JP2012143212A - 溶液回収補助具および溶液回収方法 - Google Patents

Abstract

【課題】層分離した複数の層のうち下層のみを簡便な構成および操作で回収する。
【解決手段】容器２内において層分離した上層と下層のうち該下層を吸引管により吸引する際に用いられ、両端に開口する貫通孔１１ａを有し、容器２内に一端側から挿入可能であるとともに貫通孔１１ａ内に吸引管を挿入可能な筒状の胴部１１と、該胴部１１の一端の開口を密閉し吸引管の先端により貫通可能な封止部材１２と、胴部１１の外周面に外側に突出して設けられ、胴部１１が容器２内に挿入されたときに該容器２の上面に突き当てられる肩部１３とを備える溶液回収補助具１を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、溶液回収補助具および溶液回収方法に関するものである。

従来、試料をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって処理する際に、ＰＣＲの反応を安定した条件で進行させる目的でマイクロチューブ内のＰＣＲの反応溶液の上にミネラルオイルを重層する方法が用いられている。ＰＣＲ法による処理後、ミネラルオイルは核酸の解析に影響を与える可能性があるため、反応溶液はミネラルオイルと十分に分離して回収されなければならない。しかし、ピペットをマイクロチューブ内に挿入して下層の反応溶液を吸引しようとすると、ピペットに上層のミネラルオイルが付着して反応溶液にミネラルオイルが混入してしまう。

そこで、反応溶液をミネラルオイルから分離して回収する方法として、疎水性のフィルム上に滴下することによりミネラルオイルと反応溶液とを分離させてから反応溶液のみを回収する方法や、市販のキットを利用する方法などが用いられている（例えば、非特許文献１参照。）。

"High Pure PCR Product Purification Kit"、［ｏｎｌｉｎｅ］、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、［平成２２年１１月１０日検索］、インターネット＜URL：http://www.roche-biochem.jp/jp_manuals/1732668j.pdf＞

しかしながら、操作者が一つ一つサンプルをマイクロチューブ内からシート上に移してＰＣＲの反応溶液を回収する方法は手間と時間がかかり、コンタミネーションのリスクも大きい。一方、市販のキットは高価なうえに操作が煩雑であるという不都合がある。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、層分離した複数の層のうち下層のみを簡便な構成および操作で回収することができる溶液回収補助具および溶液回収方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、容器内において層分離した上層と下層のうち該下層を吸引管により吸引する際に用いられ、両端に開口する貫通孔を有し、前記容器内に一端側から挿入可能であるとともに前記貫通孔内に前記吸引管を挿入可能な筒状の胴部と、該胴部の前記一方端の開口を密閉し前記吸引管の先端により貫通可能な封止部材と、前記胴部の外周面に外側に突出して設けられ、前記胴部が前記容器内に挿入されたときに該容器の上面に突き当てられる肩部とを備える溶液回収補助具を提供する。

本発明によれば、胴部を容器内に挿入して該胴部の一端を下層に配し、次いで胴部の貫通孔内に吸引管を挿入して該吸引管の先端によって封止部材を貫通させることにより、下層を吸引管で吸引して回収することができる。

この場合に、吸引管が上層に接触することなく下層に配されるので、吸引管を介して上層の成分を混入させることなく下層を回収することができる。また、肩部が容器の上面に突き当てられることにより胴部の移動が制限される。これにより、吸引管の先端によって封止部材を貫通させるときに封止部材が吸引管によって押圧されても胴部の位置を安定に保持することができるとともに、胴部が挿入された状態で容器を遠心分離操作することにより、さらに精度良く分離した状態で下層を回収することができる。

上記発明においては、前記胴部が、前記外周面において撥油性を有していてもよく、前記封止部材が、外面において撥油性を有していてもよい。
このようにすることで、上層が親油性の成分からなる場合に、胴部を上層に貫通させて下層まで挿入したときに、上層の成分が胴部または封止部材の外面に付着して下層へ移動してしまうことを防ぐことができる。

また、本発明は、上記いずれかに記載の溶液回収補助具を使用した溶液回収方法であって、前記容器内に前記胴部を挿入する挿入ステップと、前記胴部内に吸引管を挿入し、該吸引管の先端部によって前記封止部材を貫通させることにより前記吸引管を前記下層に配置する貫通ステップと、前記吸引管により前記下層を吸引する吸引ステップとを備える溶液回収方法を提供する。

上記発明においては、前記挿入ステップと前記貫通ステップとの間に、前記容器内の溶液を遠心分離操作する遠心分離ステップを備えていてもよい。
このようにすることで、胴部の挿入にともなって下層に混入させられた上層の成分を再び上層へと分離させて、下層をのみをさらに精度良く分離して回収することができる。
また、上記発明においては、前記上層および前記下層が、液体からなっていてもよく、また、前記上層が、固体を含み、前記下層が、液体からなっていてもよい。

本発明によれば、層分離した複数の層のうち下層のみを簡便な構成および操作で回収することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る溶液回収補助具の全体構成図である。 図１の溶液回収補助具を使用した溶液回収方法を説明する図であり、（ａ）マイクロチューブ内でＰＣＲの反応溶液とミネラルオイルが層分離している状態、（ｂ）マイクロチューブ内に溶液回収補助具を挿入した状態、（ｃ）溶液回収補助具内を介してピペットを下層に配した状態をそれぞれ示している。 図１の溶液回収補助具の変形例を示す図である。

以下に、本発明の一実施形態に係る溶液回収補助具１について図面を参照して説明する。
本実施形態においては、マイクロチューブ（容器）２内に重層されたＰＣＲの反応溶液ＡとミネラルオイルＢのうち、下層のＰＣＲの反応溶液Ａをピペット（吸引管）３により回収する場合を例に挙げて説明する。

本実施形態に係る溶液回収補助具１は、図１に示されるように、マイクロチューブ２内に設置されて使用されるものであり、両端に開口する貫通孔１１ａを有する筒状の胴部１１と、該胴部１１の一端（以下、下端という。）の開口を密閉する封止部材１２と、胴部１１の外周面に外側に突出して設けられた肩部１３とを備えている。

胴部１１は、マイクロチューブ２の深さ寸法よりも若干小さい長手方向の寸法を有し、下端側からマイクロチューブ２内に挿入されたときに下端がマイクロチューブ２の底面近傍まで挿入されるようになっている。このときに、先細に形成されたマイクロチューブ２の底面近傍まで下端が到達するように、胴部１１は下端に向かって先細に形成されている。

胴部１１の外径は、胴部１１をマイクロチューブ２内に挿入したときに、上層を十分に上方まで押し上げることができ、かつ、マイクロチューブ２内から内容物が溢れることがないように、マイクロチューブ２内に収容されるＰＣＲの反応溶液ＡおよびミネラルオイルＢの液量とチューブ２の内径に応じて適宜決定される。

封止部材１２は、薄膜であり、ピペット３の先端により貫通可能な十分に薄さを有する。薄膜は、例えば、アルミニウムなどの金属やポリエチレンなどの合成樹脂からなり、３０〜７０μｍ程度の厚さを有する。

肩部１３は、胴部１１の他端（以下、上端という。）において半径方向外方に広がった形状を有し、胴部１１の下端がマイクロチューブ２内に底面近傍まで挿入されたときにマイクロチューブ２の上面に突き当てられることにより、胴部１１のそれ以上の挿入を制限するようになっている。

胴部１１および封止部材１２の外面は、例えば、フッ素樹脂によって被覆されることにより撥油性を有している。これにより、ミネラルオイルＢは、胴部１１および封性部材１２に接触してもこれら１１，１２に付着することなく胴部１１および封止部材１２の外表面に沿って滑らかに移動するようになっている。

次に、このように構成された溶液回収補助具１を使用した溶液回収方法について説明する。
本実施形態に係る溶液回収補助具１を使用して、図２（ａ）に示されるように、マイクロチューブ２内で重層されたＰＣＲの反応溶液ＡとミネラルオイルＢのうち下層のＰＣＲの反応溶液Ａのみを回収するには、まず、図２（ｂ）に示されるように、胴部１１をマイクロチューブ２内に挿入する（挿入ステップ）。このときに、封止部材１２および胴部１１は、ミネラルオイルＢの上層を滑らかに通過する。

次に、胴部１１が挿入された状態でマイクロチューブ２を遠心分離機により遠心回転させる（遠心分離ステップ）。このときに、マイクロチューブ２および溶液回収補助具１にはそれぞれ底面または下端に向かう遠心力が作用するが、溶液回収補助具１の肩部１３がマイクロチューブ２の上面に突き当てられて溶液回収補助具１がマイクロチューブ２に対して一定の位置に保持されることにより、マイクロチューブ２を溶液回収補助具１とともに正常に遠心回転させることができる。

次に、胴部１１の貫通孔１１ａ内にピペット３を挿入し、図２（ｃ）に示されるように、ピペット３の先端によって封止部材１２を貫通させる（貫通ステップ）。このときに、ピペット３の先端によって封止部材１２が押圧されることにより溶液回収補助具１に下向きの力が加わるが、肩部１３がマイクロチューブ２の上面に突き当てられることにより、溶液回収補助具１の位置が安定に保持される。したがって、ピペット３により容易に封止部材１２を貫通させることができる。そして、ピペット３の先端を下層に配して吸引することにより（吸引ステップ）、ＰＣＲの反応溶液Ａを回収することができる。

この場合に、本実施形態によれば、ピペット３が上層のミネラルオイルＢに接触することなく下層へ配されるので、ピペット３を介してミネラルオイルＢがＰＣＲの反応溶液Ａに混入することを防ぐことができる。また、胴部１１をマイクロチューブ２内に挿入したときに、胴部１１および封止部材１２によってミネラルオイルＢが下層に移動させられてしまっても、その後の遠心分離によってＰＣＲの反応溶液ＡとミネラルオイルＢとが精度良く層分離した状態となる。これにより、簡便な手順でありながら、ＰＣＲの反応溶液ＡをミネラルオイルＢとより高い精度で分離して回収することができるという利点がある。

なお、本実施形態においては、水溶性のＰＣＲの反応溶液ＡをミネラルオイルＢから分離して回収する場合を例に挙げて説明したが、本実施形態に係る溶液回収補助具１は、層分離可能な複数の物質のうちより大きな比重を有する方の物質を回収する場合であれば使用することができる。胴部１１および封止部材１２の構成は、物質の性質や該物質を層分離させた状態で収容する容器の形状に応じて適宜選択することができる。

例えば、層分離した水溶液と有機溶剤とから、比重が大きい方の液体を回収することができる。有機溶剤としては、水よりも大きな比重を有するものとしてクロロホルム、ジクロロメタン、水よりも小さな比重を有するものとしてヘキサン、ベンゼン、トルエンなどを一例として挙げることができる。また、互いに混合しない複数の有機溶剤のうち、下層に分離した有機溶剤を回収することもできる。このように有機溶剤が使用される場合には、胴部１１および封止部材１２は有機溶剤に対して耐性を有する材料、例えば、アルミニウムなどによって表面が被覆される。

また、本実施形態においては、マイクロチューブ２内において下層と上層の２層が形成される場合について説明したが、３層以上が形成され、これらの層のうち中層または下層を回収することとしてもよい。この場合には、マイクロチューブ２内に挿入された胴部１１の下端が回収すべき層の位置に配されるように、胴部１１の長手方向の寸法や肩部１３の位置が適宜決定される。

また、本実施形態においては、単体のマイクロチューブ２を使用する場合を例に挙げて説明したが、複数個連結されたマイクロチューブを使用する場合でも溶液回収補助具１を使用することができる。
例えば、図３に示されるように、８連のマイクロチューブ２の構成に合わせて、溶液回収補助具１は、８つの胴部１１が連結されて構成されていてもよい。

また、本実施形態においては、封止部材１２が薄膜からなることとしたが、封性部材１２の構成はこれに限定されず、胴部１１の下端側の開口を密閉しつつピペット３の先端により貫通可能な構成であればよい。例えば、封止部材１２は、放射状に切り込みが形成された薄い弾性部材であってもよく、ピペット３の先端によって押圧されることにより開放可能な弁であってもよい。

次に、上述した実施形態に係る溶液回収補助具および溶液回収方法の実施例１〜４について説明する。
〔実施例１〕
ＭＫＮ４５細胞を、１ｘ１０^６細胞数ずつ分注して液体窒素により凍結し、−８０℃で保存した。凍結したＭＫＮ４５細胞から、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。すなわち、凍結したＭＮＫ４５細胞にＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴを添加した後ホモジナイズし、キット付属のカラムメンブレンにＲＮＡを吸着させ洗浄した後、５０μＬのＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ水で全ＲＮＡ溶液を回収した。その後、回収された全ＲＮＡ量を定量した。

ＲＮＡ１μｇをサンプルとし、逆転写酵素としてＭ−ＭＬＶ（ＴａＫａＲａ社製)、逆転写ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて逆転写反応溶液を調製した。この反応溶液を、０．２μｍのマイクロチューブ（ＭβＰ社製）に２０μＬずつ分注し、ミネラルオイルを重層し、逆転写反応を、２５℃で１０分、４３℃で１時間、８５℃で５分行い、４℃で保存した。これにより、ＭＮＫ４５細胞のｃＤＮＡを調製した。

次に、ＣＯＸ−２のＴａｑＭａｎ ａｓｓａｙ（アプライドバイオシステムズ社製）によるリアルタイムＰＣＲを行った。すなわち、超純水：核酸増幅試薬（ＴａｑＭａｎ ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、アプライドバイオシステム社製）：ＣＯＸ−２プライマープローブＭＩＸ（アプライドバイオシステム社製、カタログＮｏ：Ｈｓ００１５３１３３＿ｍ１）＝１：１０：７の体積比でこれらを混合することによりＰＣＲの反応溶液を調製し、調製したＰＣＲの反応溶液をＰＣＲプレートの１２個のウェルに１８μＬずつ分注した。

逆転写酵素反応の終了後、本発明に係る溶液回収補助具を各マイクロチューブ内に挿入し、３０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離することにより、ミネラルオイルを上層に分離させた。その後、ピペットチップを溶液回収補助具内に挿入して薄膜に貫通させ、ｃＤＮＡを含んだ下層の溶液を吸引することにより回収し、２μＬずつＰＣＲプレートの６個のウェルに添加した。

この際、ミネラルオイル層は胴部の下端から上方に５ｍｍの位置に配置されており、ピペットチップにミネラルオイルが付着することはなく、ピペットチップ内に吸引した溶液をウェルに添加できた。
一方、比較例として溶液回収補助具を使用せずに、ピペットチップを直接マイクロチューブ内に挿入して下層の溶液を吸引し２μＬずつＰＣＲプレートの６個のウェルに添加した。この際には、ピペットチップにミネラルオイルの付着が見られ、ピペットチップ内に吸引した溶液をウェルに添加するときにミネラルオイルが共に添加された。

その後、ＰＣＲプレートをリアルタイムＰＣＲ装置に設置し、９５℃で１０分間処理し、９５℃で１分間、５６．５℃で１分間、７２℃で１分間の熱サイクルを４０サイクル行い、７２℃で７分間処理することにより、経時的に蛍光強度を計測しながらリアルタイムＰＣＲを行った。蛍光強度の計測結果を分析し、各ウェルに添加された溶液に含まれていたＲＮＡ中のＣＯＸ−２遺伝子の発現量（コピー数）を算出した。その結果を表１に示す。

表１に示されるように、６つのウェル１〜ウェル６のコピー数の変動係数は、溶液回収補助具使用した場合（実施例１）には６．４８％とばらつきが小さかったのに対し、溶液回収補助具を使用しない場合（比較例）には８３．６０％と大きくばらついた。すなわち、溶液回収補助具を使用せずに回収されたサンプルにはミネラルオイルが混入していたために、回収後に行われたリアルタイムＰＣＲが正常に進行せず、一方溶液回収補助具を使用して回収されたサンプルにはミネラルオイルが混入していなかったために各サンプルにおいてリアルタイムＰＣＲが正常に進行したことが確認された。

〔実施例２〕
実施例２として、本発明の溶液回収補助具を使用して食パンに含まれる脂質の量を測定した。
まず、食パンの湿重量を量った後に食パンを粉砕した。食パンの粉砕物に、クロロホルム：メタノール=２：１で混合した液を、食パンの粉砕物の１０倍量加えて混合し、１時間静置した後に再び混合した。次に、静置することにより容器内で上層、中間層、下層に層分離させ、上層を除去した。次に、溶液回収補助具を容器内に挿入し、ピペットにより下層を回収し、回収された下層を他の容器に移した。次に、該容器を加熱して下層に含まれた液体を十分に蒸発させた後に重量を計測し、計測された重量から容器の重量を減算することにより、食パンに含まれていた脂質の重量を算出することができた。

〔実施例３〕
実施例３として、本発明の溶液回収補助具を使用して茶葉に含まれる有機成分を分析した。
まず、茶葉５ｇに、沸騰した超純水１５ｍＬを添加した。次に、ＭｏｎｏＴｒａｐ ＤＣＣ１８（ＧＬサイエンス株式会社製）を直接茶葉の上に載置し、６０℃で３０分インキュベートした。次に、ＭｏｎｏＴｒａｐ ＤＣＣ１８を別の容器に移し、ジクロロメタンを１０００μＬ添加し、超音波を５分間照射した。超音波の照射後、ジクロロメタン溶液の上層に、ＭｏｎｏＴｒａｐ ＤＣＣ１８に付着していた水の層が形成された。

次に、溶液回収補助具をジクロロメタンの入った容器内に挿入して遠心分離し、下層から８００μＬのジクロロメタンを回収した。回収したジクロロメタンを窒素パージにより１００μＬまで濃縮した。濃縮されたジクロロメタンに含まれる成分を、ガスクロマトグラフィ／質量分析法により分析した。分析は、キャピラリーカラムとしてＩｎｅｒｔＣａｐ Ｐｕｒｅ−ＷＡＸ（膜厚０．２５ｍｍ、Ｉ．Ｄ．×３０ｍｄｆ＝０．２５μｍ、ＧＬサイエンス株式会社製）を使用し、キャリアガスとしてＨｅを１ｍＬ/分の流量で流し、カラム温度を４０℃（５分間）→（４℃／分）→２５０℃と変化させることにより行った。

分析の結果、Methylpyrazine、Dimethylpyrazine、Ethylpyrazine、6-Methyl-5-heptene-2-one、2-Ethyl-6-methylpyrazine、Trimethylpyrazine、Furfural、Acetol acetate、2,4-Heptadien-1-al、2-Acetylfuran、Benzaldehyde、2-Formyl-5-methylfuran、Methyl 2-furoate、2-Furanmethanol、Dimethoxybenzene、Trimethoxybenzene、Pyrrole-2-aldehyde、Coumaran、Caffeinのピークが観察された。すなわち、ジクロロメタンに溶出する成分のみ検出され、本発明の溶液回収補助具を使用することにより上層の水を混入させることなく下層のジクロロメタンのみを回収することができたことが確認された。

〔実施例４〕
実施例４として、本発明の溶液回収補助具を使用してゴマに付着した細菌の分析を行った。
まず、被検体であるゴマ２．５ｇを、ポリプロピレン製の容量５０ｍＬのコニカルチューブ（ベクトンディッキンソン社製）に入れ、生理食塩水２２．５ｍＬを添加し、ボルテックスミキサーで３０秒間懸濁した。懸濁後、コニカルチューブ内の懸濁液の上層にはゴマによる浮遊物が確認された。

次に、マイクロピペットを使用してコニカルチューブ内から懸濁液１ｍＬを吸引しようとしたとところ、浮遊物によってピペットのチップが目詰まりし、吸引できなかった。そこで、コニカルチューブ内に、底面と液面の高さの半分の位置に封止部材が配置される本発明の溶液回収補助具を設置し、２００ｒｐｍで３０秒間遠心分離することにより浮遊物を上層に分離させた。次に、ピペットチップを溶液回収補助具内に挿入し、封止部材である薄膜に貫通させ、下層の懸濁液を吸引したところ、ピペットチップに浮遊物が付着したりピペットチップが浮遊物によって目詰まりしたりすることなく、溶液のみを吸引することができた。

回収した懸濁液１ｍＬをプラスチックシャーレに分注した。シャーレは、予めフラスコ内で粉末の培地を精製水で溶解してオートクレーブ滅菌した後に培地の寒天が固まらない温度（４５〜５０℃）まで冷やしておいた標準寒天培地を１５ｍＬ程度流し込み、培地が固まるまで静置したものを使用した。そして、シャーレを３５℃のエアインキュベーター内で４８時間培養した。培養後、シャーレ内に形成されたコロニーを観察したところ、複数種類の細菌のコロニーが観察された。
このように、本発明に係る溶液回収補助具は、液体の上に固体が浮遊している状態で液体のみを回収する場合にも、好適に用いることができることが確認された。

１ 溶液回収補助具
２ マイクロチューブ（容器）
３ ピペット（吸引管）
１１ 胴部
１１ａ 貫通孔
１２ 封止部材
１３ 肩部
Ａ ＰＣＲの反応溶液（下層）
Ｂ ミネラルオイル（上層）

Claims (7)

1. 容器内において層分離した上層と下層のうち該下層を吸引管により吸引する際に用いられ、
   両端に開口する貫通孔を有し、前記容器内に一端側から挿入可能であるとともに前記貫通孔内に前記吸引管を挿入可能な筒状の胴部と、
   該胴部の前記一端の開口を密閉し前記吸引管の先端により貫通可能な封止部材と、
   前記胴部の外周面に外側に突出して設けられ、前記胴部が前記容器内に挿入されたときに該容器の上面に突き当てられる肩部とを備える溶液回収補助具。
2. 前記胴部が、前記外周面において撥油性を有する請求項１に記載の溶液回収補助具。
3. 前記封止部材が、外面において撥油性を有する請求項１または請求項２に記載の溶液回収補助具。
4. 請求項１から請求項３のいずれかに記載の溶液回収補助具を使用した溶液回収方法であって、
   前記容器内に前記胴部を挿入する挿入ステップと、
   前記胴部内に吸引管を挿入し、該吸引管の先端によって前記封止部材を貫通させることにより前記吸引管を前記下層に配置する貫通ステップと、
   前記吸引管により前記下層を吸引する吸引ステップとを備える溶液回収方法。
5. 前記挿入ステップと前記貫通ステップとの間に、前記容器内の溶液を遠心分離操作する遠心分離ステップを備える請求項４に記載の溶液回収方法。
6. 前記上層および前記下層が、液体からなる請求項４または請求項５に記載の溶液回収方法。
7. 前記上層が、固体を含み、
   前記下層が、液体からなる請求項４または請求項５に記載の溶液回収方法。

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