FR2921491B1

FR2921491B1 - Procede, dispositif et kit de biologie moleculaire permettant l'extraction du materiel genetique amplifiee.

Info

Publication number: FR2921491B1
Application number: FR0855849A
Authority: FR
Inventors: Yvon Cayre; Naoual Linda Benali-Furet; Janine Wechsler; Cecile Aucant
Original assignee: METAGENEX; SCREENCELL
Current assignee: METAGENEX; SCREENCELL
Priority date: 2007-09-21
Filing date: 2008-09-01
Publication date: 2019-08-09
Anticipated expiration: 2028-09-01
Also published as: US20090081772A1; WO2009047436A1; EP2191250A1; FR2921491A1; FR2921490B1; US20110104670A1; JP2010538672A; FR2921490A1

Abstract

Le procédé pour recueillir du matériel cellulaire de cellules particulières présentes dans un liquide comporte :- une étape (210) d'insertion du liquide dans un compartiment (105) par l'intermédiaire d'une ouverture supérieure (106) du compartiment, ledit compartiment présentant une ouverture inférieure (107), entre les deux ouvertures étant positionné un filtre (115) dont les micropores ont un diamètre intermédiaire entre celui des dites cellules particulières et celui d'autres cellules,- une étape (215) de filtration au cours de laquelle le principal du liquide et des dites autres cellules passe à travers le filtre,- une étape (230) de lyse et d'amplification de l'ADN et/ou de l'ARN et- une étape (250) de récupération du matériel génétique amplifié des cellules lysées, sur le filtre.

Description

La présente invention concerne un procédé, un dispositif et un kit debiologie moléculaire permettant l’extraction du matériel génétique amplifié decellules isolées sur filtre et la détection de mutations et des niveaux del’expression de gènes de sensibilité et de résistance aux thérapies ciblées.

Elle s’applique, en particulier à recueillir et à amplifier de façonuniforme l’ADN ou l’ARN de cellules particulières présentes dans un liquide,notamment le sang.

Certaines cellules particulières du sang, par exemple les cellulestumorales ou les cellules trophoblastiques, sont en très faible concentration etdoivent être concentrées pour une analyse cytopathologique. Cependant, parrapport aux cellules sanguines, elles sont de plus grande taille.

Il est connu, par exemple du document PCT/FR 2006/000562,d’appliquer un tampon de fixation à base de formaldéhyde à un échantillonsanguin pour fixer les cellules recherchées, puis de faire passer le liquiderésultant dans un filtre poreux. Ce filtre est ensuite analysé en laboratoire poury rechercher les cellules sous microscope. On peut, par la suite, les préleversur le filtre pour des analyses, par exemple par une analyse génétique.Cependant, cette procédure ne peut faire l’objet d’une reproduction à grandeéchelle et à un coût raisonnable, du fait du temps, des matériels et de laprécision de travail qu’elle implique.

Cela permettrait la conduite d’analyses de biologie moléculaire à lafois sur des cellules tumorales et sur des cellules trophoblastiques.

La présente invention vise à remédier à ces inconvénients et àrépondre à ce besoin en permettant de recueillir dans des conditionscompatibles avec des examens de laboratoire de routine, une grandeproportion du matériel cellulaire, en particulier, ARN et ADN, des cellulesconsidérées, en bon état. A cet effet, selon un premier aspect, la présente invention vise unprocédé pour recueillir du matériel cellulaire de cellules particulières présentesdans un liquide, caractérisé en ce qu’il comporte : - une étape d’insertion du liquide dans un compartiment parl’intermédiaire d’une ouverture supérieure du compartiment, ledit compartimentprésentant une ouverture inférieure, entre les deux ouvertures étant positionnéun filtre dont les micropores ont un diamètre intermédiaire entre celui des ditescellules particulières et celui d’autres cellules, - une étape de filtration au cours de laquelle le principal du liquide etdes dites autres cellules passe à travers le filtre, - une étape de lyse et d’amplification de l’ADN et/ou de l’ARN et - une étape de récupération du matériel génétique amplifié descellules lysées, sur le filtre.

Le procédé objet de la présente invention permet de recueillir dumatériel cellulaire rapidement et efficacement.

Selon des caractéristiques particulières, au cours de l’étape de lyseet d’amplification, on effectue une amplification uniforme conservant l’aspectquantitatif de l’ADN et de l’ARN.

Selon des caractéristiques particulières, le procédé objet de laprésente invention, tel que succinctement exposé ci-dessus, comporte, enoutre, une étape de détection, au cours de laquelle l’ADN amplifié est utilisécomme matrice pour détecter au moins une mutation de gêne de sensibilité oude résistance à au moins une thérapie ciblée.

Selon des caractéristiques particulières, le procédé objet de laprésente invention, tel que succinctement exposé ci-dessus, comporte, enoutre, une étape de détection, au cours de laquelle l’ADN amplifié est utilisécomme matrice pour détecter une variation de niveau d’expression de gènes desensibilité ou de résistance aux thérapies ciblées.

Selon des caractéristiques particulières, le procédé objet de laprésente invention, tel que succinctement exposé ci-dessus, comporte, enoutre, une étape de détection au cours de laquelle on convertit de l’ARN en ADNc et on utilise ledit ADNc pour détecter le niveau d’expression de gène desensibilité ou de résistance aux thérapies ciblées.

Selon des caractéristiques particulières, au cours de l’étape dedétection, on met en œuvre une PCR (acronyme de « polymerase chainreaction ») quantitative et en temps réel.

Selon des caractéristiques particulières, au cours de l’étape dedétection, on met en œuvre au moins un couple d’amorces sens et anti-senspour amplifier une séquence d'intérêt prédéterminé.

Selon des caractéristiques particulières, au cours de l’étape dedétection, on met en œuvre au moins un couple de sondes.

Selon des caractéristiques particulières, au moins deux sondes d’uncouple de sondes sont couplées à deux fluorochromes différents et sont définispour que l’une reconnaisse la séquence mutée et que l'autre reconnaisse laséquence normale.

Selon des caractéristiques particulières, au moins un coupled’amorces et un couple de sondes sont adaptés à détecter la mutation G12D dugène K-ras de résistance à l’Erlotinib et au Gefitinib.

Selon des caractéristiques particulières, au moins une amorcecomporte au moins 80 % de la séquence AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT.

Selon des caractéristiques particulières, au moins une amorcecomporte au moins 80 % de la séquence TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT.

Selon des caractéristiques particulières, au moins une sonde comporte au moins 80 % de la séquence TTGGAGCTGGTGGCGT.

Selon des caractéristiques particulières, au moins une sonde comporte au moins 80 % de la séquence TGGAGCTGATGGCGT.

Selon des caractéristiques particulières, au moins un couple d’amorces et un couple de sondes sont adaptés à détecter la mutation G12V dugène K-ras de résistance à l’Erlotinib et au Gefitinib.

Selon des caractéristiques particulières, au moins une sondecomporte au moins 80 % de la séquence TTGGAGCTGGTGGCGT.

Selon des caractéristiques particulières, au moins une sondecomporte au moins 80 % de la séquence TTGGAGCTGTTGGCGT.

Selon des caractéristiques particulières, au moins un coupled’amorces et un couple de sondes sont adaptés à détecter la mutation G13C dugène K-ras de résistance à l’Erlotinib et au Gefitinib.

Selon des caractéristiques particulières, au moins une sondecomporte au moins 80 % de la séquence TTGGAGCTGGTTGCGT.

Selon des caractéristiques particulières, au moins un coupled’amorces et un couple de sondes sont adaptés à détecter la mutation L858Rdu gène EGFR de sensibilité augmentée à l’Erlotinib et au Gefitinib.

Selon des caractéristiques particulières, au moins une amorcecomporte au moins 80 % de la séquence GCAGCATGTCAAGATCACAGATTT.

Selon des caractéristiques particulières, au moins une amorcecomporte au moins 80 % de la séquence CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT.

Selon des caractéristiques particulières, au moins une sondecomporte au moins 80 % de la séquence CAGTTTGGCCAGCCCA.

Selon des caractéristiques particulières, au moins une sondecomporte au moins 80 % de la séquence CAGTTTGGCCCGCCCA.

Selon un deuxième aspect, la présente invention vise un dispositifpour recueillir du matériel génétique de cellules particulières présentes dans unliquide, caractérisé en ce qu’il comporte : - un compartiment comportant une ouverture supérieure et uneouverture inférieure, entre les deux ouvertures étant positionné un filtre dont lesmicropores ont un diamètre intermédiaire entre celui des dites cellulesparticulières et celui d’autres cellules, - un moyen d’insertion du liquide dans ledit compartiment parl’intermédiaire de l’ouverture supérieure, - un moyen de filtration faisant passer le principal du liquide et desdites autres cellules à travers le filtre, - un moyen de lyse des cellules retenues sur le filtre etd’amplification de l’ADN et/ou de l’ARN et - un moyen de récupération du matériel génétique amplifié descellules lysées, sur le filtre.

Selon un troisième aspect, la présente invention vise un kit debiologie moléculaire comportant au moins deux amorces et/ou deux sondesparmi les séquences suivantes : - AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT, - TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT, - TTGGAGCTGGTGGCGT, - TGGAGCTGATGGCGT, - AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT, - TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT, - TTGGAGCTGGTGGCGT, - TTGGAGCTGTTGGCGT, - AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT, - TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT, - TTGGAGCTGGTGGCGT, - TTGGAGCTGGTTGCGT, - GCAGCATGTCAAGATCACAGATTT, - CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT, - CAGTTTGGCCAGCCCA et - CAGTTTGGCCCGCCCA.

Selon des caractéristiques particulières, le kit objet de la présenteinvention, tel que succinctement exposé ci-dessus comporte, en outre, undispositif objet de la présente invention, tel que succinctement exposé ci-dessus.

Les avantages, buts et caractéristiques de ce dispositif et de ce kitétant similaires à ceux du procédé objet de la présente invention, tel quesuccinctement exposé ci-dessus, ils ne sont pas rappelés ici. D’autres avantages, buts et caractéristiques de la présente inventionressortiront de la description qui va suivre, faite, dans un but explicatif etnullement limitatif en regard des dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 représente, schématiquement, en perspective, despièces de deux modes de réalisation particuliers du dispositif objet de laprésente invention, mises en œuvre dans une première phase du procédé objetde la présente invention, - la figure 2 représente, schématiquement, en coupe, des pièces desdeux modes de réalisation particuliers du dispositif objet de la présenteinvention, mises en œuvre dans une première phase du procédé objet de laprésente invention, - la figure 3 représente, schématiquement, en perspective, despièces d’un premier mode de réalisation particulier du dispositif objet de laprésente invention, - la figure 4 représente, schématiquement, en élévation, des piècesdu premier mode de réalisation particulier du dispositif objet de la présenteinvention, - la figure 5 représente, schématiquement, en coupe, des pièces dupremier mode de réalisation particulier du dispositif objet de la présenteinvention, - la figure 6 représente, schématiquement, en perspective, despièces d’un deuxième mode de réalisation particulier du dispositif objet de laprésente invention, - la figure 7 représente, schématiquement, en coupe, des pièces dudeuxième mode de réalisation particulier du dispositif objet de la présenteinvention - la figure 8 représente, schématiquement, en perspective, despièces des deux modes de réalisation particuliers du dispositif objet de laprésente invention, utilisés dans une deuxième phase du procédé objet de laprésente invention et - la figure 9 représente, sous forme d’un logigramme, des étapesmises en œuvre dans un mode de réalisation particulier du procédé objet de laprésente invention.

Comme on l’observe en regard des figures 1 et 2, dans les deuxmodes de réalisation illustrés dans les figures, le dispositif pour recueillir dumatériel cellulaire, ici génétique, comporte des (ici quatre) compartiments enforme de seringue 105 présentant, chacun, une ouverture supérieure 106 etune ouverture inférieure 107. Une rondelle ou bague 118 placée dansl’ouverture inférieure 107 retient un filtre 115. Les filtres 115 sont micro perforéset collés sur les rondelles ou bagues 118 puis insérés à l’extrémité distale,c’est-à-dire au fond, des quatre compartiments en forme de seringue 105. Parexemple, le filtre 115 est réalisé en polycarbonate avec un traitement desurface hydrophile. L’utilisation d’un tel filtre améliore le taux de retenu descellules particulières et réduit l’adhérence du matériel cellulaire à récupérer. Lefiltre 115 présente, par exemple, un diamètre de pores centré sur 7,5 pm. Dufait de la dispersion des diamètres, pratiquement aucun pore ne possède alorsun diamètre supérieur à 8 pm. A la petite ouverture, ou ouverture inférieure, de chaquecompartiment 105 est placé, de façon étanche, un embout (en anglais « tip ») 117 afin d’éviter de potentielles contaminations de l’extrémité du compartiment105 par des éclaboussures provenant du réservoir 112. Ces compartiments 105sont assemblés par une barrette 116, en matière plastique, pour constituer unepièce unique. L’ensemble, ainsi constitué des quatre compartiments 105, de labarrette supérieure 116, les quatre pistons 140 et la barrette-bouchon 120(décrite plus loin) est à usage unique.

Dans la première phase du procédé pour recueillir du matérielcellulaire, les compartiments 105 sont supportés par une platine 110 inséréedans un porte-tiroir 111 comportant un compartiment relié à un réservoir 112sous la surface inférieure de la platine 110 par laquelle une aspiration peut êtreeffectuée. Un joint torique 113 assure l’étanchéité de la liaison entre un embout117 et la platine 110. Un joint torique 114 assure l’étanchéité de la liaison entrela platine 110 et le porte tiroir 111. L’étanchéité offerte par les joints toriques113 et 114 permet l’aspiration du contenu des compartiments.

Lors de l’aspiration par le réservoir 112, certaines cellulesparticulières du liquide présent dans le compartiment 105, de plus fort diamètre,sont retenues par le filtre 115 alors que le principal du liquide et des cellules depetites dimensions sont aspirées en dehors du compartiment 105, à travers lefiltre 115. A la fin de la première phase du procédé pour recueillir du matérielcellulaire, les compartiments 105 sont retirés de la partie du dispositif illustréeen figures 1 et 2 et les embouts 117 sont retirés des ouvertures inférieures descompartiments 105. Puis, une barrette-bouchon 120 est insérée à l’embout descompartiments 105 en forme de seringues. Il s’agit d’une barrette avec quatreperforations qui reçoivent l’embout inférieur des compartiments. Un film-plastique est collé à la face inférieure de cette barrette-bouchon 120, etconstitue une membrane étanche, préférentiellement adhésive.

Le contenu du compartiment 105 est ainsi maintenu à l’écart del’environnement jusqu’à la récupération du matériel cellulaire des cellulesparticulières.

Lors de la deuxième phase du procédé, la barrette 116, portant lescompartiments 105, associés à la barrette de bouchons 120, est mise en appui sur un portoir 133 en matière plastique. Puis, on réalise, en étuve, la lyse descellules présentes dans le compartiment 105. A cet effet, après l’addition desréactifs pour la lyse des membranes cellulaires des cellules recherchées etl’amplification uniforme de l’ADN ou de l’ARN, le portoir 133, maintenant lescompartiments 105 verticaux, est transporté dans une étuve. A la sortie del’étuve, après refroidissement, on positionne les tubes de type Eppendorf sur lesupport inférieur 131 du portique 130. On positionne la barrette 116 portant lescompartiments 105, associés à la barrette de bouchons 120 sur le portique 130et on place le portique 130 sur le support inférieur 131.

Ensuite, par l’ouverture supérieure 106 de chaque compartiment105, est inséré un piston 140 muni d’un poinçon axial central 141 se finissantpar une pointe 142. Préférentiellement, en coupe, cette pointe 142 présenteune forme en étoile, par exemple à quatre branches, la pointe étant alorscruciforme.

En dessous de chaque compartiment 105 est positionné un tube detype Eppendorf 125 retenu en position par une étagère du portique 130.

Les figures 3 et 4 illustrent les positions respectives successives dupiston 140 et du poinçon 141 au cours de la deuxième phase du procédé. Agauche de chacune de ces figures 3 et 4, le piston 140 et le poinçon 141 sontpratiquement intégralement en dehors du compartiment 106 et la partiesupérieure du poinçon 141 dépasse verticalement au dessus du piston 140.

Puis, par application d’une rotation, on fait passer le poinçon d’uneposition de sécurité dans laquelle le poinçon 141 ne peut pas coulisserlongitudinalement à l’intérieur d’un piston 140 du fait d’une butée mécanique, àune position d’activation dans laquelle le poinçon peut coulisserlongitudinalement à l’intérieur du piston 140. Ensuite, on applique une forceverticale vers le bas sur le sommet du poinçon 141, on fait descendre la pointe142 de ce poinçon 141 dans le corps du compartiment 106, vers le filtre 115. Enpoursuivant cette descente, la pointe 142 perce d’abord le filtre 115 puis lamembrane 120 jusqu’à pénétrer légèrement dans le tube 125. Le poinçon 141est alors maintenu en position par contact sur l’ouverture inférieure ducompartiment 105. Enfin, comme représenté à droite des figures 3 et 4, en maintenant en place le poinçon 141, on applique une force vers le bas sur lepiston 140 afin qu’il repousse le contenu du compartiment 105 vers le tube 125,par l’intermédiaire du trou formé dans le filtre 115 et dans la membrane 120 parla pointe du poinçon 142.

Les tubes de type Eppendorf 125 sont ensuite retirés du supportinférieur 131, par retrait, vers le haut du portique 130, des compartiments 105 etde la membrane 120, pour analyse du matériel génétique amplifié, notammentl’ADN ou l’ARN des cellules d’intérêt, recueillis dans ces tubes 125.

On note que la platine 110, le portoir 133, le portique 130 et lesupport 131 sont réutilisables.

Dans le deuxième mode de réalisation, illustré en regard des figures1, 2, 6 et 7, un support 131 du portique 130 est remplacé par un support 132présentant huit ouvertures au lieu de quatre. Les quatre tubes de typeEppendorf 125 sont remplacés par une barrette de huit tubes de typeEppendorf 126 de capacité inférieure, typiquement de 0.25 ml. Au lieu de 1,5ml. Ces tubes de type Eppendorf sont adaptés à un autre mode de récupérationde matériel cellulaire permettant d’extraire le matériel génétique amplifiédirectement sur le filtre mais dans un plus petit volume. Un tel volume peutalors être contenu dans des tubes de type Eppendorf directement adaptés à unappareil de RT-PCR (acronyme de « reverse transcription polymerase chainreaction » pour transcription reverse et réaction en chaîne à la polymerase) entemps réel. On note que, lors de l’utilisation de huit tubes de type Eppendorf,quatre tubes servent à recueillir du matériel génétique amplifié et quatre tubesservent à réaliser des témoins, positifs ou négatifs.

Comme on l’observe en figure 9, le procédé objet de la présenteinvention comporte d’abord, de manière connue, une étape 200 de prélèvementd’un échantillon de liquide à analyser, par exemple de sang auquel on applique,éventuellement, une dilution ou une filtration.

Au cours d’une étape 205, on applique un tampon de fixation sansformaldéhyde afin de fixer, c’est-à-dire durcir, spécifiquement les cellulesparticulières recherchées, sans altérer leur matériel génétique.

Par exemple, ce tampon de fixation est composé de « PBS », untampon de phosphate, de saponine pour lyser les globules rouges de BSA,sérum albumine bovine pour préserver la morphologie des cellules de l’ETDAchélateur de calcium, de soude (NaOH) pour ajuster le pH à 7,2 et de RCL2, unfixateur de cellules n’altérant pas leur matériel génétique. On note que leformaldéhyde n’est pas utilisé car il induit des cassures dans le matérielgénétique.

Au cours d’une étape 210, on place le liquide résultant de l’étape 205dans un compartiment 105 qui se termine par un filtre dont les micropores ontun diamètre intermédiaire entre celui des cellules recherchées et celui desautres cellules de l’échantillon de liquide. En variante, on effectue la fixation del’étape 205 à l’intérieur du compartiment 105, après l’étape 210.

Au cours d’une étape 215, on applique une aspiration par dépressionen dessous du filtre. Le principal du liquide ainsi que les cellules de diamètreinférieur à celui des pores du filtre 115 traversent alors le filtre 115. Enrevanche, les cellules recherchées de diamètre inférieur à celui des pores dufiltre 115 sont retenues au dessus du filtre 115, dans le compartiment 105.

Au cours d’une étape 220, on retire les compartiments de la platine110, on retire les embouts 117 des compartiments 105 et on isole ce contenurestant dans le compartiment 105 en bouchant l’ouverture inférieure par unebarrette-bouchon recouverte, dans sa partie inférieure d’une membraneadhésive 120.

Au cours d’une étape 225, les compartiments 105, associés d’unepart à la barrette de bouchons 120 et à la barrette 116, sont insérés dans leportoir 133, la barrette 116 étant maintenue par ce portoir 133.

Au cours d’une étape 230, on lyse les cellules retenues sur le filtre,selon des techniques connues. A cet effet, après l’addition des réactifs pour lalyse des membranes cellulaires des cellules recherchées et l’amplificationuniforme du matériel génétique conservant l’aspect quantitatif, le portoir 133,maintenant les compartiments 105 verticaux, est maintenu dans une étuvependant une durée connue.

Après la sortie de l’étuve, au cours d’une étape 232, on retire duportoir 133, la barrette 116, les compartiments 105 et la barrette de bouchons120 et on les place sur le portique 130.

Au cours d’une étape 235, on place chaque compartiment 105 audessus d’un tube du type Eppendorf 125, ou 126 en positionnant ce tube sur lesupport inférieur, 131 ou 132 respectivement, puis on positionne le portique 130avec la barrette 116, les compartiments 105 et la barrette de bouchons 120 surla partie inférieure 131, ou 132, respectivement.

Au cours d’une étape 240, par l’ouverture supérieure 106 de chaquecompartiment 105, est inséré un piston 140 muni d’un poinçon axial central 141mobile par rapport au piston 140 et se finissant, à l’intérieur du compartiment105, par une pointe 142. Préférentiellement, en coupe transversale, cette pointe142 présente une forme en étoile, par exemple à quatre branches, la pointeétant alors cruciforme.

Au cours d’une étape 245, on tourne le poinçon pour le sortir de saposition de sécurité. Puis, on applique une pression sur la partie haute dupoinçon 141 pour le faire descendre le long de l’axe longitudinal ducompartiment 105, en étant guidé par le piston 140. Au cours de cedéplacement longitudinal, la pointe 142 du poinçon 141 perfore,successivement, le filtre 115 et le bouchon ou la membrane adhésive 120.

Au cours d’une étape 250, on applique une pression sur le reste dupiston 140 pour que le contenu restant du compartiment 105 passe à travers lefiltre 115 et le bouchon ou la membrane 120, et atteigne le tube de typeEppendorf, par l’ouverture entourant la pointe 142 du poinçon 141.

Ainsi, le matériel génétique des cellules particulières est extrait sansdétérioration à travers la perforation du filtre.

Au cours d’une étape 255, le support, 131 ou 132, et les tubes detype Eppendorf, 125 ou 126, sont retirés après retrait, vers le haut du portique130, des compartiments 105 et de la membrane 120.

Au cours d’étapes 265 et 270, on effectue une analyse du matérielgénétique, notamment l’ADN ou l’ARN des cellules recherchées, recueilli dansces tubes 125 ou 126. L’ADN amplifié est utilisé comme matrice pour détecter les mutations de sensibilité ou de résistance aux thérapies ciblées. De plus, oualternativement, l’ADNc (en anglais « cDNA », « c » signifiant « complémentaire ») provenant de l’ARN par conversion par RT et amplifié estutilisé comme matrice pour détecter le niveau d’expression de gènes desensibilité ou de résistance aux thérapies ciblées.

Un volume défini du matériel génétique amplifié, notamment l’ADN,est prélevé pour détecter les mutations de sensibilité ou de résistance auxthérapies ciblées à l’aide de couples d’amorces (en anglais « primers ») sens etanti-sens et de couples de sondes et au cours d’une PCR (acronyme de« polymerase chain reaction ») quantitative et en temps réel.

Le principe de la recherche de mutations de sensibilité ou derésistance aux thérapies ciblées mis en œuvre dans le mode de réalisationreprésenté est le suivant. La discrimination allélique ou « SNP genotypingassay » (SNP étant l’acronyme de « single nucléotide polymorphism » pourpolymorphisme nucléotide simple) permet de renseigner sur la présence oul’absence d’une mutation ponctuelle au niveau d’un gène. La première étape,265, d’une discrimination allélique est une réaction de PCR quantitative entemps réel réalisée avec deux amorces pour amplifier la séquence d'intérêt etdeux sondes, par exemple de type TaqMan (marque déposée). L'une dessondes reconnaît la séquence mutée et l'autre reconnaît la séquence normale.Les deux sondes sont associées à des fluorochromes différents, par exemple« VIC » pour la sonde s'hybridant à la séquence normale et « FAM » pour lasonde s'hybridant à la séquence mutée. La seconde étape, 270, fait appel à unprogramme de discrimination allélique mesurant la fluorescence initiale et lafluorescence finale émise par les fluorochromes FAM ou/et VIC. Ce programmepermet de faire la distinction entre les différentes séquences présentes danschaque échantillon : - une augmentation de la fluorescence uniquement en VIC indiqueun profil homozygote pour la séquence normale, - une augmentation de la fluorescence uniquement en FAM indiqueun profil homozygote pour la séquence mutée, - une augmentation de la fluorescence à la fois en VIC et en FAMindique un profil hétérozygote.

Pour la détection de mutations, on met en œuvre, par exemple, lesséquences des amorces et sondes suivantes (sens et anti-sens, 5’ à 3’) :

Pour la mutation G12D du gène K-ras de résistance à l’Erlotinib et auGefitinib : - amorce sens (ou « forward ») AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT, amorce anti-sens (ou « reverse ») TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT, - sondes « sauvage », couleur « VIC » TTGGAGCTGGTGGCGT, - sonde « muté », couleur « FAM » TGGAGCTGATGGCGT.

Pour la mutation G12V (codant « 12 ») du gène K-ras de résistanceà l’Erlotinib et au Gefitinib : - amorce sens (ou « forward ») AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT, amorce anti-sens (ou « reverse ») TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT, - sondes « sauvage », couleur « VIC » TTGGAGCTGGTGGCGT, - sonde « muté », couleur « FAM » TTGGAGCTGTTGGCGT.

Pour la mutation G13C du gène K-ras de résistance à l’Erlotinib et auGefitinib : - amorce sens (ou « forward ») AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT, amorce anti-sens (ou « reverse ») TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT, - sondes « sauvage », couleur « VIC » TTGGAGCTGGTGGCGT, - sonde « muté », couleur « FAM » TTGGAGCTGGTTGCGT.

Pour la mutation L858R du gène EGFR de sensibilité augmentée àl’Erlotinib et au Gefitinib : - amorce sens (ou « forward ») GCAGCATGTCAAGATCACAGATTT, - amorce anti-sens (ou « reverse ») CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT, - sondes « sauvage », couleur « VIC » CAGTTTGGCCAGCCCA, - sonde « muté », couleur « FAM » CAGTTTGGCCCGCCCA.

La signification de « sens » et « anti-sens », et « 5’ à 3’ » est bienconnue de l’homme du métier. Les sondes s’apparient entre les deux amorceset révèlent la présence ou l’absence d’une mutation du fait de leur couleur defluorescence associée. Pour mémoire, la couleur « FAM » est dans les bleus etla couleur « VIC » est dans les verts. Une mesure de l’intensité de lafluorescence dans chacune de ces couleurs, par l’appareil de PCR, permet dediscriminer les gènes normaux, les gènes homozygotes mutés et les gèneshétérozygotes mutés. Par exemple, on réalise 50 cycles d’amplification.

Dans d’autres modes de réalisation, un volume défini du matérielgénétique notamment l’ARN converti en ADNc par RT (acronyme de « reversetranscription ») et amplifié est prélevé pour détecter le niveau d’expression degène de sensibilité ou de résistance aux thérapies ciblées à l’aide de couplesd’amorces sens et anti-sens et d’une sonde et au cours d’une PCR (acronymede « polymerase chain reaction ») quantitative et en temps réel, par exempleavec 50 cycles.

Comme on le comprend à la lecture de la description, le procédé, ledispositif et le kit objets de la présente invention permettent de recueillir etd’amplifier dans des conditions compatibles avec des examens de laboratoirede routine, une grande proportion du matériel génétique des cellulesconsidérées, en bon état, même si l’échantillon ne comporte qu’une seulecellule recherchée.

Claims

REVENDICATIONS

1 - Procédé pour recueillir du matériel cellulaire de cellulesparticulières présentes dans un liquide, caractérisé en ce qu’il comporte,successivement : - une étape (210) d’insertion du liquide dans un compartiment (105)par l’intermédiaire d’une ouverture supérieure (106) du compartiment, leditcompartiment présentant une ouverture inférieure (107), entre les deuxouvertures étant positionné un filtre (115) dont les micropores ont un diamètreintermédiaire entre celui des dites cellules particulières et celui d’autrescellules, - une étape (215) de filtration au cours de laquelle le principal duliquide et des dites autres cellules passe à travers le filtre, - une étape (230) de lyse et d’amplification de l’ADN et/ou de l’ARNet - une étape (250) de récupération du matériel génétique amplifié descellules lysées, sur le filtre.
2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, aucours de l’étape (230) de lyse et d'amplification, on effectue une amplificationuniforme conservant l’aspect quantitatif de l’ADN ou de l’ARN. 3 - Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2,caractérisé en ce qu’il comporte, en outre, une étape (265, 270) de détection,au cours de laquelle l’ADN amplifié est utilisé comme matrice pour détecter aumoins une mutation de gêne de sensibilité ou de résistance à au moins unethérapie ciblée. 4 - Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2,caractérisé en ce qu’il comporte, en outre, une étape (265, 270) de détection,au cours de laquelle l’ADN amplifié est utilisé comme matrice pour détecter unevariation de niveau d’expression de gènes de sensibilité ou de résistance auxthérapies ciblées. 5 - Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2,caractérisé en ce qu’il comporte, en outre, une étape (265, 270) de détection,au cours de laquelle on convertit de l’ARN en ADNc et on utilise ledit ADNcpour détecter le niveau d’expression de gène de sensibilité ou de résistanceaux thérapies ciblées. 6 - Procédé selon l’une quelconque des revendications 3 à 5,caractérisé en ce que, au cours de l’étape (265, 270) de détection, on met enœuvre une PCR (acronyme de « polymerase chain reaction ») quantitative eten temps réel. 7 - Procédé selon l’une quelconque des revendications 3 à 6,caractérisé en ce que, au cours de l’étape (265, 270) de détection, on met enœuvre au moins un couple d’amorces sens et anti-sens pour amplifier uneséquence d'intérêt prédéterminé. 8 - Procédé selon l’une quelconque des revendications 3 à 7,caractérisé en ce que, au cours de l’étape (265, 270) de détection, on met enœuvre au moins un couple de sondes. 9 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu’au moinsdeux sondes d’un couple de sondes sont couplées à deux fluorochromesdifférents et sont définis pour que l’une reconnaisse la séquence mutée et quel'autre reconnaisse la séquence normale. 10 - Procédé selon l’une quelconque des revendications 6 ou 7 etune des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce qu’au moins un coupled’amorces et un couple de sondes sont adaptés à détecter la mutation G12Ddu gène K-ras de résistance à l’Erlotinib et au Gefitinib. 11 - Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu’au moins une amorce comporte au moins 80 % de la séquence AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT.
12 - Procédé selon l’une quelconque des revendications 10 ou 11,caractérisé en ce qu’au moins une amorce comporte au moins 80 % de laséquence TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT . 13 - Procédé selon l’une quelconque des revendications 10 à 12,caractérisé en ce qu’au moins une sonde comporte au moins 80 % de la séquence TTGGAGCTGGTGGCGT.
14 - Procédé selon l’une quelconque des revendications 10 à 13,caractérisé en ce qu’au moins une sonde comporte au moins 80 % de laséquence TGGAGCTGATGGCGT. 15 - Procédé selon l’une quelconque des revendications 6 ou 7 etune des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce qu’au moins un coupled’amorces et un couple de sondes sont adaptés à détecter la mutation G12Vdu gène K-ras de résistance à l’Erlotinib et au Gefitinib. 16 - Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu’au moins une amorce comporte au moins 80 % de la séquence AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT.
17 - Procédé selon l’une quelconque des revendications 15 ou 16,caractérisé en ce qu’au moins une amorce comporte au moins 80 % de laséquence TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT. 18 - Procédé selon l’une quelconque des revendications 15 à 17,caractérisé en ce qu’au moins une sonde comporte au moins 80 % de laséquence TTGGAGCTGGTGGCGT. 19 - Procédé selon l’une quelconque des revendications 15 à 18,caractérisé en ce qu’au moins une sonde comporte au moins 80 % de laséquence TTGGAGCTGTTGGCGT. 20 - Procédé selon l’une quelconque des revendications 6 ou 7 etune des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce qu’au moins un coupled’amorces et un couple de sondes sont adaptés à détecter la mutation G13Cdu gène K-ras de résistance à l’Erlotinib et au Gefitinib. 21 - Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce qu’au moins une amorce comporte au moins 80 % de la séquence AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT.
22 - Procédé selon l’une quelconque des revendications 20 ou 21,caractérisé en ce qu’au moins une amorce comporte au moins 80 % de laséquence TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT. 23 - Procédé selon l’une quelconque des revendications 20 à 22,caractérisé en ce qu’au moins une sonde comporte au moins 80 % de la séquence TTGGAGCTGGTGGCGT.
24 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 à 23,caractérisé en ce qu’au moins une sonde comporte au moins 80 % de laséquence TTGGAGCTGGTTGCGT 25 - Procédé selon l’une quelconque des revendications 6 ou 7 etune des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce qu’au moins un coupled'amorces et un couple de sondes sont adaptés à détecter la mutation L858Rdu gène EGFR de sensibilité augmentée à l’Erlotinib et au Gefitinib. 26 - Procédé selon l’une revendication 25, caractérisé en ce qu’au moins une amorce comporte au moins 80 % de la séquence GCAGCATGTCAAGATCACAGATTT.
27 - Procédé selon l’une quelconque des revendications 25 ou 26,caractérisé en ce qu’au moins une amorce comporte au moins 80 % de laséquence CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT. 28 - Procédé selon l’une quelconque des revendications 25 à 27,caractérisé en ce qu’au moins une sonde comporte au moins 80 % de laséquence CAGTTTGGCCAGCCCA. 29 - Procédé selon l’une quelconque des revendications 25 à 28,caractérisé en ce qu’au moins une sonde comporte au moins 80 % de laséquence CAGTTTGGCCCGCCCA. 30 - Dispositif pour recueillir du matériel génétique de cellulesparticulières présentes dans un liquide, caractérisé en ce qu’il comporte : - un compartiment (105) comportant une ouverture supérieure (106)et une ouverture inférieure (107), entre les deux ouvertures étant positionné unfiltre (115) dont les micropores ont un diamètre intermédiaire entre celui desdites cellules particulières et celui d’autres cellules, - un moyen d’insertion du liquide dans ledit compartiment parl’intermédiaire de l’ouverture supérieure, - un moyen (111, 112) de filtration faisant passer le principal duliquide et des dites autres cellules à travers le filtre, - un moyen de lyse des cellules retenues sur le filtre après action dumoyen de filtration et d’amplification de l’ADN et/ou de l’ARN et - un moyen de récupération du matériel génétique amplifié descellules lysées, sur le filtre.
31 - Kit de biologie moléculaire comportant au moins deux amorceset/ou deux sondes parmi les séquences suivantes : - AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT, - TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT, - TTGGAGCTGGTGGCGT, - TGGAGCTGATGGCGT, - AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT, - TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT, - TTGGAGCTGGTGGCGT, - TTGGAGCTGTTGGCGT, - AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT, - TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT, - TTGGAGCTGGTGGCGT, - TTGGAGCTGGTTGCGT, - GCAGCATGTCAAGATCACAGATTT, - CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT, - CAGTTTGGCCAGCCCA et - CAGTTTGGCCCGCCCA. 32 - kit selon la revendication 31, caractérisé en ce qu’il comporte, en outre, undispositif selon la revendication 30.