FR2964665A1 - Nanoparticules luminescentes utilisables en tant que marqueurs et procede pour leur preparation - Google Patents

Abstract

L'invention concerne des nanoparticules luminescentes hybrides inorganiques − organiques à structure cœur-coquille, utilisables en tant que marqueurs pour des applications biologiques et médicales, qui comportent un cœur formé d'une nanoparticule d'oxysulfure de terres rares de formule (X Y )O S, dans laquelle X représente au moins un élément non émissif appartenant à la famille des lanthanides, Y représente au moins un élément appartenant à la famille des lanthanides émettant à des longueurs d'onde d'émission dans la région spectrale du visible ou du proche infrarouge, et a et b illustrant les nombres d'atomes respectivement de X et Y sont tels que a+b=2, et une coquille formée d'une couche de silice fonctionnalisée de façon covalente par des molécules présentant au moins un groupement réactif libre accessible en surface de la nanoparticule luminescente hybride.

Description

La présente invention concerne des nanoparticules luminescentes hybrides organiques - inorganiques, du type à structure coeur-coquille, qui sont utilisables en tant que marqueurs pour des applications biologiques et médicales, ainsi qu'un procédé pour la préparation de telles nanoparticules.

On entend dans la présente description, par le terme nanoparticules, des particules dont la granulométrie est inférieure ou égale à 300 nm en diamètre. Les particules selon l'invention trouvent application dans des domaines très divers de la biologie et de l'imagerie moléculaire et médicale, tels que par exemple les domaines du tri cellulaire par cytométrie de flux, de l'imagerie par microscopie, notamment confocale, du marquage de cellules, notamment infectées, pour le suivi de la prolifération cellulaire ou pour la reconnaissance de la fonction métabolique, de la microscopie ou de la spectroscopie de luminescence, de l'imagerie par résonance magnétique (IRM), de la tomographie par rayons X, de la microscopie électronique, etc. On connait à l'heure actuelle plusieurs types de marqueurs moléculaires luminescents utilisables pour l'une ou plusieurs de telles applications, dont chacun présente un certain nombre d'inconvénients. Parmi ces marqueurs, on peut citer les molécules organiques, telles que la fluorescéine, la rhodamine, la GFP (pour l'anglais green fluorescent protein), etc., qui ont l'inconvénient de présenter des raies d'émission de très courte durée de vie, de l'ordre de quelques nanosecondes seulement, et qui sont sujettes au phénomène de photo-blanchiment, c'est-à-dire de dégradation de la luminescence sous irradiation ; les nanoparticules de semi-conducteurs, usuellement nommées quantum dots, qui présentent un phénomène de luminescence discontinu, qui sont toxiques et relativement onéreuses à fabriquer ; et les complexes moléculaires intégrant des terres rares. Concernant ce dernier type de marqueurs, il a en particulier été proposé par l'art antérieur des nanoparticules à coeur d'oxyde de gadolinium dopé par des ions luminescents Tb3+ et à coquille de silice fonctionnalisée de façon covalente par la fluorescéine (Escribano et al, J. Mater. Chem., 2008, 18, 23- 40). Pour produire la luminescence nécessaire à une application donnée, de telles nanoparticules nécessitent cependant une excitation des ions Tb3+ dans la région spectrale de l'ultra-violet, qui s'avère stressante pour les substrats biologiques, si bien qu'elles ne trouvent application que dans quelques domaines limités. La présente invention vise à remédier aux inconvénients des marqueurs moléculaires luminescents pour applications biologiques existants, et notamment à ceux exposés ci-avant, en proposant un marqueur fluorescent qui possède un bon pouvoir émissif, notamment en termes de durée et de continuité de la luminescence, qui n'est pas sujet au phénomène de photo-blanchiment, qui est peu onéreux à produire, qui répond à une excitation à des longueurs d'ondes qui n'induisent pas de stress pour les substrats biologiques et qui présente des longueurs d'ondes d'émission également non stressantes pour ces substrats, si bien que ce marqueur peut être utilisé pour tous types d'applications dans le domaine de la biologie et du médical, notamment, mais non limitativement, pour les applications mentionnées ci-avant. D'autres objectifs encore de l'invention sont de fournir des marqueurs luminescents qui autorisent des mesures en temps retardé, postérieurement à l'extinction complète de l'auto-fluorescence du milieu biologique dans lequel ils sont mis en oeuvre, et qui par ailleurs puissent être facilement couplés à une grande variété de molécules d'intérêt différentes. A cet effet, il est proposé selon la présente invention une nanoparticule luminescente hybride inorganique - organique, à structure coeur-coquille, utilisable en tant que marqueur pour des applications biologiques et médicales, qui comporte : - un coeur formé d'une nanoparticule d'oxysulfure de terres rares répondant à la formule (I) : (XaYb)O2S (1) dans laquelle X représente au moins un élément non émissif appartenant à la famille des lanthanides, Y, dit élément dopant luminescent, représente au moins un élément appartenant également à la famille des lanthanides, et émettant à des longueurs d'ondes d'émission dans la région spectrale du visible (soit entre 400 et 800 nm) ou du proche infrarouge (soit entre 800 et 1 200 nm), et a et b illustrant les nombres d'atomes respectivement de X et Y sont tels que a+b=2, - et une coquille formée d'une couche de silice fonctionnalisée de façon covalente par des molécules dites de fonctionnalisation présentant au moins un groupement réactif libre, accessible en surface de la nanoparticule luminescente hybride, lesdites molécules de fonctionnalisation étant aptes à permettre la liaison de molécules d'intérêt sur une surface de la nanoparticule luminescente hybride. Les nanoparticules conformes à une telle définition répondent avantageusement à des excitations à une longueur d'onde proche du domaine spectral du visible, à savoir d'environ 360 nm, qui n'est pas stressante pour les substrats biologiques. Elles tirent en outre avantageusement profit des propriétés de luminescence des lanthanides, en termes de durée d'émission (de l'ordre de plusieurs centaines de microsecondes) et de finesse des raies d'émission. Elles permettent les mesures dites en temps retardé, c'est-à-dire que l'observation de la luminescence de l'élément dopant en réponse à une excitation peut être effectuée quelques microsecondes après l'excitation, ce qui permet de s'affranchir du phénomène d'auto-fluorescence des milieux biologiques, qui présentent quant à eux typiquement une durée d'émission de l'ordre de quelques nanosecondes, et de diminuer, voire supprimer, le bruit de fond dû au milieu durant la mesure.

Ces nanoparticules sont en outre chimiquement stables, non toxiques, et elles ne sont pas sujettes au phénomène de photo-blanchiment. En faisant varier les éléments X et Y, ainsi que les groupements réactifs libres présents en surface des nanoparticules, l'invention fournit en outre avantageusement une famille de nanoparticules luminescentes qui sont aptes à être mises en oeuvre dans une large gamme de domaines d'application différents, après couplage à des molécules d'intérêt pouvant être de tous types, et choisies en fonction de l'application visée donnée. Ces nanoparticules offrent ainsi des possibilités de multiplexage d'analyses, qui ne sont permises par aucun des marqueurs proposés par l'art antérieur. Suivant des modes de réalisation préférés, l'invention répond en outre 5 aux caractéristiques suivantes, mises en oeuvre séparément ou en chacune de leurs combinaisons techniquement opérantes. Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, X, dit lanthanide principal, élément constitutif principal de la matrice minérale, représente de préférence un ou une pluralité d'éléments choisis dans le groupe constitué du 10 gadolinium Gd, de l'yttrium et du lutétium Lu. Ces éléments présentent notamment l'avantage d'être structurellement et chimiquement proches de l'élément dopant luminescent choisi conformément à l'invention, ce qui assure la stabilité chimique de la nanoparticule. Le gadolinium est particulièrement préféré dans le cadre de l'invention, notamment en ce que les nanoparticules 15 dans la constitution desquelles il entre peuvent avantageusement être mises en oeuvre pour une grande variété de d'applications, par exemple notamment pour l'imagerie par résonance magnétique. En liaison avec cette caractéristique, l'élément dopant Y représente préférentiellement un ou une pluralité d'éléments à longueur d'onde d'émission 20 dans la région spectrale du visible. L'europium Eu3+, qui émet dans le rouge à une longueur d'onde de 620 nm, et/ou le terbium Tb3+, qui émet quant à lui dans le vert à une longueur d'onde de 550 nm, sont particulièrement préférés dans le cadre de l'invention, notamment car ils présentent une grande finesse des raies d'émission, ces raies étant en outre largement décalées par rapport à 25 la longueur d'onde d'excitation utilisable d'environ 360 nm. Il n'existe ainsi avantageusement aucun recouvrement entre le rayonnement lumineux issu de l'excitation des nanoparticules et le rayonnement lumineux issu de l'émission par ces nanoparticules, ce qui augmente la précision et la fiabilité des mesures effectuées. 30 Une nanoparticule particulièrement préférée dans le cadre de l'invention, apte à être mise en oeuvre dans une très large gamme de domaines d'application tant biologiques que médicaux, comporte le gadolinium en tant que lanthanide principal, et l'europium en tant qu'élément dopant luminescent. Dans des modes de réalisation préférés de l'invention, le rapport a/b est compris entre 18 et 50 environ, c'est-à-dire que l'élément dopant Y est présent dans la nanoparticule en substitution du lanthanide principal X, dans des proportions d'environ 2 à 5 % en nombre d'atomes. Une telle concentration de l'élément dopant permet notamment de s'assurer que la luminescence de la nanoparticule soit suffisamment forte pour permettre son utilisation en tant que marqueur luminescent pour des applications biologiques et médicales. Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, les nanoparticules sont monodisperses, et elles présentent en outre une granulométrie comprise entre 40 et 200 nm, et un écart-type sur la distribution granulométrique de préférence inférieur à 10 %, préférentiellement inférieur à 5 %. Le choix de telles plages de valeurs assure avantageusement que les nanoparticules présentent une taille qui est d'une part suffisamment faible pour qu'elles soient aptes à diffuser à travers les barrières cellulaires, et d'autre part suffisamment élevée pour autoriser une localisation sub-cellulaire aisée par microscopie électronique sur des coupes histologiques post-mortem.

En outre, les nanoparticules conformes à l'invention présentent avantageusement un haut poids moléculaire, de l'ordre de quelques centaines de grammes par mole, par exemple compris entre environ 242 et 414 g/mol selon les lanthanides mis en oeuvre, qui leur confère un pouvoir d'absorption des rayons X élevé, leur permettant de constituer de bons agents de contraste pour la tomographie par rayons X. Préférentiellement, les nanoparticules selon l'invention présentent une forme sensiblement sphérique, si bien qu'elles ne risquent pas d'endommager la membrane cellulaire, contrairement aux particules aciculaires. Dans des modes de réalisation préférés de l'invention, la couche de silice entrant dans la constitution de la coquille est du type mésoporeux, de sorte qu'elle constitue un réservoir permettant, par exemple, d'incorporer un principe actif dans la nanoparticule en fonction de l'application particulière visée. L'invention n'exclut pas pour autant les modes de réalisation dans lesquels la couche de silice est plus dense et non poreuse. Dans ce cas, il est avantageusement prévu selon l'invention que cette couche de silice soit plus fine, notamment d'épaisseur inférieure à 10 nm, alors qu'une couche mésoporeuse peut typiquement présenter une épaisseur d'environ 20 nm. Préférentiellement, le groupement réactif libre porté par la molécule dite de fonctionnalisation greffée par liaison covalente sur la couche de silice, est un groupement amine, acide carboxylique, alcool, thiol, aldéhyde ou époxyde. Une même nanoparticule peut le cas échéant comporter des groupements réactifs de types différents. Le groupement réactif permet avantageusement le couplage sur la particule d'une molécule d'intérêt présentant un groupement réactif coopérant, dite clef de reconnaissance biologique, qui permet de reconnaître spécifiquement une cible biologique donnée, et qui peut par exemple être, en fonction des applications visées, un peptide, l'avidine ou la streptavidine, un anticorps, ou tout autre molécule classique en elle-même connue pour une ou plusieurs des applications visées. La molécule de fonctionnalisation de la couche de silice joue en outre un rôle d'espaceur entre la molécule d'intérêt et la nanoparticule, qui présente typiquement une taille de l'ordre de 50 à 500 fois plus importante que la molécule d'intérêt, si bien qu'elle limite l'effet de l'encombrement stérique qui pourrait être généré par la nanoparticule et qui serait susceptible d'interférer avec les interactions se produisant dans le milieu de mesure entre la molécule d'intérêt et la cible biologique. A cet effet, il est avantageusement prévu, selon des modes de réalisation préférés de l'invention, que la molécule de fonctionnalisation présente une chaîne linéaire comportant de 12 à 18 atomes de carbone. L'invention concerne également un procédé de préparation de nanoparticules répondant à une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant, qui comporte les étapes de : - synthèse de nanoparticules d'hydroxycarbonate de terres rares répondant à la formule (II) : (XaYb)1/2(OH)(CO3) (II) dans laquelle X représente au moins un élément non émissif appartenant à la famille des lanthanides, Y représente au moins un élément appartenant à la famille des lanthanides émettant à des longueurs d'onde d'émission dans la région spectrale du visible (soit entre 400 et 800 nm) ou du proche infrarouge (soit entre 800 et 1 200 nm), et a+b=2, par réaction de nitrate de X et de nitrate de Y avec l'urée, à une 10 température supérieure ou égale à 65 °C, - sulfuration des nanoparticules d'hydroxycarbonate de terres rares répondant à la formule (II), suivie d'une étape de cristallisation par chauffage à une température supérieure ou égale à 800 °C, de sorte à former des nanoparticules d'oxysulfure de terres rares répondant à la formule (I), 15 - synthèse d'une couche de silice en surface des nanoparticules d'oxysulfure de terres rares répondant à la formule (I) ainsi obtenues, - fonctionnalisation de la couche de silice par liaison covalente de molécules dites de fonctionnalisation présentant au moins un groupement réactif libre, de telle sorte que ledit groupement réactif libre soit accessible en 20 surface desdites nanoparticules luminescentes hybrides, lesdites molécules de fonctionnalisation étant aptes à permettre la liaison de molécules d'intérêt sur une surface des nanoparticules ainsi obtenues. Selon des modes de mise en oeuvre préférés de l'invention, il est réalisé lors de la synthèse des nanoparticules d'hydroxycarbonate de terres 25 rares répondant à la formule (II), un contrôle continu du pH du milieu réactionnel et, lorsqu'il est observé que la valeur de ce pH atteint un plateau, un refroidissement rapide du milieu réactionnel, de préférence à une température comprise entre 0 et 25 °C, par exemple par mise à la température ambiante ou par immersion dans un bain d'eau et de glace. Une telle étape de contrôle du pH et de refroidissement s'avère particulièrement avantageuse, notamment car elle permet d'obtenir des nanoparticules dont la taille est maîtrisée, la morphologie est sphérique et la monodispersité est satisfaisante et conforme à un écart-type sur la distribution granulométrique inférieur à 5 0/0 tel que préconisé par la présente invention. Il a été observé par les présents inventeurs que cette phase de plateau est obtenue à une valeur de pH sensiblement égal à 6, en fonction des conditions opératoires particulières. Préférentiellement, ce refroidissement est suivi d'une étape de séparation des nanoparticules du milieu réactionnel, notamment par centrifugation, et de plusieurs rinçages à l'eau. Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, cette réaction met en outre de préférence en oeuvre, en tant que solvant, un mélange d'eau et d'un solvant organique, de préférence choisi parmi le groupe constitué de l'éthanol, l'isopropanol, le méthanol et l'acétone, l'éthanol étant particulièrement préféré, ledit solvant organique étant de préférence présent dans le mélange dans une proportion inférieure ou égale à 20 % en volume. Une telle caractéristique permet avantageusement de former des nanoparticules dont la taille est inférieure à celle qui est obtenue en l'absence de solvant organique dans le milieu aqueux.

Préférentiellement, cette réaction est effectuée à une température comprise entre 65 °C et 85 °C. Dans des modes de mise en oeuvre préférés de l'invention, l'étape de sulfuration est réalisée par mise en contact des nanoparticules d'hydroxycarbonate de terres rares répondant à la formule (II), placées dans une chambre dite de sulfuration, avec un gaz inerte contenant des vapeurs soufrées produites par introduction de ce gaz inerte dans du disulfure de carbone CS2 liquide. Ce dernier est en outre de préférence maintenu à une température comprise entre 2 et 6 °C, notamment d'environ 4 °C, ce qui permet avantageusement d'obtenir une tension de vapeur saturante constante.

Cette mise en contact est notamment assurée par balayage du gaz contenant les vapeurs soufrées dans la chambre de sulfuration dans laquelle sont placées les nanoparticules. De préférence, elle est réalisée à une température supérieure ou égale à 600 °C, de préférence à environ 750 °C, pendant un temps suffisant pour former des nanoparticules d'oxysulfure répondant à la formule (I) selon l'invention.

De façon tout à fait avantageuse, les nanoparticules d'oxysulfure de terres rares de formule (I) obtenues à l'issue d'une étape de sulfuration répondant aux caractéristiques ci-avant présentent une taille, une morphologie, et une monodispersité sensiblement similaires à celles des nanoparticules d'hydroxycarbonate de terres rares de formule (II) utilisées en tant que précurseurs pour cette étape. L'invention n'exclut pas pour autant que l'étape de sulfuration des nanoparticules d'hydroxycarbonate de terres rares soit réalisée par tout autre moyen, notamment par mise en oeuvre, en tant qu'agent de sulfuration, d'hydrogène sulfuré H2S, additionné à un gaz inerte tel que l'argon, ou encore par exemple du soufre solide vaporisé, entraîné là encore dans la chambre de sulfuration par un gaz inerte. L'étape de synthèse de la couche de silice autour du coeur formé par les nanoparticules d'oxysulfure de terres rares répondant à la formule (I) peut être réalisée par toute méthode connue en elle-même, de sorte à former des nanoparticules à structure coeur-coquille répondant à la formule (III) ci-après : XaO2S:Yb@mSiO2 (III) dans laquelle @mSiO2 représente, par convention, la coquille de silice mésoporeuse formée autour du coeur d'oxysulfure de lanthanide, et :Yb exprime que Y est un élément dopant introduit dans le coeur en petite quantité.

Cette coquille de silice sert avantageusement de base pour le greffage de la molécule de fonctionnalisation. Cette dernière est choisie de sorte à permettre une liaison ultérieure à une molécule d'intérêt adaptée à l'application visée. L'étape de fonctionnalisation du procédé selon l'invention peut être réalisée par toute méthode classique en elle-même.

Un procédé d'utilisation des nanoparticules luminescentes hybrides à structure coeur-coquille selon l'invention en tant que marqueurs luminescents pour des applications biologiques et médicales comprend les étapes de : - couplage de molécules d'intérêt sur la surface des nanoparticules, par réaction des groupements réactifs libres des molécules de fonctionnalisation avec des groupements coopérants portés par les molécules d'intérêt, - introduction des nanoparticules ainsi fonctionnalisées dans le milieu de mesure, - après un temps d'attente adéquat pour assurer une interaction entre la molécule d'intérêt et sa cible dans le milieu, excitation des nanoparticules à une longueur d'onde d'environ 360 nm, - et mesure de la luminescence des nanoparticules consécutive à cette excitation, de préférence entre 2 et 500 µs, préférentiellement entre 2 et 10 µs, après l'excitation, afin de permettre l'extinction préalable totale de l'auto- fluorescence du milieu biologique. Lorsque l'élément dopant est l'europium ou le terbium, l'excitation des nanoparticules peut en outre alternativement être effectuée à une longueur d'onde d'environ 488 nm, notamment au moyen d'un laser à gaz.

L'invention sera maintenant plus précisément décrite dans le cadre des exemples de mise en oeuvre particuliers ci-après, qui n'en sont toutefois nullement limitatifs. Exemples 1 à 3 - Synthèse de nanoparticules d'hydroxycarbonate (II) Exemple 1 Un mélange de nitrate de gadolinium Gd(NO3)3 et de nitrate d'europium Eu(NO3)3 dans un rapport molaire de 0,95/0,05, est ajouté à une concentration de 5,6.10-3 M dans une solution d'urée à la concentration de 0,5 M dans l'eau. La solution est placée dans un ballon fermé hermétiquement, et 30 agitée sous chauffage à une température de 85 °C. Il se forme progressivement un précipité blanc d'hydroxycarbonate de lanthanide. Il est effectué un contrôle continu du pH du milieu réactionnel. On observe que le pH augmente régulièrement, depuis une valeur initiale de 4, jusqu'à atteindre un plateau à la valeur de 6, après 2 h de réaction.

Le mélange réactionnel est alors immédiatement refroidi par immersion du ballon dans un bain glacé, puis il est centrifugé afin d'isoler le précipité formé. Ce dernier est ensuite lavé plusieurs fois à l'eau distillée pour éliminer l'urée et les précurseurs nitrate qui n'auraient pas réagi, puis séché à l'étuve à 80 °C pendant une nuit.

Après séchage, on obtient une poudre de (Gdo,95Euo,o5)(OH)(CO3). Cette poudre est constituée de nanoparticules sphériques, monodisperses, de 150 ± 5 nm de diamètre. Exemple 2 Le procédé de l'Exemple 1 est mis en oeuvre en utilisant en tant que solvant un mélange d'eau et d'éthanol dans des proportions respectives de 80 % et 20 % en volume. On obtient une poudre de (Gdo,95Euo,o5)(OH)(CO3) constituée de nanoparticules sphériques, monodisperses, de 100 ± 4,5 nm de diamètre. Un résultat similaire est obtenu en utilisant en tant que solvant un mélange d'eau et d'isopropanol, un mélange d'eau et de méthanol, ou un mélange d'eau et d'acétone, dans les mêmes proportions relatives que ci-dessus. Exemple 3 Le procédé de l'Exemple 1 est mis en oeuvre en utilisant en tant que solvant de l'eau, ou un mélange d'eau H2O et d'éthanol EtOH dans des proportions respectives de 80 % et 20 % en volume, aux différentes températures indiquées dans le Tableau 1 ci-après. Le temps de réaction, correspondant au temps pour atteindre le plateau de pH, est également indiqué dans ce Tableau 1.

12 On obtient là encore des poudres de (Gdo,95Euo,o5)(OH)(CO3) constituées de nanoparticules sphériques, monodisperses, dont le diamètre est indiqué dans le Tableau 1 : Solvant Température de Temps de Diamètre des nanoparticules chauffage (°C) réaction (h) obtenues (nm) H2O 75 2 110 H2O 70 4 80 H2O / EtOH 70 4 50 H2O / EtOH 65 24 40 Tableau 1 - Diamètre des nanoparticules (II) d'hydroxycarbonate de Gd dopé à l'Eu en fonction des conditions de réaction Exemple 4 - Sulfuration des nanoparticules d'hydroxycarbonate (II) La poudre de nanoparticules d'hydroxycarbonate obtenues conformément au procédé de l'Exemple 1 est placée dans une chambre de sulfuration. On fait circuler un flux d'argon dans du disulfure de carbone CS2 liquide maintenu dans un bain de glace à une température de 4 °C, de sorte à produire des vapeurs soufrées. Ces vapeurs sont entraînées par ce même flux gazeux jusqu'à la chambre de sulfuration. Les nanoparticules y sont soumises à un traitement à 750 °C sous balayage d'un mélange d'argon à un débit de 50 ml/min et de CS2 gazeux à un débit de 5 ml/min, pendant une durée de 90 min. L'oxysulfure de gadolinium dopé à l'europium ainsi obtenu est ensuite soumis à un recuit de 4 h à 1 000 °C sous atmosphère inerte, par exemple d'argon, de sorte à assurer sa cristallisation. On obtient des nanoparticules d'oxysulfure (Gdo,95Euo,05)2O25 qui sont sphériques, monodisperses, de 140 ± 5 nm de diamètre. Ce diamètre est proche du diamètre des nanoparticules d'hydroxycarbonate (II) de départ.

Exemple 5 - Synthèse d'une coquille de silice mésopreuse en surface des nanoparticules d'oxysulfure (I) 100 mg de nanoparticules de (Gdo,95Euo,05)2O25 synthétisées conformément à l'Exemple 4 sont dispersées dans l'éthanol et traitées par ultra-sons pendant 20 min. Ces nanoparticules sont ensuite séparées du solvant par centrifugation, et re-dispersées dans un mélange contenant : 80 ml d'eau distillée, 60 ml d'éthanol, 300 mg de bromure de cétytriméthylammonium (CTAB) et 1,344 ml d'une solution d'hydroxyde d'ammonium NH4OH à 25% en masse. La solution obtenue est agitée pendant 30 min. Ensuite, 430 pl de tétraéthoxysilane (TEOS) sont ajoutés en goutte à goutte à la solution, sous agitation. Après 6 h d'agitation, la solution est traitée par ultra-sons pendant 30 min puis filtrée à l'aide d'une seringue pour éliminer les agrégats de grande taille.

Le produit obtenu est séparé par centrifugation, lavé plusieurs fois à l'éthanol puis à l'eau. Il est ensuite séché sous air à 70 °C pendant 24 h. Le CTAB, ayant servi à la génération des pores, est éliminé en chauffant le produit dans 170 ml d'acétone sous reflux pendant 48 h. Les particules sont alors séparées par centrifugation et lavées à l'acétone, puis à l'eau, dans cet ordre. Ce procédé d'élimination du CTAB est répété 3 fois. Enfin, le produit obtenu est séché sous air à 70 °C pendant 12 h. On obtient des nanoparticules à structure coeur-coquille, comportant un coeur d'oxysulfure et une coquille de silice mésoporeuse, qui répondent à la formule (III) : Gdi,9O25:Euo,i@mSiO2. Ces particules sont sphériques, monodisperses, et elles présentent un diamètre de 180 ± 10 nm. Exemple 6 - Fonctionnalisation des nanoparticules à structure coeur-coquille (III) par la 3-Triethoxysilylpropylamine (APTES) Les nanoparticules obtenues conformément à l'Exemple 5 sont séchées à 120 °C sous vide pendant 3 h. 500 mg de ces nanoparticules sont ensuite mises en suspension dans 50 ml de toluène, et de l'APTES est ajoutée dans une proportion égale à 1 ; 0,5 ; 0,25 ; 0,2 ; 0,1 ou 0,05 moles par mole de Gd199O2S:Euo11. Le mélange est agité à reflux à 110 °C pendant 24 à 72 h, puis centrifugé et lavé plusieurs fois au toluène puis à l'éthanol, avant d'être séché à 110 °C sous vide. On obtient des nanoparticules présentant en surface des fonctions amine libres réactives, dont le nombre varie en fonction de la concentration en APTES utilisée.

Ces fonctions amine pourront ensuite avantageusement être utilisées pour des réactions de couplage à des molécules d'intérêt, par exemple de couplage peptidique, ou par des fonctionnalisations de type ester activé, tel que l'N-hydroxysuccinimide, ou isothiocyanate. Elles répondent à une excitation à une longueur d'onde de 360 nm, en émettant un rayonnement dans le domaine spectral du visible, à une longueur d'onde de 620 nm. La description ci-avant illustre clairement que par ses différentes caractéristiques et leurs avantages, la présente invention atteint les objectifs qu'elle s'était fixés. En particulier, elle fournit des nanoparticules luminescentes utilisables en tant que marqueurs pour de multiples types d'analyses tant biologiques que médicales, ainsi qu'un procédé pour leur préparation, qui leur confère des caractéristiques tout à fait avantageuses pour ces applications.

Claims (10)

1. REVENDICATIONS1. Nanoparticule luminescente hybride inorganique - organique à structure coeur-coquille, utilisable en tant que marqueur, caractérisée en ce qu'elle comporte : - un coeur formé d'une nanoparticule d'oxysulfure de terres rares répondant à la formule (I) : (XaYb)O2S (1) dans laquelle X représente au moins un élément non émissif appartenant à la famille des lanthanides, Y, dit élément dopant luminescent, représente au moins un élément appartenant à la famille des lanthanides émettant à des longueurs d'onde d'émission dans la région spectrale du visible ou du proche infrarouge, et a et b illustrant les nombres d'atomes respectivement de X et Y sont tels que a+b=2, - et une coquille formée d'une couche de silice fonctionnalisée de façon covalente par des molécules présentant au moins un groupement réactif libre accessible en surface de ladite nanoparticule luminescente hybride.
2. 2. Nanoparticule selon la revendication 1, caractérisée en ce que X représente un ou une pluralité d'éléments choisis dans le groupe constitué du gadolinium Gd, de l'yttrium et du lutétium Lu.
3. 3. Nanoparticule selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que Y représente un ou une pluralité d'éléments à longueur d'onde d'émission dans la région spectrale du visible, de préférence l'europium Eu3+ et/ou le terbium Tb3+
4. 4. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le rapport a/b est compris entre 18 et 50.
5. 5. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 1 à 4,caractérisée par une granulométrie comprise entre 40 et 200 nm, et un écart-type sur la distribution granulométrique inférieur à 10 %, de préférence inférieur à5%.
6. 6. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ladite couche de silice est mésoporeuse.
7. 7. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit groupement réactif libre est un groupement amine, acide carboxylique, alcool, thiol, aldéhyde ou époxyde.
8. 8. Procédé de préparation de nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes de : - synthèse de nanoparticules d'hydroxycarbonate de terres rares répondant à la formule (II) : (XaYb)1/2(OH)(CO3) (II) dans laquelle X représente au moins un élément non émissif appartenant à la famille des lanthanides, Y représente au moins un élément appartenant à la famille des lanthanides émettant à des longueurs d'onde d'émission dans la région spectrale du visible ou du proche infrarouge, et a+b=2, par réaction de nitrate de X et de nitrate de Y avec l'urée, à une 20 température supérieure ou égale à 65 °C, - sulfuration des nanoparticules d'hydroxycarbonate de terres rares répondant à la formule (II), suivie d'une étape de cristallisation par chauffage à une température supérieure ou égale à 800 °C, de sorte à former des nanoparticules d'oxysulfure de terres rares répondant à la formule (I), 25 - synthèse d'une couche de silice en surface des nanoparticules d'oxysulfure de terres rares répondant à la formule (I), - fonctionnalisation de ladite couche de silice par liaison covalente demolécules présentant au moins un groupement réactif libre, de telle sorte que ledit groupement réactif libre soit accessible en surface desdites nanoparticules luminescentes hybrides.
9. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est réalisé lors de ladite synthèse de nanoparticules d'hydroxycarbonate de terres rares répondant à la formule (II), un contrôle continu du pH du milieu réactionnel et, lorsqu'il est observé que la valeur dudit pH atteint un plateau, un refroidissement rapide dudit milieu réactionnel.
10. 10. Procédé selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que ladite étape de sulfuration est mise en oeuvre par mise en contact des nanoparticules d'hydroxycarbonate de terres rares répondant à la formule (II) avec un gaz inerte contenant des vapeurs soufrées produites par introduction dudit gaz inerte dans du disulfure de carbone CS2 liquide maintenu à une température d'environ 4 °C.