KR20100122795A

KR20100122795A - 북방수염하늘소 유래의 셀룰라아제 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20100122795A
Application number: KR1020090041872A
Authority: KR
Inventors: 박용철; 조세열; 권혁민; 홍진아; 황세희
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2009-05-13
Filing date: 2009-05-13
Publication date: 2010-11-23

Abstract

본 발명은 북방수염하늘소 중장(midgut) 유래의 셀룰라아제 (cellulase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 단백질에 대한 항체, 상기 단백질을 포함하는 해충 방제용 생물농약 및 셀룰라아제 유전자 증폭용 프라이머 세트에 관한 것이다.

본 발명의 셀룰라아제 효소는 북방수염하늘소의 소화에 관여하는 단백질이며, 북방수염하늘소는 소나무재선충병을 옮기는 매개체로, 이 발명을 통해 섭식을 저해할 수 있다면 북방수염하늘소의 방제에 사용될 수 있다. 또한, 셀룰라아제는 식물의 섬유조직인 셀룰로오스를 에탄올로 전환 시킬 수 있는 자연적 과정이 있는데, 이를 대량으로 생산해 낸다면 화석연료를 대체할 수 있는 친환경적인 에너지를 만들 수 있다.

북방수염하늘소, 중장, 셀룰라아제, 생물농약, 프라이머 세트

Description

북방수염하늘소 유래의 셀룰라아제 유전자 및 이의 용도{Cellulase gene from Monochamus saltuarius and uses thereof}

본 발명은 북방수염하늘소 중장에서 분리한 셀룰라아제 (cellulase) 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

지구상 자연계에서 석탄에 이어 가장 풍부하게 존재하는 유기화합물인 셀룰로오스(cellulose)는 미래자원으로 그 이용가치가 크게 주목받고 있다. 셀룰로오스는 고등식물의 세포벽의 주성분으로 목질부의 대부분을 차지하는 다당류이다. 또한, 베타-글루코오스(β-glucose)가 β-1,4 결합으로 다수 중합되어 이루어진 중합체로, 셀룰로오스의 곧은 사슬이 나란히 배열하여 결정상을 이루고 있다. 자연계에 존재하는 셀룰로오스는 녹말, 팩틴, 목질류 등과 결합된 안정한 형태로 존재하므로 자연상태에서의 분해속도는 대단히 느리다. 셀룰로오스는 주로 균류, 세균, 연체동물 등의 셀룰라아제(cellulase)에 의해 분해된 후 최종적으로 글루코스가 된다. 이러한 셀룰로오스를 분해시켜 저분자 물질로 만드는 방법으로 효소나 산을 이용하거나 열분해 시키는 방법 등이 알려져 있는데, 그 중에서도 효소반응을 이용한 셀룰로오스의 가수분해 방법이 가장 활발하게 연구되고 있다.

셀룰라아제는 복합효소로서 기질에 따른 가수분해 특성에 따라 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose, CMcellulose)에 대한 가수 분해능이 우수한 엔도글루카나제(endoglucanase, EG), 아비셀(Avicel)에 대한 분해능이 우수한 엑소글루카나제(exoglucanase, CBH) 그리고 베타-글루코시다제(β-glucosidase) 등의 3종으로 분류되는데, 셀룰로오스의 분해에는 이들 세 종류의 효소가 관여한다고 알려져 있다. 엔도글루카나제는 셀룰로오스를 무작위로 공격하여 비환원성 말단기를 만드는데, 저분자량의 수용성 셀룰로오스, 인산 가수분해된 셀룰로오스 등은 쉽게 분해하나, 결정성 셀룰로오스를 단독으로 분해하지는 못한다. 엑소글루카나제는 셀룰로오스 사슬의 비환원성 말단기를 공격하여 셀로비오스(cellobiose)를 생성시키며, 특히 기질이 결정상으로 존재할 때 이 효소의 존재는 커다란 의미를 갖는다. 즉, 여러 유기화학, 물리화학적인 연구 결과, 셀룰로오스의 분자는 많은 글루코오스가 탈수축합하여 세로비오스 모양으로 결합하여 생긴 고분자로 추정되는데 이와 같은 결합을 β-1,4 글루코시드 결합이라 한다. 마지막으로 베타-글루코시다제는 저분자량의 수용성 셀룰로오스를 분해하여 글루코스(glucose)를 생성한다(Beldman et al., Eur. J. Biochem., vol 146, p301-308, 1985; Kim et al., Korean J. Biotechnol. Bioeng., vol 13, p162-167, 1998).

셀룰라아제의 이러한 특성 때문에, 이를 이용하고자 다양한 생물체로부터 분리된 셀룰라아제 및 그 유전자가 보고되고 있다. 지금까지 셀룰라아제 및 그 유전자는 주로 세균과 곰팡이 등의 미생물로부터 분리된 것들이 많이 알려져 왔다(Eber hardt et al., Microbiology, vol 146, p1999-2008, 2000; Guiseppi et al., Mol. Microbiol., vol 2, p159-164, 1988; Hagen et al., Gen, vol 150, p163-167, 1994; Nakatani et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., vol 64, p1238-1246, 2000; Takashima et al., J. Biotechnol., vol 67, p85-97, 1999).

그러나, 곤충에서는 현재까지 초식성 딱정벌레(phytophagous beetle, Phaedon cochleariae)와 흰개미(termites) 등에서 제한적으로 밝혀져 있으며 (Girard amp; Jouanin, Insect Biochem. Mol. Biol., vol 29, p1129-1142, 1999; Tokuda et al., Biochem. Biophys. Acta, vol 1447, p146-159), 더욱이 북방수염하늘소 중장으로부터 셀룰라아제 유전자를 분리하였다는 연구 결과는 아직까지 보고된 바 없다.

한국등록특허 제10-0864699호에는 하늘소류 해충의 생물적 방제용 개미침벌의 대량 생산방법이 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2007-0116881호에는 셀룰라아제, 이것을 암호화하는 핵산 및 이들을 제조 및 사용하는 방법이 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2004-0079249호에는 뽕나무하늘소로부터 분리한 셀룰라아제 코딩 유전자 및 이를 이용하여 제조한 재조합 셀룰라아제가 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 북방수염하늘소 중장(midgut)으로부터 셀룰라아제 유전자를 클로닝하고, 클로닝된 유전자의 염기서열을 결정하여 기존의 셀룰라아제 유전자와의 염기서열 비교를 통해 분리된 유전자가 셀룰라아제를 코딩하는 유전자임을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 북방수염하늘소 중장 유래의 셀룰라아제 (cellulase) 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 셀룰라아제 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 셀룰라아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 셀룰라아제 단백질에 대한 항체를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 셀룰라아제 단백질을 포함하는 해충 방제용 생물농약을 제공한다.

본 발명은 또한, 셀룰라아제 유전자 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 북방수염하늘소 중장 유래의 셀룰라아제 (cellulase) 단백질을 제공한다.

본 발명에 따른 셀룰라아제 단백질의 범위는 북방수염하늘소 중장으로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

또한, 본 발명은 상기 셀룰라아제 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 셀룰라아제 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상 동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 셀룰라아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클 로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 셀룰라아제 단백질에 대한 항체를 제공한다.

본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 모노클로날 항체, 다중특이적(multispecific) 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 카멜화 항체(camelised antibody), 키메라 항체, 단일 체인 Fvs(scFv), 단일 체인 항체, 단일 도메인 항체, Fab 프래그먼트, F(ab) 프래그먼트, 디설피드-결합 Fvs(sdFv), 및 항이디오타입(항-Id) 항체, 및 상기 임의의 에피토프 결합 단편을 말한다. 특히, 항체는 면역 글로불린 분자 및 면역학적으로 활성이 있는 면역글로불린 분자 단편, 즉 항원결합부위를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 종류(예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(예: IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁, 및 IgA₂) 또는 서브클래스일 수 있다.

본 발명의 항체는 본 발명의 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람 직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

본 발명은 또한, 본 발명의 셀룰라아제 단백질을 유효성분으로 포함하는 해충 방제용 생물농약을 제공한다. 북방수염하늘소는 소나무재선충병을 옮기는 매개체이므로, 상기 셀룰라아제 단백질을 이용하여 북방수염하늘소의 섭식을 저해할 수 있다면 북방수염하늘소의 방제에 사용될 수 있을 것이다.

본 발명은 또한, 셀룰라아제 유전자 증폭용 프라이머 세트를 제공한다. 상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발 명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: DNA 단편 제작

Gene bank를 통해서 유사종들 간의 셀룰라아제(cellulase) 단백질 서열을 비교하여 상동성이 높은 부분을 바탕으로 하여 하기 프라이머 쌍을 제작하였다.

정방향 프라이머: 5'-GTC GTA GAA ANW GGA GAG AA-3' (서열번호 3)

역방향 프라이머: 5'-ATT CAG TTA CGA AGA TGG GGA-3' (서열번호 4)

북방수염하늘소의 DNA를 추출하여 Gradient PCR을 수행하여 단백질 셀룰라아제에 해당하는 약 600bp의 DNA 절편을 얻고, pGEM-T Easy 벡터에 삽입하였다.

상기 DNA 절편을 DNA 시퀀싱을 수행하고 유전자은행의 블라스트 프로그램으로 비교하여 이들 DNA 절편이 단백질 셀룰라아제 유전자의 일부임을 확인하였다. 이것을 MsGHF5 셀룰라아제라고 명명하였다.

실시예 2: cDNA 합성 및 RACE PCR

cDNA를 합성하기 위해서 SV Total RNA Isolation system (Promega)을 이용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 가지고 SMART™ RACE cDNA Amplification Kit (Clontech)을 사용하여 제조자가 추천하는 방법에 따라 다음과 같이 제조하였다.

1㎍의 total RNA를 각각 5'과 3'으로 MMLV Reverse Transcriptase를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 SMART™ RACE cDNA Amplification Kit (Clontech)에서 제조가 추천하는 방법에 따라 다음과 같이 제조하였다. Grade water 29.5㎕, 5x Advantage 2PCR 버퍼 10㎕, dNTP Mix(10mM) 1㎕, 50x Expand Long Range polymerase mix 1㎕를 혼합하여 PCR Master Mix를 만들었다. 상기 PCR Master Mix에 cDNA 2.5㎕, 키트에 들어있는 Univesal Primer A Mix(10X) 5㎕, F1 프라이머 1㎕는 3' 합성시 사용하고, R1 프라이머 1㎕는 5' 합성시 사용하여 PCR을 다음과 같이 수행하였다: 사이클 1(1x) 95℃, 4min; 사이클 2(5x) 94℃, 30s/72℃, 3min; 사이클 3(5x) 94℃, 30s/70℃, 30s/72℃, 3min; 사이클 4(25x) 94℃, 30s/68℃, 30s/72℃, 3min; 사이클 5(1x) 4℃, ∞.

상기 PCR을 수행하여 얻은 산물을 이용하여 상기 방법과 같이 Nested PCR을 수행하였다. 단, F2 및 F3 프라이머 1㎕는 3' 합성시 사용하고, R2 및 R3 프라이머 1㎕는 5' 합성시 사용하며 Univesal Primer A Mix(10X) 대신 Nested Universal Primer A를 사용하였다.

상기 PCR 산물을 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 예상되는 크기의 밴드를 확인하였다.

RACE PCR 프라이머:

F1 프라이머: 5'-GCC ACT CCA CTG TCG TCC GTG CAG CTG T-3' (서열번호 5)

F2 프라이머: 5'-GGC ACG ACC ATG CGG CCA ATC TCC AT-3' (서열번호 6)

F3 프라이머: 5'-GAA CCC ACC ACA CAA TCG TGG GAT GAC G-3' (서열번호 7)

R1 프라이머: 5'-TGG TGG CGG TAT CTC TAA GCC ACT GCT T-3' (서열번호 8)

R2 프라이머: 5'-GTG ATG GGG TTG GCC GCG GCT TGG TC-3' (서열번호 9)

R3 프라이머: 5'-CGT CAT CCC ACG ATT GTG TGG TGG GTT C-3' (서열번호 10)

실시예 3: MsGHF5 셀룰라아제 유전자의 클로닝

상기 실시예 2에서 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 얻어진 예상 크기의 밴드 부분을 잘라내어 GEN CLEAN Turbo

kit(MP Biomedicals, LLC)를 사용하여 제조자가 추천하는 방법에 따라 다음과 같이 정제하였다.

예상 크기의 정제된 추출물은 pGEM-T Easy 벡터(Promega)에 T4 DNA Ligase를 처리하여 연결시켰고, 상기 재조합된 플라스미드 DNA는 Competent Cell인 Competent Cells HIT-DH5a(RBC)에 넣어 삽입하여 LB(+amp) 플레이트 배지에 X-gal 40㎕와 IPTG 7㎕를 첨가한 후 37℃에서 12시간 배양하였다. 배양된 콜로니들을 선별하여 LB(+amp) 액체 배지에 다시 37℃에서 12시간 배양하였다.

배양된 세포 내의 플라스미드 DNA만을 추출하기 위해 HiYield Plasmid Mini Kit(RBC)을 사용하여 제조자가 추천하는 방법에 따라 실시하였다.

얻어진 플라스미드를 제한효소 EcoR1으로 효소 절단을 실시하여 예상되는 DNA와 pGEM-T Easy 벡터(Promega)를 분리해 내어 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 벡터와 DNA의 결합여부를 확인하였다.

시퀀싱을 수행하여 유전자은행의 블라스트 프로그램을 이용하여 셀룰라아제 유전자임을 확인하였다.

도 1은 셀룰라아제 단백질의 아미노산 서열을 기존에 알려진 것들과 비교한 그림이다.

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Cellulase gene from Monochamus saltuarius and uses thereof <130> PN09084 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 978 <212> DNA <213> Monochamus saltuarius <220> <221> gene <222> (1)..(978) <223> Cellulase gene <400> 1 atgaagttca tacttgctct tgtcggtttg gtgttggcct gctcagttga catttcccta 60 tcaaaagatg ccgcattgga aactgtgagc aaacacggcc agttgtccgt acaaggtgtg 120 gatatagtcg atgaaaatgg agagaagctt cagctaaaag gaatgtctct tttctgggat 180 gtctggatgc ctcagtacta caacaaggaa gccatcgatg gaatccacga tctgtgccac 240 tccaatgtcg tccgtgcagc tgtatccgta gaaaccgaat tagacggagg atttattgaa 300 actcctgaag acagtttagc aaggttgtac gctgtcgttg acgcagcaat tgaagatgat 360 atttacgtta tcatagattg gcacgaccat gcggccaatc tccatctgta ctactctcta 420 gaattcttcg acattgtgtc caagaagtac agtggtgtgc caaacatcat ctacgaaacc 480 ttcaacgaac ccaccacaca atcgtgggat gacgtcttga aaccctacca tgaagccgtc 540 attaacgtca tccgtgctaa tgatccagac aatatcatcg tcgtaggtac ccctacttgg 600 tcccaatctg ttgaccaagc cgcggccaac cccatcacag atcagacaaa cattatgtac 660 gcccttcact tctacgctgg tacccacaaa cagtggctta gagataccgc caccaatgct 720 ttgaacaatg gtctccccat ctttgtaact gaatacggta cagtaaacgc tgatgctacc 780 gatcccgtcg atgaagctga atctcgcttg tggtgggact ggcttgatga gcacaacctt 840 tcctacgcca actgggccat ctctgacaaa cttgaaggcg cttctgcttt ggtagctaat 900 actactgctg ctgaaacctg ccaagaggaa ttccttacta aatctggaaa acttgtagtt 960 gcacaaaaca tggcttaa 978 <210> 2 <211> 325 <212> PRT <213> Monochamus saltuarius <400> 2 Met Lys Phe Ile Leu Ala Leu Val Gly Leu Val Leu Ala Cys Ser Val 1 5 10 15 Asp Ile Ser Leu Ser Lys Asp Ala Ala Leu Glu Thr Val Ser Lys His 20 25 30 Gly Gln Leu Ser Val Gln Gly Val Asp Ile Val Asp Glu Asn Gly Glu 35 40 45 Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Leu Phe Trp Asp Val Trp Met Pro 50 55 60 Gln Tyr Tyr Asn Lys Glu Ala Ile Asp Gly Ile His Asp Leu Cys His 65 70 75 80 Ser Asn Val Val Arg Ala Ala Val Ser Val Glu Thr Glu Leu Asp Gly 85 90 95 Gly Phe Ile Glu Thr Pro Glu Asp Ser Leu Ala Arg Leu Tyr Ala Val 100 105 110 Val Asp Ala Ala Ile Glu Asp Asp Ile Tyr Val Ile Ile Asp Trp His 115 120 125 Asp His Ala Ala Asn Leu His Leu Tyr Tyr Ser Leu Glu Phe Phe Asp 130 135 140 Ile Val Ser Lys Lys Tyr Ser Gly Val Pro Asn Ile Ile Tyr Glu Thr 145 150 155 160 Phe Asn Glu Pro Thr Thr Gln Ser Trp Asp Asp Val Leu Lys Pro Tyr 165 170 175 His Glu Ala Val Ile Asn Val Ile Arg Ala Asn Asp Pro Asp Asn Ile 180 185 190 Ile Val Val Gly Thr Pro Thr Trp Ser Gln Ser Val Asp Gln Ala Ala 195 200 205 Ala Asn Pro Ile Thr Asp Gln Thr Asn Ile Met Tyr Ala Leu His Phe 210 215 220 Tyr Ala Gly Thr His Lys Gln Trp Leu Arg Asp Thr Ala Thr Asn Ala 225 230 235 240 Leu Asn Asn Gly Leu Pro Ile Phe Val Thr Glu Tyr Gly Thr Val Asn 245 250 255 Ala Asp Ala Thr Asp Pro Val Asp Glu Ala Glu Ser Arg Leu Trp Trp 260 265 270 Asp Trp Leu Asp Glu His Asn Leu Ser Tyr Ala Asn Trp Ala Ile Ser 275 280 285 Asp Lys Leu Glu Gly Ala Ser Ala Leu Val Ala Asn Thr Thr Ala Ala 290 295 300 Glu Thr Cys Gln Glu Glu Phe Leu Thr Lys Ser Gly Lys Leu Val Val 305 310 315 320 Ala Gln Asn Met Ala 325 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 gtcgtagaaa nwggagagaa 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 4 attcagttac gaagatgggg a 21 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1 primer <400> 5 gccactccac tgtcgtccgt gcagctgt 28 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2 primer <400> 6 ggcacgacca tgcggccaat ctccat 26 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer <400> 7 gaacccacca cacaatcgtg ggatgacg 28 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1 primer <400> 8 tggtggcggt atctctaagc cactgctt 28 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R2 primer <400> 9 gtgatggggt tggccgcggc ttggtc 26 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R3 primer <400> 10 cgtcatccca cgattgtgtg gtgggttc 28

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 북방수염하늘소 (Monochamus saltuarius) 유래의 셀룰라아제 (cellulase) 단백질.
제1항의 셀룰라아제 단백질을 코딩하는 유전자.
제1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제1항의 셀룰라아제 단백질에 대한 항체.
제1항의 셀룰라아제 단백질을 유효성분으로 포함하는 해충 방제용 생물농약.
서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어진, 셀룰라아제 유전자 증폭용 프라이머 세트.