FR2991682A1 - Procedes de preparation de lipochito-oligosaccharides et de leurs precurseurs - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne des procédés multi-étapes d'obtention de dérivés de chito-oligosaccharides, lesdits procédés comprenant la mise en oeuvre d'une N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae.
Description
Titre de l'invention Procédés de préparation de lipochito-oligosaccharides et de leurs précurseurs. Domaine de l'invention La présente invention se rapporte au domaine de l'agrochimie, et plus particulièrement à la fabrication de produits utiles pour la croissance des plantes. Art antérieur Les facteurs de nodulation (facteurs "Nod") sont des molécules signal essentielles pour le développement des nodules et pour l'invasion bactérienne au moment des étapes initiales de la symbiose Rhizobium-plante. Les facteurs Nod sont produits par les rhizobia, y compris les rhizobia des genres Allorhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium et Sinorhizobium. Le phénomène de symbiose bactéries-plante inclut la formation de nodules de racine, lesquels constituent de nouveaux organes colonisés par des bactéries différenciées. Les nodules de racine fixent l'azote de l'atmosphère et fournissent l'azote fixé à la plante hôte, ce qui favorise la croissance de la plante hôte indépendamment de l'accessibilité d'autres sources d'azote. Alors que les facteurs Nod participent à la symbiose Rhizobium-plante, un autre type de symbiose entre des champignons mycorhizés et les plantes est réalisée par d'autres facteurs, appelés facteurs de mycorhization (ou facteurs "Myc"). Les facteurs Myc consistent en des lipochito-oligosaccharides (Maillet et al., 2011, Nature, Vol. 469 : 5864). Les mycorhizes à arbuscules consistent en une endosymbiose de racine entre des champignons appartenant au phylum ancien Glomeromycota et les plantes terrestres. Le champignon G. intraradices de mycorhizes à arbuscules sécrète un mélange de lipochito- oligosaccharides (aussi appelés "LCOs") sulfatés et non sulfatés, lesquels possèdent des similarités de structure avec les facteurs Nod rhizobiens. Ces LCOs sulfatés et non sulfatés sont appelés facteurs Myc, du fait qu'ils stimulent la formation de mycorhizes chez les plantes légumineuses et chez les plantes non-légumineuses. Les facteurs Nod (décrits notamment par Dénarié et al., 1996, Annu. Rev.
Biochem., Vol. 65 : 503-535) et les facteurs Myc (décrits notamment par Maillet et al., 2011, Nature, Vol. 469 : 58-64) consistent tous les deux en des composés basés sur un squelette d'un polymère de résidus de N-acétyl-D-glucosaminyl (G1cNAc) liés entre eux par des liaisons f3-1,4, ledit polymère étant N-acylé au niveau du résidu localisé à l'extrémité non réductrice. La structure des facteurs Nod et des facteurs Myc diffère (i) par le nombre de résidus GlcNAc présents dans le squelette oligosaccharidique du type chitine, (ii) dans le type du groupe acyle gras, et (iii) dans le type de substitution des résidus localisés respectivement à l'extrémité réductrice et à l'extrémité non réductrice.
Du fait de leurs propriétés favorables pour la fixation de l'azote atmosphérique et pour la croissance des plantes, les facteurs Nod et les facteurs Myc présentent un intérêt important pour améliorer le rendement des cultures végétales, y compris en permettant une utilisation réduite de divers composés fertilisants conventionnels. Certains LCOs sont déjà commercialisés par la société Novozymes et sont destinés en particulier à la culture du soja, du maïs, du pois et de la luzerne. L'utilisation de LCOs dans l'agriculture implique que ces composés puissent être disponibles sous une forme très pure, et dans des quantités importantes. La disponibilité de quantités de LCOs adaptées à une utilisation dans l'agriculture implique aussi que les LCOs puissent être produits sous forme pure à des coûts qui soient industriellement compatibles. A la connaissance du demandeur, la plupart des procédés chimiques ou biochimiques connus pour la synthèse de LCOs n'ont permis de produire ces composés qu'en faible quantité.
Des procédés améliorés pour la production de composés précurseurs des facteurs Nod ont été décrits. Selon ces procédés améliorés, les précurseurs des facteurs Nod sont produits par culture de bactéries E. cou recombinantes, transformées avec les gènes nodC ou nodB et nodC ainsi que nodH et/ou nodL provenant de souches de Rhizobium. Le gène nodC code pour une chitooligosacharide synthase. Le gène nodB code pour une chitooligosaccharide N-désacétylase qui hydrolyse le groupement acétate de l'unité osidique non réductrice d'un chito-oligosaccharide. Le gène nodH code pour une chitooligosaccharide sulfotransférase. Le gène nodL code pour une chitooligosaccharide 0-acétylase. On peut notamment citer les travaux de Samain et al., qui ont utilisé des souches de E. cou transformées avec les gènes nodC ou nodBC pour produire, en des quantités élevées, respectivement un penta-N-acétyl-chitopentaose et un tetra-N-acétyl- chitopentaose (Samain et al., 1997, Carbohydr Res, Vol. 302 (n° 1-2) : 35-42). On peut également citer les travaux de la même équipe qui a mis en oeuvre des souches de E. cou transformées avec nodC ou nodB et nodC ainsi que nodH et/ou nodL pour produire respectivement du penta-N-acétyl-chitopentaose et du tetra-N-acétyl-chitopentaose sulfaté et/ou 0-acétylé (Samain et al., 1999, J Biotechnol, Vol. 72 (n°1-2) : 33-47). Il existe un besoin pour des procédés de préparation de LCOs et de composés précurseurs de LCOs, y compris pour des procédés de préparation de facteurs Nod et Myc, ainsi que de composés précurseurs de facteurs Nod et Myc, alternatifs ou améliorés par rapport aux procédés connus.35 Résumé de l'invention La présente invention fournit de nouveaux procédés pour la synthèse de LCOs ou de précurseurs de LCOs, lesquels ont été rendus possibles du fait de la disponibilité des enzymes adaptées, en particulier de N-désacétylase, en quantité et qualité suffisante pour la production des composés d'intérêt dans des quantités et à des coûts compatibles avec une exploitation à l'échelle industrielle. L'invention concerne un procédé pour l'obtention d'un dérivé de chitooligosaccharide mono-N-désacétylé de formule (I) suivante : NH2 HO O OH 0 O H.s.0 HO H 0 ).0 NH ( n 0 (I) dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8), ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) réaliser une hydrolyse in vitro du groupe N-acétyle de la seconde unité Nacétylglucosamine du côté non réducteur d'un dérivé de chito-oligosaccharide de formule (II) suivante : 0 NH HO OH 0 R1 0 ---(0 ----( -- NH HO NH HO HO HO OH HO HO HO 0 NH 0 OH NH 0 ( 0 dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, et - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8), avec une préparation de chitine oligosaccharide N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae, afin d'obtenir un dérivé chito-oligosaccharide mono-N-désacétylé de formule (III) suivante : dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8), b) éliminer l'unité osidique non réductrice du dérivé de formule (III) obtenu à la fin de l'étape a) par hydrolyse in vitro avec une P-N-acétyl-hexosaminidase afin d'obtenir le dérivé de formule (I). L'invention est également relative à un procédé pour l'obtention d'un dérivé de chito-oligosaccharide mono-N-désacétylé de formule (IV) suivante : R2 NH HO 0 HO OH NH ( 0 HO HO OH 0 NH HO OH 0 0 R1 dans laquelle :25 - n est un entier allant de 0 à 5, - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8), - R2 est un radical acyle lipidique, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) réaliser une hydrolyse in vitro du groupe N-acétyle de la seconde unité Nacétylglucosamine du côté non réducteur d'un dérivé de chito-oligosaccharide de formule (II) suivante : HO HO HO 0 NH -< 0 0 ---(0 ------( -- NH HO NH HO O HO HO OH NH 0 / R1 OH dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, et - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8), avec une préparation de chitine oligosaccharide N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae, afin d'obtenir un dérivé chito-oligosaccharide mono-N-désacétylé de formule (III) suivante : OH NH ( 0 OH NH 0 < / R1 0 dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8), b) éliminer l'unité osidique non réductrice du dérivé de formule (III) obtenu à la fin de l'étape a) par hydrolyse in vitro avec une P-N-acétyl-hexosaminidase afin d'obtenir le dérivé de formule (I), et c) réaliser une étape de N-acylation d'un composé de formule (I) avec un radical lipidique afin d'obtenir un dérivé de formule (IV) suivante : 0 R2 \ ---( NH HO NH HO HO OH HO HO 0 / R1 (IV) La présente invention a également trait à un procédé pour l'obtention d'un dérivé de chito-oligosaccharide mono-N-désacétylé de formule (V) suivante : 0 R2 \ -----( HO NH HO NH OH NH ( 0 0 / R1 OH NH ( 0 NH -< 0 HO HO (V) OH dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8), - R2 est un radical acyle lipidique, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) réaliser une hydrolyse in vitro du groupe N-acétyle de la seconde unité Nacétylglucosamine d'un dérivé de chito-oligosaccharide de formule (II) suivante : 0 ---(0 -----( -- HO NH HO NH HO O HO HO dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, et - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, 10 acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8), avec une préparation de chitine oligosaccharide N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae, afin d'obtenir un dérivé chito-oligosaccharide mono-N-désacétylé de formule (III) suivante : OH NH 0 ( / R1 0 dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, 20 - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8), b) réaliser une étape de N-acylation d'un composé de formule (III) obtenu à la fin de l'étape a) avec un radical lipidique afin d'obtenir un dérivé de formule (V) suivante : HO HO HO ---° o HO HO HO NI-12 HO HO HO 0 NH < 0 OH NH 0 / R1 OH OH NH ( 15 0 0 R2 HO NH HO NH HO HO NH OH NH 0 < ( 0 0 OH (V) dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8), - R2 est un radical acyle lipidique. Figures La Figure 1 est un schéma de préparation d'un précurseur de LCO comprenant (i) une étape enzymatique in vitro de N-désacétylation régiosélective d'un oligosaccharide de chitine, suivie par (ii) une étape d'hydrolyse in vitro du résidu localisé à l'extrémité non réductrice de l'oligosaccharide par une P-N-acétyl-hexosaminidase. La Figure 2 illustre les profils de spectrométrie de masse Maldi (Maldi MS) de précurseurs de LCOs. La Figure 2 (a) illustre le profil Maldi MS du composé CO-V(Niv) obtenu après incubation du chitinpentaose (CO-V) avec la N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae. mlz=1014 correspond à [M+Na] La Figure 2 (b) illustre le profil Maldi MS du composé CO-IV(Niv) obtenu après action in vitro de la P-N-acétyl-hexosaminidase de Aspergillus oryzae sur le composé CO-V(Niv). m/z=811 correspond à [M+Na] Pour chaque réaction, il n'y a pas de pic détectable correspondant à des composés COs ayant un degré de polymérisation différent. Les réactions sont quantitatives comme l'atteste l'absence totale du produit de départ sur chacun des spectres de masse.
La Figure 3 illustre le profil Maldi MS du composé CO-VI(Nv) obtenu après incubation du chitinhexaose (CO-VI) avec la N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae. m/z=1217 correspond à [M+Na] La Figure 4 illustre le profil Maldi MS du composé CO-V(Nv) obtenu par action in vitro de la P-N-acétyl-hexosaminidase de Aspergillus oryzae sur le composé CO-30 VI(Nv). m/z=1014 correspond à [M+Na] La Figure 5 illustre le profil Maldi MS du composé CO-V(Niv, S1) obtenu après action in vitro de la N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae sur le composé CO-V(S1). m/z=1116 correspond à [M+Na]+. La Figure 6 illustre le profil Maldi MS du composé CO-IV(Niv, S1) obtenu après action in vitro de la P-N-acétyl-hexosaminidase de Aspergillus oryzae sur le composé CO-V(NIv, S1). m/z=913 correspond à [M+Na]+. La Figure 7 illustre l'analyse par SDS-PAGE de VC1280 COD lors de sa purification par chromatographie d'affinité sur résine de nickel. Les échantillons analysés sont les suivants : Marqueur de PM (1), Extrait brut (2), Fraction exclue (3), Lavages (4- 5), VC1280 COD purifiée (6-7). Description détaillée de l'invention L'invention fournit de nouveaux procédés pour l'obtention de composés LCOs et de composés précurseurs de LCOs.
En particulier, le demandeur a mis au point un procédé permettant de produire, en grande quantité, une N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae. Selon ce procédé la N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae est produite dans une souche de E. cou qui a préalablement été transformée avec un plasmide dans lequel est intégrée une cassette d'expression comprenant (i) un acide nucléique codant pour la N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae fusionnée à son extrémité N-terminale avec le peptide leader pelB et fusionnée à son extrémité C-terminale avec une queue de poly-histidine (ii) ledit acide nucléique étant placé sous le contrôle d'un promoteur inductible par l'IPTG, de préférence, le promoteur du phage T7 inductible par l'IPTG. Les caractéristiques du vecteur utilisé pour transformer les cellules de E. et en particulier les caractéristiques de la séquence de fusion pe1B-enzyme-poly(His) ont permis de produire la N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae dans l'espace périplasmique de ces cellules, lequel est délimité respectivement par la membrane externe et la membrane interne. La N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae est retrouvée majoritairement dans l'espace périplasmique des cellules de E. cou i transformées, ladite enzyme étant dans sa configuration active. En second lieu, la présence de la queue poly-histidine à l'extrémité C-terminale de l'enzyme recombinante a rendu possible son obtention à un haut degré de pureté, par purification par chromatographie d'affinité sur une résine de Nickel. De préférence, on utilise une queue poly-histidine comprenant une chaîne de six résidus histidine. Une analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE) a permis de déterminer que l'enzyme a été purifiée à homogénéité. Les inventeurs ont déterminé que l'activité spécifique de la préparation de N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae obtenue selon le procédé ci-dessus sur le substrat CO-II est au moins d'environ 9 nmol.s-i.mg-1. On a mesuré dans certains lots une activité spécifique de la préparation de cette N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae sur le substrat CO-II 9,7 nmol. mg-1.
A titre illustratif, on précise que le procédé de production décrit ci-dessus a permis aux inventeurs d'obtenir la N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae, sous une forme pure, en des quantités de plusieurs dizaines de milligrammes par litre de milieu de culture de bactéries recombinantes. Les exemples illustrent l'obtention de la Ndésacétylase recombinante de Vibrio cholerae à raison de 120 milligrammes par litre de milieu de culture. La disponibilité de la N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae en quantité importante a permis aux inventeurs la mise au point de procédés de préparation de LCOs et de précurseurs de LCOs lesquels sont réalisés entièrement in vitro et en l'absence de cellules recombinées produisant cette enzyme recombinante.
On précise que c'est la quantité disponible d'enzymes, et particulièrement de N-désacétylase, qui a permis la mise au point des procédés de l'invention. Le degré de pureté des enzymes, et en particulier de la N-désacétylase, ne constitue pas une caractéristique limitante pour la mise en oeuvre de ces procédés. En effet, l'enzyme agit en tant que catalyseur et peut être utilisée à une concentration finale faible dans le milieu réactionnel. Les exemples illustrent la mise en oeuvre des procédés de l'invention à une concentration finale de N-désacétylase dans le milieu réactionnel variant de 5 i.tg/mL à 80 i.tg/mL pour une concentration de substrat de 1 à 5 mg/mL.Plus particulièrement, il a été mis au point des procédés multi-étapes pour la préparation de LCOs et de précurseurs de LCOs, dans lesquels on réalise successivement (i) une première transformation in vitro de N-désacétylation enzymatique du substrat, suivie, directement ou indirectement, (ii) d'une seconde transformation in vitro d'un produit intermédiaire par une P-N-acétylhexosaminidase. Du fait qu'une seule enzyme est utilisée in vitro à chaque étape de transformation d'un composé cible, et donc de l'absence d'autres enzymes susceptibles de transformer le même substrat en des produits non désirés, la totalité du substrat cible est transformé, en le seul composé produit désiré. En particulier, on a montré dans les exemples que l'action de la N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae sur un substrat cible, tel que le chitinpentaose, conduit (i) à la transformation enzymatique de la totalité dudit substrat cible et (ii) à la synthèse d'un unique produit transformé, à savoir le substrat cible qui a été N-désacétylé sur le résidu GlcNAc localisé en seconde position du côté non réducteur de l'oligosaccharide. De même, les résultats des exemples montrent que la seconde transformation, par élimination du résidu GlcNAc à l'extrémité non réductrice du substrat avec une P-N-acétylhexosaminidase, conduit à la conversion de la totalité du substrat en le seul produit désiré. De plus, puisque les procédés de l'invention mettent en oeuvre in vitro exclusivement des catalyseurs enzymatiques, qui ne nécessitent pas une fréquente régénération, lesdits procédés peuvent être mis en oeuvre selon des protocoles de traitement par lot ou selon des protocoles de traitement en continu. La présente invention est relative à un procédé pour l'obtention d'un dérivé de chito-oligosaccharide mono-N-désacétylé de formule (I) suivante : 0 NH NH2 HO 0 HO 0 HO 0 NH HO HO OH OH 0 R1 dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, 15 - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8), ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) réaliser une hydrolyse in vitro du groupe N-acétyle de la seconde unité Nacétylglucosamine du côté non réducteur d'un dérivé de chito-oligosaccharide de 20 formule (II) suivante : 0 0 HO NH HO NH HO HO OH HO 0 NH 0 25 dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, et - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8), avec une préparation de chitine oligosaccharide N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae, afin d'obtenir un dérivé chito-oligosaccharide mono-N-désacétylé de formule (III) suivante : 0 HO 0 0 NH OH dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8), b) éliminer l'unité osidique non réductrice du dérivé de formule (III) obtenu à la fin de l'étape a) par hydrolyse in vitro avec une P-N-acétyl-hexosaminidase afin d'obtenir le dérivé de formule (I). Par « préparation » de chitine oligosaccharide N-désacétylase, on entend selon l'invention une composition comprenant cette enzyme, à une concentration finale appropriée pour réaliser la conversion du substrat de départ en produit final qui est recherchée. Au sens de l'invention, le terme alkyle (ou alk) Ch6 désigne les radicaux, linéaires et le cas échéant ramifiés, méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, sec- butyle, tert-butyle, pentyle, isopentyle, hexyle, et isohexyle ainsi que leurs isomères de position linéaires ou ramifiés. L'un des avantages du procédé ci-dessus réside dans l'utilisation d'oligomères de la chitine (chito-oligosaccharides, COs) comme produit de départ. La chitine est l'une des substances naturelles les plus abondantes et est accessible à très faible coût. La chitine est retrouvée notamment dans la cuticule de tous les arthropodes et dans l'endosquelette de tous les céphalopodes, ainsi que dans la paroi cellulaire des champignons et des levures. La chitine est un copolymère linéaire de résidus de D-glucosamine (G1cN) et de N-acétyl- glucosamine (G1cNac) liés entre eux par des liaisons 13-(14) dans des proportions variées. Un autre avantage du procédé ci-dessus réside en ce qu'il consiste en un procédé enzymatique réalisé dans des conditions acellulaires. Contrairement aux procédés connus mettant en oeuvre des bactéries recombinantes, lesquels sont limités à la transformation de composés précurseurs endogènes synthétisés par ces cellules, les procédés selon l'invention ne comportent pas cette limitation technique. Ainsi, selon l'invention, une grande variété de composés substrats de départ, ayant différentes longueurs de chaîne osidique, peut être utilisée. Ainsi, alors que les procédés connus mettant en oeuvre des bactéries recombinantes sont limités à l'obtention de chito-oligosaccharides ayant 4 ou 5 unités osidiques, les procédés selon l'invention permettent l'obtention de composés ayant par exemple de 2 à 8 unités osidiques, selon le substrat de départ qui est utilisé. La chitine peut être hydrolysée chimiquement ou enzymatiquement afin de produire des chitooligosaccharides (C0s) constitués exclusivement de résidus N-acétyl-glucosaminyle. On a montré dans les exemples que le procédé ci-dessus permet l'obtention des précurseurs de LCOs désirés, avec un rendement proche de 100%. On précise que certains des précurseurs de LCOs susceptibles d'être obtenus selon l'invention constituent des composés présentant un intérêt agronomique déjà parfaitement identifié. Certains de ces précurseurs de LCOs sont commercialisés, par exemple par les sociétés Carbosynth, Carbomer, Megazyme, Seikagaku ou encore Dextra.
Il est notamment montré que le procédé ci-dessus permet la préparation de précurseurs de LCOs substitués ou non substitués sur le radical -CH2-C(0)-R1 du résidu GlcNAc de l'extrémité réductrice du composé de formule (I) d'intérêt. En particulier, les exemples illustrent la préparation de précurseurs de LCOs sulfatés ou non sulfatés sur le radical -CH2-C(0)-R1 du résidu GlcNAc de l'extrémité réductrice du composé de formule (I) d'intérêt. Dans un composé de formule (I) ci-dessus, le groupe R1 est un substituant choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8). De préférence, le groupe R1 est choisi parmi H, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, et SO3H. Dans ces modes de réalisation, le groupe R1 pré-existe préférentiellement dans le substrat de départ. Dans certains modes de réalisation du procédé ci-dessus, l'étape a) est réalisée en incubant le substrat de formule (II) de départ avec la N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae purifiée, à une concentration finale d'au moins 5 pg/mL de milieu 35 réactionnel. Selon l'invention, une concentration finale de N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae purifiée englobe les concentrations finales d'au moins 5 lag/mL, 10 iag/mL, 15 iag/mL, 20 iag/mL, 25 iag/mL, 30 iag/mL, 35 iag/mL, 40 iag/mL, 45 iag/mL, 50 iag/mL, 55 iag/mL, 60 1.1g/mL, 65 iag/mL, 70 i.tg/mL et 80 pg/mL. Les exemples illustrent la mise en oeuvre du procédé dans lequel, à l'étape a), le substrat de formule (II) est incubé avec la N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae purifiée qui est à une concentration finale comprise entre 5 lag/mL et 80 i.tg/mL pour une concentration de substrat de 1 à 5 mg/mL. Il est montré dans les exemples que la N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae purifiée présente une masse moléculaire apparente de 47 kDa, tel que déterminé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes. Selon ces données expérimentales, une concentration finale de N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae purifiée de 20 i.tg/mL correspond à une concentration finale de 4,26 10-7 Préférentiellement, l'étape a) est réalisée à une température d'au moins 30 °C, ce qui englobe au moins 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C, 35 °C et au moins 36 °C.
Préférentiellement, l'étape a) est réalisée à une température d'au plus à 45 °C; ce qui englobe au plus 44 °C, 43 °C, 42 °C, 41 °C, 40 °C et 39 °C. Les exemples illustrent la mise en oeuvre de l'étape a) à la température de 37 °C. La durée de l'étape a) peut être variable et peut être aisément déterminée par l'homme du métier. La durée de l'étape a) dépend notamment du rapport pondéral ou molaire entre la quantité de substrat de formule (II) à transformer et la quantité d'enzyme purifiée qui est présente dans le milieu réactionnel. La durée de l'étape a) peut aussi dépendre de la température de réaction, qui influe sur la cinétique de la catalyse enzymatique. Les exemples illustrent la transformation complète d'un substrat de formule (II) à 37 °C par incubation pendant une nuit avec la N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae à une concentration finale de 5 iig/mL à 80 i.tg/mL pour une concentration de substrat de 1 à 5 mg/mL. A l'étape b) du procédé ci-dessus, on utilise préférentiellement une P-N-acétylhexosaminidase de Aspergillus oryzae. Cette enzyme est décrite notamment par Vanek et al. (2011, Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun, Vol. 67 (Pt4) : 498-503). La P-N-acétyl-hexosaminidase de Aspergillus oryzae est commercialisée notamment par la société Sigma-Aldrich sous la référence A7708, ou encore par la société Wako Pure Chemical Industries Ltd. A l'étape b), la P-N-acétyl-hexosaminidase de Aspergillus oryzae est utilisée avantageusement à la concentration finale d'au moins 0,01 U/mL, ce qui englobe au moins 0,05 U/mL et 0,1 U/mL. A l'étape b), la P-N-acétyl-hexosaminidase de Aspergillus oryzae est utilisée avantageusement à la concentration finale d'au plus 10 U/mL. Les exemples illustrent l'utilisation de la P-N-acétyl-hexosaminidase à la concentration finale de 0,2 U/mL, en présence du substrat de formule (III) à la concentration finale d'environ 1 mg/mL. L'activité de la P-N-acétyl-hexosaminidase de Aspergillus oryzae est aisément déterminée par l'homme du métier, selon la technique décrite par Sakamoto et al. (2009, J. Appl. Glycosci., Vol. 56, 273-276).
Préférentiellement, l'étape b) est réalisée à une température d'au moins 30 °C, ce qui englobe au moins 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C, 35 °C et au moins 36 °C. Préférentiellement, l'étape b) est réalisée à une température d'au plus à 45 °C; ce qui englobe au plus 44 °C, 43 °C, 42 °C, 41 °C, 40 °C et 39 °C. Les exemples illustrent la mise en oeuvre de l'étape b) à la température de 37 °C.
La durée de l'étape b) peut être variable et peut être aisément déterminée par l'homme du métier. La durée de l'étape b) dépend notamment du rapport pondéral ou molaire entre la quantité de substrat à transformer et la quantité d'enzyme purifiée qui est présente dans le milieu réactionnel. La durée de l'étape b) peut aussi dépendre de la température de réaction, qui influe sur la cinétique de la catalyse enzymatique. Les exemples illustrent la transformation complète d'un substrat de formule III à 37 °C par incubation pendant une durée allant de 16 à 36 heures avec la P-N-acétyl-hexosaminidase de Aspergillus oryzae à une concentration finale d'environ 0,2 U/mL. Comme cela a déjà été mentionné, les caractéristiques spécifiques du procédé ci-dessus permettent, à chacune des étapes a) et b), de transformer la totalité du substrat en produit issu de la réaction par catalyse enzymatique, comme l'illustrent les exemples où, par analyse par spectrométrie de masse, il est montré la présence d'un seul composé à l'issue de la réaction. Ces résultats montrent que le procédé ci-dessus permet un rendement d'obtention du produit final de formule (I) qui est proche de 100%. Selon un autre de ses aspects, l'invention fournit aussi des procédés permettant l'obtention de LCOs, ou l'obtention de précurseurs de LCOs, qui possèdent un radical lipidique sur la fonction amine du résidu localisé à l'extrémité non réductrice ou sur la seconde unité N-acétyl-glucosamine du côté non réducteur. Comme cela est exposé ci-dessous, les procédés d'obtention de LCOs, ou d'obtention de précurseurs de LCOs, possédant un radical lipidique sur la fonction amine du résidu localisé à l'extrémité non réductrice ou sur la seconde unité N-acétyl- glucosamine du côté non réducteur. comprennent des étapes de transformation enzymatiques (i) avec la N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae et (ii) avec la 13- N-acétyl-hexosaminidase, comme dans le procédé ci-dessus. Ainsi, la présente invention est également relative à un procédé pour l'obtention d'un dérivé de chito-oligosaccharide mono-N-désacétylé de formule (IV) suivante : 0 R2 \ ------( NH HO NH HO HO OH HO OH HO 0 / R1 dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8), - R2 est un radical lipidique, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) réaliser une hydrolyse in vitro du groupe N-acétyle de la seconde unité N-acétylglucosamine du côté non réducteur d'un dérivé de chito-oligosaccharide de formule (II) suivante : HO HO HO 0 NH -< 0 0 ---(0 ----( -- NH HO NH HO O HO HO OH NH 0 / R1 OH dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, et - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8), avec une préparation de chitine oligosaccharide N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae, afin d'obtenir un dérivé chito-oligosaccharide mono-N-désacétylé de formule (III) suivante : NI-12 HO 0 o HO HO HO 0 NH OH NH OH NH 0 ( 0 0 dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8), b) éliminer l'unité osidique non réductrice du dérivé de formule (III) obtenu à la fin de l'étape a) par hydrolyse in vitro avec une P-N-acétyl-hexosaminidase afin d'obtenir le dérivé de formule (I), et c) réaliser une étape de N-acylation d'un composé de formule (I) avec un radical lipidique, afin d'obtenir le composé de formule (IV).
Pour les composés de formules (II), (III) et (IV), la signification du groupe R1 est identique à celle spécifiée précédemment dans la présente description. Comme précisé ci-dessus, le groupe R2 du composé de formule (IV) est un radical lipidique. Dans certains modes de réalisation, le groupe R2 est un groupe de formule (VI) suivante : -A-(B)x-(C)y-D (VI), dans laquelle: - x est un entier égal à 0 ou 1, - y est un entier égal à 0 ou 1, - A est un groupe choisi parmi -C(0)-, -C(S)-, -CH2-, -CHR1°-, CR1OR11-, -C(0)0-, - C(0)S-, C(S)O-, -C(S)S-, -C(0)NH-, C(NH)NH- et -C(S)NH-, - B est un groupe choisi parmi : - un arylène, - un hétéroarylène comprenant 1 ou 2 hétéroatomes chosis parmi l'azote, l'oxygène et le soufre, - un napthylène, - un hétéronaphthylène comprenant un ou 2 hétéroatomes choisis parmi l'azote, l'oxygène et le soufre, - un radical divalent dérivé de 2 cycles aromatiques ou hétéroaromatiques ayant chacun de 5 à 6 carbones et comprenant 1 ou 2 hétéro-atomes choisis parmi l'azote, l'oxygène et le soufre, - un biphénylène, - un hétérobiphénylène comprenant 1 ou 2 hétéroatomes choisis parmi l'azote, l'oxygène et le soufre, ces groupes pouvant être substitués par un ou deux substituants R12 et RH, indépendants l'un de l'autre, choisis parmi un halogène, CN, C(0)0R14, C(0)NR15 CF3, OCF3, -NO2, N3, OR14, SR14, NR16K-1'18 et un alkyle en C1_6; - C est un substituant choisi parmi -0-, -S-, -CH2-, -CHR17-, -CR 17R18 et NR19_, et - D est une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, ayant de 10 à 22 atomes de carbone, _ R14, R15, R16 et R'9 représentent, indépendamment l'un de l'autre, un substituant choisi parmi H, -C1_6 alkyle, -C(0)Ci_6 alkyle, -C(S)C1_6 alkyle, -C(0)0C1_6 alkyle, -C(0)NH2, - C(S)NH2, -C(NH)NH2, - C (0)NHC _6 alkyle, - C ( S )NHC _6 alkyle et -C (NH)NHC 1 -6 alkyle, R10, RH, R17 et K-18 représentent, indépendamment l'un de l'autre, un substituant choisi parmi C1_6 alkyle et F. Dans des modes de réalisation préférés, le groupe R2 est un radical de formule (VI) tel que défini ci-dessus, dans laquelle x est égal à 0 et y est égal à 0, A est tel que défini ci-dessus et D est une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, ayant de 10 à 22 atomes de carbone, y compris de 14 à 22 atomes de carbone.
Dans ces mêmes modes de réalisation préférés, lorsque la chaîne hydrocarbonée est insaturée, ladite chaîne hydrocarbonée comprend de 1 à 6 insaturations, ce qui englobe 1, 2, 3, 4, 5 et 6 insaturations. Selon un premier aspect particulier de ces modes de réalisation préférés, le groupe R2 est choisi parmi les radicaux acyle saturés suivants : decanoyl (C10), 30 dodecanoyl (C12), tetradecanoyl (C14), hexadecanoyl (C16), octadecanoyl (C18), icosanoyl (C20) et docosanoyl (C22). Selon un second aspect particulier de ces modes de réalisation préférés, le groupe R2 est choisi parmi les radicaux acyle insaturés suivants : palmitoyl aussi appelé (C16 :0), cis-9-hexadecenoyl aussi appelé palmitoleyl (C16: 1(9)), acide stéarique aussi 35 appelé (C18 :0), cis-9-octadecenoyl aussi appelé oleyl (C18: 1(9)), cis-11-octadecenoyl aussi appelé vaccenyl (C18: 1(11)), cis-9-12-octadecadienoyl aussi appelé linoleyl (C18: 2(9,12)), tout cis-9-12-15-octadecatrienoyl aussi appelé linolenyl (C18: 3(9, 12, 15)), tout cis-5-8-11-14-icosatetraenoyl aussi appelé arachidonyl (C20: 4(5, 8, 11, 14)) et tout cis-5- 8-11-14-17-icosapentaneoyl aussi appelé EPA (C20: 5(5, 8, 11, 14, 17)). Dans certains modes de réalisation, le groupe R2 d'un composé de formule (IV) est tel que l'entier x et l'entier y sont simultanément égaux à 0, ce qui entraîne que les groupes « B » et « C » sont absents et que le groupe R2 peut être aussi défini par la formule (VII) suivante : -A-D (VII), dans laquelle les groupes A et D ont, indépendamment l'un de l'autre, les significations déjà définies pour le groupe R2 de formule (VI). Avantageusement, les étapes a) et b) du procédé ci-dessus sont réalisées dans des conditions générales identiques à celles qui ont déjà été décrites pour les étapes a) et b) du procédé précédemment spécifié dans la présente description. De manière générale, pour réaliser l'étape c) de N-acylation avec un radical lipidique, on précise que les méthodes permettant de fonctionnaliser la fonction amino d'un polymère oligosaccharidique avec un radical lipidique, et en particulier un radical lipidique tel que défini ci-dessus, sont connues dans l'état de la technique. Il est fait notamment référence au contenu de la demande PCT n° WO 2005/063784 où ces méthodes de fonctionnalisation sont décrites en détail. On peut citer également les publications de Rasmussen et al. (2004, Org Biomol Chem, Vol. 2 : 1908-1910) et de Huang et al. (2007, J Enz Inhib Med Chem, Vol. 22 : 247-249).
A titre illustratif, en utilisant un chlorure du radical lipidique à greffer à l'étape c) du procédé, la réaction d'acylation peut être réalisée dans un mélange de diméthylformamide (DMI)-eau en présence d'hydrogéno-carbonate de sodium, en utilisant de préférence plusieurs équivalents de chlorure de lipide, par exemple 6 équivalents de chlorure de lipide. La réaction peut être poursuivie pendant environ 18 heures. Dans certaines situations, l'homme du métier peut aussi ajouter de la résine basique de Dowex (HCO3) au mélange réactionnel, afin de faciliter la purification du produit de la réaction. Dans d'autres situations, l'homme du métier peut en outre, à la fin de la réaction, procéder à une dilution du mélange réactionnel dans un mélange d'acétonitrile/eau, puis purifier le produit de la réaction par filtration de la résine de Dowex basique, passage sur une résine Dowex acide (H+), concentration des fractions résultantes et lavage du résidu solide obtenu avec de l'acétate d'éthyle, puis lavage avec de l'eau.
Ainsi, selon cet autre aspect, la présente invention concerne aussi un procédé pour l'obtention d'un dérivé de chito-oligosaccharide mono-N-désacétylé de formule (V) suivante : dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8), - R2 est un radical lipidique, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) réaliser une hydrolyse in vitro du groupe N-acétyle de la seconde unité N-acétylglucosamine du côté non réducteur d'un dérivé de chito-oligosaccharide de formule (II) suivante : 0 / R1 OH NH ( 0 0 \ --------( R2 NH HO NH NH -< 0 0 HO 0 HO OH (V) HO HO HO 0 NH -< 0 0 ---(0 ----( -- NH HO NH HO O HO HO OH NH 0 / R1 OH dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, et - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinofucosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8), avec une préparation de chitine oligosaccharide N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae, afin d'obtenir un dérivé chito-oligosaccharide mono-N-désacétylé de formule (III) suivante : NH ( 0 OH 0 NH OH NH 0 0 dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8), b) réaliser une étape de N-acylation d'un composé de formule (III) obtenu à la fin de l'étape a) avec un radical lipidique afin d'obtenir un dérivé de formule (V) suivante : 0 R2 HO NH HO NH NH OH NH 0 0 ( 0 (V) HO HO OH dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8), - R2 est un radical lipidique, et de préférence un radical lipidique de formule (VI) tel que défini dans la présente description. Plusieurs aspects communs aux trois procédés détaillés précédemment dans la présente description sont également décrits ci-dessous. Selon un premier aspect commun aux trois procédés, l'étape a) d'hydrolyse in vitro du groupe N-acétyle de la seconde unité N-acétyl-glucosamine d'un dérivé de chito- oligosaccharide de formule (II) est réalisée avec une préparation de chitine oligosaccharide N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae à une concentration finale appropriée, par exemple à une concentration finale de 5 lag/mL à 80 ug/mL pour une concentration de substrat de 1 à 5 mg/mL. Dans ces conditions une réaction quantitative est obtenue en 24h sur CO-V.
Selon un second aspect commun à ces trois procédés, pour les composés de formule (I) à (V), n est un entier allant de 0 à 5, y compris un entier égal à 2 ou 3. Selon un troisième aspect commun, pour les composés de formule (I) à (V), le groupe R1 est choisi parmi un sulfate, un fucosyle, un méthylfucosyle, un sulfofucosyle, un acétylfucosyle et un arabinosyle.
La présente invention concerne aussi l'utilisation d'un composé de formule (I) tel que défini dans la description, et en particulier d'un composé de formule (I) obtenu par un procédé de l'invention, comme composé intermédiaire dans la préparation d'un lipochito-oligosaccharide. L'invention est également relative à l'utilisation d'un composé de formule (IV) tel que défini dans la description, et en particulier d'un composé de formule (IV) obtenu par un procédé de l'invention, comme facteur de nodulation chez une plante. L'invention a aussi trait à l'utilisation d'un composé de formule (IV) tel que défini dans la description, et en particulier d'un composé de formule (IV) obtenu par un procédé de l'invention, pour favoriser la croissance d'une plante, ou pour favoriser la fixation d'azote par une plante. Un certain nombre des précurseurs de LCOs ou des LCOs de formules (II) et (IV) sont connus en eux-mêmes, et pour leur activité sur les plantes. De manière générale, les précurseurs de LCOs obtenus par un procédé selon l'invention, peuvent être utilisés comme composés intermédiaires dans des procédés de synthèse de LCOs. Les LCOs susceptibles d'être obtenus par les procédés divulgués dans la présente description englobent les facteurs Nod et les facteurs Myc. Les LCOs, obtenus par un procédé selon l'invention, peuvent être utiles comme agents actifs pour induire ou favoriser la formation de nodules chez les plantes et pour favoriser la fixation de l'azote par les plantes. La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant y être limitée, par les exemples suivants.35 EXEMPLES Exemple 1 : Production de la chitine oligosaccharide N-désacétylase de Vibrio cholerae 1.1 Induction de la synthèse de VC1280 COD La souche E. cou BL21 transformée avec le plasmide d'expression pET26bvc1280 a été mise en pré-culture dans un milieu LB (Bertani, 1951, J. Bacteriol., vol. 62(3) : 293-300) pendant la nuit à 37 °C sous agitation à 180 tours par minute. 200 mL de milieu LB ont ensuite été inoculés à 1% avec la pré-culture précédente et incubés à 37 °C sous agitation jusqu'à atteindre une densité optique (DO) à 600 nm de 0,4. L'induction de l'enzyme a été induite par addition d'isopropyl-beta-thio-galactoside (IPTG) à 0,05 mM suivie d'une incubation à 20 °C pendant 22 heures sous agitation. Le milieu de culture a été centrifugé pendant 10 minutes à 8450 g à 4 °C et les culots cellulaires ont été conservés à -20 °C. 1.2 Préparation des fractions périplasmiques et purification de VC1280 COD par chromatographie d'affinité sur résine de Nickel Les culots cellulaires obtenus dans l'étape précédente ont été remis en suspension dans 6,6 mL d'une solution de saccharose à 20% dans du Tris-HCl 20 mM à pH 8 et 13,2 tL d'EDTA 0,5 M à pH 8. Après incubation pendant 10 minutes à température ambiante, puis centrifugation pendant 10 minutes à 8450 g à 4 °C, le culot a été remis en suspension dans 10 mL de MgSO4 5 mM froid. Après une incubation additionnelle pendant 10 minutes à 4°C, la solution a été centrifugée pendant 10 minutes à 18300 g à 4 °C et le surnageant (la fraction périplasmique) a été déposé sur 1 mL de résine de Ni2+ préalablement équilibrée avec un tampon Tris-HCl 20 mM à pH 8/NaCl 0,2 M. Après lavage avec le tampon Tris-HCl 20 mM à pH 8/NaCl 0,2 M/Imidazole 20 mM, la VC1280 COD a été éluée avec un tampon identique contenant 150 mM d'imidazole. La pureté de VC1280 COD a été contrôlée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (à 10 %) en présence de SDS (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning. A laboratoty Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press) après coloration avec le colorant Instant Bluee. La Figure 7 montre que VC1280 COD a été purifiée à homogénéité et qu'elle présente une masse moléculaire apparente de 47kDa. Les fractions protéiques les plus concentrées ont ensuite été rassemblées et dialysées contre le tampon phosphate de potassium 20 mM à pH 8 et la concentration en protéines a été déterminée par la méthode de Bradford (Bradford, 1976, Anal Biochem, vol. 72 : 248-254) en utilisant de l'albumine sérique bovine comme standard ainsi que par la méthode de Kalckar.
L'enzyme ainsi purifiée (24 mg) a été conservée sous forme de fractions aliquotes de 500 !IL à la concentration de 2,58 mg/mL de protéine. Exemple 2 : Détermination des paramètres cinétiques de l'enzyme VC1280 COD Le milieu réactionnel contenant 500 à 3000 i.tM de CO-II et 3 iiIVl de VC1280 COD dans 350 !IL de tampon HEPES 20 mM à pH 7 est incubé au bain-marie 5 min à 37 °C. Les cinétiques se déroulent sur 10 min. Toutes les 2 min, 50 !IL de milieu réactionnel sont prélevés et transférés dans 50 pl de KHSO4 5%. 50 !IL de NaNO2 5 % sont additionnés et le milieu réactionnel est placé sous agitation pendant 15 min à température ambiante. Puis 50 !IL de NH4S03NH2 12,5% sont ajoutés au milieu que l'on agite pendant 5 min à température ambiante. Après avoir additionné 50 !IL du réactif 3- Methy1-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate (MBTH) 0,5% (Tsuji et al 1969, Chem. Pharm. Bull, Vol 17 : 1505 - 1510) le milieu réactionnel est laissé 1 heure au repos à température ambiante. Enfin, 50 !IL de FeC13 0,5% sont ajoutés au milieu. Après 30 min à température ambiante, l'absorbance est lue à 655 nm contre du tampon. La concentration en CO-II(NI) du milieu réactionnel est déterminée grâce à une courbe d'étalonnage réalisée avec des concentrations de G1cNH2 allant de 0 à 559 1.1M. Ainsi, sur le substrat CO-II, VC1280 COD présente les paramètres cinétiques suivant : = 3,67 mM, kcat = 0,45 s-1 et AS = 9,7 nmol.s-1.mg-1.
Exemple 3 : Préparation de CO-V et CO-VI mono-N-désacétylés Les CO-V et CO-VI, à raison d'une quantité de 5 mg de chacun des composés, ont été incubés à 37 °C pendant une nuit en présence de 500 1.1g d'enzyme VC1280 COD 25 pure dans 6 mL de tampon HEPES 20 mM à pH 7. Les produits de la réaction ont été analysés par chromatographie sur couche mince (CCM) en utilisant le solvant propanol/eau/ammoniaque (70 : 30 : 1). Les sucres ont été détectés par trempage dans le réactif diphénylamine/aniline/acide orthophosphorique (Walkey et al, 1977, J Chromatogr., Vol. 132 : 172-174) suivi d'une 30 révélation par chauffage. Cette analyse a montré que les CO-V et CO-VI ont été convertis en totalité en composés mono-N-désacétylé CO-V(Niv) et CO-VI(Nv) respectivement. Les mélanges réactionnels ont ensuite été lyophilisés et analysés par spectrométrie de masse en utilisant un appareil MALDI-ToF/ToF AutoFlex I® Bruker, sur la plateforme technique de spectrométrie de masse du CERMAV (Centre de Recherches 35 sur les Macromolécules Végétales, Grenoble, CNRS, France). Les échantillons ont été dissous dans l'eau à une concentration approximative de 0,2 mM et mélangés avec le même volume de matrice (acide 2,5-dihydroxybenzoïque, DHB) avant séchage à température ambiante sur la plaque MALDI. Cette analyse a confirmé l'identité des produits formés (voir figures 2 (a) et 3). Exemple 4 : Préparation de CO-HI mono-N-désacétylé 129 mg de CO-HI ont été incubés à 37 °C pendant 120 heures en présence de 2,58 mg d'enzyme VC1280 COD pure dans 30 mL de tampon HEPES 20 mM à pH 7,0. L'analyse du milieu réactionnel par chromatographie sur couche mince (CCM) comme décrit précédemment a montré que le CO-HI a été converti en composé mono-Ndésacétylé CO-III(NII) par comparaison avec un échantillon authentique.
Le mélange réactionnel a ensuite été lyophilisé et analysé par spectrométrie de masse comme décrit précédemment. Cette analyse a confirmé l'identité du produit formé. Exemple 5 : Préparation de CO-V(S) mono-N-désacétylé 1 mg de CO-V(SI) ont été incubés à 37 °C pendant 90 heures en présence de 15 100 tg d'enzyme VC1280 COD pure dans 1,1 mL de tampon HEPES 20 mM à pH 7,0. L'analyse du milieu réactionnel par spectrométrie de masse comme décrit précédemment a montré que le CO-V(SI) a été converti en totalité en composé mono-Ndésacétylé CO-V(Niv,SI). Cette analyse a confirmé l'identité du produit formé (voir figure 5). 20 Exemple 6 : Hydrolyse des composés mono-N-désacétylés par la R-N-acétylhexosaminidase de Aspergillus oryzae Afin d'obtenir le précurseur direct des facteurs Nod et Myc, c'est-à-dire des composés contenant un chitintetraose désacétylé à l'extrémité non réductrice, le composé 25 mono-N-désacétylé CO-V(Niv) a été traité avec la 13-N-acétyl-hexosaminidase de Aspergillus oryzae. Cette enzyme est capable d'éliminer le résidu GlcNac à partir de l'extrémité non réductrice des COs. Cependant, cette enzyme est incapable d'hydrolyser une liaison impliquant un résidu glucosaminyle (G1eNH2). Un volume d'enzyme (à la concentration finale de 2 U/mL) a été ajouté à 9 30 volumes de COs mono-N-désacétylés à la concentration finale de 0,8-1 mg/mL. La réaction a été réalisée dans le tampon HEPES 20 mM à pH 7 à 37 °C pendant 16 à 36 heures. Le mélange réactionnel a été lyophilisé puis analysé par chromatographie sur couche mince (CCM) comme décrit précédemment. Cette analyse a montré la libération 35 d'un résidu GlcNAc et la formation d'un produit qui migre à la même position que le composé de référence CO-IV(Niv).
Afin de confirmer que la désacétylation par VC1280 COD a eu lieu à l'avant dernière position, le produit a été analysé par spectrométrie de masse (voir figure 2(b)). Le pic majeur correspond au CO-IV mono-N-désacétylé. Il n'y a pas de pic correspondant au CO-III mono-N-désacétylé (585) ou au CO-II mono-N-désacétylé (382). 5 Ces résultats confirment que la N-désacétylation du composé CO-V par VC1280 COD a effectivement eu lieu sur l'avant-dernière position. Lorsque le composé CO-VI a été soumis à l'action de VC1280 COD suivie par l'action de la 13-N-acétyl-hexosaminidase comme décrit précédemment, le précurseur des facteurs Nod et Myc CO-V (Nv) a été produit (voir figures 3 et 4). 10 Lorsqu'on utilise le chitinpentaose sulfaté sur l'atome d'oxygène en position 6 du résidu de l'extrémité réductrice (CO-V, SI) comme substrat de départ, on génère le COV(Niv,SI), puis le CO-IV (Niv,SI) (voir figures 5 et 6). Cette dernière expérience montre que les COs modifiés à l'extrémité réductrice constituent également un substrat de départ approprié afin d'obtenir des précurseurs de 15 LCOs sulfatés ou fucosylés, lesquels constituent une classe extrêmement importante de LCOs biologiquement actifs. Les exemples illustrent pour la première fois la production des précurseurs des facteurs Nod et Myc à grande échelle, grâce à l'utilisation d'un système d'expression périplasmique pour la production de VC1280 COD. 20 Le degré de polymérisation ainsi que la position de N-désacétylation sont parfaitement contrôlés. Les LCOs biologiquement actifs peuvent être ensuite obtenus à partir de ces composés précurseurs par une réaction d'acylation chimique avec une chaîne d'acide gras appropriée, comme décrit par Rasmussen et al. (2004, Organic & Biomolecular 25 Chemistry, Vol. 2(13) : 1908-1910) ou en utilisant d'autres procédures conventionnelles de couplage peptidique. Le choix du système d'expression de l'enzyme recombinante VC1280 COD est essentiel. En effet, l'expression périplasmique de la COD, (i) facilite sa purification du fait du nombre réduit de protéines présentes dans le périplasme, par rapport au nombre de 30 protéines présentes dans le cytoplasme, et (ii) indique que la protéine est correctement repliée. Le repliement et la fonctionnalité de la protéine sont étroitement corrélés. La localisation de la protéine dans le périplasme est une indication positive de la viabilité de la VC1280 COD produite. Il est raisonnable de penser que les rendements de purification 35 de VC1280 COD dans E. cou i peuvent encore être améliorés en optimisant la concentration d'imidazole durant l'élution de la protéine du support d'affinité IMAC.
Egalement, les études cinétiques suggèrent un temps de réaction de désacétylation plus court que celui obtenu dans les exemples et/ou un rapport VC1280 COD/substrat plus faible, ce qui présente un grand intérêt en vue de réaliser la réaction à l'échelle industrielle.
En résumé, les résultats des exemples montrent pour la première fois une voie de synthèse enzymatique in vitro pour produire des précurseurs des facteurs Nod et Myc, grâce à l'utilisation de l'enzyme recombinante VC1280 COD exprimée dans E. colt Les procédés selon l'invention représentent une amélioration significative de la quantité de précurseurs des facteurs Nod et Myc susceptibles d'être produits, par comparaison avec les voies de synthèse chimique connues qui permettent la production d'une quantité réduite de quelques molécules d'intérêt à partir de la biomasse. Les exemples illustrent aussi la possibilité de synthétiser pour la première fois des précurseurs des facteurs Nod et Myc à l'échelle industrielle, par des procédés biotechnologiques utilisant des voies chimio-enzymatiques afin de remodeler des oligosaccharides dérivés de la chitine. Du fait que les facteurs de nodulation et de mycorhization constituent des produits naturels agissant à faible concentration, l'impact de leur utilisation industrielle sur l'environnement devrait être très limité voire inexistant.20
Claims (12)
- REVENDICATIONS1. Procédé pour l'obtention d'un dérivé de chito-oligosaccharide mono-N-désacétylé de formule (I) suivante : NH2 HO ----- e0 N HO 0 0 HO OH HO HO 0 OH NH n 0 ' / 0 R1 (I) dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1-6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1_8), ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) réaliser une hydrolyse in vitro du groupe N-acétyle de la seconde unité N- acétylglucosamine du côté non réducteur d'un dérivé de chito-oligosaccharides de formule (II) suivante : dans laquelle : n est un entier allant de 0 à 5, et - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1-6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1_8), NH OH 0 0 NH HO HO 0 û HO HO OH 0 O Ravec une préparation de chitine oligosaccharide N-désacétylase recombinante de Vibrio chokrae, afin d'obtenir un dérivé chito-oligosaccharide mono-N-désacétylé de formule (III) suivante : e0 HO NH2 HO HO HO 0 HO HO 0 HO NH OH 0 dans laquelle : n est un entier allant de 0 à 5, - RI est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfiicosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, axabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1_8), b) éliminer l'unité osidique non réductrice du dérivé de formule (III) obtenu 'à la fin de l'étape a) par hydrolyse in vitro avec une P-N-Acetyl-hexosaminidase afin d'obtenir le dérivé de formule (I).
- 2. Procédé pour l'obtention d'un dérivé de chito-oligosaccharide mono-N-désacétylé de formule (IV) suivante : R2 NH HO NH HO HO OH 0 OH HO OH NM L 0 R1 HO (IV) dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5,- R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1.8), - R2 est un radical acyle lipidique, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) réaliser une hydrolyse in vitro du groupe N-acétyle de la seconde unité Nacétylglucosamine du côté non réducteur d'un dérivé de chito-oligosaccharide de formule (II) suivante : e0 ----3Ç 40 NH HO "-----eçNH HO 0 HO HO 0 OH NH ( 0 OH NH 0 R/1 dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à5, et 15 - RI est choisi parmi H, un alkyle C1..6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, S031C, et SO3N(alkyle C1,8), avec une préparation de chitine oligosaccharide N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae, afin d'obtenir un dérivé chito-oligosaccharide mono-N-désacétylé de formule (III) suivante : 20 0 HO NH2 HO NH HO HO HO OH HO ---° HO NH OH 0 0 dans laquelle : 25 - n est un entier allant de° à5, R1 10- R1 est choisi parmi H, un alkyle C6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle b) éliminer l'unité osidique non réductrice du dérivé de formule (III) obtenu à la fin de l'étape a) par hydrolyse in vitro avec une rs-N-acétyl-hexosaminidase afin d'obtenir le dérivé de formule (I), et c) réaliser une étape de N-acylation d'un composé de formule (I) avec un radical lipidique, afin d'obtenir le composé de formule (IV).
- 3. Procédé pour l'obtention d'un dérivé de chito-oligosaccharide mono-N-désacétylé de formule (V) suivante : 0 R2 NH HO NH HO O U HO OH 0 HO OH NH 0 (v) dans laquelle : 20 - n est un entier allant de 0 à 5, - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1_6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C14), - R2 est un radical lipidique, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : 25 a) réaliser une hydrolyse in vitro du groupe N-acétyle de la seconde unité Nacétyleucosaxnine du côté non réducteur d'un dérivé de chito-oligosaccharide de formule (II) suivante : 15 HO HO HO NH 040 0 HONH HO NH , HO O HO OH 0 Ri OH NH 0 dans laquelle : n est un entier allant de 0 à 5, et - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1-8), avec _une préparation de chitine oligosaccharide de-N-déacetylase recombinante de Vibrio cholerae, afin d'obtenir un dérivé chito-oligosaccharide mono-N-désacétylé de formule (III) suivante : dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, - R1 est choisi parmi H, un alkyle C1.6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle b) réaliser une étape de N-acylation d'un composé de formule (III) obtenu à la fin de l'étape a) avec un radical lipidique afin d'obtenir un dérivé de formule (V) suivante : OH NH ( 0R2 HO NH HO NH HO HO HO HO HO NH OH NH 0 0 R/1 OH (v) dans laquelle : - n est un entier allant de 0 à 5, - RI est choisi parmi H, un alkyle C1..6, fucosyle, méthylfucosyle, sulfofucosyle, acétylfucosyle, arabinosyle, SO3H, SO3Li, SO3Na, SO3K, et SO3N(alkyle C1_8), - R2 est un radical lipidique.
- 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape a) d'hydrolyse in vitro du groupe N-acétyle de la seconde unité N-acétyl-glucosamine du côté non réducteur d'un dérivé de chito-oligosaccharides de formule (II) est réalisée avec une préparation de chitine oligosacchaiide N-désacétylase recombinante de Vibrio cholerae à la concentration finale variant de 5 gg/mL à 80 pig,/mL,
- 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que, pour les composés de formule (I) à (V), n est un entier égal à 2 ou 3.
- 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que, pour les composés de formule (I) à (V), le groupe RI est choisi parmi un sulfate, fucosyl, un méthylfucosyl, un 20 sulfofucosyl, un acétylfucosyl et un arabinosyl.
- 7. Procédé selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que le groupe R2 d'un composé de formule (I) ou d'un composé de formule (III) est un radical de formule (VI) suivante : 25 -A-(B)x-(C)y-D (VI), dans laquelle : x est un entier égal à zéro, - y est un entier égal à zéro, - A est un groupe choisi parmi -C(0)-, -C(S)-, -CH2-, -CHR1°-, CRI OR"-, -C(0)0-, - 30 C(0)S-, C(S)O-, -C(S)S-, -C(0)M1-, C(NH)NH- et -C(S)NH-, B est un groupe choisi parmi :- un arylène, - un hétéroarylène comprenant 1 ou 2 hétéroatomes cho sis parmi l'azote, l'oxygène et le soufre, - un napthylène, - un hétéronaphthylène comprenant un ou 2 hétéroatomes choisis parmi l'azote, l'oxygène et le soufre, - un radical divalent dérivé de 2 cycles aromatiques ou hétéroaromatiques. ayant chacun de 5 à 6 carbones et comprenant 1 ou 2 hétéro-atomes choisis parmi l'azote, l'oxygène et le soufre, - un biphénylène, - un hétérobiphénylène comprenant 1 ou 2 hétéroatomes choisis parmi l'azote, l'oxygène et le soufre, ces groupes pouvant être substitués par un ou deux substituants R12 et R13, indépendants l'un de l'autre, choisis parmi un halogène, CN, C(0)0R14, C(0)NR15R16, CF3, OCF3, -NO2, N3, OR14, sR14, NR16RI8 et un alkyle en C1-6; - C est un substituant choisi parmi -0-, -S-, -CH2-, -CHR17-, -CR17R18 et -NR19-, et - D est une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, ayant de 10 à 22 atomes de carbone, _ R14, R15, R16 et R19 représentent, indépendamment l'un de l'autre, un substituant choisi parmi 1-1, -C1_6 alkyle, -C(0)C1.6 alkyle, -C(S)C1_6 alkyle, -C(0)0C1_6 alkyle, -C(0)NH2, - C(S)NH2, -C(NH)NH2, -C(0)NHCI..6 alkyle, -C(S)NHCI-6 alkyle et -C(NH)NHC1-4 alkyle, - R1°, R11, R17 et R18 représentent, indépendamment l'un de l'autre, un substituant choisi parmi Ci.6 alkyle et F.
- 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que, dans le radical de formule (VI), - D représente une chaîne alkyle linéaire ayant de 14 à 22 atomes de carbone.
- 9. Procédé selon l'une des revendications 7 et 8, caractérisé en ce que, dans le radical de formule (VI), -D représente une chaîne alkyle ayant de 1 à. 6 insaturations.
- 10. Utilisation d'un composé de formule (1) obtenu par le procédé de la revendication 1 comme composé intermédiaire dans la préparation d'un lipochito-oligosaccharide.
- 11. Utilisation d'un composé de formule (V) obtenu par le procédé selon l'une des revendications 3 à 9, comme facteur de nodulation chez une plante.
- 12. Utilisation d'un composé de formule (IV) obtenu par le procédé selon l'une des revendications 2 et 4 à 9, vour favoriser la croissance d'une plante, ou pour favoriser la fixation d'azote par une plante.5
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