FR2901807A1 - Nouveau traitement d'une infection par le vhc - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une molécule d'ARN simple brin qui comprend, en partant de l'extrémité 3' vers l'extrémité 5', (i) une séquence d'acide nucléique complémentaire à la région 5' non-codante (5'UTR) de l'ARN génomique (brin (+)) du virus de l'hépatite C (VHC), laquelle séquence d'acide nucléique permet la réplication de ladite molécule d'ARN simple brin par le complexe de réplication du VHC, (ii) la séquence d'acide nucléique complémentaire d'une séquence d'acide nucléique correspondant d'un site d'entrée interne du ribosome (IRES), et (iii) la séquence d'acide nucléique complémentaire de la séquence d'acide nucléique d'un gène suicide ou d'un gène codant pour une protéine interférant avec la réplication du virus VHC ; une molécule d'ADN permettant la transcription de ladite molécule d'ARN simple brin ; un vecteur d'acide nucléiques comprenant lesdites molécules d'acides nucléiques ; et une composition pharmaceutique comprenant lesdites molécules d'acide nucléique ou ledit vecteur d'acide nucléique.

Description

NOUVEAU TRAITEMENT D'UNE INFECTION PAR LE VHC La présente invention

concerne une molécule d'acide nucléique, une composition pharmaceutique comprenant une telle molécule d'acide nucléique et l'utilisation d'une telle molécule d'acide nucléique pour la préparation d'un médicament destiné à traiter ou à prévenir une infection par le virus de l'hépatite C. Le virus de l'hépatite C (VHC) représente aujourd'hui un important problème de santé publique, au vu de la forte prévalence de l'infection par celui-ci et du risque important d'évolution ultérieure vers une hépatite chronique de l'ordre de 80%. En effet, le virus de l'hépatite C (VHC) infecte environ 3 % de la population et est responsable d'approximativement 170 millions d'infections chroniques. Les patients atteints d'une telle infection chronique sont alors susceptibles de développer une cirrhose, avec un risque estimé à 20-30% vingt ans après la primo-infection, qui peut évoluer en hépatocarcinome. La primo-infection étant généralement asymptomatique, l'infection est diagnostiquée lorsque les complications liées à l'infection chronique apparaissent. Le VHC est un virus à ARN positif, appartenant à la famille des Flaviviridae, découvert par la société CHIRON en 1989 (KUO et al., Science, vol. 244(4902), p :362-4, 1989). Des analyses moléculaires fines ont permis de démontrer qu'il existe près de 6 génotypes différents de VHC, lesquels génotypes se subdivisent en de multiples sous-types. Concernant les infections par le VHC, la majorité d'entre elles sont associées au génotype 1.

L'ARN génomique du VHC contient une seule phase ouverte de lecture encadrée par des séquences non codantes en 5' (5'UTR) et en 3' (3'UTR). Si la séquence 5'UTR montre une importante conservation quel que soit le génotype étudié, la séquence 3'UTR montre de son côté une importante variabilité au niveau de ses 30 premiers nucléotides en fonction du génotype étudié. Parallèlement, la phase ouverte de lecture code selon le génotype considéré pour une polyprotéine de 3008 à 3037 acides aminés, laquelle est clivée de façon co- et post- traductionnelle par des protéases cellulaires et virales pour générer au moins 10 protéines virales matures impliquées dans la réplication et la morphogenèse de nouveaux virions. Plus spécifiquement, les protéines structurales sont situées dans le tiers amino-terminal de ladite polyprotéine et les protéines non structurales, dont certaines forment le complexe de réplication, dans la partie carboxy-terminale de la polyprotéine. La région 5'UTR contient un site d'entrée interne de ribosome qui permet au génome viral (brin (+)), suite à l'internalisation du virion, d'être traduit de manière coiffe-indépendante. Après traduction et maturation de la polyprotéine, le complexe de réplication s'assemble, puis l'ARN polymérase dépendante de l'ARN (NS5B) commence la réplication de l'ARN. Le complexe de réplication du VHC est donc présent au sein de toutes les cellules infectées. La réplication de l'ARN génomique simple brin du VHC nécessite une étape intermédiaire correspondant à la synthèse d'un brin anti-génomique de polarité négative (brin (-)), lequel servira de matrice pour la synthèse d'ARN génomiques de polarité positive (brin (+)). Pour cette étape de réplication de l'ARN génomique du VHC, les deux séquences 5'UTR et 3'UTR sont indispensables. La séquence 3'UTR est nécessaire pour la synthèse du brin (-) à partir du brin (+). Parallèlement, la séquence 5'UTR est nécessaire pour la synthèse des brins (+) des nouveaux virions à partir du brin (-). La région 5'UTR présente une longueur de l'ordre de 340 nucléotides. Cette région 5'UTR comprend quatre domaines présentant une structure de type tige-boucle (domaines 5'UTR-dl à 5'UTR-dIV), le dernier domaine 5'UTR- dIV étant chevauchant avec les premiers nucléotides de la phase codante correspondant à la protéine de capside de la polyprotéine. Cette région 5'UTR se trouve fortement conservée entre les différentes souches du VHC et ceci tant au niveau de la séquence nucléotidique qu'au niveau structural. Outre son rôle dans la réplication du génome, la région 5'UTR est également impliquée dans l'initiation de la traduction de la polyprotéine. Le domaine minimal de la région 5'UTR pour que la réplication s'effectue comprend les domaines 5'UTR-dI et 5'UTR-d. II (FRIEBE et al., J. Virol., vol.75(24), p:12047-57, 2001), le domaine 5'UTR-dIII jouant un rôle modulateur sur celle-ci (REUSKEN et al., J. Gen. Virol., vol.84, p:1761-69, 2003). Le domaine minimal pour la traduction du VHC correspond à un site d'entrée interne du ribosome (IRES) auquel vient directement se fixer le ribosome (HONDA et al., Virology, vol.222(1), p:31-42, 1996) qui permet une initiation de la traduction coiffe-indépendante. À l'exception de la tige-boucle constituant le domaine 5'UTR-dI, les domaines 5'UTR-dII à 5'UTR-dIV sont nécessaires à l'initiation de la traduction. Cependant, la localisation de l'extrémité 3' de l'IRES est controversée. L'évaluation de l'efficacité d'initiation de la traduction à partir de segments de régions 5' du génome de VHC de différentes longueurs placés en amont de différents gènes rapporteurs (SEAP, CAT) a conduit certains auteurs à conclure que la partie 5' de la séquence codant la protéine de capside C localisée directement en aval de l'AUG initiateur, était nécessaire pour obtenir une efficacité optimale de l'IRES (REYNOLDS et al., RNA, vol.2(9), p:867-78, 1996; LU et al., Proc Natl Acad Sci U S A., vol.93(4), p:1412-7, 1996), ce qui a été réfuté par d'autres (RIJNBRAND et al., FEBS Lett., vol.365(2-3), p:115-9, 1995).

Une des difficultés majeures pour développer de nouveaux traitements antiviraux a découlé de l'absence de systèmes de culture cellulaires permissifs à l'infection et à la réplication du VHC, mais également de l'absence de modèles animaux de petite taille qui remplaceraient le chimpanzé, seul modèle animal expérimental sensible à l'infection par le VHC. Une première avancée majeure a pu être réalisée avec le développement d'ARN sous-génomiques bicistroniques (réplicons) du VHC capables de se répliquer dans la lignée hépatocytaire Huh-7 (LOHMANN et al., Science., vol.285(5424), p:110-3, 1999). Pour autant, et malgré les nombreuses améliorations apportées à ce système, aucune équipe n'a pu montrer à ce jour que des réplicons génomiques codant l'ensemble des protéines structurales et non structurales du VHC soient capables de générer des particules virales. En outre, seuls des réplicons de génotype la, lb et plus récemment de génotype 2a (KATO et al., Gastroenterology, vol.125(6), p :1808-17, 2003) ont pu être étudiés dans ce système. Ce système cellulaire reste toutefois un modèle de prédilection pour étudier la réplication virale et pour mettre au point de nouveaux antiviraux plus efficaces. À ce jour, différents traitements ont pu être développés pour traiter les infections par le VHC, le traitement actuel antiviral le plus efficace consistant en une bithérapie reposant sur l'utilisation conjointe d'interféron alpha pégylé et d'un analogue nucléosidique, la ribavirine. Toutefois, l'efficacité de ce traitement semble dépendre en partie du génotype du virus responsable de l'infection. En effet, cette thérapie n'est efficace que pour environ 40 à 50 % des patients infectés chroniquement par les souches du VHC de génotype 1 alors qu'elle guérit près de 80 % des patients infectés par les VHC de génotypes 2 ou 3. Sachant que le génotype 1 est prédominant dans une grande partie du monde (60 à 90 % des infections), la nécessité de mettre au point de nouveaux antiviraux et/ou un vaccin constitue un besoin important.

D'autre part, l'utilisation dans cette thérapie d'interféron la rend très coûteuse et souvent mal supportée par le patient. Pour améliorer le traitement des infections par le VHC, de nombreux travaux ont été menés pour découvrir de nouvelles molécules qui inhibent spécifiquement des étapes du cycle viral du VHC. Dans les stratégies développées, on peut distinguer (1) celles qui visent à cibler au niveau protéique spécifiquement les enzymes virales qui n'ont pas d'homologue cellulaire, notamment l'ARN polymérase ARN dépendante (NS5B) ou la protéase virale NS3, et (2) les stratégies qui prennent pour cible le génome du VHC. Dans le cadre de cette seconde stratégie, de nombreuses molécules ont été développées pour inhiber la réplication virale, comme notamment des ribozymes, des ARNi, des aptamères ou encore des acides nucléiques anti-sens. Pour autant, les composés développés pour ces approches ont été confrontés à la grande variabilité génétique du VHC, conséquence de l'infidélité de l'ARN polymérase du VHC (NS5B) lors de la réplication du génome du VHC. En effet, et dans la mesure où ces molécules ciblent spécifiquement une séquence du génome du VHC, une unique mutation au sein du génome viral peut réduire, voire annuler, leur activité d'inhibition de la réplication du VHC. En outre, la variabilité existant entre les différents génotypes du VHC interdit le plus souvent d'utiliser une même molécule pour traiter des infections par différents génotypes du VHC. Il existe donc aujourd'hui un besoin important pour identifier de nouvelles molécules possédant une spécificité suffisamment large pour cibler les nombreux variants du VHC, tout en conservant une grande efficacité vis-à-vis des différents variants. De façon surprenante, les inventeurs ont maintenant 35 réussi à développer un vecteur suicide sous la forme d'un ARN génomique chimère de polarité négative qui sera répliqué en un ARN génomique chimère de polarité positive uniquement dans les cellules infectées par le VHC (cellules exprimant le complexe de réplication du VHC), lequel ARN génomique chimère de polarité positive permet la traduction d'une protéine toxique dont l'expression entraîne la mort des cellules infectées par le VHC. L'ARN génomique chimère de polarité négative selon l'invention permet ainsi de s'affranchir des problèmes mentionnés précédemment, notamment l'efficacité variable en fonction des génotypes des molécules anti-VHC des traitements de l'art antérieur et la grande variabilité génétique à la base des résistances aux antiviraux. Ainsi, un premier objet de l'invention correspond à une molécule d'ARN simple brin, correspondant à un ARN génomique chimère de polarité négative (ARN(-)) du virus de l'hépatite C (VHC), laquelle molécule d'ARN simple brin est caractérisée en ce qu'elle comprend en partant de l'extrémité 3' vers l'extrémité 5' : (i) une séquence d'acide nucléique complémentaire à la région 5' non-codante (5'UTR) de l'ARN génomique (brin (+)) du virus de l'hépatite C (VHC), laquelle séquence d'acide nucléique complémentaire permet la réplication de ladite molécule d'ARN simple brin par le complexe de réplication du VHC ; (ii) la séquence d'acide nucléique complémentaire d'une séquence d'acide nucléique correspondant à un site d'entrée interne du ribosome (IRES); (iii) la séquence d'acide nucléique complémentaire de la séquence d'acide nucléique d'un gène suicide ou d'un gène codant pour une protéine interférant avec la réplication du virus VHC ; et (iv) éventuellement, une séquence d'acide nucléique complémentaire à la région 3' non-5 codante (3'UTR) de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC. La molécule d'ARN simple brin selon l'invention est non codante. En conséquence, ladite molécule d'ARN simple brin, lorsqu'elle est présente dans des cellules 10 non-infectées par le VHC dans lesquelles le complexe de réplication du VHC n'est donc pas exprimé, ne permet pas d'obtenir le transcrit du gène suicide et sa traduction consécutive et donc d'induire la mort cellulaire. En revanche, la molécule d'ARN simple brin selon 15 l'invention, lorsqu'elle est présente dans des cellules infectées par le VHC qui expriment le complexe de réplication, est répliquée en un brin complémentaire (brin (+)) dont la traduction initiée au niveau de la séquence IRES induit la synthèse de la protéine du gène suicide et, 20 consécutivement, la mort cellulaire. L'utilisation d'une molécule d'ARN simple brin correspondant à un ARN génomique chimère de polarité négative (brin (-)) du virus de l'hépatite C permet, à la différence d'un ARN génomique chimère de polarité positive 25 (brin (+)), de s'affranchir de l'étape de réplication nécessitant la reconnaissance de la séquence 3'UTR du brin (+) pour obtenir sa réplication en brin (-). Dans la mesure où les 30 premiers nucléotides de cette région 3'UTR sont plus faiblement conservés entre les différents 30 génotypes par rapport à la région 5'UTR, l'utilisation d'un ARN génomique chimère de polarité positive, par rapport à un ARN génomique chimère de polarité négative, pourrait s'avérer d'une efficacité très variable en fonction du génotype du virus de l'hépatite C infectant la 35 cellule, le tissu ou le patient à traiter.

Avantageusement, la molécule d'ARN simple brin selon l'invention peut comprendre des ribonucléotides modifiés ou non, de préférence ladite molécule d'ARN simple brin comprend des ribonucléotides non-modifiés.

Par ribonucléotide modifié, on entend un ribonucléotide naturel substitué par un analogue synthétique d'un nucléotide, lequel analogue synthétique de ribonucléotide est, de préférence, localisé à l'extrémité 3' ou 5' de la molécule d'acide nucléique.

Des analogues synthétiques de nucléotides préférés sont sélectionnés parmi les ribonucléotides présentant un groupement sucre ou groupement carboné modifié. De préférence, les ribonucléotides présentant un groupement sucre modifié présentent un groupement 2'-OH remplacé par un groupement sélectionné parmi un atome d'hydrogène, un halogène, un groupement OR, R, SH, SR, NH2, NHR, NR2 ou CN, dans lequel R est un groupement alkyle, alcényle ou alcynyle de 1 à 6 carbone et l'halogène est le fluor, le chlore, le brome ou l'iode. De préférence, les ribonucléotides présentant un groupement carboné modifié ont leur groupement phosphoester lié au ribonucléotide adjacent qui est remplacé par un groupement modifié tel qu'un groupement phosphothioate. Pour autant, il est également possible d'utiliser des ribonucléotides présentant un noyau purine ou pyrimidine modifié. Comme exemples de tels noyaux modifiés, on citera notamment les uridines ou les cytidines modifiées en position 5, telles que la 5-(2-amino)propyl uridine et la 5-bromo uridine, les adénosines et guanosines modifiées en position 8, telle que la 8-bromo guanosine, les nucléotides déazotés, telle que la 7-déaza-adénosine, les nucléotides N-et O-alkylés, telle que la N6-méthyl adénosine. Ces différentes modifications peuvent également être combinées. Par une séquence d'acide nucléique complémentaire à 35 la région 5' non-codante (5'UTR) de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC, laquelle séquence d'acide nucléique complémentaire permet la réplication de ladite molécule d'ARN simple brin par le complexe de réplication du VHC , on entend une séquence d'acide nucléique comprenant au moins la séquence complémentaire d'une séquence comprenant les domaines tige-boucle I et II (5'UTR-dI et 5' UTR-dII) de ladite région 5'UTR, de préférence au moins la séquence complémentaire d'une séquence comprenant les domaines tige- boucle I, II et III (5'UTR-dI, 5' UTR-dII et 5' UTR-dIII) de ladite région 5'UTR.

L'homme du métier, au regard de ses connaissances générales pourra déterminer simplement la séquence des différents domaines tige-boucle dans la région 5'UTR du virus VHC d'un génotype donné, voir d'un sous-type donné. Les connaissances générales de l'homme du métier concernant le VHC et le positionnement de ces domaines sont notamment illustrées sur le site http://euhcvdb.ibcp.fr/euHCVdb/. À titre d'exemple, le domaine 5'UTR-dI va des nucléotides 5 à 20 des séquences ayant le numéro d'accession M62321, M67463 ou AF009606 pour le génotype la ; 1 à 8 de la séquence ayant le numéro d'accession D90208 ou 1 à 11 de la séquence ayant le numéro d'accession M58335 pour le génotype lb ; 5 à 20 de la séquence ayant le numéro d'accession D14853 ou AY051292 pour le génotype le ; 5 à 19 de la séquence ayant le numéro d'accession D00944 ou AB047639 pour le génotype 2a ; 5 à 20 de la séquence ayant le numéro d'accession D10988 ou AB030907 pour le génotype 2b ; 5 à 19 de la séquence ayant le numéro d'accession D50409 pour le génotype 2c ; 6 à 20 de la séquence ayant le numéro d'accession AB031663 pour le génotype 2k ; 5 à 18 de la séquence ayant le numéro d'accession D17763 ou D28917 pour le génotype 3a ; 5 à 18 de la séquence ayant le numéro d'accession D49374 pour le génotype 3b ; 5 à 18 de la séquence ayant le numéro d'accession D63821 pour le génotype 3k ; 5 à 19 de la séquence ayant le numéro d'accession D84262 pour le génotype 6b ; 5 à 18 de la séquence ayant le numéro d'accession D84263 pour le génotype 6d ; 5 à 18 de la séquence ayant le numéro d'accession D63822 pour le génotype 6g ; 5 à 18 de la séquence ayant le numéro d'accession D84265 pour le génotype 6h ; 5 à 18 de la séquence ayant le numéro d'accession D84264 pour le génotype 6k. À titre d'exemple, le domaine 5'UTR-dII va des nucléotides 44 à 118 des séquences ayant le numéro d'accession M62321, M67463 ou AF009606 pour le génotype la ; 35 à 109 de la séquence ayant le numéro d'accession M58335 ou 32 à 106 de la séquence ayant le numéro d'accession D90208 pour le génotype lb; 44 à 118 des séquences ayant le numéro d'accession D14853 ou AY051292 pour le génotype le ; 43 à 117 des séquences ayant le numéro d'accession D00944 ou AB047639 pour le génotype 2a ; 44 à 118 des séquences ayant le numéro d'accession AB030907 ou D10988 pour le génotype 2b ; 43 à 117 de la séquence ayant le numéro d'accession D50409 pour le génotype 2c ; 44 à 118 de la séquence ayant le numéro d'accession AB031663 pour le génotype 2k ; 42 à 116 de la séquence ayant le numéro d'accession D17763 ou D28917 pour le génotype 3a ; 42 à 116 de la séquence ayant le numéro d'accession D49374 pour le génotype 3b ; 42 à 116 de la séquence ayant le numéro d'accession D63821 pour le génotype 3k ; 1 à 72 de la séquence ayant le numéro d'accession AY859526 pour le génotype 6a ; 42 à 116 de la séquence ayant le numéro d'accession D84262 pour le génotype 6b ; 41 à 115 de la séquence ayant le numéro d'accession D84263 pour le génotype 6d ; 41 à 115 de la séquence ayant le numéro d'accession D63822 pour le génotype 6g ; 41 à 115 de la séquence ayant le numéro d'accession D84265 pour le génotype 6h ; 41 à 115 de la séquence ayant le numéro d'accession D84264 pour le génotype 6k. À titre d'exemple, le domaine 5'UTR-dIII va des nucléotides 125 à 323 des séquences ayant le numéro d'accession M62321, M67463 ou AF009606 pour le génotype la ; 116 à 314 de la séquence ayant le numéro d'accession M58335 ou 113 à 311 de la séquence ayant le numéro d'accession D90208 pour le génotype lb ; 125 à 323 des séquences ayant le numéro d'accession D14853 ou AY051292 pour le génotype le ; 124 à 322 des séquences ayant le numéro d'accession D00944 ou AB047639 pour le génotype 2a ; 125 à 323 des séquences ayant le numéro d'accession AB030907 ou D10988 pour le génotype 2b ; 124 à 322 de la séquence ayant le numéro d'accession D50409 pour le génotype 2c ; 125 à 323 de la séquence ayant le numéro d'accession AB031663 pour le génotype 2k ; 123 à 321 des séquences ayant le numéro d'accession D17763 ou D28917 pour le génotype 3a ; 123 à 321 de la séquence ayant le numéro d'accession D49374 pour le génotype 3b ; 123 à 321 de la séquence ayant le numéro d'accession D63821 pour le génotype 3k ; 63 à 261 de la séquence ayant le numéro d'accession Y11604 pour le génotype 4a ; 30 à 228 de la séquence ayant le numéro d'accession AF064490 pour le génotype 5a ; 79 à 277 de la séquence ayant le numéro d'accession AY859526 pour le génotype 6a ; 123 à 324 de la séquence ayant le numéro d'accession D84262 pour le génotype 6b ; 122 à 320 de la séquence ayant le numéro d'accession D84263 pour le génotype 6d ; 122 à 320 de la séquence ayant le numéro d'accession D63822 pour le génotype 6g ; 122 à 320 de la séquence ayant le numéro d'accession D84265 pour le génotype 6h ; 122 à 320 de la séquence ayant le numéro d'accession D84264 pour le génotype 6k. Avantageusement, on entend par une séquence d'acide nucléique complémentaire à la région 5' non-codante (5'UTR) de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC, laquelle séquence d'acide nucléique complémentaire permet la réplication de ladite molécule d'ARN simple brin par le complexe de réplication du VHC , la séquence d'acide nucléique complémentaire de la séquence allant de la position 1 à 120 de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC, de préférence comprenant allant de la position 1 à 150 et de manière particulièrement préféré allant de la position 1 à 341 de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC. La position 1 correspond au premier nucléotide de la de l'ARN génomique (brin (+)) d'un virus de l'hépatite C (VHC) complet. Par région 5'UTR de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC, on entend la région 5'UTR de l'ARN génomique d'un virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, ou une séquence dérivée de celle-ci. Par séquence dérivée, on entend une séquence présentant une identité d'au moins 80% avec la séquence de la région 5'UTR de l'ARN génomique d'un virus de l'hépatite C de génotype 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, de préférence d'au moins 85%, notamment d'au moins 90%, et de manière particulièrement préférée d'au moins 95% d'identité. De préférence, la séquence de la région 5'UTR de l'ARN génomique du VHC correspond à la séquence de la région 5'UTR du génome de l'ARN génomique d'un virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 1. De manière particulièrement préférée, la séquence de la région 5'UTR de l'ARN génomique du VHC correspond à la séquence allant de la position 1 à 120 de la séquence SEQ ID No : 1, de préférence allant de la position 1 à 150 et de manière particulièrement préférée allant de la position 1 à 341 de la séquence SEQ ID No :1 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.

L'homme du métier pourra identifier, sans difficulté et au regard de ses connaissances générales, une séquence d'acide nucléique correspondant à un site d'entrée interne du ribosome (IRES). Une telle séquence IRES pourra être d'origine eucaryote ou d'origine virale. À titre d'exemple de séquence IRES d'origine eucaryote, on peut citer la séquence IRES des transcrits codant pour les protéines choisies dans le groupe comprenant la famille FGF (Fibroblast Growth Factor), la famille des connexines, la protéine p27 inhibitrice de la kinase dépendante des cyclines, BCL 2, HSP 101, HSP 70, les proto-oncogènes c-myc, L-myc, n-myc ou encore le répresseur transcriptionnel Mnt. À titre d'exemple de séquence IRES d'origine virale, on peut citer la séquence IRES du virus de la poliomyélite, du virus de l'encéphalomyocardite (EMCV), du virus GBV-A, du virus GBV-B, du virus GBV-C, du virus de l'hépatite C, du virus de la diarrhée virale bovine (BVDV), des virus A et B de la rhinite équine (ERAV et ERBV), des rétroéléments ZAM, Idefix et gypsy ou du VIH. De préférence, la séquence IRES est d'origine virale et de manière particulièrement préférée ladite séquence IRES correspond à la séquence IRES du VHC, laquelle comprend les domaines tige-boucle II à IV (5'UTR-dII à 5' UTR-dIV) de la région 5'UTR de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC. À titre d'exemple, la séquence IRES du VHC va des nucléotides 44 à 354 des séquences ayant le numéro d'accession M62321, M67463 ou AF009606 pour le génotype la ; 35 à 345 de la séquence ayant le numéro d'accession M58335 ou 32 à 342 de la séquence ayant le numéro d'accession D90208 pour le génotype lb ; 44 à 354 des séquences ayant le numéro d'accession D14853 ou AY051292 pour le génotype le ; 43 à 353 des séquences ayant le numéro d'accession D00944 ou AB047639 pour le génotype 2a ; 44 à 354 des séquences ayant le numéro d'accession AB030907 ou D10988 pour le génotype 2b ; 43 à 353 de la séquence ayant le numéro d'accession D50409 pour le génotype 2c 44 à 354 de la séquence ayant le numéro d'accession AB031663 pour le génotype 2k ; 42 à 352 des séquences ayant le numéro d'accession D17763 ou D28917 pour le génotype 3a ; 42 à 352 de la séquence ayant le numéro d'accession D49374 pour le génotype 3b ; 42 à 352 de la séquence ayant le numéro d'accession D63821 pour le génotype 3k ; 1 à 308 de la séquence ayant le numéro d'accession AY859526 pour le génotype 6a ; 42 à 355 de la séquence ayant le numéro d'accession D84262 pour le génotype 6b ; 41 à 351 de la séquence ayant le numéro d'accession D84263 pour le génotype 6d ; 41 à 351 de la séquence ayant le numéro d'accession D63822 pour le génotype 6g ; 41 à 351 de la séquence ayant le numéro d'accession D84265 pour le génotype 6h ; 41 à 351 de la séquence ayant le numéro d'accession D84264 pour le génotype 6k. Avantageusement, on entend séquence IRES du VHC , la séquence allant de la position 30 à 355 de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC, de préférence allant de la position 25 à 370 et de manière particulièrement préférée allant de la position 20 à 385 de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC.

Par séquence IRES du VHC, on entend la séquence IRES d'un ARN génomique (brin (+)) d'un virus de l'hépatite (VHC) de génotype 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, ou une séquence dérivée de celle-ci, de préférence la séquence IRES de l'ARN génomique (brin (+)) d'un virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 1. Par séquence dérivée, on entend une séquence présentant une identité d'au moins 80% avec la séquence de la séquence IRES de l'ARN génomique (brin (+)) d'un virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, de préférence d'au moins 85%, notamment d'au moins 90%, et de manière particulièrement préférée d'au moins 95% d'identité. De manière particulièrement préférée, la séquence IRES du VHC correspond à la séquence allant de la position 30 à 355 de la séquence SEQ ID No : 1, de préférence allant de la position 25 à 370 et de manière particulièrement préférée allant de la position 20 à 386 de la séquence SEQ ID No :1 ou d'une séquence dérivée de celle-ci. Selon un mode de réalisation préférée, la molécule d'ARN simple brin selon l'invention comprend la séquence complémentaire de la séquence allant de la position 1 à 355 de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC, de préférence allant de la position 1 à 370 et de manière particulièrement préférée allant de la position 1 à 385 de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC. Par séquence de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC, on entend la séquence d'un virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, ou une séquence dérivée de celle-ci, de préférence on entend la séquence d'un virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 1. Par séquence dérivée, on entend une séquence présentant une identité d'au moins 80% avec la séquence de l'ARN génomique (brin (+)) d'un virus de l'hépatite C de génotype 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, de préférence d'au moins 85%, notamment d'au moins 90%, et de manière particulièrement préférée d'au moins 95% d'identité. De préférence, la molécule d'ARN simple brin selon l'invention comprend la séquence complémentaire de la séquence allant de la position 1 à 355 de la séquence SEQ ID No : 1, de préférence allant de la position 1 à 370 et de manière particulièrement préférée allant de la position 1 à 386 de la séquence SEQ ID No :1 ou d'une séquence dérivée de celle-ci. L'homme du métier pourra déterminer,sans difficulté et au regard de ses connaissances générales, les séquences d'acide nucléique des gènes suicides utilisables pour la molécule selon l'invention. L'homme du métier pourra identifier simplement les gènes codant pour des protéines interférant avec la réplication du virus VHC au regard de ses connaissances générales. À titre d'exemple de protéines interférant avec la réplication du VHC, on peut citer l'interféron a, l'interféron (3 et l'interféron y, de préférence l'interféron a et de manière particulièrement préférée l'interféron a 2a ou a 2b. Par gène suicide, on entend un gène qui code pour un produit protéique qui induit la mort de la cellule en présence ou en l'absence de drogues.

Selon un mode de réalisation particulier, le gène suicide code pour une enzyme bactérienne ou virale induisant la mort de la cellule en présence d'une drogue spécifique. Plus spécifiquement, lesdites enzymes convertissent la forme inactive d'une drogue (prodrogue) présente dans le milieu en sa forme active et toxique induisant la mort de la cellule, par exemple par une inhibition de la synthèse d'acide nucléique. L'homme du métier pourra identifier, sans difficulté 20 et au regard de ses seules connaissances générales, les gènes suicides adaptés. À titre d'exemple de tels gènes suicides, on peut citer, à titre non-limitatif, les gènes de la thymidine kinase de HSV (HSV1tk) ou de la cytosine déaminase (CD), 25 utilisés respectivement avec le Ganciclovir ou le 5-FU respectivement (cf. demande internationale PCT WO 2005/092374, pages 11 et 12). Selon un autre mode de réalisation particulier, le gène suicide code pour une toxine protéique induisant la 30 mort de la cellule. À titre d'exemple de protéines utilisables, on peut citer les exotoxines bactériennes, les toxines fongiques, les toxines d'origine eucaryote, d'origine végétale ou d'origine virale ou des protéines dérivées de celles-ci. Par protéine dérivée, on entend une protéine présentant une identité d'au moins 80% avec une exotoxine bactérienne, une toxine fongique, une toxine d'origine eucaryote, d'origine végétale ou d'origine virale, de préférence d'au moins 85%, notamment d'au moins 90%, et de manière particulièrement préférée d'au moins 95% d'identité.

Avantageusement encore, la toxine protéique induisant la mort de la cellule appartient à la famille RIP (Ribosome-Inactivating Protein), lesquelles toxine protéiques existent dans de nombreuses espèces de plantes, de bactéries ou fongiques (VAN DAMME et al., Crit. Rev.

Plant Sci., vol.20, p :395-465, 2001 ; SANDVIG and VAN DEURS, FEBS Lett., vol.529, p :49-53, 2002). Les protéines de la famille RIP sont apparentées à la famille des lectines, mais leur toxicité est beaucoup plus importante que ces dernières. Les protéines de la famille RIP se divisent en deux types en fonction de leur structure moléculaire. Le type I regroupe les protéines qui comportent une seule chaîne polypeptidique d'environ 30 kDa et sont dépourvues d'activité lectine permettant la fixation à la surface cellulaire, ce qui leur confère une faible toxicité. Le type II regroupe les protéines comprenant deux chaînes polypeptidiques A et B aux propriétés distinctes. L'haptomère ou chaîne B (Binding), qui contient un domaine lectine, interagit avec un sucre ou un composé glycosylé de la surface de la cellule et facilite l'entrée de la chaîne A dans la cellule. L'effectomère, ou chaîne A (Activity) est porteuse de l'activité toxique. La mieux connue de ces toxines est la ricine (de Ricinus communis) mais d'autres phytotoxines telles que l'abrine (d'Abrus precatorius), la modeccine (d'Adenai digitata), la volkensine (d'Adenia volkensii) et la viscumine (de Viscum album), possèdent les mêmes propriétés. Entrent également dans ce groupe certaines toxines bactériennes comme la Shiga toxine produite par shigella dysentria et des toxines apparentées (Shiga like toxins ou SLT) sécrétées par certaines souches d'Escherichia coli (STEC aussi appelées VTEC car cytotoxiques pour les cellules Vero) mais aussi Citrobacter freundii, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae et Enterobacter cloacae. Les RIPs de type 2 sont beaucoup plus efficaces que les RIPs de type 1 ; en effet, bien que puissants inhibiteurs de la synthèse protéique dans des préparations acellulaires, les RIPs de type 1 sont beaucoup moins toxiques chez la souris (DL50 de 1 à 40 mg/kg) que les RIP de type 2 (DL50 de la ricine :2pg/kg). Avantageusement, le gène suicide code pour une toxine protéique de la famille RIP de type 2 ou une protéine dérivée, de préférence pour la chaîne A d'une toxine protéique de la famille RIP de type 2 comme la ricine, l'abrine, la modeccine, la volkensine, la viscumine et la Shiga toxine, et de manière particulièrement préférée pour la chaîne A de la ricine. De manière particulièrement préférée, le gène suicide 25 correspond à la séquence SEQ ID No : 2 ou à une séquence dérivée. Par séquence dérivée, on entend une séquence présentant une identité d'au moins 80% avec la séquence SEQ ID No :2, de préférence d'au moins 85%, notamment d'au 30 moins 90%, et de manière particulièrement préférée d'au moins 95% d'identité. L'homme du métier, au regard de ses connaissances générales pourra déterminer simplement la séquence d'acide nucléique complémentaire de la région 3' non-codante 35 (3'UTR) de l'ARN génomique (brin (+)) d'un virus de l'hépatite C (VHC) d'un génotype donné, voir d'un sous-type donné. Les connaissances générales de l'homme du métier concernant le VHC et le positionnement de cette région sont notamment illustrées sur le site http://euhcvdb.ibcp.fr/euHCVdb/. À titre d'exemple, la région 3'UTR va des nucléotides 9378 à 9646 de la séquence ayant le numéro d'accession AF009606 pour le génotype la ; 9443 à 9678 de la séquence ayant le numéro d'accession AB047639 pour le génotype 2a ; 9444 à 9654 de la séquence ayant le numéro d'accession AB030907 pour le génotype 2b ; 9403 à 9628 de la séquence ayant le numéro d'accession D84262 pour le génotype 6b ; 9381 à 9615 de la séquence ayant le numéro d'accession D84263 pour le génotype 6d ; 9387 à 9621 de la séquence ayant le numéro d'accession D84264 pour le génotype 6k. Par région 3'UTR de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC, on entend la région 3'UTR de l'ARN génomique d'un virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, ou une séquence dérivée de celle-ci, de préférence d'un virus de l'hépatite C de génotype 1. Par séquence dérivée, on entend une séquence présentant une identité d'au moins 80% avec la séquence de la région 3'UTR de l'ARN génomique d'un virus de l'hépatite C de génotype 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, de préférence d'au moins 85%, notamment d'au moins 90%, et de manière particulièrement préférée d'au moins 95% d'identité. De préférence, la séquence de la région 3'UTR de l'ARN génomique du VHC correspond à la séquence SEQ ID No : 3 ou à une séquence dérivée de celle-ci.

La molécule d'ARN simple brin selon l'invention peut être obtenue par des méthodes de synthèse chimique ou par des méthodes de biologie moléculaire, notamment par transcription à partir de matrices ADN ou de plasmides isolés à partir de microorganismes recombinants. De préférence, cette étape de transcription utilise des ARN polymérase de phage telles que l'ARN polymérase T7, T3 ou SP6. Selon un second mode de réalisation préférée, la molécule d'ARN simple brin selon l'invention correspond à la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID No :4 ou d'une séquence dérivée. Par séquence dérivée, on entend une séquence présentant une identité d'au moins 80% avec la séquence SEQ ID No :4, de préférence d'au moins 85%, notamment d'au moins 90%, et de manière particulièrement préférée d'au moins 95% d'identité. Un second objet de l'invention correspond à une molécule d'ADN, de préférence d'ADN double brin, permettant la transcription de la molécule d'ARN simple brin décrite précédemment. Avantageusement, ladite molécule d'ADN comprend une séquence d'acide nucléique complémentaire à la séquence d'acide nucléique de la molécule d'ARN simple brin décrite précédemment, laquelle séquence d'acide nucléique complémentaire est liée de manière opérationnelle à une séquence d'acide nucléique permettant sa transcription dans une cellule eucaryote ou procaryote, de préférence eucaryote, et donc l'obtention de la molécule d'ARN simple brin décrite précédemment. Ladite molécule d'ADN permet donc d'obtenir la molécule d'ARN simple brin correspondant à un ARN génomique chimère de polarité négative directement et sans passer par les étapes successives de transcription d'un ARN génomique chimère de polarité positive et de réplication de ce dernier. Par une séquence d'acide nucléique permettant la transcription, on entend toute séquence de régulation de la transcription, comme une séquence promotrice ou activatrice, de préférence une séquence promotrice. Ladite séquence promotrice peut correspondre, par exemple, à un promoteur cellulaire ou viral, et à un promoteur constitutif ou inductible. À titre d'exemple de promoteurs constitutifs de mammifères, on peut citer, à titre non-limitatif, les promoteurs des gènes suivants : hypoxanthine phosphoribosyl transférase (HPTR), adénosine déaminase, pyruvate kinase, (3-actine, créatine kinase du muscle et facteur d'élongation humain. À titre d'exemple de promoteurs viraux présentant une expression constitutive dans les cellules de mammifères, on peut citer, à titre non-limitatif, les promoteurs des virus suivants : SV40, papilloma virus, adénovirus, virus de l'immunodéficience humaine (HIV), cytomégalovirus (CMV), virus du sarcome de Rous (RSV), virus de l'hépatite B (HBV). D'autres promoteurs constitutifs sont bien connus de l'homme du métier. Des séquences promotrices utiles incluent également les promoteurs inductibles et permettant une transcription consécutivement à l'addition d'un agent inductible. À titre d'exemple, on peut citer les promoteurs des gènes de la famille des métallothionines dont la transcription est induite en présence de certains ions métalliques. D'autres promoteurs inductibles pourront être simplement identifiés par l'homme du métier au regard de ses connaissances générales. En général, la séquence promotrice inclut des séquences 5' non transcrites impliquées dans l'initiation 30 de la transcription comme une boîte TATA (TATA box). Un autre objet de l'invention consiste en un vecteur d'acide nucléique comprenant une molécule d'acide nucléique telle que décrite précédemment, notamment une molécule d'ARN ou d'ADN.

Par vecteur d'acide nucléique , on entend tout support permettant de faciliter le transfert desdites molécules d'ARN ou d'ADN dans les cellules, de préférence dans les cellules potentiellement infectées par le virus de l'hépatite C. De préférence, le vecteur selon l'invention permet de transporter lesdites molécules d'acide nucléique en limitant la dégradation de celles-ci par rapport à leur transport en l'absence de vecteur. Le vecteur comprend éventuellement les séquences promotrices décrites précédemment. À titre d'exemple de vecteurs utilisables, on peut citer, à titre non-limitatif, les plasmides, les phagemides, les virus et d'autres vecteurs dérivés d'origine virale ou bactérienne. Des vecteurs viraux préférés incluent les adénovirus (modifiés), lesquels sont capables d'infecter un très grand nombre d'espèces et de types cellulaires, les lentivirus (modifiés notamment par une modification de la protéine d'enveloppe de sorte d'obtenir le tropisme recherché) ou les virus de l'hépatite A et B (modifiés) lesquels sont capables d'infecter spécifiquement les cellules hépatiques. Des vecteurs non-viraux préférés incluent les vecteurs plasmidiques, lesquels sont décrits de façon extensive dans l'art antérieur (voir notamment SANBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Les plasmides peuvent être administrés par de multiples voies, notamment topique ou parentérale. Par exemple, les plasmides peuvent être injectés par voie intramusculaire, intradermique, intrahépatique ou sous-cutanée.

Le vecteur d'acide nucléique selon l'invention peut comprendre des marqueurs de sélection actifs dans les cellules eucaryotes et/ou procaryotes. Un autre objet de l'invention consiste en une composition pharmaceutique comprenant une molécule d'acide 35 nucléique, ARN ou ADN, ou un vecteur tel que décrit précédemment.

Avantageusement, ladite composition pharmaceutique comprend un support pharmaceutiquement acceptable. À titre de support pharmaceutiquement acceptable, la compositions selon l'invention peut comprendre des émulsions, des microémulsions, des émulsions huile-danseau ou eau-dans-huile, ou d'autres types d'émulsion. La composition peut également comprendre un ou plusieurs additifs, tels que des diluants, des excipients ou des stabilisateurs (voir notamment Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6tn Ed., 1989-1998, Marcel Dekker; ANSEL et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, WILLIAMS & WILKINS, 1994). La composition peut comprendre de l'eau ou un tampon de solubilisation, lesquels tampons incluent, à titre non limitatif, tampon salin phosphate (PBS), le tampon salin phosphate sans Ca'/Mg', le sérum physiologique (150 mM NaCl dans de l'eau) ou les tampons Tris. Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation d'une molécule d'acide nucléique ou d'un vecteur tels que décrits précédemment pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à traiter une infection par le virus de l'hépatite C (VHC) chez un patient. Par patient , on entend un mammifère, de 25 préférence un homme. La composition selon l'invention pourra être administrée dans une quantité thérapeutiquement efficace par voie topique ou parentérale, notamment par injection intramusculaire, intradermique, intra-hépatique ou souscutanée, de préférence par injection intra-hépatique. L'administration de la composition selon l'invention peut être effectuée par des méthodes de transfert de gènes connues dans l'homme du métier.

Des méthodes communes de transfert de gène incluent le phosphate de calcium, le DEAE-Dextran, l'électroporation, la microinjection, les méthodes virales et les liposomes cationiques (GRAHAM et VAN DER EB, Virol., vol.52, p :456, 1973 ; McCUTHAN et PAGANO, J. Natl. Cancer Inst., vol.41, p :351, 1968 ; CHU et al., Nucl. Acids Res., vol. 15, p :1311 ; FRALEY et al., J. Biot. Chem., vol.255, p :10431, 1980 ; CAPECCHI et al., Celi, vol. 22, p :479, 1980 ; FELGNER et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, vol.84, p :7413, 1988). Une quantité efficace de molécules d'acides nucléiques à administrer à un patient peut être déterminée simplement par l'homme du métier. À titre d'exemple, une quantité efficace de molécules d'acides nucléiques est comprise entre 0,001mg et 10g/kg du patient à traiter, de préférence entre 0,01mg et 1g/kg, et de manière particulièrement préférée entre 0,1 et 100mg/kg. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent, sans pour autant que ceux- ci ne constituent une quelconque limitation de l'invention. EXEMPLES 1) Construction d'un système cellulaire permettant l'expression d'ARN qénomique dérivés du VHC.

Afin d'analyser le potentiel réplicatif d'ARN génomique chimères selon l'invention, un système cellulaire qui synthétise de façon constitutive le complexe de réplication du VHC a été développé en insérant les protéines non-structurales du VHC (NS3-NS5B) dans le génome des cellules de la lignée cellulaire d'hépatome Huh7. Pour cela, un vecteur pcDNA3.1/NS3-5B(2884R/G) codant pour lesdites protéines non structurales a été construit comme suit : • les gènes codant pour les protéines non-structurales couvrant NS3 à NS5B ont été amplifiés à partir de l'isolat infectieux J4L6 du VHC, souche de génotype la (YANAGI et al., Virology, vol.244(l), p :161-72, 1998) en utilisant la polymérase Herculase (STRATAGENE) et les amorces NS3-Start (SEQ ID No 5 : ACACACTGGCCAATGGCGCCCATCACGGCCTACTCC) et NS5B-stop (SEQ ID No 6 : GTGTGTTCTAGATCATCGGTTGGGGAGCAGGTA). • Le fragment NS3-5B a ensuite été inséré entre les sites EcoRV et XbaI du plasmide pcDNA3.1 (INVITROGEN), produisant ainsi le vecteur pcDNA3.1/NS3-5B. • Une mutation du résidu Gly en Arg à la position 2884 (PIETSCHMANN et al.) a ensuite été introduit par mutagenèse directe en utilisant les amorces NS5B2884S (SEQ ID No 7 : TCATTGAAGGGCTCCATGGTCTTAGCGCATTTACAC) et NS5B2884AS (SEQ ID No 8 TAAGACCATGGAGCCCTTCAATGATCTGAGGTAGGTC) et l'ADN polymérase Taq Phusion (OZYME). La réaction de PCR a été réalisée sur le vecteur pcDNA3.1/NS3-5B, le produit PCR obtenu a ensuite été digéré par l'enzyme Dpn I (PROMEGA) et directement amplifié en culture de bactéries E. coli DH5a. Finalement, le plasmide pcDNA3.1/NS3-5B(2884R/G) contenant la séquence mutée a été sélectionnée par séquençage. Un million de cellules Huh7 ont donc été transfectées par 2,5pg du plasmide vecteur pcDNA3.1/NS3-'5B(2884R/G) en utilisant la lipofectine additionnée de réactif + (INVITROGEN) suivant les instructions du fournisseur.

Les cellules ont ensuite été cultivées dans du milieu de Dulbecco modifié supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (SVF ; inactivé par la chaleur) et de l'antibiotique G418 (lmg/ml) à 37 C sous atmosphère 5 % de CO2.

L'expression du plasmide pcDNA3.1/NS3-5B(2884R/G) a ensuite été analysée par la technique de Western Blot chez les différents clones résistants à l'antibiotique G418 (Huh7/NS3-5B).

Les résultats ont montré que la protéine NS5B était constitutivement exprimée et présentait le poids moléculaire attendu, indiquant que la polyprotéine NS3-5B a été correctement maturée par la protéase NS3. 2) Capacité de réplication d'un ARN génomique minimal 10 de polarité néqative dérivé du VHC dans la lignée cellulaire Huh7/NS3-5B : 2-1 : Construction d'un ARN génomique minimal de polarité négative dérivé du VHC : Afin d'évaluer l'activité de réplication de la lignée 15 cellulaire Huh7/NS3-5B, une séquence minimale de réplication nommée 5UTR-H2AE-3UTR a été construite. Cette séquence 5UTR-H2AE-3UTR est constituée de la région 5'UTR du VHC, d'une séquence codant pour une polyprotéine constituée des séquences de la protéine de 20 résistance à l'hygromycine, de la protéine 2A du virus de la fièvre aphteuse (FMDV) et de la protéine EGFP, suivie de la région 3'NC du VHC, a été construite. La construction du vecteur codant pour la séquence 5UTR-H2AE-3UTR a été effectuée en deux étapes: 25 Étape 1 : La construction du plasmide vecteur pGEM- T/5UTR-EGFP-3UTR (figure 1A) a été effectuée par amplification des régions 5'UTR et 3'UTR (ou région non codante), provenant respectivement de l'isolat conl et de la souche H77, et du gène de la EGFP (enhanced green 30 fluorescent protein ou protéine de fluorescence verte amplifiée). La séquence 5'NC, étendue aux 27 premiers nucléotides codant pour la protéine de capside (protéine C), a été amplifiée à l'aide des amorces 5NC-Start (SEQ ID No 9 : GCCAGCCCCCGATTGGGGGCG) et 5NC-Bam (SEQ ID No 10 : ATAGGATCCGGTGTTACGTTTGGTTTTTC) et de l'isolat conl en tant que matrice (EMBL X61596), la séquence EGFP a été amplifiée par la polymérase Taq Gold (ROCHES) à l'aide des amorces EGFP-Bam (SEQ ID No 11 TATGGATCCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG) et EGFP-Xba (SEQ ID No 12 : CGCTCAGTTGGAATTCTAGAGTC). Les fragments obtenus ont ensuite été clivés par l'enzyme de restriction Bam HI, ligaturés à l'aide de l'ADN ligase T4 (PROMEGA) à 16 C durant la nuit, puis amplifiés à nouveaux avec les amorces 5NC-Start (SEQ ID No : 9) et EGFP-Xba (SEQ ID No : 12), générant ainsi le fragment 5UTR-EGFP. La région 3'NC a été obtenue par réaction de polymérase en chaîne (PCR) en utilisant les amorces 3NC-Xba (SEQ ID No 13 : ATATATTCTAGAACGGGGAGCTAAACACTCCAG) et 3NC-stop (SEQ ID No 14 : ACTTGATCTGCAGAGAGGCCAG) de la souche VHC H77 (EMLB AF011753). Le produit d'amplification et le fragment 5UTREGFP ont été digérés par l'enzyme XbaI, ligaturés dans les conditions décrites précédemment et le produit de ligation obtenu a été amplifié à l'aide des amorces 5NC-Start et 3NC-stop. Finalement, le fragment résultant à été inséré dans le plasmide vecteur pGEM-T (PROMEGA), produisant le vecteur pGEM-T/5UTR-EGFP-3UTR. La séquence du vecteur pGEM-T/5NC-EGFP-3NC obtenu a été confirmée par séquençage. Étape 2 : La construction du plasmide pGEM-T/5UTR-H2AE-3UTR (voir figure 1B) a été effectuée par l'insertion de la séquence de l'hygromycine phosphotransférase (HygroR) et de la séquence codant pour la protéine 2A du virus de la fièvre aphteuse (FMDV pour Foot and Mouth Disease Virus) entre la région 5'UTR et la séquence EGFP du vecteur pGEM-T/5UTR-EGFP-3UTR. La séquence de l'hygromycine a été obtenue par une amplification par PCR du plasmide vecteur psiSTRIKETM (PROMEGA) à l'aide des amorces Hygro-Bam (SEQ ID No 15: ATATATGGATCCAAAAAGCCTGAACTCACCGCG) et Hygro2A-Bam (SEQ ID No 16: ATATATGGATCCGGGCCCAGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTTAAG AAGTTCCTTTGCCCTCGGACGAG) ; laquelle amorce Hygro2A-Bam comprend les 42 nucléotides de la séquence de protéine 2A. Le produit d'amplification obtenu a alors été inséré au site BamHI du plasmide pGEM-T/5UTR-EGFP-3UTR, pour obtenir le vecteur pGEM-T/5UTR-H2AE-3UTR. Finalement, la séquence du vecteur pGEM-T/5UTR-H2AE-3UTR obtenu a été confirmée par séquençage. Le promoteur du phage T7 nécessaire à la transcription a été introduit par PCR. Afin de transcrire le brin (+) les amorces T7-5UTR (SEQ ID No 17 : TAATACGACTCACTATAGGGCCAGCCCCCTGATGGGGGCG) et 3UTR-STOP (SEQ ID NO 18 :ACTTGATCTGCAGAGAGGCCAG) ont été utilisées. Afin de transcrire le brin(-) les amorces T7-3UTR (SEQ ID No 19 : TAATACGACTCACTATAGGACTTGATCTGCAGAGAGGCCAG) et 5UTR-Start (SEQ ID No 20 : GCCAGCCCCCGATTGGGGGCG) ont été utilisées. Finalement, l'ARN génomique minimal de polarité négative a été obtenu par transcription de 1 g de produit de PCR à l'aide de polymérase T7 (PROMEGA) en suivant les instructions du fabriquant. Finalement, les ARN ont été purifiés à l'aide d'un kit RNeasy (QIAGEN) en suivant les instructions du fabricant. 2-2 : Réplication de l'ARN génomique minimal dérivé de polarité négative du VHC dans la lignée cellulaire Huh7/NS3-5B : Des plaques de culture 24 puits ont été ensemencées à raison de 105 cellules Huh7/NS3-5B par puits et incubées 24 heures à 37 C. Les cellules obtenues ont alors été transfectées à l'aide de lpg de transcrits 5UTR-H2AE-3UTR de polarité positive mélangé à 3pl de DMRIE-C (INVITROGEN) selon les recommandations du fournisseur. Les cellules ainsi transfectées ont été cultivées en présence de différentes concentrations d'hygromycine pour sélectionner les cellules répliquant le transcrit transfecté. La multiplication cellulaire en présence de différentes 35 concentrations d'hygromycine et l'activité réplicative des mini-génomes ont été analysées simultanément durant un mois. À intervalles réguliers, des cellules Huh7/NS3-5B transfectées ou non par les transcrits 5UTR-H2AE-3UTR et en présence de différentes concentrations d'hygromycine ont été trypsinées et remises en suspension à une concentration de 0,5.106 à 1.106 cellules/ml en tampon phosphate 2mM EDTA. Les suspensions de cellules obtenues ont alors été analysées par cytométrie de flux à 488 nm pour détecter l'expression de l'EGFP et à l'aide d'un appareil FACS Calibur (BECKTON). La figure 2A montre le pourcentage de cellules transfectées fluorescentes Huh7 (rayés), Huh7/NS3-5B (noir) et Huh7/Rep5.1 (gris, cf.3) 24, 48 et 72 heures après transfection. La figure 2B montre l'index de fluorescence correspondant au rapport de fluorescence entre les cellules transfectées Huh7 et Huh7/NS3-5B (noir), et entre les cellules transfectées Huh7 et Huh7/Rep5. 1 (gris, cf.3). Les résultats ont montré que le pourcentage de cellules montrant une résistance à l'hygromycine est corrélé au pourcentage de cellules exprimant l'EGFP (figures 2A et 2B), lesquels pourcentages augmentent conjointement durant le mois de culture. En conclusion, les cellules de la lignée cellulaire Huh7/NS3-5B, lesquelles expriment de manière constitutive la polyprotéine NS3-NS5B, permettent la production d'un complexe de réplication efficace pour la réplication du mini-génome. 3) Capacité de réplication de l'ARN génomique minimal de polarité néqative dérivé du VHC dans une lignée cellulaire infectée: Le modèle d'étude actuellement utilisé pour étudier la réplication dans des cellules infectées est celui des réplicons. Dans le cadre de cette analyse, nous avons utilisé des cellules de la lignée cellulaire Huh7 exprimant le réplicon Rep5.1 du VHC de génotype lb (Cellules Huh7/Rep5.l ; KRIEGER et al., J. Viro1., vol.75, p :4614-4624). Des cellules huh7/Rep5.1 et Huh7 ont été transfectées par 1 g de transcrits 5UTR-H2AE-3UTR de polarité positive a été transfecté selon le protocole décrit en 2-2. L'expression de la protéine EGFP a été analysée après 24, 48 et 72 heures par cytométrie de flux (figure 2A). Afin de prendre en compte les variations d'efficacité de traduction, l'expression de la protéine EGFP est représentée comme le pourcentage d'expression de l'EGFP par les cellules Huh7/rep5.1 par rapport au niveau d'expression des cellules Huh7. Les résultats montrent que la production de protéine EGFP décroît après 48 heures de culture (figure 2A), ce qui suggère la dégradation des transcrits par les cellules. Cependant, cette diminution est plus faible dans le cas des cellules Huh7/Rep5.1 et Huh7/NS3-5B par rapport aux cellules Huh7 ce qui suggère la réplication des ARN par le complexe de réplication du VHC. Les résultats obtenus concernant le niveau d'expression de l'EGFP dans les cellules Huh7/Rep5.1 ou Huh7/NS3-5B ont été normalisés par rapport au niveau d'expression de l'EGFP obtenu dans les cellules Huh7 (100% ; figure 2B). Les valeurs supérieures à 100% indiquent que la dégradation observée dans les cellules Huh7 est compensée par la réplication de l'ARN génomique minimal dans les cellules Huh7/Rep5.1 et Huh7/NS3-5B, suggérant que le complexe de réplication issu du réplicon fonctionne efficacement. Les résultats montrent en outre que le niveau d'expression de l'EGFP augmente durant les trois premiers jours de 206 à 238% dans les cellules exprimant le réplicon, alors que dans les cellules Huh7/NS3-5B, le niveau d'expression augmente les deux premiers jours de 123 à 203%, puis diminue le troisième jour. Dans la mesure où les cellules Huh7/Rep5.1 sont cultivées sous pression de sélection à l'opposé des cellules Huh7/NS3-5B, la différence d'expression de l'EGFP entre ces deux lignées cellulaires reflète vraisemblablement une permissivité cellulaire moindre des cellules Huh7/NS3-5B en absence préalable de pression de sélection. En conclusion, les résultats montrent que l'ARN génomique minimal se réplique efficacement dans les deux lignées cellulaires Huh7/Rep5.1 et Huh7/NS3-5B testées, lesquelles expriment un complexe de réplication du VHC de génotype lb. 4) Évaluation de l'efficacité d'un vecteur suicide correspondant à un ARN génomique minimal Les expériences précédentes ont montré que des ARN génomiques de polarité négative dérivés du VHC étaient capables de se répliquer dans les cellules hébergeant un réplicon. Afin de tester la capacité d'un tel ARN génomique de polarité négative à détruire les cellules infectées par le VHC, un ARN génomique chimère a été construit comme précédemment dans lequel le transgène correspondait, non pas à l'EGFP, mais au gène codant pour la chaîne A de la ricine encadré par les régions 5'UTR et 3'UTR du VHC(5UTR-Ric-3UTR). Le gène de la chaîne A de la ricine a été choisi comme gène suicide sur la base de sa forte toxicité vis-à-vis des ribosomes eucaryotes des cellules cibles infectées par le VHC (EIKLID et al., Exp. Celi. Res., vol.126(2), p :321-6, 1980 ; OLSNES and KOZLOV, Toxicon, vol.39(11), p :1723-1728, 2001), et pour sa non diffusivité en l'absence de la chaîne B, préservant ainsi les cellules environnantes saines qui n'expriment pas le complexe de réplication du VHC. 4-1 : Construction d'un vecteur suicide correspondant à un ARN génomique minimal de polarité négative dérivé du 10 VHC : Le plasmide vecteur pGEM-T/5UTR-Ric-3UTR a été construit comme suit : • Le gène codant pour la chaîne A de la ricine a été obtenu par amplification PCR en utilisant les amorces 15 Ric Start (SEQ No 21 : CACACAGGATCCATATTTCCCAAACAATACCCAATC et Ric_stop (SEQ No 22 : ATATATTCTAGATTACTAAAACTGTGAGCTCGG). • Le gène codant pour la chaîne A de la ricine a été introduit dans le plasmide pGEM-T/5UTR-EGFP-3UTR en 20 échangeant le gène de l'EGFP par celui de la chaîne A de la ricine aux sites BamHI et XbaI, produisant le plasmide pGEM-T/5UTR-Ric-3UTR (figure 1C). Le promoteur du phage T7 nécessaire à la transcription a été introduit par PCR. Afin de transcrire le brin (+) 25 les amorces T7-5UTR (SEQ ID No 17) et 3UTR-STOP (SEQ ID No 18) ont été utilisées. Afin de transcrire le brin(-) les amorces T7-3UTR (SEQ ID No 19) et 5UTRStart (SEQ ID No 20) ont été utilisées. Finalement, l'ARN génomique minimal de polarité 30 négative a été obtenu par transcription de 1 g de produit de PCR à l'aide de polymérase T7 (AMBION) en suivant les instructions du fabriquant. L'ARN génomique minimal de polarité négative obtenu est constitué, en partant de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', par les séquences complémentaires de : la région 3' non-codante du VHC (3'UTR), de la séquence de la ricine A, des 27 premiers nucléotides de la séquence codant pour la protéine capside, et enfin de la région 5' non-codante du VHC. Un ARN génomique minimal de polarité positive a également été produit suivant le même protocole et de transcription in vitro avec la polymérase T3 (AMBION) en suivant les instructions du fabricant.

La figure 3 montre la séquence de l'ARN génomique de polarité positive avec la séquence de la chaîne A de la ricine (souligné), encadrée par les sites de clonage (gras et italique) et les régions 5'UTR (haut) et 3'-UTR (bas). 4-2 : Réplication du vecteur suicide dans les lignées 15 cellulaires Huh7/Rep5.1 (modèle pour les cellules infectées) et Huh7/NS3-5B : Des cellules Huh7/Rep5.1 et Huh7/NS3-5B ont été transfectées par l'ARN génomique minimal de polarité négative obtenu en 4-1 selon le protocole décrit en 2-2. 20 À titre de contrôle, des cellules Huh7 ont été transfectées par l'ARN génomique minimal de polarité négative obtenu en 4-1 selon le même protocole. Également à titre de contrôle, les mêmes expériences de transfection ont été effectuées avec l'ARN génomique 25 minimal de polarité positive obtenu en 4-1 Dans le cas où ledit ARN génomique minimal de polarité négative serait répliqué par l'ARN polymérase ARN dépendante du virus de l'hépatite C en un brin de polarité positive, on obtiendrait alors la production de Ricine 30 (chaîne A) grâce à la séquence IRES présente au sein de la région 5'UTR du VHC et présente dans le brin de polarité positive.

La figure 4 montre la cytotoxicité 48 heures après transfection de cellules Huh7, Huh7/Rep5.1 ou Huh7/NS3-5B par de l'ARN génomique minimal de polarité négative (noir) ou positive (gris).

Les résultats montrent que la transfection dudit ARN génomique minimal de polarité négative induit la mort des cellules Huh7/Rep5.1 (38%) et Huh7/NS3-5B (36%), alors que les cellules Huh7 ne sont que faiblement affectées par ledit ARN génomique minimal de polarité négative (4% de cellules mortes) (figure 4). La figure 5 correspond à la normalisation du pourcentage de cytoxicité de l'ARN génomique minimal de polarité négative en prenant comme référence de transfection (100%) le pourcentage de cytoxicité de l'ARN génomique minimal de polarité positive. La normalisation des résultats montre que l'ARN génomique minimal de polarité négative induit la mort de 59% des cellules Huh7/Rep5.1 transfectées et de 54% des Huh7/NS3-5B transfectées, alors que seules 9% cellules Huh7 infectées sont affectées (figure 5). En conclusion, les résultats montrent que le vecteur suicide développé, correspondant à une molécule d'ARN dérivée du VHC et de polarité négative, est efficace pour cibler et détruire les cellules exprimant les complexes de réplication du VHC de génotype lb. Les inventeurs ont également pu montrer que le même vecteur suicide développé est efficace pour cibler et détruire (à près de 90%) des cellules Huh7 infectées par un virus du VHC de génotype 2a (JFH-1, ZHONG et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, vol.102(26), p :9294-9, 2005).

Claims (25)

REVENDICATIONS

1. Une molécule d'ARN simple brin, caractérisée en ce qu'elle comprend en partant de l'extrémité 3' vers l'extrémité 5' : (i) une séquence d'acide nucléique complémentaire à la région 5' non-codante (5'UTR) de l'ARN génomique (brin (+)) du virus de l'hépatite C (VHC), laquelle séquence d'acide nucléique complémentaire permet la réplication de ladite molécule d'ARN simple brin par le complexe de réplication du VHC ; (ii) la séquence d'acide nucléique complémentaire d'une séquence d'acide nucléique correspondant à un site d'entrée interne du ribosome (IRES); (iii) la séquence d'acide nucléique complémentaire de la séquence d'acide nucléique d'un gène suicide ou d'un gène codant pour une protéine interférant avec la réplication du virus VHC ; et (iv) éventuellement, une séquence d'acide nucléique complémentaire à la région 3' non-codante (3'UTR) de l'ARN génomique du VHC.

2. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite séquence d'acide nucléique complémentaire à ladite région 5'UTR 25 comprend au moins la séquence complémentaire d'une séquence comprenant les domaines tige-boucle I et II (5'UTR-dI et 5' UTR-dII) de ladite région 5'UTR, de préférence au moins la séquence complémentaire d'une séquence comprenant les domaines tige-boucle I, II et III 30 (5'UTR-dI, 5' UTR-dII et 5' UTR-dIII) de ladite région 5'UTR.

3. La molécule d'ARN simple brin selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce 20que ladite séquence d'acide nucléique complémentaire à ladite région 5'UTR comprend au moins la séquence complémentaire de la séquence allant de la position 1 à 120 de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC, de préférence allant de la position 1 à 150 et de manière particulièrement préférée allant de la position 1 à 341 de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC.

4. La molécule d'ARN simple brin selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite région 5'UTR correspond à la région 5'UTR de l'ARN génomique d'un virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, ou à une séquence dérivée de celle-ci, de préférence à la région 5'UTR de l'ARN génomique d'un virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 1.

5. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite séquence d'acide nucléique complémentaire à ladite région 5'UTR comprend au moins la séquence complémentaire de la séquence allant de la position 1 à 120 de la séquence SEQ ID No : 1, de préférence allant de la position 1 à 150 et de manière particulièrement préférée allant de la position 1 à 341 de la séquence SEQ ID No :1 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.

6. La molécule d'ARN simple brin selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique correspondant à un site d'entrée interne du ribosome (IRES) est d'origine eucaryote ou d'origine virale.

7. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 6, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique correspondant à un site d'entrée interne du ribosome (IRES) est d'origine virale, de préférence à la séquence IRES du VHC, laquelle comprend les domaines tige-boucle II à IV (5'UTR-dII à 5' UTR-dIV) de la région 5'UTR de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC.

8. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 7, caractérisée en ce que la séquence IRES est la séquence IRES du VHC et en ce qu'elle comprend la séquence allant de la position 30 à 355 de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC, de préférence allant de la position 25 à 370 et de manière particulièrement préférée allant de la position 20 à 385 de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC.

9. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 8, caractérisée en ce que ladite séquence IRES correspond à la séquence IRES de l'ARN génomique (brin (+)) d'un virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, ou une séquence dérivée de celle-ci, de préférence à la séquence IRES d'un virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 1.

10. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 8, caractérisée en ce que ladite séquence d'acide nucléique complémentaire à ladite région IRES du VHC correspond à la séquence complémentaire de la séquence allant de la position 30 à 355 de la séquence SEQ ID No : 1, de préférence allant de la position 25 à 370 et de manière particulièrement préférée allant de la position 20 à 386 de la séquence SEQ ID No :1 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.

11. La molécule d'ARN simple brin selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 et 8 à 10, caractérisée en ce que ladite molécule d'ARN simple brin comprend la séquence complémentaire de la séquence allant de la position 1 à 355 de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC, de préférence allant de la position 1 à 370.

12. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 11, caractérisée en ce que ladite séquence de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC correspond à la séquence d'un virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, ou une séquence dérivée de celle-ci, depréférence à la séquence d'un virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 1.

13. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 11, caractérisée en ce que ladite séquence ladite molécule d'ARN simple brin comprend la séquence complémentaire de la séquence allant de la position 1 à 355 de la séquence SEQ ID No : 1, de préférence allant de la position 1 à 370 et de manière particulièrement préférée allant de la position 1 à 386 de la séquence SEQ ID No :1 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.

14. La molécule d'ARN simple brin selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que le gène suicide code pour un produit protéique qui induit la mort de la cellule en présence ou en l'absence de drogues.

15. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 14, caractérisée en ce que le gène suicide code pour un produit protéique qui induit la mort de la cellule en présence de drogues comme les gènes de la thymidine kinase de HSV (HSV1tk) ou de la cytosine déaminase (CD).

16. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 14, caractérisée en ce que le gène suicide code pour une toxine protéique induisant la mort de la cellule comme les exotoxines bactériennes, les toxines fongiques, les toxines d'origine eucaryote, d'origine végétale ou d'origine virale des protéines dérivées de celles-ci.

17. La molécule d'ARN simple brin selon la 30 revendication 16, caractérisée en ce que le gène suicide code pour une toxine protéique de la famille RIP (Ribosome-Inactivating Protein).

18. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 17, caractérisée en ce que le gène suicidecode pour une toxine protéique de la famille RIP de type 2, de préférence pour la chaîne A d'une toxine protéique de la famille RIP de type 2 comme la ricine, l'abrine, la modeccine, la volkensine, la viscumine et la Shiga toxine.

19. Une molécule d'ARN simple brin selon la revendication 18, caractérisée en ce que le gène suicide correspond à la séquence SEQ ID No : 2 ou à une séquence dérivée.

20. Une molécule d'ARN selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisée en ce que ladite séquence d'acide nucléique complémentaire à ladite région 3'UTR comprend la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID No : 3 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.

21. Une molécule d'ARN selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisée en ce que ladite molécule d'ARN simple brin correspond à la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID No :4 ou d'une séquence dérivée.

22. Un vecteur d'acide nucléique comprenant une 20 molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 21.

23. Une composition pharmaceutique comprenant une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 21 ou un vecteur selon la revendication 25 22.

24. Une utilisation d'une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 21 ou d'un vecteur selon la revendication 22 pour la préparation d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter une infection 30 par le virus de l'hépatite C (VHC) chez un patient.

25. L'utilisation selon la revendication 24, caractérisée en ce que ledit médicament peut être administré par voie topique ou parentérale, notamment parinjection intramusculaire, intradermique, intra-hépatique ou sous-cutanée.