FR2904004A1 - Modulateurs de scarb-1 dans le traitement de l'acne ou de l'hyperseborrhee - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif ou curatif de l'acné, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité du récepteur SCARB-1, ainsi que l'utilisation de modulateurs de l'expression ou de l'activité de ce récepteur pour le traitement de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. L'invention concerne aussi des méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro de ces pathologies.

Description

1 L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés

modulateurs du récepteur SCARB-1, pour le traitement de l'acné, ainsi que des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro de ces pathologies.

Une peau grasse hyperséborrhéique est caractérisée par une sécrétion et une excrétion exagérées de sébum. Classiquement, un taux de sébum supérieur à 200pg/cm2 mesuré au niveau du front est considéré comme caractéristique d'une peau grasse. Une peau grasse est souvent associée à un défaut de desquamation, un teint luisant, un grain de peau épais. En plus de ces désordres esthétiques, l'excès de sébum peut servir de support au développement anarchique de la flore bactérienne saprophyte (P. acnes en particulier), et provoquer l'apparition de comédons et/ou de lésions acnéiques. Cette stimulation de la production de glandes sébacées est induite par les androgènes. L'acné est, de fait, une maladie chronique du follicule pilosébacé sous dépendance hormonale. Une thérapie hormonale contre l'acné est une possibilité de traitement pour les femmes, le but étant de s'opposer aux effets des androgènes sur la glande sébacée. Dans ce cadre on utilise généralement des oestrogènes, des anti-androgènes, ou des agents diminuant la production d'androgènes par les ovaires ou la glande surrénale. Les anti-androgènes utilisés pour le traitement de l'acné incluent notamment la spironolactone, l'acétate de cyprotérone, et le flutamide. Cependant, ces agents présentent des effets secondaires sévères. Ainsi, toute grossesse doit être absolument empêchée, du fait notamment d'un risque de féminisation pour le foetus mâle. Ces agents sont prohibés chez les patients masculins. II existe donc un besoin d'identifier des médiateurs en aval de l'action des hormones 25 stéroïdiennes, et de les moduler, pour obtenir un profil thérapeutique similaire, mais avec des effets secondaires réduits. La demanderesse a maintenant découvert que le gène codant pour le récepteur SCARB-1 était exprimé dans les glandes sébacées humaines, et que son expression était régulée 30 par les androgènes, in vivo, dans un modèle de glande préputiale de souris. Elle propose dès lors de cibler le gène SCARB-1 ou son produit d'expression, pour prévenir ou améliorer les phénomènes d'acné, ainsi que les désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, notamment l'aspect de peau grasse. Par acné, on entend toutes les formes d'acné, à savoir notamment les acnés vulgaires, 35 comédoniennes, polymorphes, les acnés nodulokystiques, conglobata, ou encore les acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse ou professionnelle.

2904004 2 La demanderesse propose également des méthodes de diagnostic, in vitro ou pronostic in vitro, basées sur la détection du niveau d'expression ou d'activité du SCARB-1.

5 SCARB-1 Les récepteurs éboueurs ("scavengers") sont des protéines de surface cellulaire, qui sont typiquement trouvées sur les macrophages et qui se lient à divers types de lipoprotéines modifiées, telles que les lipoprotéines de basse densité (LDL). Cette famille de récepteurs transmembranaires, qui présente une grande diversité structurelle, est impliquée dans 10 l'endocytose et la phagocytose des cellules apoptotiques et des bactéries, ainsi que dans l'adhésion cellulaire. Ces récepteurs interviendraient aussi dans le dépôt du LDL cholestérol des macrophages au niveau des parois des artères coronaires, au cours des premières phases de la formation d'une plaque d'athérosclérose. SCARB-1 ("scavenger receptor class B, member 1", désigné également SRB-1, ou Cla-1) 15 appartient à la famille des récepteurs "éboueurs" ("scavengers"), de classe B, et est un récepteur des lipoprotéines de haute-densité, qui médie l'incorporation de cholestérol dans les cellules. SRB-1 peut aussi servir de récepteur à des lipoprotéines non-HDL et jouerait un rôle important dans le transport inverse du cholestérol. L'expression de ce gène serait induite par la testostérone dans des macrophages et des hépatocytes en 20 culture (Langer et al, Biochem Biophys Res Commun. 2002, 296(5) :1051-1057). Millena et al (Mol Cell Endocrinol, 2004, 224(1-2) :29-39) ont, de leur côté, montré qu'une augmentation de la production androgénique en réponse au TGF(i était associée à des niveaux élevés d'ARNm de SCARB-1. Dans le contexte de l'invention, le terme gène SCARB-1 ou acide nucléique SCARB-1 signifie le gène ou la séquence nucléique codant pour un récepteur transmembranaire SCARB-1. Si la cible visée est de préférence le gène humain ou son produit d'expression, l'invention peut également faire appel à des cellules exprimant un récepteur SCARB-1 hétérologue, par intégration génomique ou expression transitoire d'une séquence d'acides nucléiques exogène codant pour l'enzyme (par exemple une enzyme d'un autre organisme). Une séquence d'ADNc humain de SCARB-1 est reproduite en annexe (SEQ ID No.1). Il s'agit de la séquence NM005505 dont la partie codante se situe de l'acide nucléique 70 à 1599. Applications diagnostiques Un objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution de lésions acnéiques ou d'un désordre cutané associé à une hyperséborrhée 2904004 3 chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité du SCARB-1, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle.

5 L'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de la protéine SCARB-1 par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité du SCARB-1 peut être également envisagé.

10 Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet contrôle est un sujet sain . Dans le cadre d'un suivi de l'évolution des lésions acnéiques ou d'un désordre cutané lié a une hyperséborrhée, le sujet contrôle fait référence au même sujet à un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To). Cette mesure de la différence d'expression ou de l'activité du SCARB-1, ou d'expression de son gène ou 15 d'activité d'au moins un de ses promoteurs, permet notamment de suivre l'efficacité d'un traitement, notamment un traitement par un modulateur du SCARB-1, tel qu'envisagé plus haut ou par un autre traitement contre l'acné ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien fondé, ou à la nécessité, de poursuivre ce traitement.

20 Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer des lésions acnéiques ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité du SCARB-1, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses 25 promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle. Là encore, l'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de la protéine SCARB-1 par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm 30 correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité du SCARB-1 peut être également envisagé. Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble cutané lié à une hyperséborrhée ou une acné. Le sujet contrôle , dans cette méthode, signifie un sujet ou une population de référence saine . La détection de cette susceptibilité permet 35 la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des signes liés à l'acné ou à un désordre cutané associé à une hyperséborrhée.

2904004 4 Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon biologique testé peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une biopsie. De préférence l'échantillon peut être néanmoins une préparation de cellules de la peau, 5 obtenues par exemple par desquamation ou biopsie. II peut également s'agir de sébum. Méthodes de criblage Un objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une 10 hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité du récepteur SCARB-1 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, ladite modulation indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. La méthode permet donc de sélectionner les composés capables de 15 moduler l'expression ou l'activité du récepteur SCARB-1, ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés 20 associés à une hyperséborrhée, comprenant les étapes suivantes : a. préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; 25 c. mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine SCARB-1, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou 30 de l'activité de la protéine SCARB-1, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b), par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.

35 Par modulation , on entend tout effet sur l'expression ou l'activité du récepteur, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, à savoir 2904004 5 éventuellement une stimulation (c'est à dire une activité agoniste), mais de préférence une inhibition, partielle ou complète (c'est à dire une activité antagoniste). La différence d'expression obtenue avec le composé testé par rapport à un contrôle réalisé en l'absence du composé est significative à partir de 25% ou plus.

5 Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par expression d'une protéine , on entencl la quantité de cette protéine ; Par activité d'une protéine , on entend son activité biologique ; Par activité d'un promoteur , on entend la capacité de ce promoteur à déclencher la transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement 10 la synthèse de la protéine correspondante). Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. II peut s'agir d'une banque de composés chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non caractérisés, ou 15 d'un mélange de composés. Différentes techniques peuvent être mises en oeuvre pour tester ces composés et identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression ou de l'activité du récepteur SCARB-1.

20 Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène SCARB-1, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un 25 substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT (chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta glucuronidase). II peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codée par le gène rapporteur, ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques, fluorométriques, 30 ou de chimioluminescence, entre autres.

2904004 6 Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène SCARB-1, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène. La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule exprimant le gène 5 SCARB-1 de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule ovarienne, ou encore mieux un sébocyte. On peut également utiliser des organes d'origine humaine ou animale, comme par exemple la glande préputiale, clitoridienne, ou encore la glande sébacée de la peau. II peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétérologue, 10 codant pour un récepteur SCARB-1, de préférence humain, ou de mammifère. Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, 15 liposome, virus, électroporation, ou microinjection. Dans cette méthode, l'expression de SCARB-1 peut être déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction. Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité d'ARNm correspondant 20 produite. Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine correspondante produite. L'homme du métier est familier des techniques permettant la détection quantitative ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiclues spécifiques sont les plus usuelles (Northern 25 Blot, RT-PCR, protection à la RNase). II peut être avantageux d'utiliser des marqueurs de détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques ou autres ligands (par exemple, avidine/biotine). En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un ARNm 30 connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une hybridation spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué (radioactif) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été cloné dans un phage. De l'ARN-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions d'hybridation 35 lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN entre l'ARNm recherché et la sonde antisens. Le milieu hybridé est alors incubé avec un mélange de ribonucléases 2904004 7 spécifiques de l'ARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite déprotéinisé et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par autoradiographie.

5 Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal anti-SCARB-1 peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel 10 qu'un lapin ou une souris, à l'aide de l'enzyme entière, prélèvement puis épuisement de l'antisérum selon des méthodes en soi connues de l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues, On peut, par exemple, produire des anticorps 15 monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à la surface du phage (par exemple fUSE5 pour E.coli).

20 Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase homogène; en un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, ou des 25 particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques. Des dosages ELISA, des radioimmunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés. La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des protéines 30 isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la digestion 35 enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) basé sur leurs propriétés physico- 2904004 8 chimiques (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi séparés est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI) soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite 5 identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot). Selon un troisième mode de réalisation, l'étape a) décrite ci-dessus consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant chacun un récepteur SCARB-1 et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer la capacité de liaison du composé au récepteur et la 10 modulation de son activité. Le récepteur SCARB-1 peut être produit selon des techniques usuelles en utilisant les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Elle peut également être produite à l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21.

15 La mesure de l'activité se réfère à la détermination de l'activité d'adhésion cellulaire, activité de transporteur, d'activité apoptotique, d'activité dans le métabolisme lipidique, dans la transduction du signal et/ou dans la sécrétion de cytokine. Un exemple de méthode de détection est présenté dans TIAN et al., Bio Env Sci, 2005, 18 :265-272. Cette méthode de détection de l'activité du récepteur est basée sur 20 l'utilisation de lipoprotéines humaines marquées par fluorescence, les Dil-lipoprotéines (Dil-AcLDL et DiLHDL). La mesure de la liaison des Dil-lipoprotéines est réalisée par incubation de cellules Sf9, préalablement transformées avec un baculovirus à une M.O.I (multiplicité d'infection) de 5 avec des baculovirus possédant ou non la séquence codante pour le récepteur SCARB1, dans 50 pl_ de milieu de culture Grace contenant 0,2% de 25 BSA (sérumalbumine bovine) avec différentes concentrations de DiL-AcLDL et de Dil-HDL à température ambiante pendant quelques heures. Après incubation, les cellules ont été lavées deux fois avec un tampon phosphate (PBS) froid, détachées avec une pipette et transférées sur une plaque contenant 100pL de PBS. Les résultats ont été quantifiés avec un lecteur de fluorescence de plaque. La mesure de l'activité de liaison spécifique du 30 récepteur est faite par différence entre l'activité de liaison des cellules transformées avec le baculovirus n'exprimant pas le récepteur (contrôle) et l'activité de liaison les cellules transformées avec le baculovirus exprimant le récepteur. Modulateurs du récepteur 35 L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur du récepteur humain SCARB-1 susceptible d'être obtenu selon l'une des méthodes décrites ci-dessus pour la 2904004 9 préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Il est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, méthode comprenant l'administration 5 d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur du récepteur humain SCARB-1, à un patient nécessitant un tel traitement. L'invention vise enfin l'utilisation cosmétique d'un modulateur du récepteur SCARB-1, pour le traitement esthétique des peaux grasses. De manière préférentielle, le modulateur est un antagoniste du récepteur. Le terme 10 antagoniste ou inhibiteur se réfère à un composé ou une substance chimique qui élimine ou réduit substantiellement l'activité du récepteur SCARB-1. Le terme substantiellement signifie une réduction d'au moins 25%, de préférence d'au moins 35%, de préférence encore d'au moins 50%, et de manière plus préférée d'au moins 70% ou 90%. Plus particulièrement il peut s'agir d'un composé qui interagit avec, et bloque, la 15 liaison du récepteur avec son ligand. Un inhibiteur préféré interagit avec le récepteur en solution à des concentrations en inhibiteur de moins de lpM, de préférence moins de 0,1 pM, de préférence encore moins de 0,01 pM. Le composé modulateur peut également être un polypeptide, un polynucleotide antisens 20 d'ADN OU d'ARN, un si-ARN, ou un PNA ("Peptide nucleic acid", chaîne polypeptidique substituée par des bases puriques et pyrimidiques, dont la structure spatiale mime celle de l'ADN et permet l'hybridation à celui-ci). Le composé modulateur peut être un anticorps inhibiteur anti- récepteur SCARB-1, de 25 préférence un anticorps monoclonal. De manière avantageuse, un tel anticorps inhibiteur est administré en une quantité suffisante pour obtenir une concentration plasmatique d'environ 0.01 g par ml à environ 100 g/ml, de préférence d'environ 1 g par ml à environ 5pg/ml. II peut par exemple s'agir d'un anticorps qui se lie au domaine extracellulaire collagénique 30 du récepteur, qui joue un rôle dans la liaison au ligand (Acton, 1993, J. Biol. Chem. 268 (5): 3530-7). Des exemples d'anticorps neutralisants sont également décrits dans la demande WO04/80385. D'autres anticorps neutralisants sont connus dans l'art antérieur (voir par exemple Frolov, 2000, J. Biol. Chem. 275 (17): 12769-12780).

2904004 10 L'invention comprend l'utilisation de tels composés antagonistes du récepteur SCARB-1 pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée. D'autres composés modulateurs identifiés par la méthode de criblage décrite plus haut 5 sont également utiles. Les composés modulateurs sont formulés au sein de composition pharmaceutique, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions peuvent être administrées par exemple par voie orale, parentérale, ou topique. De 10 préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la composition 15 pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection. Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au traitement de la peau et des muqueuses et peut se présenter sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, 20 de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée. Cette composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la composition 25 pharmaceutique se présente sous la forrne d'un gel, d'une crème ou d'une lotion. La composition peut comprendre une teneur en modulateur de la SCARB-1 allant de 0,001 à 10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition.

30 La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des combinaisons de ces additifs, tels que : - des agents mouillants; - des agents d'amélioration de la saveur; 35 - des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque; - des agents stabilisants; 2904004 11 - des agents régulateurs d'humidité; - des agents régulateurs de pH; - des agents modificateurs de pression osmotique; - des agents émulsionnants; 5 - des filtres UV-A et UV-B - et des antioxydants, tels que l'aipha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou le butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, l'Ubiquinol ou certains chelatants de métaux.

10 Les Figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Légendes des Figures La Figure 1 montre la mesure de l'expression du gène SCARB-1 chez des souris mâles 15 gonadectomisés et traitées avec le véhicule, le DHT, le DHEA ou la combinaison de DHEA-Flutamide pendant une période de 7 jours une fois par jour (traitement long terme). A la fin de l'expérience les glandes préputiales ont été enlevées, l'ARN a été isolé et l'expression des gènes a été analysée par la technique Affymetrix. GDX: souris gonadectomisées et traitées avec le véhicule 20 DHT: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydrotestosterone (agoniste du récepteur aux androgènes) DHEA: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydroepiandrosterone (précurseur des hormones stéroïdiennes; dans les glandes préputiales métabolisé en androgène actif) DHEA-Flu: souris gonadectomisées et traitées avec une combinaison de 25 Dihydroepiandrosterone et Flutamide (antagoniste du récepteur aux androgènes; qui bloque les effets des agonistes DHT et DHEA). Niveau d'expression: niveau d'expression de l'ARNm La Figure 2 est un graphe d'une étude cinétique de 15 à 96 heures. Les points I_24h et 30 1_24h(R1) montrent le niveau d'expression de SCARB-1 de souris contrôles (= souris non gonadectomisées; duplicata) au point 24 heures. Les points suivants proviennent de souris gonadectomisées et indiquent les temps successifs (en heures) de l'étude cinétique.

2904004 12 La ligne bleue pointillée représente l'expression dans les souris gonadectomisées suite au traitement avec le DHT au temps zéro. La ligne rouge représente l'expression dans les souris gonadectomisées sans traitement avec le DHT. Niveau d'expression: niveau d'expression de l'ARNm Exemples : DONNEES EXPERIMENTALES Exemple 1 : Expression de SCARB-1 dans la glande sébacéehumaine et dans l'épiderme humain.

10 Des glandes sébacées humaines ont été séparées de l'épiderme humain par traitement à la dispase et dissection sous une loupe binoculaire. Des échantillons d'ARN totaux ont été préparés à partir des glandes sébacées et à partir de l'épiderme. L'expression des gènes a été analysée sur une station d'Affymetrix (module 15 microfluidique; four à hybridation; scanner; ordinateur) en suivant les protocoles fournis par la société. En bref, l'ARN total isolé des tissus est transcrit en ADNc. A partir de l'ADNc double brin on synthétise un ARNc marqué à la biotine en utilisant la polymérase T7 et un NTP précurseur conjugué à la biotine. Les ARNc sont ensuite fragmentés en fragments de petites tailles. Toutes les étapes de biologie moléculaire sont contrôlées en 20 utilisant le système Lab on a chip d'Agilent pour confirmer les bonnes efficacités des réactions enzymatiques. La puce Affymetrix est hybridée avec l'ARNc biotinylé, rincée et ensuite marquée par fluorescence en utilisant un fluorophore conjugué à la Streptavidine. Après des lavages la puce est scannée et les résultats sont calculés en utilisant le logiciel MASS fourni par Affymetrix. On obtient une valeur d'expression pour chaque gène ainsi 25 que l'indication de la significativité de la valeur obtenue. Le calcul de la significativité de l'expression est basé sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite à l'hybridation de l'ARNc d'un gène donné avec un oligonucléotide s'hybridant parfaitement ( perfect match ) versus un oligonucléotide qui contient une mutation ( single mismatch ) dans la région centrale de l'oligonucléotide (voir tableau 1) 30 Tableau 1 : Mesure de l'expression de SCARB-1 dans l'épiderme et dans la glande sébacée humaine par utilisation de la technologie Affymetrix.

5 2904004 13 Identifiant Nom du Expression Expression Significativité Significativité Affymetrix gène dans la dans de de glande l'épiderme l'expression* l'expression* sébacée humain dans la dans humaine glande l'épiderme sébacée humain humaine 201819_at Récepteur 190 77 1 1 scavenger membre 1 de la classe B (SCARBI ) *Indicateur de la significativité du gène analysé dans l'échantillon indiqué : présence (=1) ou absence (=0). Résultats : 5 Le récepteur SCARB-1 est bien exprimé dans les deux tissus (glande sébacée, épiderme). L'analyse différentielle entre l'expression dans la glande sébacée humaine et l'épiderme humain montre que SCARE3-1 est exprimé plus fortement dans la glande sébacée humaine.

10 Exemple 2 : expression de SCARB-1 dans la glande préputiale de souris A. Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type sébocytaire et sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée. Elles ont une taille suffisante pour permettre l'isolement d'ARN sans avoir recours à des technologies de 15 microdissection. L'analyse de l'expression de SCARB-1 dans les glandes préputiales de souris a été réalisée dans des conditions de déficience en hormones stéroïdiennes (notamment en hormones androgéniques) suite à une gonadectomie. Les animaux gonadectomisés ont ensuite été traités avec des quantités physiologiques de Dihydrotestosterone (DHT) ou de 20 Dihydroepiandrosterone (DHEA) pour restituer un niveau physiologique des hormones androgéniques, ou bien comme expérience de contrôle avec une combinaison de DHEAFlutamide dans laquelle le Flutamide, un antagoniste du récepteur aux androgènes bloque l'effet de la DHEA. La comparaison de l'expression génique dans ces conditions 2904004 14 expérimentales permet d'identifier de façon non ambiguë la modulation ou non de l'expression génique d'un gène en question par les hormones androgéniques (Figure 1). L'expression génique a été analysée en utilisant la technologie Affymetrix décrit ci- 5 dessus. Résultat: L'ARNm de SCARB-1 est induit par un traitement chronique pendant 7 jours aux androgènes dans la glande préputiale.

10 B. Des souris mâles gonadectomisées et traitées avec le véhicule, ou le DHT. Une étude cinétique de l'expression du gène, de 15 minutes à 96 heures, a été réalisée. Pour cela, les glandes préputiales ont été prélevées pendant une période allant jusqu'à 4 jours (traitement androgénique unique û observation d'une cinétique de court terme), l'ARN a 15 été isolé, et l'expression des gènes a été analysée par la technique Affymetrix (Figure 2). Résultats: La gonadectomie (qui provoque une déficience d'hormones stéroïdiennes) induit une diminution de la quantité d'ARNm de SCARB-1 dans la glande préputiale de la souris.

20 L'ARNm de SCARB-1 dans la glande préputiale de la souris n'est pas induit par un traitement court terme avec le DHT (effet non visible à 18, 24, 48 et 96 heures).

Claims (10)

REVENDICATIONS

1. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de Ha capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité du récepteur SCARB-1 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.

2. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes : a. Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. Mesure de l'expression ou de l'activité du récepteur SCARB-1, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité du récepteur SCARB-1, ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.

3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composés sélectionnés à l'étape d) inhibent: l'expression ou l'activité du récepteur SCARB-1, ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.

4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du prornoteur du gène codant le récepteur SCARB-1, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. 2904004 16

5. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour SCARB-1, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène. 5

6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des sébocytes.

7. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des cellules transformées par un acide nucléique hétérologue codant pour le récepteur 10 SCARB-1.

8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène. 15

9. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de traduction dudit gène.

10. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les mélanges réactionnels comprennent chacun un récepteur SCARB-1, et en ce que l'étape c) 20 consiste à mesurer l'activité du récepteur.