JPH03185356A - 血液採集方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、全血からの血清の抽出方法に関し、特に血清
のＤＮＡの抽出方法に関する。そのためこのＤＮＡをさ
らに処理することができる。

〔従来の技術］ 相当昔から血液採集分前装置は、遠心力の方向と平行ま
たはほぼ平行な長手方向軸線を有するコンテナ内で全血
を回転させてきた。具体例は、たとえば米国特許第４，
０１２，３２５号に見ることができる。この方向につい
てはいくつかの理由がある。

一つの理由は、遠心力が解除されたとき、重い赤血球は
軽い血清との間に相当の分離間隔が存在することと同時
に、２つの相間の界面の表面積を縮小することである。

その結果として、血清が取り出される場合に軽い血清相
中に血液細胞が再分散する可能性は少なくなる。その好
ましくない現象をさらに防ぐため、しばしば中間的な比
重のゲルを使用して２つの相間の表面を塞いでいる。長
手混合を抑止するゲルの厚みを大きくすることかで記の
ようなコンテナを回転、させることが適当であるとは考
えられなかった。この理由は、分離された血？：１のｉ
ｓ裏表面分離された血液細胞の表面との間の間隔が非常
に短くなりそれに付随してその界面の表面積が大きくな
るためである。このことが、おそらく取り出されたりま
たは除去される際に、血液細胞を血清により汚染されや
すくする。

そのような大きな表面積の界面を支えるようにゲルを使
用しようとしてもそれは機能しそうにない。

というのは、ゲルにより再混合を抑制するにはその厚み
が過少であるからである（ゲルの容積には限りがあり、
それが大きな表面積の界面にわたって一様に分布される
であろう）。

しかしながら、このような結論のため従来の試みは代価
を払ってきた。この代価は、液体容積の最も長い寸法上
で相分離を起こさせるために長い時間がかかることであ
る。例えば、約２ｄの血液にで前記米国特許第４，０１
２，３２５号明細書に記載されるものに類似の装置を使
用すると、例えば１００ｇで回転させるならば血液細胞
から血清を分離する時間はほぼ５．３分である。熱論、
このような分離時間は、かけられる遠心力の関数である
ことも事実であり、より大きな力（例えば、より高いｒ
ｐｍ値によって生ずる）はより早い分離をもたらす。

従って、弱い遠心力は相分離の許容できない遅延をもた
らす可能性があるので、使用される典型的な遠心力は１
０００　ｇを超える場合が都合よいであろう。しかし、
例えば１６００　ｇという大きな力を使用したとしても
、２−容積のコンテナにおける分離は一般に３０秒未満
では不可能であった。そして最も重要なことであるが、
このような遠心力について見い出される欠点は血液細胞
と血清との界面に「バッフイーコート」と称される層が
存在することである。１００ｇを超える遠心力で形成さ
れる種々のものの中でバッフイーコートは、有用なりＮ
八を含むリンパ球のような白点細胞をそれらの分離不能
な部分として有する。これらの細胞を取り出すことがで
きるならば前記ＤＮＡは抽出することができる。従来の
コンテナおよびそれらの遠心により生ずる相分離は、そ
れらのリンパ球が残りのバッフイーコートと不可逆的に
混合することが確実であることに課題があった。従って
、回転速度を劇的に高めて相分Ｍ時間を１分未満に短縮
する試みのいずれも、リンパ球の回収が完全に妨害され
るであろうことは明らかであろう。

この欲求に対処するアプローチの一つは、熱論、遠心力
が解除される前にコンテナから軽い血清用の簡単な抜き
取りを可能にするある種の機構を設けることであろう、
これは、遠心力が印加されたままなので血清の採集期間
を通じてコンテナの捕捉区画内に意図しない血液細胞を
保持することを助長するであろう。事実、回転させたま
までコンテナから血清を採集する血液分離器は提供され
ているが、それは回転速度を上げることによって達成さ
れる。この種の装置は、例えば特開昭６３−２３７３６
８号公報に示されている。出口路をコンテナから遮断す
るバルブが設けられており、それは遠心力が相分離に使
用される速度、例えば３０００〜５０００ｒｐｍを超え
て助人したときにのみ開放するような一方に偏るスプリ
ングを有する。明らかに、この種の装置では、抜き取ら
れる血清が赤血球と再混合する危険性を最少にして血清
を採集することができる。しかしながら、この装置でさ
えも、遠心しながら血清の回収を可能にするためには、
その短い軸線のまわりに装置を回転させるように再配置
することは想定されていなかった。それどころか、この
装置はコンテナの長袖に沿っ、て相分離を起こさねばな
らない従来の回転方向を踏襲している。

ｉｉｌ　３己特許公開公報に示される装置の他の欠点は
、液流がない場合であっても高い遠心力が印加されてい
るいる限りバルブが開放のままであることである。すべ
ての血？ｒｌが取り出された後、バルブは自動的に閉領
することが明らかに好ましい構造である。その理山は、
ａ）コンテナ内をある程度自由に動く非血清成分がその
バルブから漏れ出す可能性をなくすることであり、そし
てｂ）開放のままのバルブは、コンテナ内に残存する血
液細胞に対して回転している問に行われる他の処理の支
障となる。この従来の装置のバルブが遠心力に応動する
だけで、採集すべき血清のような液体の存在に応動しな
いという事実に前記欠点は由来する。

〔発明が解決しようとする課題〕

この発明の目的は、特に全血を処理する場合により迅速
にそしてより低速度で相分離と軽い相の自動採集を達成
しうる２相液体の分離方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

この発明の目的は、液体コンパートメントの長袖よりむ
しろその短い軸の回りにその回転を行わしめることを可
能にする装置を使用することにより、そして遠心中に軽
い相の採取を可能にするパルプ手段の構成を工夫するこ
とによって都合よく達成される。その好ましい態様では
、前記バルブ手段が軽い相に由来する圧力のみに応動性
であり、遠心力には応動性でない。その結果、不当に総
遠心時間を延長することなく、従来失われていた細胞画
分の回収を可能にするレヘルまで相分離に使用する遠心
力を大幅に低減する。

より具体的には、本発明の一の態様に従えば、本発明の
目的は、ａ〉所定量の２相液体を、他の直交空間寸法よ
り長い一の空間寸法を有する第一チャンバに置く工程、
ｂ）　１００ｇ未満の速度でその一の空間チャンバにほ
ぼ平行の軸線の回りに前記チャンバを同転させて前記チ
ャンバから分液させる工程、ならびにＣ）分離された軽
い相を、チャンバ間にＩｉ人されたバルブを介して前記
第一チャンバに隣接する第二チャンバ中へ取り出す工程
、を含んでなる２相液体の重い相から軽い相の分離方法
によって達成される。

さらに本発明のもう一つの態様に従えば、本発明の目的
は、ａ）単一の遠心工程において、赤血球から血清とリ
ンパ球を分離するのに十分な時間１００ｇ未満の遠心力
でコンテナ中の全血の採集物を同転させる工程、ｂ）　
Ｘｆ４として血清とリンパ球を赤組ｆホから離れたコン
パートメント中に取り出す工程、Ｃ）細胞を溶解しそし
てその試料を凝固させるのに十分な時間、十分な温度で
分離した血清およびリンパ球試料を加熱する工程、ｄ）
工程Ｃ）でＭＮしたＤＮＡを、前記凝固した試料に水性
抽出剤を加えることによって抽出する工程、ならびにｅ
〉残存する固形物から前記抽出剤を分離することによっ
て抽出したＤＮＡを採取する工程、を含んでなる方法の
短縮法を用いる分析用ＤＮＡの抽出方法によって達成さ
れる。

以下、本発明の好ましい態様におけるその使用を考慮し
て記載するが、そこでは血清または血漿は２相液体の軽
い相であり、特に好ましいチャンバは逆止め玉バルブの
使用で２種の分離された相からバルブで液の流れが調節
された血清および／またはリンパ球を採集するものとし
て記載される。

さらに本発明は、本発明の目的を達成する方法である限
り前記バルブの下流に続くチャンバの型式またはその存
在するかどうかにさえもかかわりなく、そしてバルブの
構成にもかかわりなく有用である。

従来の多くの血清分離器はコンテナ１０（第１図）を通
常使用しており、そしてこのコンテナの長手方向軸線１
２が遠心力ＣＦ　（矢印１４）の方向と平行であ−７た
。その結果、図示のような２つの両分として軽い血清１
８から重い血液細胞１６を分離するには相当な時間と遠
心力が必要である。前述の特許公開公報にあるようにあ
る種の設計物では、疑似模型として示されているスライ
ド状試験要素Ｅと血清が接触できる分離に適するチャン
バ２４にそれが流れ込むことを可能にする取り出し間口
２０がバルブ２２と一賭に設けられている。

バルブ２２は、遠心力（ＣＦ）より大きなＣＦを使用し
て２相を分離する場合にのみ矢印２６の方向への開放が
行われ、その場合には戻しハネ（示されていない）に逆
らって移動するように構成されている。この構成は前記
の付随する欠点のずべてををする。さらに、全血がニー
ドルによる分離操作によって採集された後、オペレータ
ーの注意または中間的な機械工程を必要とする注入工程
で開口部２日を介して全血が加えられる。

この発明に従えば、少なくとも２つの相の相分離のため
の相分離装置３０（第加図）は、遠心力ＣＦ　（矢印３
４）の方向に対して垂直（平行でない〉方向をとる長さ
ｌを有する相分離のためのチャンバ３２と所定の構造の
バルブ５０を具備する。チャンバ３２は端部３６から送
出通路５６まで延びている。端部３６は吸入開口４０を
有し、この吸入開口４０に通常の隔壁４１が装填される
、チャンバ３２は４３で図示した箇所で外気と通してい
るか、または血液の吸入を補助せしめるため４３で示し
た箇所に外部の負圧源を取り付ける。開口４０は全血が
通路４２を介してチャンバ３２に流入するのを可能とす
る。チャンバ３２の幅ｄは短い方の中窓の一つであり、
約ｄ′までの深さを理めるに充分な量の血液が吸入され
るようになっている。遠心分熱を通して、チャンバ３２
の側壁４４は重い血液細胞が収集される側壁であり、対
向した側壁４６は軽い方の血清の両分に隣接し°ζいる
。

したがって、寸法ｄおよびｄ′は軽い方の相から重い方
の相へ延びている。

場合によって、固定された多孔性機械的手段、例えば、
バ・７フル４８を側壁４４に沿って血液細胞中に位置す
るように設けることができる。この出願の出願人が所有
する、“ｌ’ｈａｓｅ　５ｅｐｅｒａＬｉｏｎＣｏｎｔ
ａｉｎｅｒ　ｗｉｔｈ　Ｆｉｘｅｄ　Ｍｅａｎｓ　Ｐｒ
ｅｖｅｎｔｉｎｇ　Ｒｅｍｉｘｉｎｇと題する１９８９
年の３月２０口に提出した米国特許出廓第３２５．７２
５号に記載したように、そのような手段は重い側の相が
軽い側の血清用を取り出し中に再混合しないように保持
するべく機能する。バッフルのプレートは、角度αをも
って傾斜しており、この傾斜によって、矢印４９の方向
にチャンバ３２からの流れが起こったときに再混合力に
抵抗する。

好ましくは、この角度は約３０”から約１２０°の間の
値、最も好ましくは約６０”である。好ましくはバッフ
ル４８の個々のプレート間の間隔は約０．１８ｒｍから
０．ｌＯｒｍの間にあり、最も好ましくは約０．０２５
ｃｍである。各プレートの厚みは臨界的ではなく、ただ
、必要な数のプレートが花在し°Ｃいて、そのプレート
間に血液細胞を採集することができる空間を生ずるよう
になっていればよい。

バルブ５０が端部３６ど３８との中間のチャンバ３２の
端部５２に位置しており、分離された血漿もしくは血清
およびリンパ球を取り出すように位置している（下記に
説明する）。瓜も重要なことは、バルブ５０が液圧ヘッ
ド力に応動してのみ開口するように構成され、遠心力Ｃ
Ｆには応動せず、かつその大きさにも関係しない。この
目的のためバルブ５０は好ましくは逆止め球バルブであ
り、その球５４はチャンバ端部５２において通路５６の
下流に位置している。球５４は、半球上のシート５８に
着座しており、遠心力ＣＦの方向とほぼ直交する方向に
作用するように整列したスプリング６０によって偏らさ
れている。このように整列させることで、球５４が遠心
力ＣＦ塩以外力のみに応動するようにスプリング６０に
抗して作用することを保証することができる。

血清もしくは血漿の出口通路６２はシート５８に隣接し
て配置され、バルブ５０の開放時に液体を運び出すこと
ができる。通路６２はチャンバもしくは隔室６４に接合
しており、隔室６４は、バルブ５０を介してチャンバ３
２を流出するほぼ全ての流体を受は取るようＧこするこ
とができる寸法を持っている。チャンバ６４はリンパ球
の採集用の深い凹部６６と、ピペットをチャンバ６４、
特に四部６６に接近せしめる大きな開口６８を具備する
。カバー７０は、ピペットの導入時もしくは他の手段の
導入が必要な場合を除き開口６８を取り外し可能にシー
ルしている。

通路６２は好ましくはチャンバ６４を超えてトラップ７
４まで延びている。この１ランプの機能は通路５６にお
いて遠心分離に先立ちもしくは遠心分離後に集まる僅か
の血液ｔＪＩＩ胞を捕１にするものであり、所望される
血清もしくは血漿、またはリンパＬＨのみをチャンハロ
４に流入せしめる。

以」二の装置３０は、どんなものかを問わず適当な遠心
機（図示しない）によって回転することができ、ここに
おいて長子寸法ｌは回転軸７６に対し°ζ一般に平行で
ある。好ましい回転半径は約２、５　ｃｍであるが、こ
の寸法に限らず広い範囲の値を採用することができる。

空気の取り込み、特にこれらの液流への取り込みを避け
るために各種ベントが設けられる。例えば、ベント７７
はチャンバ６４に好ましくは設けられる（第２八図）。

図示していないが、さらにバッフル４８のパンフル板は
取り込まれた空気を放散させうるリプを有していてよい
。

装置３０を用いる相分離方法は、前記説明から容易に明
らかになるであろう。全血は、例えば隔壁４１を針入す
るニードルによってチャンバ３２に導入される。次に、
装置３０は軸線７６の回りを回転される。しかしながら
、本発明のもう一つの態様では、回転速度が遅くなるよ
うに選ばれ、その速度とは４００ｇ未満の遠心力を生ず
るものであり、最も好ましくは３０ｇより大きくない。

その理由は装置３０は、この遠心力の下で、２ｍＬの液
体を使用して、２分より短い時間で、ある場合は１分よ
り短い時間で相分離することができるからであり、それ
は分離のため血液細胞の移動に要する距離（約ｄ’／２
）が短いことによる。第３図は旋回゛［径を２．５　ｃ
ｖａ、全血の総量を５００μＬとしたとき、この発明に
よっ°ζ達成される分離時間を示す。図示するように、
遠心力が約１５０ｇもしくはそれより大きくなれば、血
清もしくは血漿、及びリンパ球の分離は１分以内に行わ
れ、遠心力を約４００ｇとしても時間の短縮は殆どない
。反対に、遠心力が３０ｇと僅かであっても、完全な分
離は８分以内、例えば、５．５分で行うことができる。

比較例として米田特許第４．８１８．４１８号では、通
常のＦｉｃｏｌｌ”ａｇｕｅ／Ｐｅｒｃｏ目を付加剤と
して使用した条件が示されており、４００ｇの遠心力を
使用しても分離に３０分も要し”ζいる。第３図の工に
°ζこれを示す。

選定された遠心力の値に関わらず、血清もしくは血漿の
分〃１後に、バルブ５０を開放することによって軽い相
がチャンバ３２内に充填された液体から取り出される。

これは次の。１、うに行われる。

スプ°リング６０のスプリング定数に、のイ直はｆＪ　
５４に所定の圧力ヘソ１゛が印加されるまで球５４の移
動に抵抗するように予め選定される。圧力ヘッド′の増
大は、相分離を達成するのに使用される力を、例えば５
０％超過するまで遠心力を増加させることによって起こ
る。好ましくは、回転速度がこれに準じて増大される。

血清もしくは血液細胞は壁４４に対して比較的に非圧縮
性であるから、遠心力ＣＦの増大は矢印４９の方向への
力の増大に変換され、この力はスプリング６０のばね定
数に１に打ち勝ち、パルプが開放するに至る。しかしな
がら、これは通路５６に押し出すべき充分な量の血Ｘｔ
もしくは血漿がチャンバ３２内に留まっているとしたと
きである。殆どの血清もしくは血漿がパルプを通して排
出されると、圧力ヘッドは回転速度が高くても降下する
。その結果、パルプ５０は回転速度が高くても自動的に
閉鎖し、この作動は第１図の従来技術のバルブ２２の動
作とは全く違っている。

第４図は、本発明の方法が遠心力による通常のリンパ球
分離では普通に使用される化学的相分離剤を使用するこ
となくリンパ球分離が可能であることを示している。（
もしリンパ球が所望のＱ綿製品であるなら、血清よりむ
しろ血漿が軽い相である。血清は血漿とは殆ど同じであ
るが、相違点は血清では、リンパ球を得るのに有害な工
程であるフィブリノーゲンの除去工程がある。）この理
由は、遠心力が約１００ｇ以下のレベルにあるから、１
００ｇ以上の遠心力で作動する従来技術と異なって、リ
ンパ球はバッフィコート内に不可逆的に凝集されてしま
うことがないことによる。

より詳細に説明すると、第４図のグラフは「が２．５４
ｔ・ｍの値を有する遠心ロータにおける第２八図のタイ
プのタイプの装置を使用してｊｌられたものである。バ
ルブ５０の開口に先だってスピン時間が長ずぎると、リ
ンパ球は赤血球中において全て失われるから、どの遠心
力Ｇ、においてもいろいろな時間にプロセスをサンプリ
ングすることが必要である。したがって、例えば、ＣＦ
・５０ｇについて、スピン時間が数多く　（例えば１分
から１０分の間）検査され、ＣＦが血漿中に残在するリ
ンパＬＲの量を最大とする尼適特間を決定する。これは
遠心力ＣＦを増大させることによるバルブ５０の開放で
変換される量についても同様である。かかる最適時間で
軽い相に残留するリンパ球の量は、異なった各ｇ力につ
いてのリンパ球の総オリジナルの量に対する比率として
ｇ力に対して、１０をベースとする対数で、プロットさ
れる。第４図はこの結果であり、この図で面線を包囲す
る帯８８はデータに合わせて引かれたものである。この
帯はデータの不確実性の範囲を示している。各データ点
は試験の平均値を表している。しかしながら標準偏差は
決定していない。上述したように、重要な点は利用可能
なリンパ球の有効な両分を回収することにある。これは
遠心力が１００ｇ未満のときに達成することができる。

リンパ球が回収されると、ＤＮＡ抽出は本発明の一の態
様により行うことができる。すなわち、第二チャンバー
中の血清とリンパ球を含んでなる相を、例えばピペット
で取り出し、次いで以下のように処理した。

ｌ）　この相がペレット状に凝集する時間と温度でこの
相を加熱した。この条件は、約１００℃〜１３０°Ｃの
温度で、２〜２０分間である。こうしてＤＮＡをａｍす
るリンパ球の溶解が起こる。第２工程に先立って、場合
により前記ペレットをトリスＥＤＴＡ緩衝液を用いて予
備加熱してもよい。

２）次に、このペレットを水または水性液体で洗浄して
、このペレットからＤＮＡを抽出した。

好ましい抽出液の容量は、チャンバ６４から取り出され
る既知少啜の２００！−１０００２の間にある値に容量
を増大するような量である。この処理を補助するのに、
場合によって、抽出液の在在下でペレットをすりつぶす
工程を使用してもよい。また、水性抽出液は、０．５Ｍ
　ＫＣｌ、Ｏ，ＩＭ　　トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、ウシ骨ゼラチンｌ　ｍｇ／　ｍｌおよびＯ
，ｌ　Ｍ　ＭｇＣｉ　ｚ　・６１１２０を含んでなる緩
衝液（ρＩ＋　８．０）であってもよい。

３）　次に、常法、例えばデカントまたは遠心し、次い
でビペ・７トを用いることによって抽出液をペレットの
残左ずろ固形分から分離した。液には残存する固形分が
全く含まれないように注意が必要である。こうしてＤ　
Ｎ　Ａ　ｈｉｓ出は終了する。

この発明の方法の各工程は、従来法より相当短い。後音
では、遠心が少なくとも３度行われる最低１１工程であ
ることに特色がある。

抽出されたＤＮＡは各種の試験にかけることができる。

このような試験では、ＤＮＡを容易に検出できるように
先ず増幅することが好ましい。通常の増幅方法が有用で
あり、これらにはＰＣＲ増幅ならびにリガーゼ連鎖反応
（ＬＣＲ）増幅が含まれる。

これらの両枝法には、標的ＤＮＡを再生する加熱サイク
ルを通して熱安定性酊素が使用される。

１’ＣＲの場合には、再生に使用されるのはＴＡＱポリ
メラーゼのようなポリメラーゼ酵素であり、ＬＣＲでは
りガーゼ酊素である。

ＰＣＩ’？増幅法は、例えば、米国特許第４．（ｉ８３
，１９５号で非常に詳細な記載を見ることができる。好
ましいプロトコールは次のとおりである。

ｌ）完全なりＮＡ二本鎖を場合により適当な制ｊ）［素
を用いて化学的に切断して目的の領域を単離する。

２〉　単離された核酸部分（ここでは、ＤＮＡ）とヌク
レオチド類の溶液を９２″〜９５°Ｃに加熱し、約１０
分果満その温度に維持し、２種の核酸鎖を変性、すなわ
ちそれらを巻き戻しそして分離させ、次いで紡型を形成
する。

３）　次に、この溶液を３０’Ｃ〜６０°Ｃの区画内に
冷却し、２つの鋳型箱のそれぞれにプライマーをアニー
ルまたは付着させる。この工程を確実に行うためには、
溶液をインキュベーション区画内で約１５秒間適当な温
度、例えば約５５°Ｃに保持する。

４）　次に、この溶液を１１７０°Ｃまで加熱してその
温度に保持し、醇素、好ましくは熱安定性ポリメラーゼ
酊素によってエクステンションを起こさせ、この目的で
（」（給されるデオキシリボヌクレオチ１′類を用いて
前記鋳型箱に結合したプライマー類を伸長させる。

５〉　完成した新しい対の禎を、再度約１０−１５分間
９２°〜９５°Ｃに加熱してこの対を分離する。

６）　次に、適当量の瑣がｉ′′）られるまで工程３）
〜５）を何度も繰り返す。例えば、７０サイクルが使用
される。さらに繰り返して非常に多くの多様な核酸（こ
こでは、ＤＡＮ）を生成することができる。所望の核酸
濃度が最も短時間に達成されることが好ましく、各サイ
クルは１分未満行われる。

しかしながら、ｌサイクルに５分程かけることもできる
。

本明細書で使用する「プライマー」の語は、天然産であ
るか合成で生成されるかを問わずオリゴヌクレオチドで
あって、ある核酸鎖に相補的なプライマーエクステンシ
ョン産物の合成を誘発する条件下に置いた場合に合成の
開始点として働きうるちのを意味する。このような条件
には、ヌクレオチド類（例えば、４種の標準的なヌクレ
オシド三リンＭ）および重合用試薬（例えば、ＤＮＡポ
リメラーゼ）の存在、ならびに適当な温度およびｐＨが
包含される。一般に、この発明で使用される各プライマ
ーは、■５〜４０のヌクレオチド、好ましくは２０〜２
５のヌクレオチドを有するであろう。

ＬＣＲ増幅はどうかといえば、これもまた、特定の標的
配列に対するプローブを使用する。このプローブはそれ
らが標的ＤＮＡに結合される場合に隣接セグメントとな
るものである。この方法では、最初に、隣接関係にある
ＤＮＡにこれらのプローブの結合を起こし、前記ＰＣＲ
増幅の工程３）で行ったのと同様に結合させる。その後
、混合物を隣接するプローブの末端と末端が化学的に結
合するような温度にてリガーゼの存在下で処理し、標的
類に相補的なりＮＡ′Ｍｉを複製する。かくして一対の
ＤＮＡ鎖が作出され、次いでこれらを前記ＰＣＲの工程
５）と同様に変性し、そして全サイクルを繰り返して４
、次いで８コピーの標的ＤＡＮを作出する。

標的ＤＮＡが増幅されるかまたは十分量存在するときは
、常法、例えばＩＩＬＡタイピングにより類別すること
ができる。このような類別法は周知であり、例えば、Ｉ
ｆ、　Ｅｒ１ｉｃｈおよびＴ、　［ｌＢａｗａｎによる
ＰＣ１ｊＴｅ５＝、ｈｎ、ｏｌｏｇｙ一の第１６章（１
９３ページ）に記載されている。

第５図の別の態様で図示されるように遠心力に影響され
ない前述のバルブを軸線上で操作することは必ずしも必
要でない。前述のものと同様な部分は、識別用に接尾辞
「Ａ」が付されている同一の引用数字を持つ。

従って、装置３０Ａは、前述のようにチャンバ３２Ａ、
血液（Ｊｊ給連通路４２Ａ備える本体３３Ａを含んでな
る。

バッフル４８Ａは、重い血液細胞を残す目的で含めるこ
とができ、通路５（ｉＡはリンパ球や血漿のような軽い
相の取り出しを可能にし、チャンバ３２Ａからチャンバ
６４Ａに取り出されたそれらはパルプ６０Ａでカバーさ
れる。チャンバ３２Ａの長子寸法ｌは回転軸７６Ａに平
行である。しかしながら、この態様ではスプリング６０
Ａは遠心力ＣＦの方向と平行に方向付けられ°Ｃいる。

それにもかかわらず、スプリング６０Ａのスプリング定
数に２は球５４Ａが液圧ヘッド力に応動してのみ開口し
、遠心力には応動し、ないように選ばれる。ＦＪ５４Ａ
がシート５８Ａから乱れたとき軽い相はチャンバ６４Ａ
に流れ込む。

この態様では、スプリング６０Ａによって−ばいになら
ない通路７４Ａの容積は相分離前に通路５６Ａで捕Ｉに
されたすべての血液細胞をトランプするのにちょうどま
にあう。

スプリング６０Ａのスプリング定数に２の選定は次のよ
うに注意して行われる。バルブ５０Ａは相分離を達成す
るのに使用される第一の遠心速度ＣＦ。

では開放しないように選ばれる。さらに、それは球５４
Ａに対するいずれかの液圧の不存在下ではバルブに対す
るヘッド圧を生しさせるのに使用される高い遠心速度Ｃ
１７２の在７〔下でもバルブの開口を妨げるのに十分な
男１さであること。しかしながら、Ｔ、）：５４Ａは矢
印４９Ａの力に対して０″′〜９０＠の角度の範聞内の
表面をイ１するので、ｌ１５４Ａは、遠心力Ｃ１ｉ、に
よって生し、矢印４９Ａの方向に発生ずる液体ヘッド圧
力ΔＰによりｃｐ、に対し°ζ平行な力を受けるであろ
う。（ＣＦ２にｘ・１シて平行なΔＰの成分は以下、Δ
Ｉ’ＣＦと称する。）ずなわら、スプリング定数に２は
ＣＦ、ｒｌ独で生ずる力よりは大きいが、（ＣＩ’Ｍ（
Δ１１ｏ）より小さい。軽い相の液体ずべてがチ、ｌ・
ンハＧ４Ａに移動したときは、力Δｌ’ｃｔを発揮する
液体ヘッド圧力はなくなってしまうので、遠心力ＣＦ２
が印加されてい°ζもバルブ５０Ａは自動的に閉鎖する
。

チャンバ（ｉ４Ａの含有物、例えばリンパ球や血漿は、
次に取り出しカバー７０Ａから吸引される。

軽い相の自動取り出しバルブは、液体ヘッド圧力にのみ
応動する限り球状パルプである必要はない。それが前記
ヘッド圧力以外の力に抵抗性であればどのようなバルブ
でも使用することができる。

さらに別の様式のものを第６Ａおよび６１１図に示すが
、前述したものと類似の部分は識別接尾辞ｒＢ、が付さ
れている同一の引用数字が印されている。

従って、装置３０Ｂは血液採集分離チャンバ、例えば３
２Ｂ、ならびに前記態様と同様に、軽い１口を離れたチ
ャンバ（ｉ４Ｂに通過させる液体ヘッド圧力のみに応動
して稼動するバルブ５０Ｂを含む。しかしながら、前述
のバルブは球を使用しているのに比し、バルブ５０Ｂは
、遠心力がＣＦ、（第６八図）からＣＦ、（第６Ｂ図）
まで増大するときに限り、バルブを開放する目的で変形
するように選定された適当なスプリング定数のスプリン
グ９１によって支えられている固体の正方形ブロック９
０を含んでなる。

流れは矢印１００．１０２に沿って進む。

〔究明の効果］ この発明の技術的な利点は、数百ｇを超える力を用いる
従来の装置とほぼ同様な遠心特間であるにもかかわらず
、著しく低減された遠心力で全血のような４１１分離を
行う相分離方法が提供される点にある。

短縮操作でＤＮＡを抽出可能にすることもこの発明の関
連する技術的効果である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、従来技術により構成される血清分離装置の充
所面図であり、 第２Ａ図は、この発明により構成される血清分離装置の
充所面図であり、 第２］３しＪは、第２Ａ図の線ｎ　ｎ−ｎ　ｎニホぼ沿
つ′ζ切断した断面図°ζあり、 第３図は、この発明の装置で実施した場合の血清分離装
置に対する遠心力のプロットであり、笛４図は、同板リ
ンパｆ、ｌに対する相分離に使用した遠心力のグラフで
あり、 第５図は、第２図のそれど同様な立面図が別の態様を図
示するものであり、そして 第６Ａおよび６Ｂ図は、第５図の一部分と同様な断片的
な断面図であるが、２種の使用位置における別の態様を
図示するものである。 図中の主要な数字は以下の意味をｎする。 ３０・・・装置、　　　　　３２・・・分離チャンバ、
５０・・・バルブ、　　　７６・・・軸線、ｌ・・・・
・・長手寸法、　　ＣＦ・・・遠心力。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ａ）所定量の２相液体を、他の直交空間寸法より長
   い一の空間寸法を有する第一チャンバに置く工程、 ｂ）４００ｇ未満の速度でその一の空間寸法にほぼ平行
   の軸線のまわりに前記チャンバを回転させて前記チャン
   バから分液させる工程、ならびにｃ）分離された軽い相
   を、チャンバ間に挿入されたバルブを介して前記第一チ
   ャンバに隣接する第二チャンバ中へ取り出す工程、 を含んでなる２相液体の重い相から軽い相の分離方法。 ２、ａ）血清とリンパ球が少なくとも比重１．０８ｇ／
   ｍｌを有する血液細胞から分離されるまで約１００ｇ未
   満の遠心力でコンテナ中の全血を回転させる工程、およ
   び ｂ）前記血液細胞から離れたコンパートメント中に血清
   およびリンパ球を取り出す工程、を含んでなる全血から
   のリンパ球の採取方法。 ３、短縮法を用いる分析用ＤＮＡの抽出方法であって、 ａ）単一の遠心工程において、赤血球から血清およびリ
   ンパ球を分離するのに十分な時間１００ｇ未満の遠心力
   でコンテナ中の全血採集物を回転させる工程、 ｂ）前記赤血球から離れたコンパートメントへ試料とし
   て血清およびリンパ球を取り出す工程、ｃ）細胞を溶解
   しそしてその試料を凝固させるのに十分な時間、十分な
   温度に前記で分離した血清およびリンパ球試料を加熱す
   る工程、 ｄ）工程ｃ）で遊離したＤＮＡを、前記凝固した試料に
   水性抽出剤を加えることによって抽出する工程、ならび
   に ｅ）残存する固形物から前記抽出剤を分離することによ
   って抽出したＤＮＡを採集する工程、を含んでなる方法
   。