraction sont alors générées afin de maintenir l'intégrité de la peau. Avec l'âge, la capacité migratoire des cellules est réduite.
[0207] Cette étude a été réalisée par un test de migration cellulaire en « time-lapse » sur des kératinocytes humains issus de donneurs jeunes et âgés. L'effet est mesuré en évaluant la capacité des cellules à recoloniser une zone de blessure.
[0208] Les kératinocytes humains jeunes et âgés sont ensemencés et incubés à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.
[0209] La blessure est réalisée. Les cellules sont traitées par les sécrétomes issus des fibroblastes jeunes (SFJ) ou âgés (SFA) en présence ou non du principe actif selon l'invention à 0,25% et 1,00% (V/V). Les cellules sont ensuite incubées dans une atmosphère contenant 5% de CO2 à 37°C.
[0210] La visualisation de la migration des kératinocytes est réalisée en « time-lapse » grâce à un système entièrement automatisé qui permet de suivre la migration des cellules lors de la culture.
[0211] La vitesse de migration des cellules au sein de la blessure est calculée grâce à un script d'analyse d'images développé en interne. Les résultats sont exprimés en pm2/min.
[0212] Les résultats sont donnés dans le tableau 9.
[0213] [Tableaux9]
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[0214] La migration des kératinocytes humains âgés est significativement diminuée de 45% par rapport aux kératinocytes humains jeunes.
[0215] Testé sur kératinocytes humains âgés, le sécrétome issu de fibroblastes humains âgés prétraités avec 1,0% du principe actif selon l'invention restaure significativement la vitesse de migration cellulaire de 99%. Tandis qu'en présence de l'exemple 2 hors invention, la vitesse de migration cellulaire n'est restaurée que de 39%.
[0216] Le principe actif selon l'invention accélère ainsi la migration kératinocytaire, étape-clé de la régénération cutanée.
[0217] Essai 5 - Effet du principe actif selon l'invention sur le système immunitaire et la polarisation des macrophages.
[0218] L'objectif de cette étude est d'évaluer l'impact du complexe régénérant fibroblastique âgé traité avec le principe actif selon l'invention sur la polarisation des macrophages prorégénérants.
[0219] Le système immunitaire est impliqué dans les défenses contre les pathogènes mais participe également à l'homéostasie tissulaire. Lors de la cicatrisation, la phase de régénération est notamment guidée par une population de macrophages pro-régénérants à l'action anti-inflammatoire et capables, entre autres, de stimuler le remodelage matriciel. Avec l'âge, l'activité de ces macrophages décroit, avec notamment une réactivité moins forte aux stimuli extérieurs entraînant une moins bonne différenciation et une diminution d'expression de certains récepteurs de surface nécessaires à leur fonctionnalité.
[0220] Cette étude a été réalisée sur macrophages humains dérivés de monocytes extraits de sang périphérique humain. La polarisation en macrophages pro-régénérants a été évaluée en analysant par cytométrie en flux la synthèse de CD163 marqueur spécifique de cette population et contribuant à la réponse anti-inflammatoire. Afin de s'assurer qu'aucune population de macrophages pro-inflammatoires n'était induite par les traitements, la synthèse de HLA-DR, marqueur préférentiel de cette population, a été analysée par cytométrie en flux et a été complémentée par l'analyse de la synthèse de TNFa par un dosage ELISA.
[0221] Le protocole opératoire de l'étude est décrit en suivant. Les monocytes humains sont isolés de cellules mononuclées du sang périphérique (PBMCs) et sont ensemencés dans un milieu de différenciation pour macrophages avant d'être incubés à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.
[0222] Les macrophages sont ensuite traités par les sécrétomes issus des fibroblastes jeunes (SFJ) ou âgés (SFA) en présence ou non du principe actif selon l'invention à 0,25% et 1,00% (V/V). Les cellules sont ensuite incubées dans une atmosphère contenant 5% de CO2 à 37°C.
[0223] Les macrophages sont récupérés et marqués avec des anticorps conjugués spécifiques de CD163 et HLA-DR. Les cellules sont ensuite fixées dans une solution de paraformaldéhyde à 1% avant d'être analysées sur un cytomètre en flux doté d'un logiciel d'analyse.
[0224] Le taux de synthèse de CD163 et HLA-DR est évalué via la médiane de fluorescence associée à chacun de ces marqueurs et est exprimée en unités arbitraires (UA).
[0225] Parallèlement, les surnageants sont prélevés et stockés à -80°C jusqu'à l'analyse par dosage ELISA du TNFa.
[0226] Les résultats sont donnés dans le tableau 10.
[0227] [TableauxlO]
Figure imgf000030_0001
[0228] Le sécrétome de fibroblastes jeunes ou âgés traités ou non avec le principe actif selon l'invention ne modifie pas le taux de synthèse de HLA-DR et n'induit pas de synthèse de TNFa. [0229] Le sécrétome issu de fibroblastes humains favorise la génération de macrophages prorégénérants sans induire des macrophages pro-inflammatoires.
[0230] Le taux de synthèse de CD163, récepteur spécifique participant à la fonctionnalité des macrophages pro-régénérants, est diminué de 23% en présence de sécrétome issu de fibroblastes humains âgés par rapport au sécrétome issu de fibroblastes humains jeunes. [0231] Le sécrétome issu de fibroblastes humains âgés prétraités avec 0,25% du principe actif selon l'invention restaure l'expression de surface de CD163 de 132%.
[0232] Le principe actif selon l'invention renforce ainsi la fonctionnalité des macrophages prorégénérants, éléments essentiels de la régénération cutanée.
[0233] Essai 6 - Effet du principe actif selon l'invention sur le système vasculaire et la migration des cellules endothéliales.
[0234] L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet du principe actif selon l'invention sur la migration des cellules endothéliales humaines âgées.
[0235] Les cellules endothéliales composant les micro-vaisseaux cutanés sont normalement quiescentes dans les capillaires. Néanmoins, en réponse à un stimulus du microenvironnement (hypoxie, blessure), les cellules endothéliales sont activées, migrent et sont capables de remodeler le réseau vasculaire afin de subvenir aux besoins du tissu lésé. Avec l'âge, les cellules endothéliales sénescentes sont dysfonctionnelles entraînant des défauts de remodelage vasculaire ainsi qu'une diminution du nombre de capillaires dans la peau.
[0236] Cette étude a été réalisée par un test de migration cellulaire en « time-lapse » sur des cellules endothéliales jeunes et âgées. L'effet est mesuré en évaluant la capacité des cellules à recoloniser une zone de blessure.
[0237] Les cellules endothéliales (HUVEC : Human umbilical vein endothelial cells) jeunes et âgées sont ensemencées et incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.
[0238] La zone de blessure est réalisée. Les cellules sont traitées par les sécrétomes issus des fibroblastes jeunes (SFJ) ou âgés (SFA) en présence ou non du principe actif selon l'invention à 0,25% et 1,00% (V/V). Les cellules sont ensuite incubées dans une atmosphère contenant 5% de CO2 à 37°C.
[0239] La visualisation de la migration des cellules endothéliales est réalisée en « time-lapse » grâce à un système entièrement automatisé qui permet de suivre la migration des cellules lors de la culture.
[0240] La vitesse de migration des cellules au sein de la blessure est calculée grâce à un script d’analyse d'images développé en interne. Les résultats sont exprimés en pm2/min.
[0241] Les résultats sont donnés dans le tableau 11.
[0242] [Tableauxll]
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[0243] La migration des cellules endothéliales humaines âgées est significativement diminuée de 47% par rapport aux cellules endothéliales jeunes.
[0244] Testé sur cellules endothéliales humaines âgées, le sécrétome issu de fibroblastes humains âgés prétraité avec 1,0% du principe actif selon l'invention, restaure significativement la vitesse de migration des cellules endothéliales de 93%.
[0245] Le principe actif selon l'invention accélère ainsi la migration des cellules endothéliales âgées, indispensable à la régénération du réseau vasculaire (blessé).
[0246] Essai 7 - Effet du principe actif selon l'invention sur le système vasculaire et la cohésion des cellules endothéliales.
[0247] L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet du principe actif selon l'invention, au sein du complexe régénérant fibroblastique, sur la synthèse de ZO-1 (Zonula Occludens -1), protéine de jonctions entre les cellules endothéliales.
[0248] L'intégrité vasculaire est assurée par l'établissement de jonctions adhérentes et serrées entre les cellules endothéliales. Ces jonctions permettent une perméabilité sélective des vaisseaux. ZO-1 est un composant constitutif des jonctions serrées endothéliales. Avec l'âge, les cellules endothéliales sont dysfonctionnelles et présentent une diminution de l'expression et de l'adressage membranaire des composants des jonctions serrées induisant une perméabilité augmentée.
[0249] L'étude a été réalisée par immunocytofluorescence, sur des cellules endothéliales jeunes et âgées.
[0250] Les cellules endothéliales humaines (HUVEC : Human umbilical vein endothelial cells) jeunes et âgées sont ensemencées et incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2. [0251] Les cellules sont traitées par les sécrétomes issus des fibroblastes jeunes (SFJ) ou âgés (SFA) en présence ou non du principe actif selon l'invention à 0,25% et 1,00% (V/V). Elles sont ensuite incubées dans une atmosphère contenant 5% de CO2 à 37°C.
[0252] Le marquage immunocytologique des ZO-1 est réalisé par fixation et perméabilisation à l'aide d'anticorps primaire et d'anticorps secondaire couplé à un fluorophore.
[0253] La visualisation est réalisée à l'aide d'un microscope couplé à un système d'analyse d'image.
[0254] La surface de fluorescence, correspondant au marquage ZO-1, est proportionnelle à l'établissement de jonctions serrées entre les cellules endothéliales. Une analyse quantitative des images a été réalisée grâce à un script d'analyse d'images développé en interne en langage python. Les résultats sont exprimés en unités arbitraires (UA).
[0255] Les résultats sont donnés dans le tableau 12.
[0256] [Tableauxl2]
Figure imgf000033_0002
Figure imgf000033_0001
[0257] La synthèse de ZO-1, protéine constitutive des jonctions intercellulaires, est significativement réduite de 52% dans les cellules endothéliales âgées par rapport aux cellules jeunes.
[0258] Testé à 1,0% sur cellules endothéliales âgées, le principe actif selon l'invention restaure significativement la synthèse de ZO-1 de 77%.
[0259] Le principe actif selon l'invention permet ainsi de renforcer la cohésion cellulaire.
[0260] Essai 8 - Effet du principe actif selon l'invention sur le système vasculaire et la formation du réseau vasculaire.
[0261] L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet du principe actif selon l'invention sur la formation d'un réseau capillaire de cellules endothéliales âgées.
[0262] Le remodelage du réseau vasculaire cutané chez l'adulte en réponse à un stimulus (hypoxie, blessure) se fait via un mécanisme d'angiogenèse. Ce processus se définit comme la formation de vaisseaux à partir de vaisseaux préexistants. Il est le résultat de spécification, de migration et de prolifération des cellules endothéliales. L'angiogenèse physiologique permet à la peau de cicatriser correctement. Avec l'âge, la formation de capillaires par angiogenèse est altérée et empêche la bonne cicatrisation et homéostasie des tissus.
[0263] L'étude a été réalisée par immunocytofluorescence, sur cellules endothéliales jeunes et âgées grâce au marqueur spécifique des cellules endothéliales : PECAM-1 (CD31).
[0264] Des fibroblastes jeunes ou âgés sont ensemencés et incubés à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.
[0265] Les cellules sont traitées avec les extraits 1,00% (V/V) puis incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.
[0266] Les cellules endothéliales humaines (HUVEC : Human Umbilical Vein Endothelial Cells) jeunes et âgées sont ensemencées sur les tapis de fibroblastes jeunes ou âgés et incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.
[0267] Les cellules sont ensuite traitées avec un extrait à 1,00% (V/V) et incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.
[0268] Le marquage immunocytologique des CD31 est réalisé par fixation et perméabilisation à l'aide d'anticorps primaire et d'anticorps secondaire couplé à un fluorophore.
[0269] La visualisation est réalisée à l'aide d'un microscope couplé à une caméra et à un système d'analyse d'images.
[0270] La surface de fluorescence correspondant au marquage CD31 est proportionnelle à l'étendue du réseau vasculaire formée par les cellules endothéliales.
[0271] Une analyse quantitative des images a été réalisée grâce à un script d'analyse d'images développé en interne. Les résultats sont exprimés en unités arbitraires (UA).
[0272] Les résultats sont donnés dans le tableau 13.
[0273] [Tableauxl3]
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[0274] Testé à 1,0% sur cellules endothéliales âgées, le principe actif selon l'invention permet de restaurer significativement la formation d'un réseau capillaire de 101%. Tandis que l'exemple 3 hors invention présente une efficacité plus faible.
[0275] Le principe actif selon l'invention favorise ainsi l'angiogenèse.
[0276] Essai 9 - Etude de l'activité biologique du principe actif selon l'invention in vivo.
[0277] L'objectif de cette étude est d'évaluer in vivo l'activité biologique du principe actif selon l'invention formulé à 2,5% en émulsion, en comparaison à une formule placebo, sur des volontaires caucasiens et asiatiques.
[0278] Le panel caucasien est composé de 19 volontaires sains, de sexe féminin, âgés de 70 à 78 ans, présentant des rides de la patte d'oie et un teint terne.
[0279] Le panel asiatique était constitué de 33 personnes âgées de 60 à 69 ans et le groupe placebo de 32 personnes âgées de 60 à 68 ans.
[0280] Effet du principe actif selon l'invention sur le renouvellement cellulaire.
[0281] Dans un premier temps, l'effet du principe actif selon l'invention a été évalué au niveau des avant-bras sur le panel caucasien en étudiant sa faculté à accélérer le renouvellement cellulaire après 14 jours d'application biquotidienne.
[0282] Le renouvellement cellulaire est mesuré grâce à la capacité de la peau à éliminer la DHA (dihydroxyacetone) qui est un marqueur colorant les protéines. Le renouvellement des cellules entraîne la disparition de la coloration induite par la DHA.
[0283] Un gel contenant 8% de DHA est appliqué à la surface de la peau des volontaires. Le suivi de la couleur obtenue après application du gel de DHA démarre 72 heures après coloration sur des zones non traitées, traitées biquotidiennement avec une formule placebo ou traitées biquotidiennement avec une formule contenant 5% du principe actif selon l'invention. L'évaluation est réalisée à partir de photographies de la peau prise à intervalles réguliers pendant 14 jours, à l'aide d'un dermatoscope.
[0284] Les résultats correspondant à l'effet du principe actif selon l'invention formulé à 2,5% en émulsion, sur la capacité à éliminer la DHA est présenté sur la figure 1.
[0285] En comparaison au placebo, le principe actif selon l'invention formulé à 2,5% en émulsion, favorise la dynamique épidermique en augmentant la capacité de la peau à éliminer la DHA.
[0286] Cet effet est observé et significatif dès 2 jours après l'application des produits et se poursuit tout au long de l'étude (J14).
[0287] En effet, avec le principe actif selon l'invention en moins de 7 jours, la coloration à la DHA est éliminée à plus de 80%, contre 11 jours pour la zone traitée par le placebo.
[0288] Effet du principe actif selon l'invention sur la structure du derme.
[0289] Dans un second temps, l'effet du principe actif selon l'invention sur la structure du derme a été évalué au niveau du visage après 21 et 42 jours d'application en évaluant la qualité de la matrice par LC-OCT (pour Line-Field Optical Cohérence Tomography ou tomographie par cohérence optique confocale à balayage linéaire). Cette étude a été réalisée sur les panels caucasien et asiatique.
[0290] Les résultats présentant l'effet sur le panel caucasien du principe actif selon l'invention sur la qualité de la matrice dermique évaluée sur une épaisseur de 50 pm sous la JDE est présenté dans le tableau 14 ci-après.
[0291] [Tableauxl4]
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[0292] Dès 21 jours de traitement, le principe actif selon l'invention formulé à 2,5% améliore significativement la qualité de la matrice de volontaires caucasiens de 32% par rapport au placebo.
[0293] Cet effet a été observé chez 89% des sujets. Ainsi, la dynamique matricielle du derme est restaurée. Cet effet se prolonge après 42 jours de traitement.
[0294] Les résultats présentant l'effet du principe actif selon l'invention sur la qualité des fibres dermiques de volontaires asiatiques est présenté dans le tableau 15 ci-après. [0295] [Tableauxl5]
Figure imgf000037_0001
[0296] Dès 21 jours de traitement, le principe actif selon l'invention formulé à 2,5% améliore significativement la qualité des fibres de volontaires asiatiques de 20% par rapport au placebo. Cet effet a été observé chez 97% des sujets asiatiques. Cet effet se prolonge après 42 jours de traitement.
[0297] Essai 10 - Evaluation des bénéfices cosmétiques du principe actif selon l'invention
[0298] L'objectif de cette étude est d'évaluer in vivo les bénéfices cosmétiques du principe actif selon l'invention formulé à 2,5% en émulsion, en comparaison à une formule placebo, chez des volontaires caucasiens et asiatiques. L'effet du principe actif selon l'invention a été évalué après 21 et 42 jours d'application biquotidienne.
[0299] Le panel caucasien est composé de 19 volontaires sains, de sexe féminin, âgés de 70 à 78 ans, présentant des rides au niveau de la patte d'oie et un teint terne.
[0300] Le panel asiatique est constitué de 33 personnes âgées de 60 à 69 ans et le groupe placebo de 32 personnes âgées de 60 à 68 ans.
[0301] Action sur les propriétés biomécaniques de la peau sur panel caucasien
[0302] Les résultats correspondant à l'effet du principe actif selon l'invention sur les propriétés biomécaniques de la peau de volontaires caucasiens sont présentés sur la figure 2.
[0303] Le principe actif selon l'invention en comparaison au placebo, améliore les propriétés biomécaniques de la peau de volontaires caucasiens.
[0304] En effet, dès 21 jours de traitement, le principe actif selon l'invention augmente de :
- 10% de la fermeté de la peau, effet observé chez 84% des sujets
- 14% de l'élasticité cutanée, effet observé chez 68% des sujets
- 25% de la tonicité de la peau, effet observé chez 84% des sujets.
[0305] De plus, 79% des volontaires trouve leur peau plus ferme et 79% plus tonique avec le principe actif selon l'invention contre respectivement 68% et 74% pour le côté placebo. Cet effet se prolonge après 42 jours d'application biquotidienne.
[0306] Action anti-rides sur panel caucasien
[0307] Les résultats correspondant à l'effet anti-rides du principe actif selon l'invention évalué sur la zone de la patte d'oie de volontaires caucasiens par scorage visuel sur photographies numériques en comparaison au placebo sont présentés dans le tableau 16.
[0308] [Tableauxl6]
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[0309] Dès 21 jours de traitement, en comparaison au placebo, le principe actif selon l'invention formulé à 2,5% en émulsion présente un effet anti-rides, en diminuant significativement de 10% le stade de rides de la patte d'oie. Cet effet est observé chez 74% des volontaires.
[0310] De plus, 74% des sujets ont constaté que leurs rides et ridules étaient moins visibles avec le principe actif selon l'invention contre seulement 58% pour le traitement placebo. Cet effet se prolonge après 42 jours de traitement.
[0311] Action sur le réseau micro-vasculaire cutané du panel caucasien
[0312] Les résultats correspondant à l'effet du principe actif selon l'invention sur la visibilité des micro-vaisseaux de la peau de volontaires caucasiens est présenté dans le tableau 17.
[0313] [Tableauxl7]
Figure imgf000038_0002
[0314] Dès 21 jours de traitement et en comparaison au placebo, le principe actif selon l'invention formulé à 2,5%, atténue la visibilité des vaisseaux dystrophiques au niveau des joues (-6%).
[0315] Cet effet se poursuit après 42 jours de traitement où une diminution significative de 7% est observée ; effet validé chez 63% des sujets.
[0316] En diminuant la visibilité des micro-vaisseaux dystrophiques le principe actif selon l'invention améliore la vascularisation cutanée.
[0317] Action sur les cernes du panel caucasien
[0318] Les résultats correspondant à l'effet du principe actif selon l'invention sur les cernes de volontaires caucasiens est présenté dans le tableau 18 ci-après. [0319] [Tableauxl8]
Figure imgf000039_0001
[0320] En comparaison au placebo, le principe actif selon l'invention formulé à 2,5% en émulsion limite les cernes en diminuant le paramètre b* de 2,9% dès 21 jours d'application et se prolonge jusqu'à la fin de l'étude. Le paramètre b* représente la gamme des bleus aux jaunes lors des mesures colorimétriques, il est caractéristique de la pigmentation jaune mélanique cutanée. Plus ce paramètre diminue plus la peau s'éclaircit.
[0321] Cet effet est visible chez 68% des volontaires et 79% d'entre eux ont perçu le produit comme un anti-cernes contre seulement 53% pour le traitement placebo.
[0322] Action sur l'éclat du teint du panel caucasien
[0323] Les résultats correspondant à l'effet du principe actif selon l'invention formulé à 2,5% sur les principaux paramètres caractéristiques de l'éclat du teint évalués par experts sur le panel caucasien, est présenté dans le tableau 19 ci-après.
[0324] [Tableauxl9]
Figure imgf000039_0002
[0325] Dès 21 jours d'application biquotidienne et en comparaison au placebo, le principe actif selon l'invention formulé à 2,5% en émulsion : o donne un teint plus lumineux et plus frais en augmentant significativement le rayonnement de la peau de 9% et la couleur rose, de 15%. Effet observé chez respectivement 74% et 84% des volontaires. o diminue significativement la couleur olive de 7% et l'état de fatigue des yeux de 6%. Effet observé chez respectivement 79% et 89% des volontaires
[0326] Cet effet est conforté par l'évaluation des volontaires : 84% à J21 ont trouvé leur peau plus éclatante avec le principe actif selon l'invention contre 63% pour le traitement placebo. [0327] Action anti-rides sur panel asiatique
[0328] Les résultats correspondant à l'effet anti-rides du principe actif selon l'invention étudié par scorage visuel par experts sur des volontaires asiatiques est présenté dans le tableau 20. Un jury composé de 3 personnes a évalué le stade de rides de la patte d'oie de chaque photo sur une échelle de score préalablement définie.
[0329] [Tableaux20]
Figure imgf000040_0001
[0330] Dès 21 jours de traitement, en comparaison au placebo, le principe actif selon l'invention formulé à 2,5% en émulsion présente un effet anti-rides chez des volontaires asiatiques, en diminuant significativement de 6% le stade de rides de la patte d'oie. Cet effet est observé chez 58% des volontaires. Cet effet se prolonge après 42 jours de traitement.
[0331] Conclusion
[0332] Le principe actif selon l'invention formulé à 2,5% en émulsion, apporte des bénéfices cosmétiques dès 21 jours de traitement qui se poursuivent après 42 jours de traitement.
[0333] En effet, le principe actif selon l'invention permet : une amélioration des propriétés biomécaniques de la peau une réduction des rides chez des volontaires caucasiens et asiatiques une amélioration de la vascularisation cutanée, en réduisant les microvaisseaux dystrophiques ainsi que les cernes une amélioration de l'éclat du teint.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Principe actif comprenant au moins un extrait de Saccharomyces cerevisiae, caractérisé en ce que ledit extrait correspond à la fraction cytosolique comprenant des oligo-glucanes de masse molaire compris entre 2 et 5 kDa.
[Revendication 2] Principe actif cosmétique selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les oligo-glucanes représentent entre 10% et 35% en poids de matières sèches de l'extrait.
[Revendication 3] Principe actif cosmétique selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l'extrait comprend un ratio glucose/mannose supérieur à 60%.
[Revendication 4] Principe actif cosmétique selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'extrait est un lysat mécanique de Saccharomyces cerevisiae.
[Revendication 5] Principe actif cosmétique selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que ledit extrait est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant les étapes suivantes : a. solubilisation d'au moins 50 g/L de Saccharomyces cerevisiae dans l'eau par homogénéisation mécanique, b. séparation des phases soluble et insoluble c. ultrafiltration et récupération du filtrat soluble d. tri moléculaire.
[Revendication 6] Composition cosmétique pour une application topique comprenant au moins un principe actif selon l'une des revendications précédentes et un milieu physiologiquement acceptable.
[Revendication 7] Composition cosmétique selon la revendication précédente, dans laquelle le principe actif sous forme liquide représente au moins 0,1% en poids du poids total de la composition.
[Revendication 8] Utilisation cosmétique d'un principe actif selon l'une des revendications 1 à 5 ou d'une composition cosmétique selon l'une des revendications 6 ou 7, pour améliorer la régénération cutanée liés au vieillissement cutané normal.
[Revendication 9] Utilisation cosmétique selon la revendication précédente, caractérisée en ce que l'extrait ou la composition améliore l'inter-connectivité des systèmes cutané, vasculaire et immunitaire.
[Revendication 10] Utilisation cosmétique selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l'extrait ou la composition augmente la synthèse et la sécrétion de
KGF, EGF, IGF, FGF, PDGF, TGF-|3 et VEGF.
[Revendication 11] Utilisation cosmétique selon l'une des revendications 8 à 10 pour améliorer l'éclat du teint.
[Revendication 12] Utilisation cosmétique selon l'une des revendications 8 à 11 pour prévenir et/ou réduire les cernes.
[Revendication 13] Utilisation cosmétique selon l'une des revendications 8 à 12 pour prévenir et/ou réduire les rides.
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