EP2021482A1 - Traitement d'une infection par un virus à arn à une arn polymérase arn dépendante - Google Patents

Traitement d'une infection par un virus à arn à une arn polymérase arn dépendante

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Publication number
EP2021482A1
EP2021482A1 EP07765973A EP07765973A EP2021482A1 EP 2021482 A1 EP2021482 A1 EP 2021482A1 EP 07765973 A EP07765973 A EP 07765973A EP 07765973 A EP07765973 A EP 07765973A EP 2021482 A1 EP2021482 A1 EP 2021482A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sequence
virus
nucleic acid
rna
hepatitis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07765973A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Michel Ventura
Thérèse ASTIER-GIN
Simon Litvak
Estelle Dumas
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Bordeaux Segalen
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Victor Segalen Bordeaux 2
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Victor Segalen Bordeaux 2 filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP2021482A1 publication Critical patent/EP2021482A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
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    • A61P31/12—Antivirals
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    • A61P31/12—Antivirals
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/24243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid molecule, a pharmaceutical composition comprising such a nucleic acid molecule and the use of such a nucleic acid molecule for the preparation of a medicament for treating or preventing an infection. by an RNA virus replicating with a RNA-dependent RNA polymerase, and in particular infection with the hepatitis C virus.
  • Hepatitis C virus is now a major public health problem, given the high prevalence of hepatitis C infection and the significant risk of later progression to chronic hepatitis. order of 80%. Indeed, the hepatitis C virus (HCV) infects about 3% of the population and is responsible for approximately 170 million cases of chronic infections. Patients with such a chronic infection are then likely to develop cirrhosis, with a risk estimated at 20-30% twenty years after the primary infection, which can evolve into hepatocarcinoma. Since primary infection is usually asymptomatic, the infection is diagnosed when the complications of chronic infection occur.
  • HCV is a positive RNA virus belonging to the Flaviviridae family, discovered by CHIRON in 1989 (KUO et al., Science, 244 (4902), p: 362-4, 1989). Fine molecular analyzes have shown that there are nearly 6 different genotypes of HCV, which genotypes are subdivided into multiple subtypes. Most HCV infections are associated with genotype 1.
  • HCV genomic RNA contains a single open reading frame framed by non-coding sequences in 5 '(5'UTR) and in 3'(3'UTR). If the 5'UTR sequence shows significant conservation regardless of the genotype studied, the 3'UTR sequence shows significant variability in its first 30 nucleotides depending on the genotype studied.
  • the open reading phase codes according to the genotype considered for a polyprotein of 3008 to 3037 amino acids, which is cleaved in a co- and post-translational way by cellular and viral proteases to generate at least 10 mature viral proteins involved in the replication and morphogenesis of new virions. More specifically, the structural proteins are located in the amino-terminal third of said polyprotein and the nonstructural proteins, some of which form the replication complex, in the carboxy-terminal portion of the polyprotein.
  • the 5'UTR region contains an internal ribosome entry site that allows the viral genome (strand (+)), following internalization of the virion, to be translated cap-independently.
  • the replication complex assembles, and then the RNA-dependent RNA polymerase (NS5B) begins replicating the RNA.
  • the HCV replication complex is therefore present in all the infected cells.
  • viruses with an RNA genome replicate through a RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) that synthesizes, from genomic RNA, a RNA of opposite polarity serving as replication intermediate.
  • This replication intermediate RNA is in turn copied by the RNA dependent RNA polymerase to regenerate the genomic RNA.
  • This RdRp is coded by the virus and develops its activity within a replication complex, some of whose proteins are also encoded by the virus. Sequences carried by the viral genome are essential for the fixation of the replication complex which precedes the synthesis of the opposite RNA strand by the RdRp.
  • This replication complex binds to the untranslated region 3 'of the viral genome to synthesize the negative strand from the positive genomic strand. Subsequently this replication complex binds to the untranslated region located 5 'of the negative strand to synthesize the positive genomic strand.
  • the replication complex of the virus having an RNA genome replicating with a RNA-dependent RNA polymerase is therefore present in all the infected cells.
  • the two 5'UTR and 3'UTR sequences are indispensable.
  • the 3'UTR sequence is necessary for the synthesis of the (-) strand from the (+) strand.
  • the 5'UTR sequence is necessary for the synthesis of (+) strands of the new virions from the (-) strand.
  • the 5'UTR region has a length of the order of 340 nucleotides.
  • This 5'UTR region comprises four domains presenting a stem-loop structure (5'UTR-dI domains at 5'UTR-dIV), the last 5 'UTR-d1V domain being overlapping with the first nucleotides of the corresponding coding phase to the capsid protein of the polyprotein.
  • This 5'UTR region is strongly conserved between the different strains of HCV, both at the nucleotide sequence and at the structural level. In addition to its role in genome replication, the 5'UTR region is also involved in initiation of the translation of the polyprotein.
  • the minimal domain of the 5'UTR region for replication to occur includes the 5'UTR-dI and 5'UTR-dII domains (FRIEBE et al., J. Virol., Vol.75 (24), p: 12047-57, 2001), the 5'UTR-dIII domain playing a modulating role on it (REUSKEN et al., J. Gen. Virol., Vol.84, p: 1761-69, 2003).
  • the minimal domain for HCV translation corresponds to an internal ribosome entry site (IRES) to which the ribosome is directly attached (HONDA et al., Virology, vol.222 (1), p: 31-42, 1996). ) which allows an initiation of cap-independent translation.
  • IRES internal ribosome entry site
  • the 5'UTR-dII domains at 5'UTR-dIV are necessary for the initiation of the translation.
  • the location of the 3 'end of the IRES is controversial.
  • HCV RNA-dependent RNA polymerase
  • NS5B RNA-dependent RNA polymerase
  • NS3 viral protease NS3
  • a suicide vector in the form of a chimeric genomic RNA of negative polarity which will be replicated to a chimeric genomic RNA of positive polarity only in the cells infected with HCV (cells expressing the complex HCV replication), which chimeric genomic RNA of positive polarity allows the translation of a toxic protein whose expression causes death of HCV-infected cells.
  • the chimeric genomic RNA of negative polarity according to the invention thus makes it possible to overcome the problems mentioned above, in particular the variable efficiency as a function of the genotypes of the anti-HCV molecules of the treatments of the prior art and the great genetic variability to the basis of antiviral resistance.
  • a first subject of the invention corresponds to a single-stranded RNA molecule, which comprises, starting from the 3 'end towards the 5' end:
  • nucleic acid sequence complementary to a nucleic acid sequence corresponding to an internal ribosome entry site optionally, the nucleic acid sequence complementary to a nucleic acid sequence corresponding to an internal ribosome entry site (IRES);
  • RNA of said virus optionally, a nucleic acid sequence complementary to the 3 'non-coding region (3'UTR) of the RNA of said virus.
  • the single-stranded RNA molecule according to the invention is non-coding. Accordingly, said single-stranded RNA molecule, when present in non-virus infected cells of interest in which the replication complex is not expressed, does not allow to obtain the transcript of the suicide gene and its subsequent translation and thus to induce cell death.
  • the single-stranded RNA molecule according to the invention when it is present in cells infected with the virus of interest which express the replication complex, is replicated in a complementary strand whose translation initiated at the level of the IRES sequence induces the synthesis of the suicide gene protein and, consequently, the cell death.
  • the RNA molecule according to the invention comprises a nucleic acid sequence complementary to a nucleic acid sequence corresponding to an internal ribosome entry site (IRES).
  • IRES internal ribosome entry site
  • this sequence is not mandatory for viruses that do not require IRES for translation.
  • Those skilled in the art can easily determine the viruses for which the RNA molecule according to the invention does not require a nucleic acid sequence complementary to a nucleic acid sequence corresponding to an internal ribosome entry site. (1RES).
  • the RNA making it possible to obtain the complementary sequences (i) and (iv) is genomic RNA.
  • RNA virus means a virus whose genomic RNA is directly coding.
  • genomic RNA is meant the RNA strand which corresponds to the RNA encapsidated in the viral particle.
  • a first subject of the invention corresponds to a single-stranded RNA molecule, corresponding to a chimeric genomic RNA of negative polarity (RNA (-)) of the hepatitis C virus (HCV), which molecule d RNA single strand is characterized in that it comprises starting from the end 3 'to the end 5':
  • strand (+) of hepatitis C virus (HCV), which complementary nucleic acid sequence allows the replication of said single-stranded RNA molecule by the HCV replication complex;
  • nucleic acid sequence complementary to the 3 'non-coding region (3'UTR) of the genomic RNA (strand (+)) of HCV optionally, a nucleic acid sequence complementary to the 3 'non-coding region (3'UTR) of the genomic RNA (strand (+)) of HCV.
  • the RNA molecule according to the invention comprises a nucleic acid sequence complementary to the 5 'non-coding region (5'UTR) of the genomic RNA (strand (+)) of the virus of the hepatitis C (HCV), which complementary nucleic acid sequence allows the replication of said single-stranded RNA molecule by the HCV replication complex.
  • 5'UTR 5 'non-coding region
  • HCV hepatitis C
  • the single-stranded RNA molecule according to the invention is non-coding.
  • said single RNA molecule strand when present in non-HCV-infected cells in which the HCV replication complex is therefore not expressed, does not make it possible to obtain the transcript of the suicide gene and its consecutive translation and therefore of induce cell death.
  • the single-stranded RNA molecule according to the invention when present in HCV-infected cells that express the replication complex, is replicated in a complementary strand (strand (+)) whose translation initiated. at the level of the sequence IRES induces the synthesis of the protein of the suicide gene and, consequently, the cell death.
  • RNA molecules corresponding to a chimeric genomic RNA of negative polarity (strand (-)) of the hepatitis C virus makes it possible, unlike a chimeric genomic RNA of positive polarity (strand (+)), to avoid the replication step requiring the recognition of the sequence 3'UTR strand (+) to obtain its replication strand (-).
  • RNA viruses that replicate using an RNA-dependent RNA polymerase
  • RNA viruses that replicate with a RNA-dependent RNA polymerase are chosen from the group comprising:
  • the single-stranded RNA molecule according to the invention may comprise modified or unmodified ribonucleotides, preferably said single-stranded RNA molecule comprises unmodified ribonucleotides.
  • modified ribonucleotide is meant a natural ribonucleotide substituted with a synthetic analog of a nucleotide, which synthetic ribonucleotide analog is preferably located at the 3 'or 5' end of the nucleic acid molecule.
  • Synthetic analogues of preferred nucleotides are selected from ribonucleotides having a sugar group or modified carbon group.
  • the ribonucleotides having a modified sugar group have a 2'-OH group replaced by a group selected from a hydrogen atom, a halogen, a group OR, R, SH, SR, NH 2 , NHR, NR 2 or CN, wherein R is an alkyl, alkenyl or alkynyl group of 1 to 6 carbon and the halogen is fluorine, chlorine, bromine or iodine.
  • the ribonucleotides having a modified carbon group have their phosphoester group attached to the adjacent ribonucleotide which is replaced by a modified group such as a phosphothioate group.
  • a modified group such as a phosphothioate group.
  • modified nuclei examples include, but are not limited to 5-substituted uridines or cytidines, such as 5- (2-amino) propyl uridine and 5-bromo uridine, 8-modified adenosines and guanosines, such as 8-brom ⁇ guanosine, denatured nucleotides, such as 7-deaza-adenosine, N- and O-alkylated nucleotides, such as N6-methyl adenosine. These different modifications can also be combined.
  • 5-substituted uridines or cytidines such as 5- (2-amino) propyl uridine and 5-bromo uridine
  • 8-modified adenosines and guanosines such as 8-brom ⁇ guanosine
  • denatured nucleotides such as 7-deaza-adenosine
  • N- and O-alkylated nucleotides such as
  • nucleic acid sequence complementary to the 5 'non-coding region (5'UTR) of the genomic RNA (strand (+)) of HCV which complementary nucleic acid sequence allows the replication of said nucleic acid molecule.
  • Single-stranded RNA by the HCV replication complex is understood to mean a nucleic acid sequence comprising at least the sequence complementary to a sequence comprising the stem-loop domains I and II (5'UTR-dI and 5 'UTR).
  • the 5'UTR-dI domain ranges from nucleotides 5 to sequences having the accession number M62321, M67463 or AF009606 for the genotype 1a; 1 to 8 of the sequence having the accession number D90208 or 1 to 11 of the sequence having the accession number M58335 for the genotype Ib; 5 to 20 of the sequence having the accession number D14853 or AY051292 for the genotype Ic; 5 to 19 of the sequence having the accession number D00944 or AB047639 for the genotype 2a; 5 to 20 of the sequence having accession number D10988 or AB030907 for genotype 2b; 5 to 19 of the sequence having accession number D50409 for genotype 2c; 6 to 20 of the sequence having the accession number AB031663 for the genotype 2k; 5 to 18 of the sequence having accession number D17763 or D28917 for genotype 3a; 5 to 18 of the sequence having accession number D49374 for genotype 3b; 5
  • the 5'UTR-dII domain ranges from nucleotides 44 to 118 for sequences having the accession number M62321, M67463 or AF009606 for the genotype 1a; 35 to 109 of the sequence having the accession number M58335 or 32 to 106 of the sequence having the accession number D90208 for the genotype Ib; 44 to 118 sequences having the accession number D14853 or AY051292 for the genotype Ic; 43 to 117, sequences having accession number D00944 or AB047639 for genotype 2a; 44 to 118 sequences having accession number AB030907 or D10988 for genotype 2b; 43 to 117 of the sequence having accession number D50409 for genotype 2c; 44 to 118 of the sequence having accession number AB031663 for genotype 2k; 42 to 116 of the sequence having accession number D17763 or D28917 for genotype 3a; 42 to 116 of the sequence having accession number D49374
  • the 5'UTR-dIII domain ranges from nucleotides 125 to 323 with accession number M62321, M67463 or AF009606 for genotype 1a; 116 to 314 of the sequence having the accession number M58335 or 113 to 311 of the sequence having the accession number D90208 for the genotype Ib; 125 to 323 sequences having the accession number D14853 or AY051292 for the genotype Ic; 124 to 322 sequences having accession number D00944 or AB047639 for genotype 2a; 125 to 323 sequences having accession number AB030907 or D10988 for genotype 2b; 124 to 322 of the sequence having accession number D50409 for genotype 2c; 125 to 323 of the sequence having the accession number AB031663 for the genotype 2k; 123 to 321 sequences having accession number D17763 or D28917 for genotype 3a; 123 to 321 of the sequence having accession number having acces
  • nucleic acid sequence complementary to the 5 'non-coding region (5'UTR) of the genomic RNA (strand (+)) of HCV which complementary nucleic acid sequence allows replication of said single-stranded RNA molecule by the HCV replication complex, the nucleic acid sequence complementary to the sequence from position 1 to 120 of the genomic RNA (strand (+)) of HCV, preferably comprising from position 1 to 150 and particularly preferably from position 1 to 341 of genomic RNA (strand (+)) of HCV.
  • Position 1 corresponds to the first nucleotide of the genomic RNA (strand (+)) of a complete hepatitis C virus (HCV).
  • 5'UTR region of the genomic RNA is meant the 5'UTR region of the genomic RNA of a genotype 1, 2, 3 hepatitis C virus (HCV). , 4, 5 or 6, or a sequence derived therefrom.
  • derivative sequence is meant a sequence having an identity of at least 80% with the sequence of the 5'UTR region of the genomic RNA of a hepatitis C virus of genotype 1, 2, 3, 4, 5 or 6, preferably at least 85%, especially at least 90%, and particularly preferably at least 95% identity.
  • the sequence of the 5'UTR region of the HCV genomic RNA corresponds to the sequence of the 5'UTR region of the genome RNA of a genotype 1 hepatitis C virus (HCV) virus. .
  • HCV hepatitis C virus
  • the sequence of the 5'UTR region of the HCV genomic RNA corresponds to the sequence from position 1 to 120 of the sequence SEQ ID No: 1, preferably from position 1 to 150 and particularly preferably from position 1 to 341 of the sequence SEQ ID No: 1 or a sequence derived therefrom.
  • IRES internal ribosome entry site
  • IRES sequence of eukaryotic origin mention may be made of the IRES sequence of the transcripts coding for the proteins chosen from the group comprising the FGF (Fibroblast Growth Factor) family, the connexin family, the p27 inhibitory protein of the cyclin-dependent kinase, BCL 2, HSP 101, HSP 70, c-myc proto-oncogenes, L-myc, n-myc or the Mnt transcriptional repressor.
  • FGF Fibroblast Growth Factor
  • IRES sequence of viral origin we can cite the IRES sequence of the polio virus, encephalomyocarditis virus (EMCV), GBV-A virus, GBV-B virus and GBV virus. -C, hepatitis C virus, bovine viral diarrhea virus (BVDV), equine rhinitis virus A and B (ERAV and ERBV), ZAM retroactive elements, Idefix and gypsy or HIV.
  • EMCV encephalomyocarditis virus
  • GBV-A virus GBV-A virus
  • GBV-B virus and GBV virus GBV virus.
  • -C hepatitis C virus
  • bovine viral diarrhea virus (BVDV) bovine viral diarrhea virus
  • EAV and ERBV equine rhinitis virus A and B
  • ZAM retroactive elements Idefix and gypsy or HIV.
  • the IRES sequence is of viral origin and, in a particularly preferred manner, said IRES sequence corresponds to the IRES sequence of HCV, which comprises the stem-loop domains II to IV (5'UTR-dII at 5 'UTR-dlV) of the 5'UTR region of genomic RNA (strand (+)) of HCV.
  • sequence 1res of HCV ranges from nucleotides 44 to 354 sequences having the accession number M62321, M67463 or AF009606 for the genotype la; 35 to 345 of the sequence having the accession number M58335 or 32 to 342 of the sequence having the number accession D90208 for genotype Ib; 44 to 354 sequences having the accession number D14853 or AY051292 for the genotype Ic; 43 to 353 sequences having accession number D00944 or AB047639 for genotype 2a; 44 to 354 sequences having accession number AB030907 or D10988 for genotype 2b; 43 to 353 of the sequence having accession number D50409 for genotype 2c; 44 to 354 of the sequence having the accession number AB031663 for the genotype 2k; 42 to 352 sequences having accession number D17763 or D28917 for genotype 3a; 42 to 352 of the sequence having accession number D49374 for genotype 3b
  • sequence 1res of HCV the sequence from position 30 to 355 of genomic RNA (strand (+)) of HCV, preferably from position 25 to 370 and particularly preferably from position 20 to 385 of the genomic RNA (strand (+)) of HCV.
  • 1RES sequence of HCV is meant the IRES sequence of a genomic RNA (strand (+)) of a hepatitis virus (HCV) genotype 1, 2, 3, 4, 5 or 6, or a sequence derived therefrom, preferably the IRES sequence of the genomic RNA (strand (+)) of a genotype 1 hepatitis C virus (HCV).
  • derivative sequence is meant a sequence having an identity of at least 80% with the sequence of the IRES sequence of the genomic RNA (strand (+)) of a hepatitis C virus (HCV) of genotype 1 , 2, 3, 4, 5 or 6, preferably at least 85%, especially at least 90%, and particularly preferably at least 95% identity.
  • the 1RES sequence of HCV corresponds to the sequence from position 30 to 355 of the sequence SEQ ID No: 1, preferably from position 25 to 370 and particularly preferably from position 20 to 386 of the sequence SEQ ID No: 1 or a sequence derived therefrom.
  • the single-stranded RNA molecule according to the invention comprises the sequence complementary to the sequence ranging from position 1 to
  • genomic RNA (strand (+)) of HCV preferably from position 1 to 370 and particularly preferably from position 1 to 385 of the genomic RNA (strand (+)) of HCV.
  • genomic RNA sequence (strand (+)) of HCV is meant the sequence of a hepatitis C virus (HCV) of genotype 1, 2, 3, 4, 5 or 6, or a derived sequence of this, preferably is the sequence of a hepatitis C virus (HCV) of genotype 1.
  • derivative sequence is meant a sequence having an identity of at least 80% with the sequence of the genomic RNA (strand (+)) of a hepatitis C virus of genotype 1, 2, 3, 4, 5 or 6, preferably at least 85%, especially at least 90%, and particularly preferably at least 95% identity.
  • the single-stranded RNA molecule according to the invention comprises the sequence complementary to the sequence ranging from position 1 to 355 of the sequence SEQ ID No: 1, preferably from position 1 to 370 and particularly preferably from position 1 to 386 of the sequence SEQ ID No: 1 or a sequence derived therefrom.
  • proteins interfering with HCV replication include interferon ⁇ , interferon ⁇ and interferon ⁇ , preferably interferon ⁇ and particularly preferably interferon ⁇ 2 ⁇ or ⁇ 2b.
  • genes coding for proteins interfering with the replication of a RNA virus that replicates using an RNA-dependent RNA polymerase in particular hepatitis C virus
  • IRF interferon regulatory factor
  • suicide gene is meant a gene that encodes a protein product that induces death of the cell in the presence or absence of drugs.
  • the suicide gene codes for a bacterial or viral enzyme inducing the death of the cell in the presence of a specific "drug".
  • said enzymes convert the inactive form of a drug (prodrug) present in the medium into its active and toxic form inducing cell death, for example by inhibition of nucleic acid synthesis.
  • a drug prodrug
  • said enzymes convert the inactive form of a drug (prodrug) present in the medium into its active and toxic form inducing cell death, for example by inhibition of nucleic acid synthesis.
  • suicide genes include, but are not limited to, HSV thymidine kinase (HSVltk) or cytosine deaminase (CD) genes used respectively with Ganciclovir or 5-FU. respectively (see PCT International Application WO 2005/092374, pages 11 and 12).
  • the suicide gene codes for a protein toxin inducing cell death.
  • bacterial exotoxins As examples of usable proteins, mention may be made of bacterial exotoxins, fungal toxins, toxins of eukaryotic origin, of plant origin or of viral origin, or proteins derived therefrom.
  • Distal protein means a protein having an identity of at least 80% with a bacterial exotoxin, a fungal toxin, a toxin of eukaryotic origin, of plant origin or viral origin, preferably at least 85%. %, especially at least 90%, and particularly preferably at least 95% identity.
  • the protein toxin inducing the death of the cell belongs to the RIP family
  • the proteins of the RIP family are related to the lectin family, but their toxicity is much greater than the latter.
  • the proteins of the RIP family are divide into two types according to their molecular structure.
  • Type I groups proteins that have a single polypeptide chain of about 30 kDa and lack lectin activity for cell-surface attachment, which gives them low toxicity.
  • Type II groups proteins comprising two polypeptide chains A and B with distinct properties.
  • the haptomer or B-chain (Binding), which contains a lectin domain, interacts with a sugar or a glycosylated compound on the surface of the cell and facilitates the entry of the A-chain into the cell.
  • the effectomer, or chain A (Activity) carries the toxic activity.
  • the best known of these toxins is ricin (from Ricinus communis), but other phytotoxins such as abrin (Abrus precatorius), modeccin (Adenai digitata), volkensin (Adenia volkensii) and viscum (from Viscum album), possess the same properties.
  • Type 2 RIPs are much more efficient than Type 1 RIPs; indeed, although potent inhibitors of protein synthesis in acellular preparations, type 1 RIPs are much less toxic in mice (LD50 of 1 to 40 mg / kg) than type 2 RIPs (ricin LD50: 2 ⁇ g / kg).
  • the suicide gene encodes a protein toxin of the RIP type 2 family or a protein derived, preferably for the chain A of a protein toxin of the RIP type 2 family such as ricin, abrin, modeccin, volkensin, viscumine and Shiga toxin, and particularly preferably for the ricin A chain.
  • a protein toxin of the RIP type 2 family such as ricin, abrin, modeccin, volkensin, viscumine and Shiga toxin, and particularly preferably for the ricin A chain.
  • the suicide gene corresponds to the sequence SEQ ID No: 2 or to a derived sequence.
  • derivative sequence is meant a sequence having an identity of at least 80% with the sequence
  • SEQ ID NO: 2 preferably at least 85%, especially at least 90%, and particularly preferably at least 95% identity.
  • the 3'UTR region ranges from nucleotides 9378 to 9646 of the sequence having the accession number AF009606 for the genotype 1a; 9443 to 9678 of the sequence having accession number AB047639 for genotype 2a; 9444 to 9654 of the sequence having accession number AB030907 for genotype 2b; 9403-9628 of the sequence having accession number D84262 for genotype 6b; 9381-9615 of the sequence having accession number D84263 for genotype 6d; 9387-9621 of the sequence having the accession number D84264 for the 6k genotype.
  • 3'UTR region of the genomic RNA (strand (+)) of the HCV is meant the 3'UTR region of the genomic RNA of a hepatitis C virus (HCV) of genotype 1, 2, 3 , 4, 5 or 6, or a sequence derived therefrom, preferably a genotype 1 hepatitis C virus.
  • HCV hepatitis C virus
  • derivative sequence is meant a sequence having an identity of at least 80% with the sequence of the 3'UTR region of the genomic RNA of a hepatitis C virus of genotype 1, 2, 3, 4, 5 or 6, preferably at least 85%, especially at least 90%, and particularly preferably at least 95% identity.
  • sequence of the 3'UTR region of the HCV genomic RNA corresponds to the sequence SEQ ID No: 3 or to a sequence derived therefrom.
  • the single-stranded RNA molecule according to the invention can be obtained by chemical synthesis methods or by molecular biological methods, in particular by transcription from DNA templates or plasmids isolated from recombinant microorganisms.
  • this transcription step uses phage RNA polymerase such as T7, T3 or SP6 RNA polymerase.
  • the single-stranded RNA molecule according to the invention corresponds to the sequence complementary to the sequence SEQ ID No. 4 or a derived sequence.
  • derivative sequence is meant a sequence having an identity of at least 80% with the sequence
  • SEQ ID NO: 4 preferably at least 85%, especially at least 90%, and particularly preferably at least 95% identity.
  • a second subject of the invention corresponds to a DNA molecule, preferably double-stranded DNA, allowing transcription of the single-stranded RNA molecule described above.
  • said DNA molecule comprises a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence of the previously described single-stranded RNA molecule, which complementary nucleic acid sequence is operably linked to a sequence of nucleic acids. nucleic acid allowing its transcription in a eukaryotic or prokaryotic cell, preferably eukaryotic, and thus obtaining the single-stranded RNA molecule described above.
  • Said DNA molecule thus makes it possible to obtain the single-stranded RNA molecule corresponding to a chimeric genomic RNA of negative polarity directly and without going through the successive steps of transcription of a chimeric genomic RNA of positive polarity and of replication of this genomic RNA. latest.
  • transcriptional nucleic acid sequence any transcriptional regulatory sequence, such as a promoter or enhancer sequence, preferably a promoter sequence.
  • Said promoter sequence may correspond, for example, to a cellular or viral promoter, and to a constitutive or inducible promoter.
  • a constitutive or inducible promoter examples include, without limitation, the promoters of the following genes: hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HPTR), adenosine deaminase, pyruvate kinase, ⁇ -actin, muscle creatine kinase and factor of human elongation.
  • viral promoters having constitutive expression in mammalian cells include, but are not limited to, promoters of the following viruses: SV40, papilloma virus, adenovirus, human immunodeficiency virus (HIV) , Cytomegalovirus (CMV), Rous sarcoma virus (RSV), Hepatitis B virus (HBV).
  • Other constitutive promoters are well known to those skilled in the art.
  • Useful promoter sequences also include inducible promoters and allowing a transcription following the addition of an induetible agent.
  • Other inducible promoters may simply be identified by those skilled in the art with regard to his general knowledge.
  • the promoter sequence includes 5 'non-transcribed sequences involved in transcription initiation such as a TATA box.
  • Another subject of the invention consists of a nucleic acid vector comprising a nucleic acid molecule as described above, in particular an RNA or DNA molecule.
  • nucleic acid vector is meant any support for facilitating the transfer of said RNA or DNA molecules in the cells, preferably in the cells potentially infected with the hepatitis C virus.
  • the vector according to the invention makes it possible to transport said nucleic acid molecules by limiting the degradation thereof with respect to their transport in the absence of a vector.
  • the vector optionally comprises the promoter sequences described above.
  • usable vectors mention may be made, without limitation, of plasmids, phagemids, viruses and other derived vectors of viral or bacterial origin.
  • Preferred viral vectors include adenoviruses (modified), which are capable of infecting a very large number of species and cell types, lentiviruses (modified in particular by a modification of the envelope protein so as to obtain the tropism sought) or hepatitis A and B viruses (modified) which are capable of specifically infecting liver cells.
  • Preferred non-viral vectors include those Plasmid vectors, which are extensively described in the prior art (see, for example, SlVNBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Plasmids can be administered by multiple routes, including topical or parenteral. For example, the plasmids can be injected intramuscularly, intradermally, intrahepaticly or subcutaneously.
  • the nucleic acid vector according to the invention may comprise active selection markers in eukaryotic and / or prokaryotic cells.
  • Another object of the invention is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid molecule, RNA or DNA, or a vector as described above.
  • said pharmaceutical composition comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the compositions according to the invention may comprise emulsions, microemulsions, oil-in-water or water-in-oil emulsions, or other types of emulsions.
  • the composition may also comprise one or more additives, such as diluents, excipients or stabilizers (see in particular ⁇ llmann's Encyclopedia of Industr ⁇ al Chemistry, 6 th Ed, 1989-1998, Marcel Dekker;.. ANSEL et al, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, WILLIAMS & WILKINS, 1994).
  • the composition may comprise water or a solubilization buffer, which buffers include, but are not limited to, phosphate buffered saline (PBS), phosphate buffered saline without Ca ++ / Mg ++ , saline (150 mM
  • buffers include, but are not limited to, phosphate buffered saline (PBS), phosphate buffered saline without Ca ++ / Mg ++ , saline (150 mM
  • Another object of the invention is the use of a nucleic acid molecule or a vector as described above for the preparation of a pharmaceutical composition for preventing or treating a replicating RNA virus by RNA dependent RNA polymerase in a patient.
  • Another subject of the invention consists in the use of a nucleic acid molecule or a vector as described above for the preparation of a pharmaceutical composition intended to prevent or treat a virus infection.
  • Hepatitis C (HCV) in a patient is another subject of the invention.
  • patient is meant a mammal, preferably a man.
  • composition according to the invention may be administered in a therapeutically effective amount by topical or parenteral route, in particular by intramuscular, intradermal, intrahepatic or subcutaneous injection, preferably by intrahepatic injection.
  • composition according to the invention may be carried out by methods of gene transfer known to those skilled in the art.
  • Common methods of gene transfer include calcium phosphate, DEAE-Dextran, electroporation, microinjection, viral methods and cationic liposomes (GRAHAM and VAN DER EB, Virol., Vol.52, p: 456, 1973; McCUTHAN and PAGANO, J. Natl Cancer Inst., Vol.41, p: 351, 1968; CHU et al., Nucl. Acids Res., Vol. 15, p: 1311; FRALEY et al., J. . Biol. Chem, vol.255, p: 10431, 1980; et al CAPECCHI f Ceil, vol 22, p... 479, 1980; FELGNER et al, Proc Natl Acad ScI USA, vol.84.... , p: 7413, 1988).
  • an effective amount of nucleic acid molecules to be administered to a patient can be determined simply by the skilled person.
  • an effective amount of nucleic acid molecules is between 0.001 mg and 10 g / kg of the patient to be treated, preferably between 0.01 mg and 1 g / kg, and particularly preferably between 0.1 and lOOmg / kg.
  • a cellular system that constitutively synthesizes the HCV replication complex was developed by inserting non-structural HCV proteins (NS3-NS5B) into the cell genome of the Huh7 hepatoma cell line.
  • NS3-NS5B non-structural HCV proteins
  • a pcDNA3.1 / NS3-5B (2884R / G) vector encoding said nonstructural proteins was constructed as follows:
  • the genes encoding nonstructural proteins spanning NS3 to NS5B were amplified from infectious isolate J4L6 of HCV, genotype 1a strain (YANAGI et al., Virology, vol.244 (1), p: 161 -72, 1998) using Herculase® polymerase (STRATAGENE) and NS3-Start primers (SEQ ID No. 5: ACACACTGGCCAATGGCGCCCATCACGGCCTACTCC) and NS5B-stop (SEQ ID No. 6: GTGTGTTCTAGATCATCGGTTGGGGAGCAGGTA).
  • the NS3-5B fragment was then inserted between the EcoRV and XbaI sites of plasmid pcDNA3.1 (INVITROGEN), thereby producing the pcDNA3.1 / NS3-5B vector.
  • a mutation of the GIy residue at Arg at position 2884 (PIETSCHMANN et al.) was then introduced by direct mutagenesis using the primers NS5B2884S (SEQ ID No 7: TCATTGAAGGGCTCCATGGTCTTAGCGCATTTACAC) and NS5B2884AS (SEQ ID No 8: TAAGACCATGGAGCCCTTCAATGATCTGAGGTAGGTC) and the Taq Phusion® DNA polymerase (OZYME).
  • the PCR reaction was carried out on the vector pcDNA3.1 / NS3-5B, the PCR product obtained was then digested with the enzyme Dpn I (PROMEGA) and directly amplified in culture of E. coli DH5 ⁇ bacteria.
  • the plasmid pcDNA3.1 / NS3-5B (2884R / G) containing the mutated sequence was selected by sequencing.
  • Huh7 cells were therefore transfected with 2.5 ⁇ g of the plasmid vector ⁇ cDNA3.1 / NS3-5B (2884R / G) using lipofectin® plus reagent + (INVITROGEN) according to the instructions of the supplier.
  • the cells were then cultured in modified Dulbecco's medium supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum (FCS) and antibiotic G418 (1 mg / ml) at 37 ° C. under an atmosphere of 5% CO 2 .
  • FCS heat-inactivated fetal calf serum
  • antibiotic G418 (1 mg / ml)
  • This 5UTR-H2AE-3UTR sequence consists of the 5'UTR region of HCV, a sequence coding for a polyprotein consisting of the sequences of the hygromycin resistance protein, the foot and mouth disease virus protein 2A ( FMDV) and the EGFP protein, followed by the 3 'NC region of HCV, was constructed.
  • Step 1 The construction of the pGEM-T / 5UTR-EGFP-3UTR vector plasmid (FIG. 1A) was carried out by amplification of the 5'UTR and 3'UTR (or non-coding region) regions, respectively from the isolate conl and the strain. H77, and the EGFP (enhanced green fluorescent protein) gene.
  • the 5 'NC sequence extended to the first 27 nucleotides encoding the capsid protein (protein C), was amplified using primers 5NC ⁇ Start (SEQ ID No 9: GCCAGCCCCCGATTGGGGGCG) and 5NC-Bam (SEQ ID No 10: ATAGGATCCGGTGTTACGTTTGGTTTTTC) and the isolate conl as template (EMBL X61596), the EGFP sequence was amplified by Taq Gold® polymerase (ROCHES) using EGFP-Bam primers (SEQ ID No 11
  • the 3 'NC region was obtained by polymerase chain reaction (PCR) using the primers 3NC-Xba (SEQ ID No 13: ATATATTCTAGAACGGGGAGCTAAACACTCCAG) and 3NC-StOp (SEQ ID No 14: ACTTGATCTGCAGAGAGGCCAG) of the VHC strain H77 ( EMLB AF011753).
  • the amplification product and the 5UTR-EGFP fragment were digested with the XbaI enzyme, ligated under the conditions described above and the ligation product obtained was amplified using the 5NC-Start and 3NC-stop primers.
  • the resulting fragment was inserted into the pGEM-T vector plasmid (PROMEGA), producing the pGEM-T / 5UTR-EGFP-3UTR vector.
  • the resulting pGEM-T / 5NC-EGFP-3NC vector sequence was confirmed by sequencing.
  • the construction of the plasmid pGEM-T / 5UTR-H2AE-3UTR was carried out by the insertion of the sequence of hygromycin phosphotransferase (HygroR) and the sequence coding for the viral protein 2A. Foot and Mouth Disease Virus (FMDV) between the 5'UTR region and the EGFP sequence of the vector pGEM-T / 5UTR-EGFP-3UTR.
  • HygroR hygromycin phosphotransferase
  • FMDV Foot and Mouth Disease Virus
  • the hygromycin sequence was obtained by PCR amplification of the psiSTRIKETM vector plasmid (PROMEGA) using Hygro-Bam primers (SEQ ID No. 15: ATATATGGATCCAAAAAGCCTGAACTCACCGCG) and Hygro2A-Bam (SEQ ID No. 16: ATATATGGATCCGGGCCCAGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTTAAG AAGTTCCTTTGCCCTCGGACGAG ); which Hygro2A-Bam primer comprises the 42 nucleotides of the 2A protein sequence.
  • the amplification product obtained was then inserted into the BamHI site of the plasmid pGEM-T / 5UTR-EGFP-3UTR, to obtain the vector pGEM-T / 5UTR-H2AE-3UTR. Finally, the resulting ⁇ GEM-T / 5UTR-H2AE-3UTR vector sequence was confirmed by sequencing.
  • the T7 phage promoter required for transcription was introduced by PCR.
  • (+) primers T7-5UTR SEQ ID No 17: TAATACGACTCACTATAGGGCCAGCCCCCTGATGGGGGCG
  • 3UTR-STOP SEQ ID NO: 18: ACTTGATCTGCAGAGAGGCCAG
  • T7-3UTR SEQ ID NO 19: TAATACGACTCACTATAGGACTTGATCTGCAGAGAGGCCAG
  • 5UTR-Start SEQ ID No 20: GCCAGCCCCCGATTGGGGGCG
  • RNA of negative polarity was obtained by transcription of 1 ⁇ g of PCR product using T7 polymerase (PROMEGA) following the instructions of the manufacturer. Finally, the RNAs were purified using an RNeasy® kit (QIAGEN) following the manufacturer's instructions.
  • 24-well culture plates were seeded at 'of 10 5 cells Huh7 / NS3-5B per well and incubated 24 hours at 37 ° C.
  • the cells obtained were then transfected with 1 ⁇ g of 5UTR-H2AE-3UTR positive polarity transcripts mixed with 3 ⁇ l of DMRIE-C (INVITROGEN) according to the supplier's recommendations.
  • the cells thus transfected were cultured in the presence of different concentrations of hygromycin to select the cells replicating the transfected transcript.
  • Huh7 / NS3-5B cells transfected or not with 5UTR-H2AE-3UTR transcripts and in the presence of different concentrations of hygromycin were trypsinized and resuspended at a concentration of 0.5 ⁇ 10 6 to 1.10 6 cells. / ml in 2mM EDTA phosphate buffer.
  • the resulting cell suspensions were then analyzed by flow cytometry at 488 nm to detect expression of EGFP and using a FACS Calibur® (BECKTON).
  • Figure 2A shows the percentage of Huh7 fluorescent transfected cells (striped), Huh7 / NS3-5B (black) and Huh7 / Rep5.1 (gray, cf.3) at 24, 48 and 72 hours post transfection.
  • FIG. 2B shows the fluorescence index corresponding to the fluorescence ratio between the Huh7 and Huh7 / NS3-5B transfected cells (black), and between the Huh7 and Huh7 / Rep5.1 transfected cells (gray, cf. 3).
  • cells of the Huh7 / NS3-5B cell line which constitutively express the NS3-NS5B polyprotein, allow the production of an efficient replication complex for replication of the mini-genome.
  • Huh7 / Rep5.1 cells Huh7 / Rep5.1 cells, KRIEGER et al., J. Virol., Vol.75, p .4614-4624.
  • Huh7 / Rep5.1 and Huh7 cells were transfected with 1 ⁇ g of 5UTR-H2AE-3UTR transcripts of positive polarity according to the protocol described in 2-2.
  • the expression of the EGFP protein was analyzed after 24, 48 and 72 hours by flow cytometry (FIG. 2A).
  • expression of the EGFP protein is represented as the percentage of expression of EGFP by Huh7 / rep5.1 cells relative to the expression level of Huh7 cells. .
  • Huh7 / Rep5.1 cells are cultured under selection pressure as opposed to Huh7 / NS3-5B cells, EGFP expression difference between these two cell lines likely reflects a lower cellular permissivity of Huh7 / NS3-5B cells in the absence of selection pressure.
  • genomic RNAs of negative polarity derived from HCV were able to replicate in cells harboring a replicon.
  • a chimeric genomic RNA was constructed as previously in which the transgene corresponded, not to EGFP, but to the gene coding for the ricin A chain flanked by the 5'UTR and 3'UTR regions of the HCV (5UTR-Ric-3UTR).
  • the ricin A chain gene has been selected as a suicide gene on the basis of its high toxicity to eukaryotic ribosomes of HCV-infected target cells (EIKLID et al., Exp. vol.126 (2), p: 321-6, 1980; OLSNES and KOZLOV, Toxicon, vol.39 (11), p: 1723-1728, 2001), and for its non-diffusivity in the absence of the B-chain thus preserving healthy surrounding cells that do not express the HCV replication complex.
  • the gene coding for the ricin A chain was obtained by PCR amplification using the Ric_Start primers (SEQ No 21:
  • the gene coding for the ricin A chain was introduced into the pGEM-T / 5UTR-EGFP-3UTR plasmid by exchanging the EGFP gene with that of the ricin A chain at the BamHI and XbaI sites, producing plasmid pGEM-T / 5UTR-Ric-3UTR (FIG. 1C).
  • the T7 phage promoter required for transcription was introduced by PCR. In order to transcribe the (+) strand the primers T7-5UTR (SEQ ID No. 17) and 3UTR-ST0P (SEQ ID No. 18) were used. In order to transcribe the (-) strand the primers T7-3UTR (SEQ ID No. 19) and 5UTR-Start (SEQ ID No. 20) were used.
  • RNA of negative polarity was obtained by transcription of 1 ⁇ g of PCR product using T7 polymerase (AMBION) following the instructions of the manufacturer.
  • the minimal genomic RNA of negative polarity obtained is constituted, starting from the 5 'end towards the 3' end, by the complementary sequences of: the 3 'non-coding region of HCV (3'UTR), the ricin A sequence, the first 27 nucleotides of the coding sequence for the capsid protein, and finally the 5 'non-coding region of HCV.
  • FIG. 3 shows the sequence of genomic RNA of positive polarity with the ricin A chain sequence (underlined), framed by the cloning sites (bold and italic) and the 5'UTR (high) and 3 regions. '-UTR (low).
  • Huh7 / Rep5.1 and Huh7 / NS3-5B cells were transfected with the minimal genomic RNA of negative polarity obtained in 4-1 according to the protocol described in 2-2.
  • Huh7 cells were transfected with the minimal genomic RNA of negative polarity obtained in 4-1 according to the same protocol.
  • Figure 4 shows the cytotoxicity 48 hours after transfection of Huh7, Huh7 / Rep5.1 or Huh7 / NS3-5B cells with minimal genomic RNA of negative (black) or positive (gray) polarity.
  • FIG. 5 corresponds to the normalization of the percentage of cytoxicity of the negative-polarity minimal genomic RNA by taking as a transfection reference (100%) the percentage of cytoxicity of the positive-polarity minimal genomic RNA.
  • the results show that the developed suicide vector, corresponding to a negative-polarity HCV-derived RNA molecule, is effective in targeting and destroying cells expressing genotype Ib HCV replication complexes.
  • the inventors have also been able to show that the same suicide vector developed is effective for targeting and destroying (at nearly 90%) Huh7 cells infected with a genotype 2a HCV virus (JFH-I, ZHONG et al., Proc Natl Acad Sci USA, vol.102 (26), p: 9294-9, 2005).
  • a chimeric genomic RNA was constructed as described above, in which the transgene corresponded to the gene coding for either interferon alpha (IFN- ⁇ ) either for the Interferon Regulatory Factor (IRF-I) by the 5'UTR and 3'UTR regions of the HCV (5UTR-Ric-3UTR).
  • IFN- ⁇ interferon alpha
  • IRF-I Interferon Regulatory Factor
  • the gene coding for IFN- ⁇ was obtained by PCR amplification using the IFN-Bam primers (SEQ ID No. 23: ATATATGGATCCGCCCTGTCCTTTTCTTTACTGATGG) and IFN-Xba (SEQ ID NO: 24: ATATATTCTAGATCAATCCTTCCTCCTTAATATTTTTTGC).
  • IRF-I The gene coding for IRF-I was obtained by PCR amplification using IRF1-Bam primers (SEQ ID No. 25: ATATATGGATCCCCCATCACTCGGATGCGCATG) and IRF1-Xba (SEQ ID No. 26: ATATATTCTAGACTACGGTGCACAGGGAATGGC).
  • the genes coding for IFN- ⁇ and IRF-I were introduced into the plasmid pGEM-T / 5UTR-EGFP-3UTR at the BamHI and XbaI sites, producing the plasmid pGEM-T / 5UTR-IFN ⁇ -3UTR and pGEM. -T / 5UTR-IRFl-3UTR.
  • the T7 phage promoter required for transcription was introduced by PCR. In order to transcribe the (+) strand the primers T7-5UTR (SEQ ID No. 17) and 3UTR-ST0P (SEQ ID No. 18) were used. In order to transcribe the (-) strand the primers T7-3UTR (SEQ ID No. 19) and 5UTR-Start (SEQ ID No. 20) were used.
  • RNA of negative polarity was obtained by transcription of 1 ⁇ g of PCR product using T7 polymerase (AMBION) following the manufacturer's instructions.
  • the minimum genomic RNA of negative polarity obtained is constituted, starting from the 5 'end towards the end
  • IRF-I the first 27 nucleotides of the coding sequence for the capsid protein, and finally the 5 'non-coding region of HCV.
  • RNA of positive polarity was also produced following the same protocol and in vitro transcription with T3 polymerase (AMBION) following the manufacturer's instructions.
  • AMBION T3 polymerase
  • Huh7 / Rep5.1 cells were transfected with the minimal genomic RNA of negative polarity obtained in 5-1 according to the protocol described in 2-2.
  • Huh7 / Rep5.1 cells were transfected with the 5UTR-EGFP-3UTR minimal genomic RNA, of positive polarity obtained in 2-1, step 1 according to the same protocol.
  • FIG. 6 shows the effects of IFN minigenomes
  • Huh7 / Rep5.1 cells were transfected with the minimal positive (+) or negative (-) polynomial RNAs expressing IFN ⁇ or IRF-I.
  • FIG. 6A illustrates the number of RNA copies of the replicon measured by real-time quantitative RT-PCR, reported per ⁇ g of total RNA after 48 hours of culture.
  • the minimal genomic RNA 5UTR-EGFP-3UTR was transfected as a control.
  • One hundred IU of IFN- ⁇ was added to the cell culture (IFN 100 IU) as a positive control.
  • Figure 6B illustrates the percentage inhibition of Rep 5.1 replicon replication calculated by taking the RNA 5UTR-EGFP-3UTR minimal genomic as replication control.
  • the results show that vectors stimulating the antiviral cellular response, corresponding to an HCV-derived and negative polarity-derived RNA molecule, are effective in targeting cells expressing the HCV replication complex and reducing the number of RNAs. genomic replicon.

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Abstract

La présente invention concerne une molécule d'ARN simple brin qui comprend, en partant de l'extrémité 3' vers l'extrémité 5', (i) une séquence d'acide nucléique complémentaire à la région 5' non-codante (5'UTR) de l'ARN génomique (brin (+) ) du virus de l'hépatite C (VHC) ou d'un autre virus à ARN se répliquant grâce à une ARN polymérase ARN dépendante, laquelle séquence d'acide nucléique permet la réplication de ladite molécule d'ARN simple brin par le complexe de réplication dudit virus, (ii) la séquence d'acide nucléique complémentaire d'une séquence d'acide nucléique correspondant d'un site d'entrée interne du ribosome (1RES), et (iii) la séquence d'acide nucléique complémentaire de la séquence d'acide nucléique d'un gène suicide ou d'un gène codant pour une protéine interférant avec la réplication du virus VHC ou d'un autre virus à ARN se répliquant grâce à une ARN polymérase ARN dépendante; une molécule d'ADN permettant la transcription de ladite molécule • d 'ARN simple brin; un vecteur d'acide nucléiques comprenant lesdites molécules d'acides nucléiques; et une composition pharmaceutique comprenant lesdites molécules d'acide nucléique ou ledit vecteur d'acide nucléique.

Description

TRAITEMENT D' UNE INFECTION PAR UN VIRUS A ARN A UNE ARN POLYMERASE ARN DEPENDANTE .
La présente invention concerne une molécule d'acide nucléique, une composition pharmaceutique comprenant une telle molécule d'acide nucléique et l'utilisation d'une telle molécule d'acide nucléique pour la préparation d'un médicament destiné à traiter ou à prévenir une infection par un virus à ARN se répliquant grâce à une ARN polymérase ARN dépendante, et en particulier une infection par le virus de l'hépatite C.
Le virus de l'hépatite C (VHC) représente aujourd'hui un important problème de santé publique, au vu de la forte prévalence de l'infection par celui-ci et du risque important d'évolution ultérieure vers une hépatite chronique de l'ordre de 80%. En effet, le virus de l'hépatite C (VHC) infecte environ 3 % de la population et est responsable d ' approximativement 170 millions de cas d'infections chroniques. Les patients atteints d'une telle infection chronique sont alors susceptibles de développer une cirrhose, avec un risque estimé à 20-30% vingt ans après la primo-infection, qui peut évoluer en hépatocarcinome. La primo-infection étant généralement asymptomatique, l'infection est diagnostiquée lorsque les complications liées à l'infection chronique apparaissent.
Le VHC est un virus à ARN positif, appartenant à la famille des Flaviviridae, découvert par la société CHIRON en 1989 (KUO et al., Science, vol. 244(4902), p :362-4, 1989). Des analyses moléculaires fines ont permis de démontrer qu'il existe près de 6 génotypes différents de VHC, lesquels génotypes se subdivisent en de multiples sous-types. Concernant les infections par le VHC, la majorité d'entre elles sont associées au génotype 1.
L'ARN génomique du VHC contient une seule phase ouverte de lecture encadrée par des séquences non codantes en 5' (5'UTR) et en 3' (3'UTR). Si la séquence 5'UTR montre une importante conservation quel que soit le génotype étudié, la séquence 3'UTR montre de son côté une importante variabilité au niveau de ses 30 premiers nucléotides en fonction du génotype étudié. Parallèlement, la phase ouverte de lecture code selon le génotype considéré pour une polyprotéine de 3008 à 3037 acides aminés, laquelle est clivée de façon co- et post- traductionnelle par des protéases cellulaires et virales pour générer au moins 10 protéines virales matures impliquées dans la réplication et la morphogenèse de nouveaux virions. Plus spécifiquement, les protéines structurales sont situées dans le tiers amino-terminal de ladite polyprotéine et les protéines non structurales, dont certaines forment le complexe de réplication, dans la partie carboxy-terminale de la polyprotéine.
La région 5'UTR contient un site d'entrée interne de ribosome qui permet au génome viral (brin (+)), suite à l'internalisation du virion, d'être traduit de manière coiffe-indépendante. Après traduction et maturation de la polyprotéine, le complexe de réplication s'assemble, puis l'ARN polymérase dépendante de l'ARN (NS5B) commence la réplication de l'ARN. Le complexe de réplication du VHC est donc présent au sein de toutes les cellules infectées.
De manière plus générale, à l'exception des rétroviridaes qui utilisent une transcriptase inverse pour leur réplication, les virus possédant un génome ARN se répliquent grâce à une ARN polymérase ARN dépendante (RdRp) qui synthétise, à partir de l'ARN génomique, un ARN de polarité opposé servant d'intermédiaire de réplication. Cet ARN intermédiaire de réplication est à son tour copié par l'ARN polymérase ARN dépendante pour régénérer l'ARN génomique .
Cette RdRp est codée par le virus et développe son activité au sein d'un complexe de réplication dont certaines protéines sont elles aussi codées par le virus. Des séquences portées par le génome viral sont indispensables pour la fixation du complexe de réplication qui précède la synthèse du brin d'ARN opposé par la RdRp. Ce complexe de réplication se fixe sur la région non traduite située en 3' du génome viral pour synthétiser le brin négatif à partir du brin génomique positif. Par la suite ce complexe de réplication se fixe sur la région non traduite située en 5 ' du brin négatif pour synthétiser le brin génomique positif. Le complexe de réplication du virus possédant un génome ARN se répliquant grâce à une ARN polymérase ARN dépendante, est donc présent au sein de toutes les cellules infectées.
La réplication de l'ARN génomique simple brin du VHC nécessite une étape intermédiaire correspondant à la synthèse d'un brin « anti-génomique de polarité négative »
(brin (-))/ lequel servira de matrice pour la synthèse d'ARN génomiques de polarité positive (brin (+)).
Pour cette étape de réplication de l'ARN génomique du VHC, les deux séquences 5'UTR et 3'UTR sont indispensables. La séquence 3'UTR est nécessaire pour la synthèse du brin (-) à partir du brin (+ ). Parallèlement, la séquence 5'UTR est nécessaire pour la synthèse des brins (+) des nouveaux virions à partir du brin (-).
La région 5'UTR présente une longueur de l'ordre de 340 nucléotides. Cette région 5'UTR comprend quatre domaines présentant une structure de type tige-boucle (domaines 5'UTR-dI à 5'UTR-dIV), le dernier domaine 5 'UTR- dlV étant chevauchant avec les premiers nucléotides de la phase codante correspondant à la protéine de capside de la polyprotéirie. Cette région 5'UTR se trouve fortement conservée entre les différentes souches du VHC et ceci tant au niveau de la séquence nucléotidique qu'au niveau structural. Outre son rôle dans la réplication du génome, la région 5'UTR est également impliquée dans l'initiation de la traduction de la polyprotéine . Le domaine minimal de la région 5'UTR pour que la réplication s'effectue comprend les domaines 5'UTR-dI et 5'UTR-dII (FRIEBE et al., J. Virol., vol.75(24), p:12047-57, 2001), le domaine 5'UTR-dIII jouant un rôle modulateur sur celle-ci (REUSKEN et al., J. Gen. Virol., vol.84, p:1761-69, 2003).
Le domaine minimal pour la traduction du VHC correspond à un site d'entrée interne du ribosome (1RES) auquel vient directement se fixer le ribosome (HONDA et al., Virology, vol.222(l), p: 31-42, 1996) qui permet une initiation de la traduction coiffe-indépendante. À l'exception de la tige-boucle constituant le domaine 5'UTR-dI, les domaines 5'UTR-dII à 5'UTR-dIV sont nécessaires à l'initiation de la traduction. Cependant, la localisation de l'extrémité 3' de l'IRES est controversée. L'évaluation de l'efficacité d'initiation de la traduction à partir de segments de régions 5 ' du génome de VHC de différentes longueurs placés en amont de différents gènes rapporteurs (SEAP, CAT) a conduit certains auteurs - à conclure que la partie 5' de la séquence codant la protéine de capside C localisée directement en aval de l'AUG initiateur, était nécessaire pour obtenir une efficacité optimale de l'IRES (REYNOLDS et al., RNA, vol.2(9), p : 867-78, 1996; LU et al., Proc Natl Acad Sci U S A., vol.93 (4), p: 1412-7, 1996), ce qui a été réfuté par d'autres (RIJNBRAND et al., FEBS Lett., vol.365(2-3) , p:115-9, 1995).
Une des difficultés majeures pour développer de nouveaux traitements antiviraux a découlé de l'absence de systèmes de culture cellulaires permissifs à l'infection et à la réplication du VHC, mais également de l'absence de modèles animaux de petite taille qui remplaceraient le chimpanzé, seul modèle animal expérimental sensible à l'infection par le VHC.
Une première avancée majeure a pu être réalisée avec le développement d'ARN sous-génomiques bicistroniques (réplicons) du VHC capables de se répliquer dans la lignée hépatocytaire Huh-7 (LOHMANN et al., Science., vol.285 (5424), p: 110-3, 1999). Pour autant, et malgré les nombreuses améliorations apportées à ce système, aucune équipe n'a pu montrer à ce jour que des réplicons génomiques codant l'ensemble des protéines structurales et non structurales du VHC soient capables de générer des particules virales. En outre, seuls des réplicons de génotype la, Ib et plus récemment de génotype 2a (KATO et al., Gastroenterology, vol.125 (6), p : 1808-17, 2003) ont pu être étudiés dans ce système. Ce système cellulaire reste toutefois un modèle de prédilection pour étudier la réplication virale et pour mettre au point de nouveaux antiviraux plus efficaces.
À ce jour, différents traitements ont pu être développés pour traiter les infections par le VHC, le traitement actuel antiviral le plus efficace consistant en une bithérapie reposant sur l'utilisation conjointe d'interféron alpha pégylé et d'un analogue nucléosidique, la ribavirine. Toutefois, l'efficacité de ce traitement semble dépendre en partie du génotype du virus responsable de l'infection. En effet, cette thérapie n'est efficace que pour environ 40 à 50 % des patients infectés chroniquement par les souches du VHC de génotype 1 alors qu'elle guérit près de 80 % des patients infectés par les VHC de génotypes 2 ou 3. Sachant que le génotype 1 est prédominant dans une grande partie du monde (60 à 90 % des infections), la nécessité de mettre au point de nouveaux antiviraux et/ou un vaccin constitue un besoin important. D'autre part, l'utilisation dans cette thérapie d'interféron la rend très coûteuse et souvent mal supportée par le patient.
Pour améliorer le traitement des infections par le
VHC, de nombreux travaux ont été menés pour découvrir de nouvelles molécules qui inhibent spécifiquement des étapes du cycle viral du VHC. Dans les stratégies développées, on peut distinguer ( 1 ) celles qui visent à cibler au niveau protéique spécifiquement les enzymes virales qui n'ont pas d'homologue cellulaire, notamment l'ARN polymérase ARN dépendante (NS5B) ou la protéase virale NS3, et (2) les stratégies qui prennent pour cible le génome du VHC.
Dans le cadre de cette seconde stratégie, de nombreuses molécules ont été développées pour inhiber la réplication virale, comme notamment des ribozymes, des ARNi, des aptamères ou encore des acides nucléiques anti-sens. Pour autant, les composés développés pour ces approches ont été confrontés à la grande variabilité génétique du VHC, conséquence de l'infidélité de l'ARN polymérase du VHC (NS5B) lors de la réplication du génome du VHC. En effet, et dans la mesure où ces molécules ciblent spécifiquement une séquence du génome du VHC, une unique mutation au sein du génome viral peut réduire, voire annuler, leur activité d'inhibition de la réplication du VHC. En outre, la variabilité existant entre les différents génotypes du VHC interdit le plus souvent d'utiliser une même molécule pour traiter des infections par différents génotypes du VHC.
Il existe donc aujourd'hui un besoin important pour identifier de nouvelles molécules possédant une spécificité suffisamment large pour cibler les nombreux variants du VHC, tout en conservant une grande efficacité vis-à-vis des différents variants.
De façon surprenante, les inventeurs ont maintenant réussi à développer un vecteur suicide sous la forme d'un ARN génomique chimère de polarité négative qui sera répliqué en un ARN génomique chimère de polarité positive uniquement dans les cellules infectées par le VHC (cellules exprimant le complexe de réplication du VHC), lequel ARN génomique chimère de polarité positive permet la traduction d'une protéine toxique dont l'expression entraîne la mort des cellules infectées par le VHC. L 'ARN génomique chimère de polarité négative selon l'invention permet ainsi de s'affranchir des problèmes mentionnés précédemment, notamment l'efficacité variable en fonction des génotypes des molécules anti-VHC des traitements de l'art antérieur et la grande variabilité génétique à la base des résistances aux antiviraux.
Ainsi, un premier objet de l'invention correspond à une molécule d'ARN simple brin, qui comprend en partant de l'extrémité 3' vers l'extrémité 5' :
(i) une séquence d'acide nucléique complémentaire de tout ou partie de la région 5 ' non-codante (5'UTR) de l'ARN brin (+) d'un virus à ARN se répliquant grâce à une ARN polymérase ARN dépendante, laquelle séquence d'acide nucléique complémentaire permet la réplication de ladite molécule d'ARN simple brin par le complexe de réplication dudit virus ;
(ii) éventuellement, la séquence d'acide nucléique complémentaire d'une séquence d'acide nucléique correspondant à un site d'entrée interne du ribosome ( 1RES) ;
(iii) la séquence d'acide nucléique complémentaire de la séquence d'acide nucléique d'un gène suicide ou d'un gène codant pour une protéine interférant avec la réplication dudit virus ; et
(iv) éventuellement, une séquence d'acide nucléique complémentaire à la région 3' non-codante (3'UTR) de l'ARN dudit virus.
La molécule d'ARN simple brin selon l'invention est non codante. En conséquence, ladite molécule d'ARN simple brin, lorsqu'elle est présente dans des cellules non-infectées par le virus d'intérêt dans lesquelles le complexe de réplication n'est donc pas exprimé, ne permet pas d'obtenir le transcrit du gène suicide et sa traduction consécutive et donc d'induire la mort cellulaire.
En revanche, la molécule d'ARN simple brin selon l'invention, lorsqu'elle est présente dans des cellules infectées par le virus d'intérêt qui expriment le complexe de réplication, est répliquée en un brin complémentaire dont la traduction initiée au niveau de la séquence 1RES induit la synthèse de la protéine du gène suicide et, consécutivement, la mort cellulaire.
De manière préférée, la molécule d'ARN selon l'invention comprend une séquence d'acide nucléique complémentaire d'une séquence d'acide nucléique correspondant à un site d'entrée interne du ribosome (1RES). Cependant, cette séquence n'est pas obligatoire pour les virus ne nécessitant pas d'IRES pour la traduction. L'homme du métier pourra sans difficulté déterminer les virus pouf lesquels la molécule d'ARN selon l'invention ne nécessite pas de séquence d'acide nucléique complémentaire d'une séquence d'acide nucléique correspondant à un site d'entrée interne du ribosome ( 1RES ) .
De préférence, pour les virus à ARN positif, l'ARN permettant d'obtenir les séquences complémentaires (i) et (iv) est de l'ARN génomique.
On entend par « virus à ARN positif », un virus dont l'ARN génomique est directement codant.
On entend par « ARN génomique » , le brin d'ARN qui correspond à l'ARN encapsidé dans la particule virale.
De manière préférée, un premier objet de l'invention correspond à une molécule d'ARN simple brin, correspondant à un ARN génomique chimère de polarité négative (ARN(-)) du virus de l'hépatite C (VHC), laquelle molécule d'ARN simple brin est caractérisée en ce qu'elle comprend en partant de l'extrémité 3' vers l'extrémité 5' :
(i) une séquence d'acide nucléique complémentaire à tout ou partie de la région 5' non-codante (5'UTR) de l'ARN génomique
(brin ( + )) du virus de l'hépatite C (VHC), laquelle séquence d'acide nucléique complémentaire permet la réplication de ladite molécule d'ARN simple brin par le complexe de réplication du VHC ;
(ii) la séquence d'acide nucléique complémentaire d'une séquence d'acide nucléique correspondant à un site d'entrée interne du ribosome ( 1RES ) ;
(ϋi) la séquence d'acide nucléique complémentaire de la séquence d'acide nucléique d'un gène suicide ou d'un gène codant pour une protéine interférant avec la réplication du virus VHC ; et
(iv) éventuellement, une séquence d'acide nucléique complémentaire à la région 3' non- codante (3'UTR) de l'ARN génomique (brin ( + ) ) du VHC .
De manière préférée, la molécule d'ARN selon l'invention comprend une séquence d'acide nucléique complémentaire à la région 5' non-codante (5'UTR) de l'ARN génomique (brin (+)) du virus de l'hépatite C (VHC), laquelle séquence d'acide nucléique complémentaire permet la réplication de ladite molécule d'ARN simple brin par le complexe de réplication du VHC.
La molécule d'ARN simple brin selon l'invention est non codante. En conséquence, ladite molécule d'ARN simple brin, lorsqu'elle est présente dans des cellules non-infectées par le VHC dans lesquelles le complexe de réplication du VHC n'est donc pas exprimé, ne permet pas d'obtenir le transcrit du gène suicide et sa traduction consécutive et donc d'induire la mort cellulaire.
En revanche, la molécule d'ARN simple brin selon l'invention, lorsqu'elle est présente dans des cellules infectées par le VHC qui expriment le complexe de réplication, est répliquée en un brin complémentaire (brin (+ )) dont la traduction initiée au niveau de la séquence 1RES induit la synthèse de la protéine du gène suicide et, consécutivement, la mort cellulaire.
L'utilisation d'une molécule d'ARN simple brin correspondant à un ARN génomique chimère de polarité négative (brin (-)) du virus de l'hépatite C permet, à la différence d'un ARN génomique chimère de polarité positive (brin (+)), de s'affranchir de l'étape de réplication nécessitant la reconnaissance de la séquence 3'UTR du brin (+) pour obtenir sa réplication en brin (-). Dans la mesure où les 30 premiers nucléotides de cette région 3'UTR sont plus faiblement conservés entre les différents génotypes par rapport à la région 5'UTR, l'utilisation d'un ARN génomique chimère de polarité positive, par rapport à un ARN génomique chimère de polarité négative, pourrait s'avérer d'une efficacité très variable en fonction du génotype du virus de l'hépatite C infectant la cellule, le tissu ou le patient à traiter.
Parmi les virus à ARN se répliquant grâce à une ARN polymérase ARN dépendante, on peut citer : le virus de l'hépatite C, ainsi que l'ensemble des virus appartenant à la famille des Flaviviridaes, des Cystoviridaes, des Birnaviridaes, des Reoviridaes, des Coronaviridaes, des Togaviridaes , des Arterivirus, des Astroviridaes, des Caliciviridaes, des Picornaviridaes, des Potyviridaes, des Orthomyxoviridaes, des Filoviridaes, des Paramyxoviridaes , des Rhabdoviridaes , des Arenaviridaes et des Bunyaviridaes .
De manière particulièrement préférée, les virus à ARN se répliquant grâce à une ARN polymérase ARN dépendantes sont choisis dans le groupe comprenant : le virus de la
Dengue, le virus de la fièvre jaune, le virus de l'Ouest du Nil et le virus de la diarrhée bovine.
Avantageusement, la molécule d'ARN simple brin selon l'invention peut comprendre des ribonucléotides modifiés ou non, de préférence ladite molécule d'ARN simple brin comprend des ribonucléotides non-modifiés .
Par ribonucléotide modifié, on entend un ribonucléotide naturel substitué par un analogue synthétique d'un nucléotide, lequel analogue synthétique de ribonucléotide est, de préférence, localisé à l'extrémité 3' ou 5' de la molécule d'acide nucléique.
Des analogues synthétiques de nucléotides préférés sont sélectionnés parmi les ribonucléotides présentant un groupement sucre ou groupement carboné modifié. De préférence, les ribonucléotides présentant un groupement sucre modifié présentent un groupement 2 ' -OH remplacé par un groupement sélectionné parmi un atome d'hydrogène, un halogène, un groupement OR, R, SH, SR, NH2, NHR, NR2 ou CN, dans lequel R est un groupement alkyle, alcényle ou alcynyle de 1 à 6 carbone et l'halogène est le fluor, le chlore, le brome ou l'iode. De préférence, les ribonucléotides présentant un groupement carboné modifié ont leur groupement phosphoester lié au ribonucléotide adjacent qui est remplacé par un groupement modifié tel qu'un groupement phosphothioate . Pour autant, il est également possible d'utiliser des ribonucléotides présentant un noyau purine ou pyrimidine modifié. Comme exemples de tels noyaux modifiés, on citera notamment les uridines ou les cytidines modifiées en position 5, telles que la 5-(2-amino)propyl uridine et la 5-bromo uridine, les adénosines et guanosines modifiées en position 8, telle que la 8-bromσ guanosine, les nucléotides déazotés, telle que la 7-déaza-adénosine, les nucléotides N- et 0- alkylés, telle que la N6-méthyl adénosine. Ces différentes modifications peuvent également être combinées.
Par « une séquence d'acide nucléique complémentaire à la région 5' non-codante (5'UTR) de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC, laquelle séquence d'acide nucléique complémentaire permet la réplication de ladite molécule d'ARN simple brin par le complexe de réplication du VHC », on entend une séquence d'acide nucléique comprenant au moins la séquence complémentaire d'une séquence comprenant les domaines tige-boucle I et II (5'UTR-dI et 5' UTR-dlI) de ladite région 5'UTR, de préférence au moins la séquence complémentaire d'une séquence comprenant les domaines tige-boucle I, II et III (5'UTR-dI, 5' UTR-dlI et 5' UTR- dlll) de ladite région 5'UTR.
L'homme du métier, au regard de ses connaissances générales pourra déterminer simplement la séquence des différents domaines tige-boucle dans la région 5'UTR du virus VHC d'un génotype donné, voir d'un sous-type donné. Les connaissances générales de l'homme du métier concernant le VHC et le positionnement de ces domaines sont notamment illustrées sur le site http : //euhcvdb. ibcp. fr/euHCVdb/ .
À titre d'exemple, le domaine 5'UTR-dI va des nucléotides 5 à 20 des séquences ayant le numéro d'accession M62321, M67463 ou AF009606 pour le génotype la ; 1 à 8 de la séquence ayant le numéro d'accession D90208 ou 1 à 11 de la séquence ayant le numéro d'accession M58335 pour le génotype Ib ; 5 à 20 de la séquence ayant le numéro d'accession D14853 ou AY051292 pour le génotype Ic ; 5 à 19 de la séquence ayant le numéro d'accession D00944 ou AB047639 pour le génotype 2a ; 5 à 20 de la séquence ayant le numéro d'accession D10988 ou AB030907 pour le génotype 2b ; 5 à 19 de la séquence ayant le numéro d'accession D50409 pour le génotype 2c ; 6 à 20 de la séquence ayant le numéro d'accession AB031663 pour le génotype 2k ; 5 à 18 de la séquence ayant le numéro d'accession D17763 ou D28917 pour le génotype 3a ; 5 à 18 de la séquence ayant le numéro d'accession D49374 pour le génotype 3b ; 5 à 18 de la séquence ayant le numéro d'accession D63821 pour le génotype 3k ; 5 à 19 de la séquence ayant le numéro d'accession D84262 pour le génotype 6b ; 5 à 18 de la séquence ayant le numéro d'accession D84263 pour le génotype 6d ; 5 à 18 de la séquence ayant le numéro d'accession D63822 pour le génotype 6g ; 5 à 18 de la séquence ayant le numéro d'accession D84265 pour le génotype 6h ; 5 à 18 de la séquence ayant le numéro d'accession D84264 pour le génotype 6k.
À titre d'exemple, le domaine 5'UTR-dII va des nucléotides 44 à 118 des séquences ayant le numéro d'accession M62321, M67463 ou AF009606 pour le génotype la ; 35 à 109 de la séquence ayant le numéro d'accession M58335 ou 32 à 106 de la séquence ayant le numéro d'accession D90208 pour le génotype Ib; 44 à 118 des séquences ayant le numéro d'accession D14853 ou AY051292 pour le génotype Ic ; 43 à 117 des séquences ayant le numéro d'accession D00944 ou AB047639 pour le génotype 2a ; 44 à 118 des séquences ayant le numéro d'accession AB030907 ou D10988 pour le génotype 2b ; 43 à 117 de la séquence ayant le numéro d'accession D50409 pour le génotype 2c ; 44 à 118 de la séquence ayant le numéro d'accession AB031663 pour le génotype 2k ; 42 à 116 de la séquence ayant le numéro d'accession D17763 ou D28917 pour le génotype 3a ; 42 à 116 de la séquence ayant le numéro d'accession D49374 pour le génotype 3b ; 42 à 116 de la séquence ayant le numéro d'accession D63821 pour le génotype 3k ; 1 à 72 de la séquence ayant le numéro d'accession AY859526 pour le génotype 6a ; 42 à 116 de la séquence ayant le numéro d'accession D84262 pour le génotype 6b ; 41 à 115 de la séquence ayant le numéro d'accession D84263 pour le génotype 6d ; 41 à 115 de la séquence ayant le numéro d'accession D63822 pour le génotype 6g ; 41 à 115 de la séquence ayant le numéro d'accession D84265 pour le génotype 6h ; 41 à 115 de la séquence ayant le numéro d'accession D84264 pour le génotype 6k.
À titre d'exemple, le domaine 5'UTR-dIII va des nucléotides 125 à 323 des séquences ayant le numéro d'accession M62321, M67463 ou AF009606 pour le génotype la ; 116 à 314 de la séquence ayant le numéro d'accession M58335 ou 113 à 311 de la séquence ayant le numéro d'accession D90208 pour le génotype Ib ; 125 à 323 des séquences ayant le numéro d'accession D14853 ou AY051292 pour le génotype Ic ; 124 à 322 des séquences ayant le numéro d'accession D00944 ou AB047639 pour le génotype 2a ; 125 à 323 des séquences ayant le numéro d'accession AB030907 ou D10988 pour le génotype 2b ; 124 à 322 de la séquence ayant le numéro d'accession D50409 pour le génotype 2c ; 125 à 323 de la séquence ayant le numéro d'accession AB031663 pour le génotype 2k ; 123 à 321 des séquences ayant le numéro d'accession D17763 ou D28917 pour le génotype 3a ; 123 à 321 de la séquence ayant le numéro d'accession D49374 pour le génotype 3b ; 123 à 321 de la séquence ayant le numéro d'accession D63821 pour le génotype 3k ; 63 à 261 de la séquence ayant le numéro d'accession Y11604 pour le génotype 4a ; 30 à 228 de la séquence ayant le numéro d'accession AF064490 pour le génotype 5a ; 79 à 277 de la séquence ayant le numéro d'accession AY859526 pour le génotype 6a ; 123 à 324 de la séquence ayant le numéro d'accession D84262 pour le génotype 6b ; 122 à 320 de la séquence ayant le numéro d'accession D84263 pour le génotype 6d ; 122 à 320 de la séquence ayant le numéro d'accession D63822 pour le génotype 6g ; 122 à 320 de la séquence ayant le numéro d'accession D84265 pour le génotype 6h ; 122 à 320 de la séquence ayant le numéro d'accession D84264 pour le génotype 6k.
Avantageusement, on entend par « une séquence d'acide nucléique complémentaire à la région 5' non-codante (5'UTR) de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC, laquelle séquence d'acide nucléique complémentaire permet la réplication de ladite molécule d'ARN simple brin par le complexe de réplication du VHC », la séquence d'acide nucléique complémentaire de la séquence allant de la position 1 à 120 de l'ARN génomique (brin ( + )) du VHC, de préférence comprenant allant de la position 1 à 150 et de manière particulièrement préféré allant de la position 1 à 341 de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC.
La position 1 correspond au premier nucléotide de la de l'ARN génomique (brin (+)) d'un virus de l'hépatite C (VHC) complet.
Par région 5'UTR de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC, on entend la région 5'UTR de l'ARN génomique d'un virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, ou une séquence dérivée de celle-ci.
Par séquence dérivée, on entend une séquence présentant une identité d'au moins 80% avec la séquence de la région 5'UTR de l'ARN génomique d'un virus de l'hépatite C de génotype 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, de préférence d'au moins 85%, notamment d'au moins 90%, et de manière particulièrement préférée d'au moins 95% d'identité.
De préférence, la séquence de la région 5'UTR de l'ARN génomique du VHC correspond à la séquence de la région 5'UTR du génome de l'ARN génomique d'un virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 1.
De manière particulièrement préférée, la séquence de la région 5'UTR de l'ARN génomique du VHC correspond à la séquence allant de la position 1 à 120 de la séquence SEQ ID No : 1, de préférence allant de la position 1 à 150 et de manière particulièrement préférée allant de la position 1 à 341 de la séquence SEQ ID No :1 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.
L'homme du métier pourra identifier, sans difficulté et au regard de ses connaissances générales, une séquence d'acide nucléique correspondant à un site d'entrée interne du ribosome (1RES). Une telle séquence 1RES pourra être d'origine eucaryote ou d'origine virale.
À titre d'exemple de séquence 1RES d'origine eucaryote, on peut citer la séquence 1RES des transcrits codant pour les protéines choisies dans le groupe comprenant la famille FGF (Fibroblast Growth Factor), la famille des connexines, la protéine p27 inhibitrice de la kinase dépendante des cyclines, BCL 2, HSP 101, HSP 70, les proto-oncogènes c-myc, L-myc, n-myc ou encore le répresseur transcriptionnel Mnt.
À titre d'exemple de séquence 1RES d'origine virale, on peut citer la séquence 1RES du virus de la poliomyélite, du virus de l'encéphalomyocardite (EMCV), du virus GBV-A, du virus GBV-B, du virus GBV-C, du virus de l'hépatite C, du virus de la diarrhée virale bovine (BVDV), des virus A et B de la rhinite équine (ERAV et ERBV) , des rétroéléments ZAM, Idefix et gypsy ou duHIV.
De préférence, la séquence 1RES est d'origine virale et de manière particulièrement préférée ladite séquence 1RES correspond à la séquence 1RES du VHC, laquelle comprend les domaines tige-boucle II à IV (5'UTR-dII à 5' UTR-dlV) de la région 5'UTR de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC.
À titre d'exemple, la séquence 1RES du VHC va des nucléotides 44 à 354 des séquences ayant le numéro d'accession M62321, M67463 ou AF009606 pour le génotype la ; 35 à 345 de la séquence ayant le numéro d'accession M58335 ou 32 à 342 de la séquence ayant le numéro d'accession D90208 pour le génotype Ib ; 44 à 354 des séquences ayant le numéro d'accession D14853 ou AY051292 pour le génotype Ic ; 43 à 353 des séquences ayant le numéro d'accession D00944 ou AB047639 pour le génotype 2a ; 44 à 354 des séquences ayant le numéro d'accession AB030907 ou D10988 pour le génotype 2b ; 43 à 353 de la séquence ayant le numéro d'accession D50409 pour le génotype 2c ; 44 à 354 de la séquence ayant le numéro d'accession AB031663 pour le génotype 2k ; 42 à 352 des séquences ayant le numéro d'accession D17763 ou D28917 pour le génotype 3a ; 42 à 352 de la séquence ayant le numéro d'accession D49374 pour le génotype 3b ; 42 à 352 de la séquence ayant le numéro d'accession D63821 pour le génotype 3k ; 1 à 308 de la séquence ayant le numéro d'accession AY859526 pour le génotype 6a ; 42 à 355 de la séquence ayant le numéro d'accession D84262 pour le génotype 6b ; 41 à 351 de la séquence ayant le numéro d'accession D84263 pour le génotype 6d ; 41 à 351 de la séquence ayant le numéro d'accession D63822 pour le génotype 6g ; 41 à 351 de la séquence ayant le numéro d'accession D84265 pour le génotype 6h ; 41 à 351 de la séquence ayant le numéro d'accession D84264 pour le génotype 6k.
Avantageusement, on entend « séquence 1RES du VHC », la séquence allant de la position 30 à 355 de l'ARN génomique (brin (+ )) du VHC, de préférence allant de la position 25 à 370 et de manière particulièrement préférée allant de la position 20 à 385 de l'ARN génomique (brin ( + ) ) du VHC .
Par séquence 1RES du VHC, on entend la séquence 1RES d'un ARN génomique (brin (+ ) ) d' un virus de l ' hépatite (VHC) de génotype 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, ou une séquence dérivée de celle-ci, de préférence la séquence 1RES de l'ARN génomique (brin (+)) d'un virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 1. Par séquence dérivée, on entend une séquence présentant une identité d'au moins 80% avec la séquence de la séquence 1RES de l'ARN génomique (brin (+) ) d'un virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, de préférence d'au moins 85%, notamment d'au moins 90%, et de manière particulièrement préférée d'au moins 95% d'identité.
De manière particulièrement préférée, la séquence 1RES du VHC correspond à la séquence allant de la position 30 à 355 de la séquence SEQ ID No : 1, de préférence allant de la position 25 à 370 et de manière particulièrement préférée allant de la position 20 à 386 de la séquence SEQ ID No :1 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.
Selon un mode de réalisation préférée, la molécule d'ARN simple brin selon l'invention comprend la séquence complémentaire de la séquence allant de la position 1 à
355 de l'ARN génomique (brin (+ )) du VHC, de préférence allant de la position 1 à 370 et de manière particulièrement préférée allant de la position 1 à 385 de l'ARN génomique (brin (+ )) du VHC.
Par séquence de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC, on entend la séquence d'un virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 , ou une séquence dérivée de celle-ci, de préférence on entend la séquence d'un virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 1.
Par séquence dérivée, on entend une séquence présentant une identité d'au moins 80% avec la séquence de l'ARN génomique (brin ( +)) d'un virus de l'hépatite C de génotype 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, de préférence d'au moins 85%, notamment d'au moins 90%, et de manière particulièrement préférée d'au moins 95% d'identité.
De préférence, la molécule d'ARN simple brin selon l'invention comprend la séquence complémentaire de la séquence allant de la position 1 à 355 de la séquence SEQ ID No : 1, de préférence allant de la position 1 à 370 et de manière particulièrement préférée allant de la position 1 à 386 de la séquence SEQ ID No : 1 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.
L'homme du métier pourra déterminer, sans difficulté et au regard de ses connaissances générales, les séquences d'acide nucléique des gènes suicides utilisables pour la molécule selon l'invention.
L'homme du métier pourra identifier simplement les gènes codant pour des protéines interférant avec la réplication du virus VHC au regard de ses connaissances générales. À titre d'exemple de protéines interférant avec la réplication du VHC, on peut citer l'interféron α, l'interféron β et l'interféron γ, de préférence l'interféron a et de manière particulièrement préférée l'interféron α 2a ou α 2b.
À titre d'exemple de gènes codant pour des protéines interférant avec la réplication d'un virus à ARN se répliquant grâce à une ARN polymérase ARN dépendante, en particulier du virus de l'hépatite C, on peut également citer les gènes codant pour un facteur régulateur d'interféron (IRF : « Interferon Regulating Factor »).
Par gène suicide, on entend un gène qui code pour un produit protéique qui induit la mort de la cellule en présence ou en l'absence de drogues.
Selon un mode de réalisation particulier, le gène suicide code pour une enzyme bactérienne ou virale induisant la mort de la cellule en présence d'une « drogue » spécifique.
Plus spécifiquement, lesdites enzymes convertissent la forme inactive d'une drogue (prodrogue) présente dans le milieu en sa forme active et toxique induisant la mort de la cellule, par exemple par une inhibition de la synthèse d'acide nucléique. L'homme du métier pourra identifier, sans difficulté et au regard de ses seules connaissances générales, les gènes suicides adaptés .
À titre d'exemple de tels gènes suicides, on peut citer, à titre non-limitatif, les gènes de la thymidine kinase de HSV (HSVltk) ou de la cytosine déaminase (CD), utilisés respectivement avec le Ganciclovir ou le 5-FU respectivement (cf. demande internationale PCT WO 2005/092374, pages 11 et 12).
Selon un autre mode de réalisation particulier, le gène suicide code pour une toxine protéique induisant la mort de la cellule.
À titre d'exemple de protéines utilisables, on peut citer les exotoxines bactériennes, les toxines fongiques, les toxines d'origine eucaryote, d'origine végétale ou d'origine virale ou des protéines dérivées de celles-ci.
Par protéine dérivée, on entend une protéine présentant une identité d'au moins 80% avec une exotoxine bactérienne, une toxine fongique, une toxine d'origine eucaryote, d'origine végétale ou d'origine virale, de préférence d'au moins 85%, notamment d'au moins 90%, et de manière particulièrement préférée d'au moins 95% d'identité.
Avantageusement encore, la toxine protéique induisant la mort de la cellule appartient à la famille RIP
(Ribosome-Inactivating Protein), lesquelles toxine protéiques existent dans de nombreuses espèces de plantes, de bactéries ou fongiques (VAN DAMME et al., CrIt. Rev.
Plant ScI., vol.20, p :395-465, 2001 ; SANDVIG and VAN DEURS, FEBS Lett. , vol.529, p :49-53, 2002). Les protéines de la famille RIP sont apparentées à la famille des lectines, mais leur toxicité est beaucoup plus importante que ces dernières. Les protéines de la famille RIP se divisent en deux types en fonction de leur structure moléculaire.
Le type I regroupe les protéines qui comportent une seule chaîne polypeptidique d'environ 30 kDa et sont dépourvues d'activité lectine permettant la fixation à la surface cellulaire, ce qui leur confère une faible toxicité.
Le type II regroupe les protéines comprenant deux chaînes polypeptidiques A et B aux propriétés distinctes. L'haptomère ou chaîne B (Binding), qui contient un domaine lectine, interagit avec un sucre ou un composé glycosylé de la surface de la cellule et facilite l'entrée de la chaîne A dans la cellule. L'effectomère, ou chaîne A (Activity) est porteuse de l'activité toxique. La mieux connue de ces toxines est la ricine (de Ricinus communis), mais d'autres phytotoxines telles que l'abrine (d'Abrus precatorius) , la modeccine (d'Adenai digitata), la volkensine (d'Adenia volkensii) et la viscumine (de Viscum album), possèdent les mêmes propriétés. Entrent également dans ce groupe certaines toxines bactériennes comme la Shiga toxine produite par shigella dysentria et des toxines apparentées (Shiga like toxins ou SLT) sécrétées par certaines souches d'Escherichia coli (STEC aussi appelées VTEC car cytotoxiques pour les cellules Vero) mais aussi Citrobacter freundii, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae et Enterobacter cloacae. Les RIPs de type 2 sont beaucoup plus efficaces que les RIPs de type 1 ; en effet, bien que puissants inhibiteurs de la synthèse protéique dans des préparations acellulaires, les RIPs de type 1 sont beaucoup moins toxiques chez la souris (DL50 de 1 à 40 mg/kg) que les RIP de type 2 (DL50 de la ricine :2μg/kg).
Avantageusement, le gène suicide code pour une toxine protéique de la famille RIP de type 2 ou une protéine dérivée, de préférence pour la chaîne A d'une toxine protéique de la famille RIP de type 2 comme la ricine, l'abrine, la modeccine, la volkensine, la viscumine et la Shiga toxine, et de manière particulièrement préférée pour la chaîne A de la ricine.
De manière particulièrement préférée, le gène suicide correspond à la séquence SEQ ID No : 2 ou à une séquence dérivée .
Par séquence dérivée, on entend une séquence présentant une identité d'au moins 80% avec la séquence
SEQ ID No :2, de préférence d'au moins 85%, notamment d'au moins 90%, et de manière particulièrement préférée d'au moins 95% d'identité.
L'homme du métier, au regard de ses connaissances générales pourra déterminer simplement la séquence d'acide nucléique complémentaire de la région 3' non-codante (3'UTR) de l'ARN génomique (brin (+)) d'un virus de l'hépatite C (VHC) d'un génotype donné, voir d'un sous- type donné. Les connaissances générales de l'homme du métier concernant le VHC et le positionnement de cette région sont notamment illustrées sur le site http : //euhcvdb. ibcp. fr/euHCVdb/ .
À titre d'exemple, la région 3'UTR va des nucléotides 9378 à 9646 de la séquence ayant le numéro d'accession AF009606 pour le génotype la ; 9443 à 9678 de la séquence ayant le numéro d'accession AB047639 pour le génotype 2a ; 9444 à 9654 de la séquence ayant le numéro d'accession AB030907 pour le génotype 2b ; 9403 à 9628 de la séquence ayant le numéro d'accession D84262 pour le génotype 6b ; 9381 à 9615 de la séquence ayant le numéro d'accession D84263 pour le génotype 6d ; 9387 à 9621 de la séquence ayant le numéro d'accession D84264 pour le génotype 6k.
Par région 3'UTR de l'ARN génomique (brin (+)) du VHC, on entend la région 3'UTR de l'ARN génomique d'un virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, ou une séquence dérivée de celle-ci, de préférence d'un virus de l'hépatite C de génotype 1.
Par séquence dérivée, on entend une séquence présentant une identité d'au moins 80% avec la séquence de la région 3'UTR de l'ARN génomique d'un virus de l'hépatite C de génotype 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, de préférence d'au moins 85%, notamment d'au moins 90%, et de manière particulièrement préférée d'au moins 95% d'identité.
De préférence, la séquence de la région 3'UTR de l'ARN génomique du VHC correspond à la séquence SEQ ID No : 3 ou à une séquence dérivée de celle-ci.
La molécule d'ARN simple brin selon l'invention peut être obtenue par des méthodes de synthèse chimique ou par des méthodes de biologie moléculaire, notamment par transcription à partir de matrices ADN ou de plasmides isolés à partir de microorganismes recombinants. De préférence, cette étape de transcription utilise des ARN polymérase de phage telles que l'ARN polymérase T7, T3 ou SP6.
Selon un second mode de réalisation préférée, la molécule d'ARN simple brin selon l'invention correspond à la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID No : 4 ou d'une séquence dérivée.
Par séquence dérivée, on entend une séquence présentant une identité d'au moins 80% avec la séquence
SEQ ID No :4, de préférence d'au moins 85%, notamment d'au moins 90%, et de manière particulièrement préférée d'au moins 95% d'identité.
Un second objet de l'invention correspond à une molécule d'ADN, de préférence d'ADN double brin, permettant la transcription de la molécule d'ARN simple brin décrite précédemment. Avantageusement, ladite molécule d'ADN comprend une séquence d'acide nucléique complémentaire à la séquence d'acide nucléique de la molécule d'ARN simple brin décrite précédemment, laquelle séquence d'acide nucléique complémentaire est liée de manière opérationnelle à une séquence d'acide nucléique permettant sa transcription dans une cellule eucaryote ou procaryote, de préférence eucaryote, et donc l'obtention de la molécule d'ARN simple brin décrite précédemment.
Ladite molécule d'ADN permet donc d'obtenir la molécule d'ARN simple brin correspondant à un ARN génomique chimère de polarité négative directement et sans passer par les étapes successives de transcription d'un ARN génomique chimère de polarité positive et de réplication de ce dernier.
Par une séquence d'acide nucléique permettant la transcription, on entend toute séquence de régulation de la transcription, comme une séquence promotrice ou activatrice, de préférence une séquence promotrice.
Ladite séquence promotrice peut correspondre, par exemple, à un promoteur cellulaire ou viral, et à un promoteur constitutif ou inductible. À titre d'exemple de promoteurs constitutifs de mammifères, on peut citer, à titre non-limitatif, les promoteurs des gènes suivants : hypoxanthine phosphoribosyl transférase (HPTR), adénosine déaminase, pyruvate kinase, β-actine, créatine kinase du muscle et facteur d'élongation humain. À titre d'exemple de promoteurs viraux présentant une expression constitutive dans les cellules de mammifères, on peut citer, à titre non-limitatif, les promoteurs des virus suivants : SV40, papilloma virus, adénovirus, virus de l'immunodéficience humaine (HIV), cytomégalovirus (CMV), virus du sarcome de Rous (RSV), virus de l'hépatite B (HBV). D'autres promoteurs constitutifs sont bien connus de l'homme du métier. Des séquences promotrices utiles incluent également les promoteurs inductibles et permettant une transcription consécutivement à l'addition d'un agent induetible. À titre d'exemple, on peut citer les promoteurs des gènes de la famille des métallothionines dont la transcription est induite en présence de certains ions métalliques. D'autres promoteurs inductibles pourront être simplement identifiés par l'homme du métier au regard de ses connaissances générales .
En général, la séquence promotrice inclut des séquences 5' non transcrites impliquées dans l'initiation de la transcription comme une boîte TATA (TATA box).
Un autre objet de l'invention consiste en un vecteur d'acide nucléique comprenant une molécule d'acide nucléique telle que décrite précédemment, notamment une molécule d'ARN ou d'ADN.
Par « vecteur d'acide nucléique », on entend tout support permettant de faciliter le transfert desdites molécules d'ARN ou d'ADN dans les cellules, de préférence dans les cellules potentiellement infectées par le virus de l'hépatite C. De préférence, le vecteur selon l'invention permet de transporter lesdites molécules d'acide nucléique en limitant la dégradation de celles-ci par rapport à leur transport en l'absence de vecteur. Le vecteur comprend éventuellement les séquences promotrices décrites précédemment. À titre d'exemple de vecteurs utilisables, on peut citer, à titre non-limitatif , les plasmides, les phagemides, les virus et d'autres vecteurs dérivés d'origine virale ou bactérienne. Des vecteurs viraux préférés incluent les adénovirus (modifiés), lesquels sont capables d'infecter un très grand nombre d'espèces et de types cellulaires, les lentivirus (modifiés notamment par une modification de la protéine d'enveloppe de sorte d'obtenir le tropisme recherché) ou les virus de l'hépatite A et B (modifiés) lesquels sont capables d'infecter spécifiquement les cellules hépatiques. Des vecteurs non-viraux préférés incluent les vecteurs plasmidiques, lesquels sont décrits de façon extensive dans l'art antérieur (voir notamment SlVNBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Les plasmides peuvent être administrés par de multiples voies, notamment topique ou parentérale. Par exemple, les plasmides peuvent être injectés par voie intramusculaire, intradermique, intrahépatique ou sous-cutanée.
Le vecteur d'acide nucléique selon l'invention peut comprendre des marqueurs de sélection actifs dans les cellules eucaryotes et/ou procaryotes.
Un autre objet de l'invention consiste en une composition pharmaceutique comprenant une molécule d'acide nucléique, ARN ou ADN, ou un vecteur tel que décrit précédemment.
Avantageusement, ladite composition pharmaceutique comprend un support pharmaceutiquement acceptable.
À titre de support pharmaceutiquement acceptable, la compositions selon l'invention peut comprendre des émulsions, des microémulsions, des émulsions huile-dans- eau ou eau-dans-huile, ou d'autres types d'émulsion. La composition peut également comprendre un ou plusieurs additifs, tels que des diluants, des excipients ou des stabilisateurs (voir notamment ϋllmann's Encyclopedia of Industr±al Chemistry, 6th Ed., 1989-1998, Marcel Dekker; ANSEL et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, WILLIAMS & WILKINS, 1994).
La composition peut comprendre de l'eau ou un tampon de solubilisation, lesquels tampons incluent, à titre non limitatif, tampon salin phosphate (PBS), le tampon salin phosphate sans Ca++/Mg++, le sérum physiologique (150 mM
NaCl dans de l'eau) ou les tampons Tris.
Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation d'une molécule d'acide nucléique ou d'un vecteur tels que décrits précédemment pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à traiter un virus à ARN se répliquant grâce à une ARN polymérase ARN dépendante chez un patient.
Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation d'une molécule d'acide nucléique ou d'un vecteur tels que décrits précédemment pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à traiter une infection par le virus de l'hépatite C (VHC) chez un patient.
Par « patient », on entend un mammifère, de préférence un homme.
La composition selon l'invention pourra être administrée dans une quantité thérapeutiquement efficace par voie topique ou parentérale, notamment par injection intramusculaire, intradermique, intra-hépatique ou sous- cutanée, de préférence par injection intra-hépatique.
L'administration de la composition selon l'invention peut être effectuée par des méthodes de transfert de gènes connues dans l'homme du métier.
Des méthodes communes de transfert de gène incluent le phosphate de calcium, le DEAE-Dextran, l'électroporation, la microinjection, les méthodes virales et les liposomes cationiques (GRAHAM et VAN DER EB, Virol., vol.52, p :456, 1973 ; McCUTHAN et PAGANO, J. Natl. Cancer Inst. , vol.41, p :351, 1968 ; CHU et al., Nucl. Acids Res., vol. 15, p :1311 ; FRALEY et al., J. Biol. Chem. , vol.255, p : 10431, 1980 ; CAPECCHI et al.f CeIl, vol. 22, p :479, 1980 ; FELGNER et al. , Proc. Natl. Acad. ScI. USA, vol.84, p :7413, 1988).
Une quantité efficace de molécules d'acides nucléiques à administrer à un patient peut être déterminée simplement par l'homme du métier. À titre d'exemple, une quantité efficace de molécules d'acides nucléiques est comprise entre 0,001mg et 10g/kg du patient à traiter, de préférence entre 0,01mg et lg/kg, et de manière particulièrement préférée entre 0,1 et lOOmg/kg.
D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent, sans pour autant que ceux- ci ne constituent une quelconque limitation de l'invention.
EXEMPLES
1) Construction d'un système cellulaire permettant l'expression d'ARN génomique dérivés du VHC.
Afin d'analyser le potentiel réplicatif d'ARN génomique chimères selon l'invention, un système cellulaire qui synthétise de façon constitutive le complexe de réplication du VHC a été développé en insérant les protéines non-structurales du VHC (NS3-NS5B) dans le génome des cellules de la lignée cellulaire d'hépatome Huh7.
Pour cela, un vecteur pcDNA3.1/NS3-5B(2884R/G) codant pour lesdites protéines non structurales a été construit comme suit :
• les gènes codant pour les protéines non-structurales couvrant NS3 à NS5B ont été amplifiés à partir de l'isolât infectieux J4L6 du VHC, souche de génotype la (YANAGI et al., Virology, vol.244(l), p : 161-72, 1998) en utilisant la polymérase Herculase® (STRATAGENE) et les amorces NS3-Start (SEQ ID No 5 : ACACACTGGCCAATGGCGCCCATCACGGCCTACTCC) et NS5B-stop (SEQ ID No 6 : GTGTGTTCTAGATCATCGGTTGGGGAGCAGGTA) .
• Le fragment NS3-5B a ensuite été inséré entre les sites EcoRV et Xbal du plasmide pcDNA3.1 (INVITROGEN), produisant ainsi le vecteur pcDNA3.1/NS3-5B.
• Une mutation du résidu GIy en Arg à la position 2884 (PIETSCHMANN et al.) a ensuite été introduit par mutagenèse directe en utilisant les amorces NS5B2884S (SEQ ID No 7 : TCATTGAAGGGCTCCATGGTCTTAGCGCATTTACAC) et NS5B2884AS (SEQ ID No 8 : TAAGACCATGGAGCCCTTCAATGATCTGAGGTAGGTC) et l'ADN polymérase Taq Phusion® (OZYME). La réaction de PCR a été réalisée sur le vecteur pcDNA3.1/NS3-5B, le produit PCR obtenu a ensuite été digéré par l'enzyme Dpn I (PROMEGA) et directement amplifié en culture de bactéries E. coli DH5α. Finalement, le plasmide pcDNA3.1/NS3-5B(2884R/G) contenant la séquence mutée a été sélectionnée par séquençage.
Un million de cellules Huh7 ont donc été transfectées par 2,5μg du plasmide vecteur ρcDNA3.1/NS3-5B(2884R/G) en utilisant la lipofectine® additionnée de réactif + (INVITROGEN) suivant les instructions du fournisseur.
Les cellules ont ensuite été cultivées dans du milieu de Dulbecco modifié supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (SVF ; inactivé par la chaleur) et de l'antibiotique G418 (lmg/ml) à 370C sous atmosphère 5 % de CO2.
L'expression du plasmide pcDNA3.1/NS3-5B(2884R/G) a ensuite été analysée par la technique de Western Blot chez les différents clones résistants à l'antibiotique G418 (Huh7/NS3-5B) .
Les résultats ont montré que la protéine NS5B était constitutivement exprimée et présentait le poids moléculaire attendu, indiquant que la polyprotéine NS3-5B a été correctement maturée par la protéase NS3. 2) Capacité de réplication d'un ARN génomique minimal de polarité négative dérivé du VHC dans la lignée cellulaire Huh7/NS3-5B :
2-1 : Construction d'un ARN génomique minimal de polarité négative dérivé du VHC :
Afin d'évaluer l'activité de réplication de la lignée cellulaire Huh7/NS3-5B, une séquence minimale de réplication nommée 5UTR-H2AE-3UTR a été construite.
Cette séquence 5UTR-H2AE-3UTR est constituée de la région 5'UTR du VHC, d'une séquence codant pour une polyprotéine constituée des séquences de la protéine de résistance à l'hygromycine, de la protéine 2A du virus de la fièvre aphteuse (FMDV) et de la protéine EGFP, suivie de la région 3 'NC du VHC, a été construite.
La construction du vecteur codant pour la séquence 5UTR-H2AE-3UTR a été effectuée en deux étapes:
Étape 1 ; La construction du plasmide vecteur pGEM- T/5UTR-EGFP-3UTR (figure IA) a été effectuée par amplification des régions 5'UTR et 3'UTR (ou région non codante), provenant respectivement de l'isolât conl et de la souche H77, et du gène de la EGFP (enhanced green fluorescent protein ou protéine de fluorescence verte amplifiée). La séquence 5 'NC, étendue aux 27 premiers nucléotides codant pour la protéine de capside (protéine C), a été amplifiée à l'aide des amorces 5NC~Start (SEQ ID No 9 : GCCAGCCCCCGATTGGGGGCG) et 5NC-Bam (SEQ ID No 10 : ATAGGATCCGGTGTTACGTTTGGTTTTTC) et de l'isolât conl en tant que matrice (EMBL X61596), la séquence EGFP a été amplifiée par la polymérase Taq Gold® (ROCHES) à l'aide des amorces EGFP-Bam (SEQ ID No 11
TATGGATCCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG) et EGFP-Xba (SEQ ID No 12 : CGCTCAGTTGGAATTCTAGAGTC). Les fragments obtenus ont ensuite été clivés par l'enzyme de restriction Bam HI, ligaturés à l'aide de l'ADN ligase T4 (PROMEGA) à 16°C durant la nuit, puis amplifiés à nouveaux avec les amorces 5NC-Start (SEQ ID No : 9) et EGFP-Xba (SEQ ID No : 12), générant ainsi le fragment 5UTR-EGFP. La région 3 'NC a été obtenue par réaction de polymérase en chaîne (PCR) en utilisant les amorces 3NC-Xba (SEQ ID No 13 : ATATATTCTAGAACGGGGAGCTAAACACTCCAG) et 3NC-StOp (SEQ ID No 14 : ACTTGATCTGCAGAGAGGCCAG) de la souche VHC H77 (EMLB AF011753). Le produit d'amplification et le fragment 5UTR- EGFP ont été digérés par l'enzyme Xbal, ligaturés dans les conditions décrites précédemment et le produit de ligation obtenu a été amplifié à l'aide des amorces 5NC-Start et 3NC-stop. Finalement, le fragment résultant à été inséré dans le plasmide vecteur pGEM-T (PROMEGA), produisant le vecteur pGEM-T/5UTR-EGFP-3UTR. La séquence du vecteur pGEM-T/5NC-EGFP-3NC obtenu a été confirmée par séquençage.
Étape 2 ; La construction du plasmide pGEM-T/5UTR-H2AE- 3UTR (voir figure IB) a été effectuée par l'insertion de la séquence de l'hygromycine phosphotransférase (HygroR) et de la séquence codant pour- la protéine 2A du virus de la fièvre aphteuse (FMDV pour Foot and Mouth Disease Virus) entre la région 5'UTR et la séquence EGFP du vecteur pGEM-T/5UTR-EGFP-3UTR.
La séquence de l'hygromycine a été obtenue par une amplification par PCR du plasmide vecteur psiSTRIKETM (PROMEGA) à l'aide des amorces Hygro-Bam (SEQ ID No 15: ATATATGGATCCAAAAAGCCTGAACTCACCGCG) et Hygro2A-Bam (SEQ ID No 16: ATATATGGATCCGGGCCCAGGGTTGGACTCGACGTCTCCCGCAAGCTTAAG AAGTTCCTTTGCCCTCGGACGAG) ; laquelle amorce Hygro2A-Bam comprend les 42 nucléotides de la séquence de protéine 2A. Le produit d'amplification obtenu a alors été inséré au site BamHI du plasmide pGEM-T/5UTR-EGFP-3UTR, pour obtenir le vecteur pGEM-T/5UTR-H2AE-3UTR. Finalement, la séquence du vecteur ρGEM-T/5UTR-H2AE-3UTR obtenu a été confirmée par séquençage.
Le promoteur du phage T7 nécessaire à la transcription a été introduit par PCR. Afin de transcrire le brin ( + ) les amorces T7-5UTR (SEQ ID No 17 : TAATACGACTCACTATAGGGCCAGCCCCCTGATGGGGGCG) et 3UTR-STOP (SEQ ID NO 18 :ACTTGATCTGCAGAGAGGCCAG) ont été utilisées. Afin de transcrire le brin(-) les amorces T7-3UTR (SEQ ID NO 19 : TAATACGACTCACTATAGGACTTGATCTGCAGAGAGGCCAG) et 5UTR-Start (SEQ ID No 20 : GCCAGCCCCCGATTGGGGGCG) ont été utilisées. Finalement, l'ARN génomigue minimal de polarité négative a été obtenu par transcription de lμg de produit de PCR à l'aide de polymérase T7 (PROMEGA) en suivant les instructions du fabriquant. Finalement, les ARN ont été purifiés à l'aide d'un kit RNeasy® (QIAGEN) en suivant les instructions du fabricant.
2-2 : Réplication de 1 'ARN génomigue minimal dérivé de polarité négative du VHC dans la lignée cellulaire Huh7/NS3-5B :
Des plaques de culture 24 puits ont été ensemencées à raison' de 105 cellules Huh7/NS3-5B par puits et incubées 24 heures à 37°C. Les cellules obtenues ont alors été transfectées à l'aide de lμg de transcrits 5UTR-H2AE-3UTR de polarité positive mélangé à 3μl de DMRIE-C (INVITROGEN) selon les recommandations du fournisseur. Les cellules ainsi transfectées ont été cultivées en présence de différentes concentrations d'hygromycine pour sélectionner les cellules répliquant le transcrit transfecté.
La multiplication cellulaire en présence de différentes concentrations d'hygromycine et l'activité réplicative des mini-génomes ont été analysées simultanément durant un mois .
À intervalles réguliers, des cellules Huh7/NS3-5B transfectées ou non par les transcrits 5UTR-H2AE-3UTR et en présence de différentes concentrations d'hygromycine ont été trypsinées et remises en suspension à une concentration de 0,5.106 à 1.106 cellules/ml en tampon phosphate 2mM EDTA. Les suspensions de cellules obtenues ont alors été analysées par cytométrie de flux à 488 nm pour détecter l'expression de l'EGFP et à l'aide d'un appareil FACS Calibur® (BECKTON).
La figure 2A montre le pourcentage de cellules transfectées fluorescentes Huh7 (rayés), Huh7/NS3-5B (noir) et Huh7/Rep5.1 (gris, cf.3) 24, 48 et 72 heures après transfection.
La figure 2B montre l'index de fluorescence correspondant au rapport de fluorescence entre les cellules transfectées Huh7 et Huh7/NS3-5B (noir), et entre les cellules transfectées Huh7 et Huh7/Rep5.1 (gris, cf .3) .
Les résultats ont montré que le pourcentage de cellules montrant une résistance à l'hygromycine est corrélé au pourcentage de cellules exprimant l'EGFP (figures 2A et
2B), lesquels pourcentages augmentent conjointement durant le mois de culture.
En conclusion, les cellules de la lignée cellulaire Huh7/NS3-5B, lesquelles expriment de manière constitutive la polyprotéine NS3-NS5B, permettent la production d'un complexe de réplication efficace pour la réplication du mini-génome .
3) Capacité de réplication de l'ARN génomique minimal de polarité négative dérivé du VHC dans une lignée cellulaire infectée;
Le modèle d'étude actuellement utilisé pour étudier la réplication dans des cellules infectées est celui des réplicons. Dans le cadre de cette analyse, nous avons utilisé des cellules de la lignée cellulaire Huh7 exprimant le réplicon Rep5.1 du VHC de génotype Ib (Cellules Huh7/Rep5.1 ; KRIEGER et al., J. Virol., vol.75, p .4614-4624). Des cellules huh7/Rep5.1 et Huh7 ont été transfectées par lμg de transcrits 5UTR-H2AE-3UTR de polarité positive selon le protocole décrit en 2-2.
L'expression de la protéine EGFP a été analysée après 24, 48 et 72 heures par cytométrie de flux (figure 2A).
Afin de prendre en compte les variations d'efficacité de traduction, l'expression de la protéine EGFP est représentée comme le pourcentage d'expression de l'EGFP par les cellules Huh7/rep5.1 par rapport au niveau d'expression des cellules Huh7.
Les résultats montrent que la production de protéine EGFP décroît après 48 heures de culture (figure 2A), ce qui suggère la dégradation des transcrits par les cellules. Cependant, cette diminution est plus faible dans le cas des cellules Huh7/Rep5.1 et Huh7/NS3-5B par rapport aux cellules Huh7 ce qui suggère la réplication des ARN par le complexe de réplication du VHC.
Les résultats obtenus concernant le niveau d'expression de l'EGFP dans les cellules Huh7/Rep5.1 ou Huh7/NS3-5B ont été normalisés par rapport au niveau d'expression de l'EGFP obtenu dans les cellules Huh7 (100% ; figure 2B). Les valeurs supérieures à 100% indiquent que la dégradation observée dans les cellules Huh7 est compensée par la réplication de l'ARN génomique minimal dans les cellules Huh7/Rep5.1 et Huh7/NS3-5B, suggérant que le complexe de réplication issu du réplicon fonctionne efficacement. Les résultats montrent en outre que le niveau d'expression de l'EGFP augmente durant les trois premiers jours de 206 à 238% dans les cellules exprimant le réplicon, alors que dans les cellules Huh7/NS3-5B, le niveau d'expression augmente les deux premiers jours de 123 à 203%, puis diminue le troisième jour.
Dans la mesure où les cellules Huh7/Rep5.1 sont cultivées sous pression de sélection à l'opposé des cellules Huh7/NS3-5B, la différence d'expression de l'EGFP entre ces deux lignées cellulaires reflète vraisemblablement une permissivité cellulaire moindre des cellules Huh7/NS3-5B en absence préalable de pression de sélection.
En conclusion, les résultats montrent que l'ARN génomique minimal se réplique efficacement dans les deux lignées cellulaires Huh7/Rep5.1 et Huh7/NS3-5B testées, lesquelles expriment un complexe de réplication du VHC de génotype Ib .
4) Evaluation de l'efficacité d'un vecteur suicide correspondant à un ARN qénomique minimal
Les expériences précédentes ont montré que des ARN génomiques de polarité négative dérivés du VHC étaient capables de se répliquer dans les cellules hébergeant un réplicon. Afin de tester la capacité d'un tel ARN génomique de polarité négative à détruire les cellules infectées par le VHC, un ARN génomique chimère a été construit comme précédemment dans lequel le transgène correspondait, non pas à l'EGFP, mais au gène codant pour la chaîne A de la ricine encadré par les régions 5'UTR et 3'UTR du VHC (5UTR-Ric-3UTR) .
Le gène de la chaîne A de la ricine a été choisi comme gène suicide sur la base de sa forte toxicité vis-à-vis des ribosomes eucaryotes des cellules cibles infectées par le VHC (EIKLID et al. , Exp. CeIl. Res., vol.126(2), p : 321-6, 1980 ; OLSNES and KOZLOV, Toxicon, vol.39 (11), p :1723-1728, 2001), et pour sa non diffusivité en l'absence de la chaîne B, préservant ainsi les cellules environnantes saines qui n'expriment pas le complexe de réplication du VHC.
4-1 : Construction d'un vecteur suicide correspondant à un ARN génomique minimal de polarité négative dérivé du VHC : Le plasmide vecteur pGEM-T/5UTR-RiC-3UTR a été construit comme suit :
• Le gène codant pour la chaîne A de la ricine a été obtenu par amplification PCR en utilisant les amorces Ric_Start (SEQ No 21 :
CACACAGGATCCATATTTCCCAAACAATACCCAATC et Ric_stθp (SEQ No 22 : ATATATTCTAGATTACTAAAACTGTGAGCTCGG) .
• Le gène codant pour la chaîne A de la ricine a été introduit dans le plasmide pGEM-T/5UTR-EGFP-3UTR en échangeant le gène de l'EGFP par celui de la chaîne A de la ricine aux sites BamHI et Xbal, produisant le plasmide pGEM-T/5UTR-Ric-3UTR (figure IC). Le promoteur du phage T7 nécessaire à la transcription a été introduit par PCR. Afin de transcrire le brin (+) les amorces T7-5UTR (SEQ ID No 17) et 3UTR-ST0P (SEQ ID No 18) ont été utilisées. Afin de transcrire le brin(-) les amorces T7-3UTR (SEQ ID No 19) et 5UTR- Start (SEQ ID No 20) ont été utilisées.
Finalement, l'ARN génomique minimal de polarité négative a été obtenu par transcription de lμg de produit de PCR à l'aide de polymérase T7 (AMBION) en suivant les instructions du fabriquant.
L'ARN génomique minimal de polarité négative obtenu est constitué, en partant de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3 ' , par les séquences complémentaires de : la région 3 ' non-codante du VHC (3'UTR), de la séquence de la ricine A, des 27 premiers nucléotides de la séquence codant pour la protéine capside, et enfin de la région 5' non-codante du VHC.
Un ARN génomique minimal de polarité positive a également été produit suivant le même protocole et de transcription in vitro avec la polymérase T3 (AMBION) en suivant les instructions du fabricant. La figure 3 montre la séquence de l'ARN génomique de polarité positive avec la séquence de la chaîne A de la ricine (souligné), encadrée par les sites de clonage (gras et italique) et les régions 5'UTR (haut) et 3'-UTR (bas).
4-2 : Réplication du vecteur suicide dans les lignées cellulaires Huh7/Rep5.1 (modèle pour les cellules infectées) et Huh7/NS3-5B :
Des cellules Huh7/Rep5.1 et Huh7/NS3-5B ont été transfectées par l'ARN génomique minimal de polarité négative obtenu en 4-1 selon le protocole décrit en 2-2.
À titre de contrôle, des cellules Huh7 ont été transfectées par l'ARN génomique minimal de polarité négative obtenu en 4-1 selon le même protocole.
Également à titre de contrôle, les mêmes expériences de transfection ont été effectuées avec l'ARN génomique minimal de polarité positive obtenu en 4-1
Dans le cas où ledit ARN génomique minimal de polarité négative serait répliqué par l'ARN polymérase ARN dépendante du virus de l'hépatite C en un brin de polarité positive, on obtiendrait alors la production de Ricine (chaîne A) grâce à la séquence 1RES présente au sein de la région 5'UTR du VHC et présente dans le brin de polarité positive.
La figure 4 montre la cytotoxicité 48 heures après transfection de cellules Huh7, Huh7/Rep5.1 ou Huh7/NS3-5B par de l'ARN génomique minimal de polarité négative (noir) ou positive (gris).
Les résultats montrent que la transfection dudit ARN génomique minimal de polarité négative induit la mort des cellules Huh7/Rep5.1 (38%) et Huh7/NS3-5B (36%), alors que les cellules Huh7 ne sont que faiblement affectées par ledit ARN génomique minimal de polarité négative (4% de cellules mortes) (figure 4). La figure 5 correspond à la normalisation du pourcentage de cytoxicité de l'ARN génomique minimal de polarité négative en prenant comme référence de transfection (100%) le pourcentage de cytoxicité de l'ARN génomique minimal de polarité positive.
La normalisation des résultats montre que l'ARN génomique minimal de polarité négative induit la mort de
59% des cellules Huh7/Rep5.1 transfectées et de 54% des
Huh7/NS3-5B transfectées, alors que seules 9% cellules Huh7 infectées sont affectées (figure 5).
En conclusion, les résultats montrent que le vecteur suicide développé, correspondant à une molécule d'ARN dérivée du VHC et de polarité négative, est efficace pour cibler et détruire les cellules exprimant les complexes de réplication du VHC de génotype Ib.
Les inventeurs ont également pu montrer que le même vecteur suicide développé est efficace pour cibler et détruire (à près de 90%) des cellules Huh7 infectées par un virus du VHC de génotype 2a (JFH-I, ZHONG et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.102 (26), p : 9294-9, 2005).
5) Évaluation de l'efficacité d'un vecteur stimulant la réponse cellulaire antivirale correspondant à un ARN génomique minimal
Afin de tester la capacité d'un tel ARN génomique de polarité négative à induire une réponse antivirale, un ARN génomique chimère a été construit comme décrit précédemment, dans lequel le transgène correspondait au gène codant soit pour l'interféron alpha (IFN-α), soit pour l'Interferon Regulatory Factor (IRF-I) par les régions 5'UTR et 3'UTR du VHC (5UTR-Ric-3UTR) .
5-1 : Construction d'un vecteur correspondant à un ARN génomique minimal de polarité négative dérivé du VHC : Les plasmides vecteurs pGEM-T/5UTR-IFN-3UTR et pGEM- T/5UTR-IRF1-3UTR ont été construits comme suit :
Le gène codant pour l'IFN-α a été obtenu par amplification PCR en utilisant les amorces IFN-Bam (SEQ ID No 23 : ATATATGGATCCGCCCTGTCCTTTTCTTTACTGATGG) et IFN-Xba (SEQ ID NO 24 : ATATATTCTAGATCAATCCTTCCTCCTTAATATTTTTTGC ) .
Le gène codant pour l' IRF-I a été obtenu par amplification PCR en utilisant les amorces IRFl-Bam (SEQ ID No 25 : ATATATGGATCCCCCATCACTCGGATGCGCATG) et IRFl-Xba (SEQ ID No 26 : ATATATTCTAGACTACGGTGCACAGGGAATGGC) .
Les gènes codant pour l'IFN-α et l' IRF-I ont été introduits dans le plasmide pGEM-T/5UTR-EGFP-3UTR aux sites BamHI et Xbal, produisant le plasmide pGEM-T/5UTR- IFNα-3UTR et pGEM-T/5UTR-IRFl-3UTR. Le promoteur du phage T7 nécessaire à la transcription a été introduit par PCR. Afin de transcrire le brin (+) les amorces T7-5UTR (SEQ ID No 17) et 3UTR-ST0P (SEQ ID No 18) ont été utilisées. Afin de transcrire le brin (-) les amorces T7-3UTR (SEQ ID No 19) et 5UTR-Start (SEQ ID No 20) ont été utilisées.
Finalement, l'ARN génomique minimal de polarité négative a été obtenu par transcription de 1 μg de produit de PCR à l'aide de polymérase T7 (AMBION) en suivant les instructions du fabriquant.
L'ARN génomique minimal de polarité négative obtenu est constitué, en partant de l'extrémité 5' vers l'extrémité
3 ' , par les séquences complémentaires de : la région 3 ' non-codante du VHC (3'UTR), de la séquence de l'IFN-α ou de
1' IRF-I, des 27 premiers nucléotides de la séquence codant pour la protéine capside, et enfin de la région 5' non- codante du VHC.
Un ARN génomique minimal de polarité positive a également été produit suivant le même protocole et de transcription in vitro avec la polymérase T3 (AMBION) en suivant les instructions du fabricant. 5-2 : Réplication du vecteur stimulant la réponse cellulaire antivirale dans les lignées cellulaires Huh7/Rep5.1 (modèle pour les cellules infectées) :
Des cellules Huh7/Rep5.1 ont été transfectées par l'ARN génomique minimal de polarité négative obtenu en 5-1 selon le protocole décrit en 2-2.
À titre de contrôle, des cellules Huh7/Rep5.1 ont été transfectées par l'ARN génomique minimal 5UTR-EGFP-3UTR, de polarité positive obtenu en 2-1, étape 1 selon le même protocole.
Également à titre de contrôle, les mêmes expériences de transfection ont été effectuées avec l'ARN génomique minimal de polarité positive obtenu en 5-1
Dans le cas où ledit ARN génomique minimal de polarité négative serait répliqué par l'ARN polymérase ARN dépendante du virus de l'hépatite C en un brin de polarité positive, on obtiendrait alors la production d'IFN-α ou d' IRF-I grâce à la séquence 1RES présente au sein de la région 5'UTR du VHC et présente dans le brin de polarité positive.
La figure 6 montre les effets des minigénomes IFN et
IRF sur le réplicon Rep 5.1. Les cellules Huh7/Rep5.1 ont été transfectées par les ARN génomiques minimaux de polarité positive (+) ou négative (-) exprimant l'IFNα ou 1' IRF-I.
La figure 6A illustre le nombre de copies d'ARN du réplicon mesuré par RT-PCR quantitative en temps réel rapporté par μg d'ARN total après 48 heures de culture. L'ARN génomique minimal 5UTR-EGFP-3UTR a été transfecté comme témoin. Cent UI d'IFN-α ont été ajoutés à la culture cellulaire (IFN 100UI) en tant que témoin positif.
La figure 6B illustre le pourcentage d'inhibition de la réplication du réplicon Rep 5.1 calculé en prenant l'ARN génomique minimal 5UTR-EGFP-3UTR comme témoin de réplication.
Les résultats montrent que la transfection desdits ARN génomiques minimaux de polarité négative réduit le nombre de copies d'ARN génomique du réplicon de 86% pour l'ARN(+) exprimant l'IFN-α, 62% pour l'ARN(-) exprimant l'IFN-α, de 83% pour l'ARN(+) exprimant l' IRF-I et de 60% pour l'ARN(- ) exprimant l' IRF-I (Figure 6B).
En conclusion, les résultats montrent que les vecteurs stimulant la réponse cellulaire antivirale, correspondant à une molécule d'ARN dérivée du VHC et de polarité négative, sont efficaces pour cibler les cellules exprimant le complexe de réplication du VHC et réduire le nombre d'ARN génomique du réplicon.

Claims

REVENDICATIONS
1. Une molécule d'ARN simple brin, qui comprend en partant de l ' extrémité 3 ' vers l ' extrémité 5 ' :
(i) une séquence d'acide nucléique complémentaire de tout ou partie de la région 5' non-codante (5'UTR) de l'ARN brin (+) d'un virus à ARN se répliquant grâce à une ARN polymérase ARN dépendante laquelle séquence d'acide nucléique complémentaire permet la réplication de ladite molécule d'ARN simple brin par le complexe de réplication dudit virus ;
(ii) éventuellement, la séquence d'acide nucléique complémentaire d'une séquence d'acide nucléique correspondant à un site d'entrée interne du ribosome (1RES) ;
(iii) la séquence d'acide nucléique complémentaire de la séquence d'acide nucléique d'un gène suicide ou d'un gène codant pour une protéine interférant avec la réplication dudit virus ; et
(iv) éventuellement, une séquence d'acide nucléique complémentaire à la région 3' non-codante (3'UTR) de l'ARN dudit virus.
2. Une molécule d'ARN simple brin selon la revendication 1, dans laquelle ledit virus à ARN se répliquant grâce à une ARN polymérase ARN dépendante est choisi dans le groupe comprenant : la famille des Flaviviridaes, des Cystoviridaes, des Birnaviridaes, Reoviridaes, des Coronaviridaes , des Togaviridaes , des Arterivirus, des Astroviridaes, des Caliciviridaes, des Picornaviridaes, des Potyviridaes, des Orthomyxoviridaes, des Filoviridaes, des Paramyxoviridaes , des Rhabdoviridaes , des Arenaviridaes et des Bunyaviridaes .
3. Une molécule d'ARN simple brin selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle ledit virus à ARN se répliquant grâce à une ARN polymérase ARN dépendante est choisi dans le groupe comprenant : le virus de la Dengue, le virus de la fièvre jaune, le virus de l'Ouest du Nil et le virus de la diarrhée bovine.
4. Une molécule d'ARN simple brin, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend en partant de l'extrémité 3' vers l'extrémité 5' :
(i) une séquence d'acide nucléique complémentaire à tout ou partie de la région 5' non-codante (5'UTR) de l'ARN génomique (brin (+) ) du virus de l'hépatite C, laquelle séquence d'acide nucléique complémentaire permet la réplication de ladite molécule d'ARN simple brin par le complexe de réplication du virus de l'hépatite C;
(ii) la séquence d'acide nucléique complémentaire d'une séquence d'acide nucléique correspondant à un site d'entrée interne du ribosome (1RES);
(iii) la séquence d'acide nucléique complémentaire de la séquence d'acide nucléique d'un gène suicide ou d'un gène codant pour une protéine interférant avec la réplication du virus de l'hépatite C ; et
(iv) éventuellement, une séquence d'acide nucléique complémentaire à la région 3' non-codante (3'UTR) de l'ARN génomique du virus de l'hépatite C.
5. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 4, dans laquelle ladite séquence d'acide nucléique complémentaire comprend au moins la séquence complémentaire d'une séquence comprenant les domaines tige-boucle I et II (5'UTR-dI et 5' UTR-dll) de ladite région 5'UTR, de préférence au moins la séquence complémentaire d'une séquence comprenant les domaines tige-boucle I, II et III (5'UTR-dI, 5' UTR-dll et 5' UTR- dlll) de ladite région 5'UTR.
6. La molécule d'ARN simple brin selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5, dans laquelle ladite séquence d'acide nucléique complémentaire comprend au moins la séquence complémentaire de la séquence allant de la position 1 à 120 de l'ARN génomique (brin (+)) du virus de l'hépatite C, de préférence allant de la position 1 à 150 et de manière particulièrement préférée allant de la position 1 à 341 de l'ARN génomique (brin (+)) du virus de l'hépatite C.
7. La molécule d'ARN simple brin selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, dans laquelle ladite région 5'UTR correspond à la région 5'UTR de l'ARN génomique d'un virus de l'hépatite C de génotype 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, ou à une séquence dérivée de celle-ci, de préférence à la région 5'UTR de l'ARN génomique d'un virus de l'hépatite C de génotype 1.
8. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 6, dans laquelle ladite séquence d'acide nucléique complémentaire comprend au moins la séquence complémentaire de la séquence allant de la position 1 à 120 de la séquence SEQ ID No : 1, de préférence allant de la position 1 à 150 et de manière particulièrement préférée allant de la position 1 à 341 de la séquence SEQ ID No :1 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.
9. La molécule d'ARN simple brin selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle la séquence d'acide nucléique correspondant à un site d'entrée interne du ribosome (1RES) est d'origine eucaryote ou d'origine virale.
10. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 9, dans laquelle la séquence d'acide nucléique correspondant à un site d'entrée interne du ribosome (1RES) est d'origine virale , de préférence à la séquence 1RES du virus de l'hépatite C, laquelle comprend les domaines tige-boucle II à IV (5'UTR-dII à 5' UTR-dIV) de la région 5'UTR de l'ARN génomique (brin ( + )) du virus de l'hépatite C.
11. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 10, dans laquelle la séquence 1RES est la séquence 1RES du virus de l'hépatite C et en ce qu'elle comprend la séquence allant de la position 30 à 355 de l'ARN génomique (brin ( + )) du virus de l'hépatite C, de préférence allant de la position 25 à 370 et de manière particulièrement préférée allant de la . position 20 à 385 de l'ARN génomique (brin (+)) du virus de l'hépatite C.
12. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 11, dans laquelle ladite séquence 1RES correspond à la séquence 1RES de l'ARN génomique (brin ( + )) d'un virus de l'hépatite C de génotype 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, ou une séquence dérivée de celle-ci, de préférence à la séquence 1RES d'un virus de l'hépatite C de génotype 1.
13. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 11, dans laquelle ladite séquence d'acide nucléique complémentaire à ladite région 1RES du virus de l'hépatite C correspond à la séquence complémentaire de la séquence allant de la position 30 à 355 de la séquence SEQ ID No : 1, de préférence allant de la position 25 à 370 et de manière particulièrement préférée allant de la position 20 à 386 de la séquence SEQ ID No :1 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.
14. La molécule d'ARN simple brin selon l'une quelconque des revendications 4 à 8 et 11 à 13, dans laquelle ladite molécule d'ARN simple brin comprend la séquence complémentaire de la séquence allant de la position 1 à 355 de l'ARN génomique (brin (+)) du virus de l'hépatite C, de préférence allant de la position 1 à 370.
15. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 14, dans laquelle ladite séquence de l'ARN génomique (brin (+)) du virus de l'hépatite C correspond à la séquence d'un virus de l'hépatite C de génotype 1, 2,
3, 4, 5 ou 6, ou une séquence dérivée de celle-ci, de préférence à la séquence d'un virus de l'hépatite C de génotype 1.
16. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 14, dans laquelle ladite séquence ladite molécule d'ARN simple brin comprend la séquence complémentaire de la séquence allant de la position 1 à 355 de la séquence SEQ ID No : 1, de préférence allant de la position 1 à 370 et de manière particulièrement préférée allant de la position 1 à 386 de la séquence SEQ ID No :1 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.
17. La molécule d'ARN simple brin selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans laquelle le gène suicide code pour un produit protéique qui induit la mort de la cellule en présence ou en l'absence de drogues.
18. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 17, dans laquelle le gène suicide code pour un produit protéique qui induit la mort de la cellule en présence de drogues comme les gènes de la thymidine kinase de HSV (HSVltk) ou de la cytosine déaminase (CD).
19. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 17, dans laquelle le gène suicide code pour une toxine protéique induisant la mort de la cellule comme les exotoxines bactériennes, les toxines fongiques, les toxines d'origine eucaryote, d'origine végétale ou d'origine virale des protéines dérivées de celles-ci.
20. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 19, dans laquelle le gène suicide code pour une toxine protéique de la famille RIP (Ribosome- Inactivating Protein) .
21. La molécule d'ARN simple brin selon la revendication 20, dans laquelle le gène suicide code pour une toxine protéique de la famille RIP de type 2, de préférence pour la chaîne A d'une toxine protéique de la famille RIP de type 2 comme la ricine, l'abrine, la modeccine, la volkensine, la viscumine et la Shiga toxine.
22. Une molécule d'ARN simple brin selon la revendication 21, dans laquelle le gène suicide correspond à la séquence SEQ ID No : 2 ou à une séquence dérivée.
23. La molécule d'ARN simple brin selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans laquelle le gène codant pour une protéine interférant avec la réplication du virus code pour un facteur régulateur d'interféron.
24. Une molécule d'ARN selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, dans laquelle ladite séquence d'acide nucléique complémentaire à ladite région 3'UTR comprend la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID No : 3 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.
25. Une molécule d'ARN selon l'une quelconque des revendications 1 à 24, dans laquelle ladite molécule d'ARN simple brin correspond à la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID No :4 ou d'une séquence dérivée.
26. Un vecteur d'acide nucléique comprenant une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 25.
27. Une composition pharmaceutique comprenant une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 25 ou un vecteur selon la revendication 26.
28. Une utilisation d'une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 25 ou d'un vecteur selon la revendication 26 pour la préparation d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter une infection par un virus à ARN se répliquant grâce à une ARN polymérase ARN dépendante.
29. Une utilisation d'une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 25 ou d'un vecteur selon la revendication 26 pour la préparation d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter une infection par le virus de l'hépatite C chez un patient.30. L'utilisation selon la revendication 28 ou 29, dans laquelle ledit médicament peut être administré par voie topique ou parentérale, notamment par injection intramusculaire, intradermique, intra-hépatique ou sous- cutanée .
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