FR2997297A1 - Emulsion concentree eau dans huile et son utilisation pour le traitement de desordres cutanes cosmetiques ou dermatologiques - Google Patents
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Abstract
Emulsion concentrée stable eau dans huile, est composée d'une phase interne hydrophile, aussi nommée phase aqueuse, qui constitue environ 90% du volume total et une phase externe lipophile pour le restant, caractérisée en ce que la phase hydrophile comporte environ 10% d'un mélange de protéines, peptides et acides aminés
Description
EMULSION CONCENTREE EAU DANS HUILE ET SON UTILISATION POUR LE TRAITEMENT DE DESORDRES CUTANES COSMETIQUES OU DERMATOLOGIQUES L'objet de l'invention porte sur une émulsion concentrée stable eau dans huile, à haut pourcentage en phase interne hydrophile, et sur son utilisation pour le traitement de désordres cutanés cosmétiques ou dermatologiques.
On entend par « émulsion concentrée stable eau dans huile », un mélange, macroscopiquement homogène mais microscopiquement hétérogène, les deux liquides étant non miscibles, c'est-à-dire une dispersion d'un liquide en fines gouttelettes dans un autre liquide, le liquide sous forme de gouttelettes étant la phase dispersée aqueuse ou hydrophile, aussi nommée phase discontinue ou phase interne, l'autre liquide étant appelé phase dispersante lipophile, aussi nommée phase continue ou phase externe.
Des émulsions stables eau dans huile sont couramment utilisées dans les compositions à usage topique de produits cosmétiques et/ou pharmaceutiques et/ou dermatologiques. De telles émulsions sont par exemple décrites dans la demande de brevet internationale WO 00/10511. Ces émulsions sont généralement des émulsions à haut pourcentage en phase hydrophile, c'est-à-dire que la phase aqueuse représente plus de 74% en volume total de l'émulsion. Pour être stables, ces émulsions nécessitent l'ajout d'émulsifiants de synthèses, tels que du cétyl diméthicone polyol. 2 99 72 9 7 2 Cependant, la présence de produits de synthèses dans des émulsions destinées à une application topique peut provoquer des réactions allergiques lors de leur mise en contact avec la peau. 5 Par ailleurs, il y a de plus en plus de la part des utilisateurs, une demande de produits dits « verts » ne comprenant pas dans leur composition des produits de synthèses. L'invention a donc pour objet une émulsion concentrée stable qui répond 10 aux désirs des utilisateurs en ne présentant pas d'émulsifiants de synthèses, et pouvant en particulier être utilisée dans le traitement de désordres cutanés cosmétiques ou dermatologiques. Selon l'invention, l'émulsion concentrée stable eau dans huile, est 15 composée d'une phase interne hydrophile, aussi nommée phase aqueuse, qui constitue environ 90% du volume total de l'émulsion et une phase externe lipophile pour le restant, caractérisée en ce que la phase hydrophile comporte environ 10% d'un mélange de protéines, peptides et acides aminés 20 On entend par « la phase hydrophile constitue environ 90% du volume total de l'émulation » que la phase hydrophile constitue entre 85 et 90% du volume total de l'émulsion selon l'invention, de préférence 90% le reste de l'émulsion est la phase lipophile qui représente donc environ 10% 25 On entend par « la phase hydrophile comporte environ 10% d'un mélange de protéines, peptides et acides aminés » que le mélange de protéines, peptides et acides aminés constitue entre 8 et 12% du volume de la phase hydrophile de l'émulsion selon l'invention, de préférence 10%. 30 Avantageusement, ladite émulsion selon l'invention est caractérisée en ce que la phase interne hydrophile est isotonique à 0,15 molaire. On entend par « phase interne hydrophile isotonique », une phase aqueuse ou hydrophile contenant une quantité de soluté dissous égale à celle du cytoplasme des cellules épithéliales soit 0,15 molaires. Dans un autre mode de réalisation, l'émulsion concentrée stable eau dans huile selon l'invention est caractérisée en ce que les protéines de la phase interne hydrophile sont une combinaison de protéines insolubles et solubles, en particulier les protéines insolubles étant des particules de soie, de soja, de laine, de kératine, tandis que les protéines solubles sont issues des hydrolysats de protéines végétales de riz, de soja, de maïs.
Dans un autre mode de réalisation, l'émulsion concentrée stable eau dans huile selon l'invention est caractérisée en ce que les peptides de la phase hydrophile sont d'origine biosynthétique ou microbiologique. Dans un autre mode de réalisation, l'émulsion concentrée stable eau dans huile selon l'invention est caractérisée en ce que la phase interne hydrophile comprend de la bétaïne, de la glycine, d'hydrolysat de protéines de riz, de la nisine de la poudre de soie naturelle du NaCI et de l'eau.
La présente demande à pour objet également l'utilisation d'une émulsion concentrée stable eau dans huile selon l'invention dans le traitement de désordres cutanés cosmétiques ou dermatologiques. La présente demande à pour objet également l'utilisation d'une émulsion concentrée stable eau dans huile selon l'invention en tant que véhicule pour la libération percutanée d'un ou plusieurs principes actifs.
Avantageusement, l'émulsion selon l'invention présente des propriétés hydratantes, cicatrisantes et anti-inflammatoires.
L'émulsion selon l'invention comporte dans sa phase hydrophile ou aqueuse, environ 10% d'un mélange de protéines, peptides et acides aminés. Ce mélange comprend de préférence, les composants ci-après exprimés en pourcentage du volume de la phase hydrophile: - Des protéines insolubles de 1 à 5% - Des protéines solubles de 1 à 5% - Des peptides d'origine biosynthétique ou microbiologique de 0,001 à 5°/0 - Des acides aminés de 0,5 à 1,5% Le reste de la phase hydrophile comprend de l'eau et des sels minéraux en quantité suffisante pour obtenir une phase hydrophile isotonique à 0,15 molaire. La totalité des composants ci-dessus représente 90% de l'émulsion selon l'invention.
On entend par « protéines insolubles » toutes protéines naturelles réticulées telles que des particules de soie calibrée entre 5 et 10 um, des particules de laine, de la kératine, de riz, de soja.
On entend par « protéines solubles » toutes protéines hydrophiles telles que les protéines issues d'hydrolysats de protéines végétales tels que les hydrolysats de protéines naturelles de riz, de soja, de soie, de maïs. On entend par « peptides d'origine biosynthétique ou microbiologique », 30 tous peptides synthétisés par des microorganismes ayant des propriétés 2 9972 97 5 antibactériennes et bactéricides, anti-inflammatoires, cicatrisantes pouvant être notamment de la Nisine. On entend par « acide aminés » tous les acides aminés et leurs dérivés 5 ou un mélange de ceux-ci, sous une forme libre, notamment la glycine, la béta'ine d'origine naturelle, l'arginine, la lysine. La phase externe lipophile de l'émulsion selon l'invention comporte de manière préférée, en pourcentage de l'émulsion : 10 Des glycérides de 0,1 à 5% Du squalane de 0,1 à 4% De l'octyldodecyl PCA de 0,1 à 3% De l'ester d'aminopropanediol de 0,01 à 1% Des esters d'acides gras de 0,01 à 1% 15 Des stérols de 0,01 à0,1% Des Lipopeptides de 0,1 à1%. La totalité des composants ci-dessus représente 10% de l'émulsion selon l'invention. 20 On entend par « glycérides » tous glycérides tels que les monoglycérides diglycérides ou triglycérides ou un mélange de ceux-ci notamment les huiles végétales, les beurres par exemple l'huile d'amande douce, de soja, de tournesol, de noyaux de prunes ou le beurre de Karité. 25 On entend par « squalane », tous squalanes issu de l'hydrogénation du squalène notamment issu du squalène de plantes ou phytosqualane. On entend par « octyldodecyl PCA » tout ester ramifié octyldodécylique de l'acide L-pyrrolidone carboxylique (L-PCA) comme par exemple le 30 Ceramidone® de la société Solabia.
On entend par « ester d'aminopropanediol » tous les dérivés d'aminopropanediol obtenus par estérification depuis des acides gras d'huiles végétales notamment d'huiles de carthame, de tournesol, de palme, de lin, de bourrache, d'olive, plus particulièrement des huiles riches en Oméga 3, 6, et 9, comme par exemple les Oméga 3,6,9 Ceramide® de la société Solabia. On entend par « ester d'acides gras » tous les esters issus d'acides gras d'huile végétale notamment d'huile de carthame, de palme, d'olive, de 10 bourrache, de tournesol contenant des acides gras comme l'alpha-linoléique, linolénique, oléique. On entend par « stérols » tous stérols notamment tous stérols issus des plantes ou phytostérols tels que le alpha et béta-sitostérol, campéstérol, 15 stigmastérol, brassicastérol. Concernant les derniers composés, octyldodecyl PCA, ester d'aminopropanediol, ester d'acides gras et stérols, on utilisera plus particulièrement le complexe Cerastyl® de la société Solabia qui est 20 composé d'un mélange de 75,5% d'Octyldodecyl PCA, 15% d'esters aminopropanediol et d'acides gras d'huile de carthame et d'huile de palme ainsi que 7,5% de phytostérols (brassicastérol, campéstérol et sitostérol). On entend par « lipopeptides » tous lipopeptides tels que les lipo- 25 monopeptides, lipo-dipeptides, lipo-tripeptides ou un mélange de ceux-ci par exemple le Sodium Dilauramidoglutamide Lysine ou Pellicer-L30® de la société Laserson. L'émulsion concentrée selon l'invention a été préparée par un mélange 30 goutte à goutte de la phase hydrophile dans la phase lipophile sous agitation à une température de 20°C selon tous protocoles pour la réalisation d'émulsion eau dans huile connu de l'homme du métier. Avantageusement, les émulsions concentrées selon l'invention peuvent 5 également être utilisées en tant que véhicules pour la libération percutanée d'un ou plusieurs principes actifs notamment des principes actifs hydrosolubles, liposolubles et amphiphiles. On entend par « principes actifs » toutes molécules hydrosolubles, amphiphiles ou liposolubles ayant des propriétés cosmétiques ou 10 dermatologiques, curatives ou préventives telles que la caféine, l'oestradiol, l'hydrocortisone, du rétinol et ses esters, des polyphénols et stilbénoïdes et leurs dérivés glycosylés comme par exemple le Inoveol® de la société Libragen. 15 L'invention est également relative à une composition pour des traitements cosmétiques ou dermatologiques comprenant notamment au moins 10%, en particulier au moins 30%, de préférence au moins 80% d'une émulsion concentrée stable eau dans l'huile précitée de l'invention. Avantageusement, cette composition selon l'invention présente des 20 propriétés hydratantes, cicatrisantes et anti-inflammatoires. La présente demande à pour objet également l'utilisation d'une composition cosmétique et/ou pharmaceutique et/ou dermatologique selon l'invention dans le traitement de désordres cutanés cosmétiques ou 25 dermatologiques. La présente invention est maintenant décrite à l'aide d'exemples uniquement illustratifs et nullement limitatifs de la portée de l'invention, et 30 à partir des illustrations ci-jointes, dans lesquelles : La figure la représente la photographie, d'un expiant de peau 3 heures après l'élimination d'une partie des lipides par un traitement chimique sans application d'une quelconque crème.
La figure 1 b représente la photographie, d'un expiant de peau 3 heures après l'élimination d'une partie des lipides par un traitement chimique et sur lequel une crème comprenant 90% d'une émulsion de l'invention a été appliquée préalablement.
La figure 2a représente la photographie d'un immunomarquage de la filaggrine, d'un expiant de peau 3 heures après l'élimination d'une partie des lipides par un traitement chimique sans application d'une quelconque crème.
La figure 2b représente la photographie d'un immunomarquage de la filaggrine, d'un expiant de peau 3 heures après l'élimination d'une partie des lipides par un traitement chimique et sur lequel une crème comprenant 90% d'une émulsion de l'invention a été appliquée préalablement.
La figure 3a représente la photographie d'un immunomarquage de la transglutaminase, d'un expiant de peau 3 heures après l'élimination d'une partie des lipides par un traitement chimique sans application d'une quelconque crème.
La figure 3b représente la photographie d'un immunomarquage de la transglutaminase, d'un expiant de peau 3 heures après l'élimination d'une partie des lipides par un traitement chimique et sur lequel une crème comprenant 90% d'une émulsion de l'invention a été appliquée préalablement.
La figure 4a représente la photographie d'un immunomarquage de LEKTI, d'un expiant de peau 3 heures après l'élimination d'une partie des lipides par un traitement chimique et sur lequel une crème comprenant 90% d'une émulsion de l'invention n'a pas été appliquée. La figure 4b représente la photographie d'un immunomarquage de LEKTI, d'un expiant de peau 3 heures après l'élimination d'une partie des lipides par un traitement chimique et sur lequel une crème comprenant 90% d'une émulsion de l'invention a été appliquée préalablement. Les exemples A, B et C suivants illustrent respectivement des émulsions concentrées selon l'invention sans en limiter la portée et une crème incorporant l'émulsion de l'exemple A. 15 Exemple A d'une émulsion concentrée eau dans huile selon l'invention La phase lipophile à été préparée dans un premier temps. Afin d'obtenir 100g de phase lipophile, les réactifs suivants ont été mélangés à 80°C sous agitation douce à l'aide d'un mélangeur à hélice et 20 dans l'ordre suivant, les pourcentages sont exprimés par rapport à la phase lipophile : - Huile d'amande douce 37 % - Beurre de Karité 5 % Phytosqualane 35 % 25 Octyldodecyl PCA 16,10 % Ester d'Aminopropanediol et d'acides gras de carthame 3,75 0/0 Beta-sitostérol 0,15% Lipo-tripeptide 3 °/0. 10 30 2 9972 97 Après le mélange des réactifs sous agitation, la phase lipophile homogène a été laissée à 20°C avant l'introduction de la phase hydrophile. Dans un second temps, 900g de phase hydrophile isotonique ont été 5 préparés. Dans cette phase la fraction en poids des protéines insolubles, solubles, peptides et acide aminés additionnés représentent 10%. Les réactifs suivants ont été mélangés à 20°C sous agitation à l'aide d'un mélangeur à hélice dans l'ordre suivant, les pourcentages sont exprimés 10 par rapport à la phase hydrophile : - Eau 89,71 % - NaCI 0,29 % - Bétaïne 1,17 % - Glycine 1 % - Hydrolysat de protéines de riz 3,82 % - Nisine 0,01 % - Poudre de soie naturelle calibrée entre 5 et lOpm 4 %. Cette phase a été agitée vigoureusement et, toujours sous agitation, a été versée lentement, par goutte à goutte, dans la phase lipophile, elle-même maintenue sous agitation. L'émulsion ci-dessus peut par exemple être utilisée dans une crème comprenant 90% de ladite émulsion pour le traitement de désordres 25 cutanés cosmétiques ou dermatologiques. Une telle crème est en exemple C. L'émulsion concentrée ainsi formée est donc par exemple utilisée à 90% dans une composition topique (les 10% restant étant constitués d'une 30 émulsion simple huile dans l'eau usuellement utilisée pour la réalisation de crème) sous la forme d'une crème cosmétique ou dermatologique. 2 99 72 9 7 11 Des tests ex-vivo sur explants de peau humaine maintenue en survie ont été réalisés et décrits, dans l'exemple C, afin de mesurer les propriétés d'hydratation, anti-inflammatoire et cicatrisantes de cette crème cosmétique ou dermatologique. 5 Exemple B d'une émulsion concentrée eau dans huile selon l'invention La phase lipophile à été préparée dans un premier temps. 10 Afin d'obtenir 100g de phase lipophile, les réactifs suivants ont été mélangés à 80°C sous agitation douce à l'aide d'un mélangeur à hélice et dans l'ordre suivant, les pourcentages sont exprimés par rapport à la phase lipophile : - Huile de Tournesol 27 % 15 - Huile de Carthame 10 % Beurre de Mangue 5 % Phytosqualane 35 % Cerastyl 20 % - Pellicer-L30 3%. 20 Après le mélange des réactifs sous agitation, la phase lipophile homogène a été laissée à 20°C avant l'introduction de la phase hydrophile. Dans un second temps, 900g de phase hydrophile isotonique ont été préparés. Dans cette phase la fraction en poids des protéines insolubles, solubles, peptides et acide aminés additionnés représentent 10%. Les réactifs suivants ont été mélangés à température ambiante sous agitation à l'aide d'un mélangeur à hélice dans l'ordre suivant les pourcentages sont exprimés par rapport à la phase hydrophile : - Eau 89,71 % 2 9972 97 12 KCI 0,29 % Lysine 1,17% Glycine 1 % Hydrolysat de protéines de maïs 3,82 % 5 Nisine 0,01 % Poudre de kératine naturelle calibrée entre 5 et lOpm 4%. Cette phase a été agitée vigoureusement et, toujours sous agitation, a été versée lentement, par goutte à goutte, dans la phase lipophile, elle-même 10 maintenue sous agitation. Exemple C : Crème incorporant 90% de l'émulsion de l'exemple A et 10% d'une émulsion simple huile dans eau. L' émulsion simple huile dans eau 15 est du type usuel pour l'élaboration de crème cosmétique ou dermatologique. Ci-après sont décrites les propriétés de la crème et les tests effectués. a. Propriétés d'hydratation 20 Les propriétés d'hydratation de crème selon la formulation ci-dessus ont été évaluées par : 1. une expertise histologique de la morphologie générale de la peau. 2. Immunomarquage de la filaggrine 3. Immunomarquage de la transglutaminase membranaire (TGM) 25 4. Immunomarquage de LEKTI. Préparation des explants 27 explants d'un diamètre d'environ 10 mm et d'une épaisseur de 2 à 3 millimètres ont été préparés à partir d'une plastie abdominale d'une 30 femme (de la société BIO-EC, référence P942-AB20, issue de chirurgie plastique sous consentement signé du donneur). Les explants ont été mis en survie dans 2 ml de milieu BEM (B10-EC's Explants Medium) dans des boîtes multi-puits. Les explants ont été séparés en 3 groupes de 9 explants et maintenus à 37°C en atmosphère humide, enrichie de 5 % de CO2.
Le tableau 1, ci-dessous, représente la répartition des explants par groupe : Groupe Nombre d'explants 1 9 2 9 3 9 Délipidation Une délipidation a été effectuée pour permettre d'altérer la fonction barrière du stratum corneum sur les groupes 2, et 3. La délipidation a été réalisée grâce au dépôt de 20111 d'un mélange de solvants organiques (éther/acétone 50/50, provenant de la société FLUKA) qui a été appliqué sur les explants pendant 2 minutes. Le mélange a été ensuite aspiré et la peau essuyée à l'aide d'un coton hydrophile imbibée d'eau physiologique stérile. Application de la crème Immédiatement après la délipidation au jour JO, la crème a été appliquée sur les explants du groupe 3 à raison de 4 mg par expiant et étalée à l'aide d'une spatule afin d'obtenir une couche uniforme. Aux jours J1 (J0+24heures), J2 (J0+48heures) et J3 (J0+72heures), la crème a été une nouvelle fois appliquée sur les explants du groupe 3 à raison de 2 mg par expiant et étalée uniformément à l'aide d'une spatule.
Le tableau 2, ci-dessous, représente la répartition des explants et les traitements subis : 2 99 72 9 7 14 Groupe Nombre d'explants Délipidation Application de la crème 1 9 2 9 Oui 3 9 Oui Oui Des prélèvements ont été effectués pour permettre la réalisation d'observations histologiques et d'immunomarquage en vue de déterminer les propriétés d'hydratation de la crème comprenant 90% de l'émulsion 5 selon l'invention. Prélèvements Aux jours J0+3heures, J1 et J4 (J0+96heures), 3 explants de chaque groupe ont été prélevés et coupés en 2. 10 Une moitié a été fixée par du formol tamponné et l'autre moitié a été congelée à -80°C. Ces méthodes sont classiquement décrites dans des livres d'Histologie comme celui intitulé « Immunohistochemical Staining Method - Dako Handbook ». 15 Traitements histologiques Après 24 heures de fixation dans le formol tamponné, les prélèvements ont été déshydratés et imprégnés en paraffine à l'aide d'un automate de 20 déshydratation Leica TP 1020 selon le mode opératoire MO-H-149 du fournisseur BIO-EC. Les prélèvements fixés par le formol tamponné ont été mis en bloc selon le mode opératoire MO-H-153 à l'aide d'une station d'enrobage Leica EG 1160 du fournisseur BIO-EC. 25 Des coupes de 5 pm ont été réalisées selon le mode opératoire MO-H-173 à l'aide d'un microtome type Minot, Leica RM 2125 et montées sur des lames de verre histologiques SuperfrostO du fournisseur BIO-EC.
Les prélèvements congelés ont été coupés à 7 pm dans un cryostat Leica CM 3050 du fournisseur BIO-EC.
Les coupes ont été collées sur des lames de verre histologique silanisées SuperfrostO Plus, pour réaliser les immunomarquages du fournisseur B10- EC. Les observations microscopiques ont été réalisées en microscopie optique, à l'aide d'un microscope Leica type Orthoplan ou DMLB. Les prises de vue ont été réalisées avec une caméra Olympus DP72 et le logiciel CellAD. Examen de la morphologie générale La morphologie générale a été examinée sur des coupes en paraffine colorées au trichrome de Masson variante de Goldner, selon le mode opératoire MO-H-157 du fournisseur BIO-EC. La morphologie générale a été évaluée par un examen microscopique, essentiellement sur la structure du stratum corneum. lmmunomarquages Tous les immunomarquages ont été réalisés sur les prélèvements congelés à l'aide d'un automate d'immunomarquages (Dako, AutostainerPlus) en suivant les instructions du fabricant et le marquage a été évalué par un examen microscopique à fluorescence. Immunomarquaqe de la filaqqrine La protéolyse de la filaggrine produit des acides aminés, importants composants du NMF (Natural Moisturizing Factor) formant le cément inter- cornéocytaire responsable de la fonction barrière du stratum corneum.
La présence de filaggrine est donc un témoin de la formation du stratum corneum et du maintien de sa fonction barrière. La filaggrine a été marquée sur coupes congelées, avec un anticorps monoclonal anti-filaggrine, clone AKH1, (de la société Santa Cruz réf. sc- 66192), fait sur souris au 1/3200ème pendant 1h à 20°C avec un système amplificateur biotine/streptavidine de la société Sigma et révélée en FITC de la société Sigma. Les noyaux ont été contre colorés à l'iodure de propidium de la société Sigma.
Immunomarquaqe de la transqlutaminase membranaire (TGM) La TGM est une enzyme impliquée dans la formation des enveloppes cornées du stratum corneum. La TGM a été marquée sur coupes congelées à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-TGM, clone B.C1, (de la société Harbor BioProducts, réf. 621), fait sur souris, dilué au 1/100ème pendant 1 nuit à 20°C avec un système amplificateur Vectastain RTU Universal Vector avidine/biotine de la société Sigma et révélée en FITC de la société Sigma. Les noyaux ont été contre colorés à l'iodure de propidium de la société 20 Sigma. Immunomarquage de LEKTI La LEKTI est un inhibiteur de sérines protéases qui régule la desquamation du stratum corneum. 25 La LEKTI a été marqué sur coupes congelées à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-LEKTI, clone 1C11G6, (de la société Santa Cruz, réf. 32330), fait sur souris, dilué au 1/100ème pendant 24h à TA avec un système amplificateur Vectastain RTU Universal Vector avidine/biotine de la société Sigma et révélé en FITC de la société Sigma. 30 Les noyaux ont été contre colorés à l'iodure de propidium de la société Sigma.
Résultats: Des comparaisons entre des photographies des groupes témoins (Figures 1 a, 2a, 3a et 4a) et du groupe traité (Figures 1 b, 2b, 3b et 4b) ont été réalisées à J0+3H, les figure la et lb correspondant à l'examen de la morphologie générale, les figure 2a et 2b, 3a et 3b, et 4a et 4b correspondant respectivement aux immunomarquages de la filaggrine, de la TGM et de la LEKTI.
La comparaison entre les figures la et lb montre notamment un stratum corneum mieux feuilleté (11) sur l'expiant traité avec la crème selon l'invention par rapport au stratum corneum (10) de l'expiant n'ayant pas été traité avec la crème.
Par ailleurs, il y a une bonne activité de restructuration de la barrière cutanée pour l'expiant ayant bénéficié de l'application de la crème. En effet les immunomarquages montrent : - La grande intensité de la fluorescence de la filaggrine (13) de l'expiant ayant été traité avec la crème selon l'invention comme le montre la figure 2b, est nettement supérieure à l'intensité de la fluorescence de la filaggrine (12) de l'expiant ayant été traité par aucune crème comme le montre la figure 2a. La crème a donc pour effet une inhibition totale de la baisse d'expression de filaggrine induite par la délipidation. - La grande intensité de la fluorescence de la TGM (15) de l'expiant ayant été traité avec la crème selon l'invention comme le montre la figure 3b, est nettement supérieure à l'intensité de la fluorescence de la TGM (14) de l'expiant ayant été traité par aucune crème comme le montre la figure 3a. La crème a donc pour effet une inhibition totale de la baisse d'expression de filaggrine induite par la délipidation. l'intensité de la fluorescence de la LEKTI (17) de l'expiant ayant été traité avec la crème selon l'invention comme le montre la figure 4b, est quelque peu supérieure à la fluorescence de la LEKTI (16) de l'expiant ayant été traité par aucune crème comme le montre la figure 4a. La crème a donc pour effet une inhibition partielle de la baisse d'expression de LEKTI induite par la délipidation.
Les observations des prélèvements à 4 jours confirment les résultats décrits ci-dessus. Conclusion sur les propriétés d'hydratation : A la lecture de ces résultats, la crème comprenant 90% de l'émulsion concentrée selon l'invention présente de bonnes propriétés d'hydratation et peut être utilisée pour le traitement de désordres cutanés cosmétiques ou dermatologiques. b. Propriétés anti-inflammatoires Lorsque du Lipopolysaccharide (LPS) de la société Sigma est appliqué sur de la peau humaine, une réaction inflammatoire est déclenchée. Dès lors les cellules secrètent des cytokines notamment des interleukines IL1a et IL8, et le facteur de nécrose tumorale TNFa dans le milieu extracellulaire.
Ces cytokines peuvent alors être quantifiées afin d'évaluer les propriétés anti-inflammatoires de produits. La crème possède de bonnes propriétés anti-inflammatoires si les quantités de cytokine des explants exposés au LPS et traités sont plus faibles, que celle des explants ayant été exposés uniquement au LPS.
Préparation des explants 18 explants d'un diamètre d'environ 10 mm (± 1 mm) et de 2 ou 3 millimètres d'épaisseur ont été préparés à partir d'une plastie abdominale d'une femme (de la société BIO-EC, référence P946-AB, issue de chirurgie plastique sous consentement signé du donneur). Les explants ont été mis en survie dans 2 ml de milieu BEM (B10-EC's Explants Medium) dans des boîtes multi-puits. Les explants ont été séparés en 3 groupes de 6 explants et maintenus à 37°C en atmosphère humide, enrichie de 5 % de CO2.
Le tableau 3, ci-dessous, représente la répartition des explants par groupe : Groupe Nombre d'explants 1 6 2 6 3 6 Application des produits Au premier jour JO, à l'aide d'une pipette automatique à raison de 2mg/cm2, du LPS a été appliqué sur les groupes 2 et 3. Immédiatement après, de la crème a été appliquée et étalée uniformément à l'aide d'une spatule sur le groupe 3.
Au jour J1 (J0+24heures), la totalité des 2 ml du milieu de culture a été renouvelé. Aux jours J1 et J2, un disque de papier filtre imprégné de 30 pl de LPS (à 60 000 U/mg) a été appliqué, pendant 1 heure, contre la surface des explants des 2 groupes préalablement traités.
Le tableau 4 représente la répartition des explants et les traitements subis : Groupe Nombre d'explants Traitement LPS Application de l'émulsion 1 6 2 6 Oui 3 6 Oui Oui Prélèvements Au jour J2 soir (J0+2jours), 2m1 de chacun des milieux de culture ont été prélevés, pour quantifier la concentration d'ILI a, d'IL8 et de TNFa. Dosages Les concentrations d'ILI a, d'IL8 et de TNFa ont été déterminées par un 10 dosage par absorbance selon les méthodes connues de l'homme du métier. Toutes les absorbances ont été mesurées à l'aide d'un lecteur de microplaque Tecan Infinite M200 Pro, associé au logiciel Magellan selon les instructions du fabricant. 15 Une moyenne de la concentration d'ILI a, d'IL8 et de TNFa en pg.m1-1 a été déterminée pour chaque groupe. Dosage d'ILI a La concentration en ILI a dans les milieux de culture a été déterminée à 20 l'aide d'un kit de dosage EIA kit (Cayman, réf. 583301) selon les instructions du fabricant. Le tableau 5, ci-dessous, représente les résultats du dosage d'ILI a en pg.mi-i : Groupe Moyenne 1 14,7 2 15,5 3 9,8 Dosage d'IL8 La concentration en IL-8 dans les milieux de culture a été déterminée à l'aide d'un kit de dosage (RayBiotech, réf. ELH-1L8-001) selon les instructions du fabricant. Le tableau 6, ci-dessous, représente les résultats du dosage d'IL8 en pg.mi-i : Groupe Moyenne 1 8,34 2 30,20 3 14,66 Dosage de TNFa La concentration en TNFa dans les milieux de culture a été déterminée à l'aide d'un kit de dosage EIA kit (Cayman, réf. 589201) selon les instructions du fabricant. Le tableau 7, ci-dessous, représente les résultats du dosage de TNFa en pg.mi-i : Groupe Moyenne 1 6,0 2 23,1 3 11,2 Résultats Dans les conditions opératoires décrites ci-dessus, après 2 jours de traitement et en comparant le groupe 2 (LPS uniquement) et le groupe 3 (LPS + crème), il a été montré que la crème comprenant 90% de l'émulsion selon l'invention a induit : - une diminution de 37% de d'ILI a - une diminution de 51% de d'IL8 - une diminution de 51% de TNFa Conclusion de l'étude sur les propriétés anti-inflammatoires: A la lecture de ces résultats, la crème comprenant 90% de l'émulsion selon l'invention présente ainsi de bonnes propriétés anti-inflammatoires et peut donc être utilisée pour le traitement de désordres cutanés cosmétiques ou dermatologiques. c. Propriétés de cicatrisation Les propriétés de cicatrisation sont une des autres propriétés intéressantes des produits cosmétiques et/ou pharmaceutiques et/ou dermatologiques pour leurs utilisations dans le traitement de désordres cutanés cosmétiques ou dermatologiques. Ces propriétés ont été évaluées à l'aide d'une comparaison entre les effets de la crème comprenant 90% de l'émulsion selon l'invention et les effets de la crème de dénomination Cicalfate de la société Avene appliqués sur des explants de peau présentant des lésions dues à une irradiation par des UVB.
Cette comparaison a été effectuée sur les bases : - d'une expertise histologique de la morphologie générale de la peau, - d'un immunomarquage de la fibronectine, - d'un immunomarquage de l'intégrine 84.
Préparation des explants 27 explants d'environ 12 mm de diamètre et de 2 ou 3 millimètres d'épaisseur ont été préparés à partir d'une plastie abdominale d'une femme (de la société BIO-EC, référence P943, issue de chirurgie plastique sous consentement signé du donneur).
Les explants ont été mis en survie dans 2 ml de milieu BEM (B10-EC's Explants Medium) dans des boîtes multi-puits. Les explants ont été séparés en 3 groupes de 9 explants et maintenus à 37°C en atmosphère humide, enrichie de 5 % de CO2.
Le tableau 8, ci-dessous, représente la répartition des explants par groupe : Groupe Nombre d'explants 1 9 2 9 3 9 Réalisation des lésions dues à l'irradiation Tous les explants ont été irradiés en leur centre avec une dose d'UVB de 10 J/ cm2. Application des produits Aux jours JO (jour den l'irradiation des explants), J1 (J0+24heures), J3 (J0+72heures), J5 (J0+120heures), J7 (J0+168 heures) et J8 (J0+192heures), la crème comprenant 90% de l'émulsion concentrée selon l'invention et du Cicalfate de la société Avene ont été appliquées respectivement sur les explants des groupes 2 et 3 par voie topique à raison de 2mg/cm2. Le milieu de culture a été renouvelé pour moitié (1 ml) aux jours et J2, J4, J6 et J8. Prélèvements Aux jours JO, J2, et J9, 3 explants de chaque lot ont été prélevés et coupés en deux. Une partie a été fixée dans une solution de formol tamponné et la 2ème partie a été congelée à -80°C.
Ces méthodes sont classiquement décrites dans des livres d'Histologie comme celui intitulé « Immunohistochemical Staining Method - Dako Handbook ».
Traitements histologiques Les traitements histologiques ont été identiques aux traitements reçus par les explants lors de l'étude sur les propriétés d'hydratation de la crème comprenant 90% de l'émulsion concentrée selon l'invention (cf. plus haut).
Examen de la morphologie générale La morphologie générale a été examinée aux jours JO, J2 et J9 sur des coupes en paraffine colorées au trichrome de Masson variante de Goldner, selon le mode opératoire MO-H-157 du fournisseur BIO EC. La morphologie générale a été évaluée par un examen microscopique. lmmunomarquages Tous les immunomarquages ont été réalisés à l'aide d'un automate d'immunomarquages (Dako, AutostainerPlus) en suivant les instructions du fabricant et le marquage a été évalué par un examen microscopique à 25 fluorescence. Immunomarquage de la fibronectine La fibronectine joue un rôle dans la migration cellulaire, et dans l'adhésion des cellules entre elles et la matrice extracellulaire, sa présence est un 30 témoin d'un processus de cicatrisation cellulaire.
La fibronectine a été marquée aux jours JO et J2 sur coupes congelées, avec un anticorps monoclonal anti-fibronectine, clone TV-1, fait sur souris de la société Chemicon (réf. MAB 88904), au 1/50ème pendant 1h à température ambiante avec un système amplificateur biotine/streptavidine de la société Sigma, révélée en FITC de la société Sigma. Les noyaux ont été contre colorés à l'iodure de propidium de la société Sigma. Immunomarquage de l'intégrine 134 L'intégrine 134 est une protéine transmembranaire qui permet aux cellules d'adhérées entre elles, sa présence est un autre témoin d'un processus de cicatrisation. L'intégrine 134 a été marquée aux jours JO et J9 sur coupes congelées, avec un anticorps monoclonal anti-intégrine 134 clone 3 El (CD104), fait sur souris de la société Chemicon (réf. MAB 1964), au 1/600ème pendant lh à température ambiante avec un système amplificateur biotine/streptavidine, de la société Sigma, révélée en FITC de la société Sigma. Les noyaux ont été contre colorés à l'iodure de propidium de la société 20 Sigma. Résultats: Des comparaisons ont été réalisées entre des photographies du groupe d'expiant irradiés n'ayant reçu aucun traitement (groupe 1), du groupe 25 d'explants irradiés ayant reçu de la crème comprenant 90% d'émulsion concentrée selon l'invention (groupe 2) et du groupe d'explants irradiés ayant reçu du Cicalfate de la société Avene (groupe 3). Ces comparaisons montrent une quasi absence de fibronectine et d'intégrine 134 sur le groupe 1, et au contraire, une présence supérieure 30 similaire de fibronectine et d'intégrine 134 sur le groupe 2 ayant reçu la crème selon l'invention et le groupe 3 ayant reçu du Cicalfate de la société Avene. Conclusion sur les propriétés de cicatrisation : A la lecture de ces résultats, la crème comprenant l'émulsion concentrée selon l'invention présente une activité cicatrisante et peut être utilisée pour le traitement de désordres cutanés cosmétiques ou dermatologiques.
Claims (10)
- REVENDICATIONS1. Emulsion concentrée stable eau dans huile, composé d'une phase interne hydrophile qui constitue environ 90% du volume total de l'émulsion et une phase externe lipophile pour le restant, caractérisée en ce que la phase hydrophile comporte environ 10% d'un mélange de protéines, peptides et acides aminés.
- 2. Emulsion concentrée stable eau dans huile selon la revendication 1, caractérisée en ce que la phase interne hydrophile est isotonique à 0,15 molaire.
- 3. Emulsion selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le mélange de protéines, peptides et acides aminés comprend de préférence, les composants ci-après, les pourcentages étant exprimés en pourcentage du volume de la phase hydrophile: - des protéines insolubles de 1 à 5% - des protéines solubles de 1 à 5% - des peptides d'origine biosynthétique ou microbiologique de 0,001 à 5% - des acides aminés de 0,5 à 1,5%
- 4. Emulsion concentrée stable eau dans huile selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que les protéines de la phase interne hydrophile sont une combinaison de protéines insolubles et solubles, en particulier les protéines insolubles étant des particules de soie, de soja, de laine, de kératine, tandis que les protéines solubles sont issues des hydrolysats de protéines végétales de riz, de soja, de maïs.30
- 5. Emulsion concentrée stable eau dans huile selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que les peptides de la phase hydrophile sont d'origine biosynthétique ou microbiologique.
- 6. Emulsion concentrée stable eau dans huile selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la phase interne hydrophile comprend de la bétaïne, de la glycine, d'hydrolysat de protéines de riz, de la nisine de la poudre de soie naturelle du NaCI et de l'eau.
- 7. Emulsion concentrée stable eau dans huile selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour son utilisation dans le traitement de désordres cutanés cosmétiques ou dermatologiques.
- 8. Utilisation d'une émulsion concentrée stable eau dans huile selon l'une des revendications 1 à 6 en tant que véhicule pour la libération percutanée d'un ou plusieurs principes actifs.
- 9. Composition cosmétique et/ou pharmaceutique et/ou dermatologique, caractérisé en ce qu'elle comprend au moins 10%, en particulier au moins 30%, de préférence au moins 80%, d'une émulsion concentrée selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
- 10. Composition cosmétique et/ou pharmaceutique et/ou dermatologique selon la revendication précédente pour son utilisation dans le traitement de désordres cutanés cosmétiques ou dermatologiques.
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