FR2886946A1 - Procede pour le diagnoctic/pronostic du cancer du sein - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein comprenant les étapes suivantes :A - on extrait le matériel nucléique d'un échantillon biologique,B - on utilise au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons d'au moins une séquence cible du matériel nucléiqueC - on utilise au moins une sonde de détection pour détecter la présence desdits ampliconscaractérisé en ce que, lors de l'étape B, ladite paire d'amorce comprend au moins une amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID No.1 à SEQ ID No.8 et/ou lors de l'étape C), ladite sonde de détection comprend au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID No.9 à SEQ ID No.10.L'invention concerne également des amorces d'amplification et des sondes d'hybridation qui peuvent être mises en oeuvre dans ce procédé, ainsi qu'un kit de diagnostic/pronostic du cancer du sein.

Description

La présente invention concerne un procédé pour le diagnostic/pronostic

d'un cancer du sein. L'invention concerne également des amorces d'amplification et des sondes d'hybridation qui peuvent être mises en oeuvre dans ce procédé, ainsi qu'un kit de diagnostic/pronostic du cancer du sein.

Le cancer du sein est une maladie fréquente: une femme sur onze développe un cancer du sein au cours de sa vie. Cependant, parce qu'il existe différents types de cancers du sein, et différents pronostic du cancer du sein, les femmes qui en sont atteintes ne suivent pas toutes le même traitement: le médecin propose à chaque patiente un traitement adapté à sa situation, afin d'obtenir les meilleures chances de guérison.

Ainsi, l'hormonothérapie, qui est un traitement général dans les cancers du sein, est utilisé dans les cancers du sein hormono-dépendants, c'est à dire dans le cas de tumeurs exprimant des récepteurs hormonaux à la surface de leurs cellules. En post-opératoire, l'hormonothérapie peut être utilisée seule ou en relais de la chimiothérapie adjuvante.

Dans le cadre d'une récidive de la maladie, l'hormonothérapie peut être prescrite soit seule, soit associée ou en relais d'une chimiothérapie.

La chimiothérapie, est quant à elle, un traitement général du cancer puisque les médicaments, portés par la circulation sanguine, peuvent agir partout dans l'organisme. La chimiothérapie a une place importante dans l'arsenal thérapeutique, particulièrement depuis une dizaine d'années, avec l'apparition de nouvelles molécules. Les médicaments sont le plus souvent administrés en perfusion par voie veineuse, en voie sous-cutanée, en intra- musculaire.

Ainsi, en fonction de l'expression des récepteurs hormonaux à la surface des cellules hormonales, le traitement sera orienté vers une hormonotérapie ou non.

On peut citer notamment les récepteurs à l' oestrogène ER et le récepteur à la progestérone (PR), qui sont les paramètres les plus connus pour prédire la réponse à une hormonothérapie dans le cancer du sein. L'analyse de l'expression des gènes UPA (Urokinase-type Plasminogen Activator) et PAI-1 (Plasminogen Activator Inhibitor type I) permet également de bénéficier d'un outil de pronostic du cancer du sein. Ces gènes sont impliqués dans la destruction de la matrice extracellulaire, et sont donc de ce fait des facteurs impliqués dans le développement métastasique des tumeurs (Andreasen et al, Int. J. Cancer,1997).

Afin de proposer aux patientes un traitement adapté, il est donc essentiel de connaître l'expression des récepteurs hormonaux, tels que ER et PR. Cette expression est étudiée le plus souvent sur la tumeur primitive par immunohistochimie. En outre, il est important de connaître l'expression du récepteur HER2, dont la surexpression, étudiée par immunohistochimie, est un facteur ch mauvais pronostique. Dans les cas douteux, l'étude d'une amplification génique du gène HER2 par hybridation in situ (FISH) est la méthode alternative utilisée. Enfin, l'analyse de l'expression de UPA et PAI-1, facteurs d'agressivité de la tumeur est étudié par ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).

Depuis quelques années, des tumeurs de petites tailles peuvent être détectées, permettant un diagnostic précoce d'un cancer du sein, mais le pronostic de ce cancer reste alors difficile de part la faible quantité de tissu tumoral qui rend difficile la quantification protéique des récepteurs hormonaux et facteurs mentionnés précédemment.

La présente invention propose un nouveau procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein. Ce procédé met notamment en oeuvre l'analyse de l'expression des gènes UPA et PAI-1 par l'utilisation de nouvelles séquences nucléotidiques qui peuvent être utilisées en tant qu'amorces d'amplification ou de sondes d'hybridation. Le procédé selon l'invention permet notamment de déterminer quel est le pronostic d'un patient atteint d'un cancer du sein, afin de lui proposer un traitement adapté.

A ce titre, l'invention concerne un procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein comprenant les étapes suivantes: A - on extrait le matériel nucléique d'un échantillon biologique, B - on utilise au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons d'au moins une séquence cible du matériel nucléique C on utilise au moins une sonde de détection pour détecter la présence desdits amplicons caractérisé en ce que, lors de l'étape B, ladite paire d'amorce comprend au moins une amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N 1 à SEQ ID N 8 et/ou lors de l'étape C), ladite sonde de détection comprend au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N 9 à SEQ ID N 10.

D'une manière surprenante, les inventeurs ont ainsi découvert que l'utilisation, dans un procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein, d'une séquence nucléotidique comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi les SEQ ID N 1 à SEQ ID N 8 est très pertinent en tant qu'amorce d'amplification pour amplifier des séquences cibles, tels que le gène codant UPA et PAI-1. Les inventeurs ont également découvert que l'utilisation d'une séquence nucléotidique comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi les SEQ ID N 9 à SEQ ID N 10 en tant que sonde d'hybridation est très pertinente pour une hybridation spécifique sur des séquences cibles, tels que les gènes codant UPA et PAI-1.

Au sens de la présente invention, on entend par échantillon biologique, tout échantillon susceptible de contenir un matériel nucléique tel que défini ci après. Cet échantillon biologique peut être prélevé chez un patient et peut être notamment un échantillon de tissus, de sang, de sérum, de salive, de cellules circulantes du patient. Préférentiellement, cet échantillon biologique est prélevé d'une tumeur. On dispose de cet échantillon biologique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier.

Au sens de la présente invention, le matériel nucléique comprend une séquence d'acides nucléiques telle que une séquence d'acides désoxyribonucléiques (ADN) ou d'acides ribonucléiques (ARN). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel nucléique comprend une séquence d'acides désoxyribonucléiques. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel nucléique est extrait d'un échantillon biologique prélevé chez un patient.

Par séquence nucléotidique (ou séquences d'acides nucléiques ou fragment nucléotidique ou oligonucléotide, ou polynucléotide), on entend un enchaînement de motifs nucléotidiques assemblés entre eux par des liaisons ester phosphorique, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à une autre séquence d'acides nucléiques, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures différentes et être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique.

Par motif nucléotidique, on entend un dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose; selon qu'il s'agisse de l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine; ou bien le monomère est un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5désoxyuridine, la diamino - 2,6 - purine, la bromo - 5 désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide (P.E. Nielsen et al, Science, 254, 1497-1500 (1991), soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl - et aryl-phosphonates et phosphorothioates. Ce matériel nucléique comprend au moins une séquence cible. Par séquence cible, on entend une séquence dont l'enchaînement en motifs nucléotidiques est spécifique d'un gène cible, tel que préférentiellement le gène codant UPA ou PAI-1. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la séquence cible est comprise dans un gène choisi parmi les gènes codant UPA ou PAI-1. Dans la suite de l'exposé, on parlera de séquence cible qu'elle soit en simple brin ou en double brin.

Lors de l'étape A, on extrait le matériel nucléique d'un échantillon biologique par tout protocole connu de l'homme du métier. A titre indicatif, l'extraction d'acides nucléique peut être réalisée par une étape de lyse des cellules présentes dans l'échantillon biologique, afin de libérer les acides nucléiques contenus dans les enveloppes protéiques et/ou lipidiques des cellules (comme des débris cellulaires qui perturbent les réactions ultérieures). A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrite dans les demandes de brevet WO 00/05338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique, WO 99/53304 sur la lyse électrique, et WO 99/15321 sur la lyse mécanique.

L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues, telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les lyses chimiques par des agents chaotropiques tels que les sels de guanidium (US 5,234,809). Cette étape de lyse peut également être suivie d'une étape de purification, permettant la séparation entre les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse. Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques, et peut être adapté à la purification d'ADN ou d'ARN. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnétiques éventuellement revêtues d'oligonucléotides, par adsorption ou covalence (voir à ce sujet les brevets US 4,672,040 et US 5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet WO 97/45202 et WO 99/35500. Un autre exemple intéressant de méthode de purification des acides nucléiques est l'utilisation de silice soit sous forme de colonne, soit sous forme de particules inertes (Boom R. et al., J. Clin. Microbiol., 1990, n 28(3), p. 495-503) ou magnétiques (Merck: MagPrep Silica, Promega: MagneSilTM Paramagnetic particles). D'autres méthodes très répandues reposent sur des résines échangeuses d'ions en colonne ou en format particulaire paramagnétique (Whatman: DEAEMagarose) (Levison PR et al., J. Chromatography, 1998, p. 337-344). Une autre méthode très pertinente mais non exclusive pour l'invention est celle de l'adsorption sur support d'oxyde métallique (société Xtrana: matrice Xtra-BindTM) Lorsque l'on souhaite extraire spécifiquement l'ADN d'un échantillon biologique, on peut notamment réaliser une extraction par du phénol, du chloroforme et de l'alcool pour éliminer les protéines et précipiter l'ADN avec de l'alcool 100%. L'ADN peut alors être culoté par centrifugation, lavé et remis en suspension.

Lors de l'étape B, on utilise au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons d'au moins une séquence cible du matériel nucléique.

Au sens de la présente invention, on entend par amorce d'amplification, une séquence nucléique comprenant de 10 à 100 motifs nucléotidiques, préférentiellement de 15 à 25 motifs nucléotidiques. Cette amorce d'amplification comprend au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques d'une séquence choisie parmi les SEQ ID N 1 à 8.

Une paire d'amorces d'amplification permet l'initiation d'une polymérisation enzymatique, telle que notamment une réaction d'amplification enzymatique.

Par réaction d'amplification enzymatique, on entend un processus générant de multiples copies (ou amplicons) d'une séquence nucléique par l'action d'au moins une enzyme. Au sens de la présente invention, on entend par amplicons les copies de la séquence cible obtenues lors d'une réaction d'amplification enzymatique. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment la PCR (Polymerase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US-A-4, 683,195, US-A-4,683,202 et US-A-4,800,159; la LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP-A-O 201 184; la RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO-A-90/01069; la 3SR (Self Sustained Sequence Replication) avec la demande de brevet WO- A-90/06995; la NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet WO-A-91/02818, ou encore la TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A-5,399,491.

D'une manière générale, ces réactions d'amplification enzymatique mettent généralement une succession de cycle comprenant les étapes suivantes: o la dénaturation de la séquence cible si celle ci est en double brin afin d'obtenir deux brins cibles, complémentaires, o l'hybridation de chacun des brins cibles, obtenus lors de l'étape de dénaturation précédente avec au moins une amorce d'amplification, o la formation à partir des amorces d'amplification des brins complémentaires aux brins sur lesquels elles sont hybridées en présence d'une enzyme polymérase et de nucléosides triphosphate (ribonucléoside triphosphate et/ou desoxyribonucléoside triphosphate selon les techniques) ce cycle étant répété un nombre de fois déterminé pour obtenir la séquence cible dans une proportion suffisante pour permettre sa détection.

Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux séquences nucléiques telle que notamment une amorce d'amplification et une séquence cible ou une sonde d'hybridation et une séquence cible, se lient avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques pour former un double brin. Ces liaisons hydrogènes se forment entre les bases complémentaires Adénine (A) et thymine (T) (ou uracile (U)) (on parle de liaison A-T) ou entre les bases complémentaires Guanine (G) et cytosine (C) (on parle de liaison CAC). L'hybridation de deux séquences nucléiques peut être totale (on parle alors de séquences complémentaires), c'est à dire que le double brin obtenu lors de cette hybridation comprend uniquement des liaisons AT et des liaisons C-G. Cette hybridation peut être partielle (on parle alors de séquences suffisamment complémentaires), c'est à dire que le double brin obtenu comprend des liaisons AT et des liaisons GG permettant de former le double brin, mais également des bases non liées à une base complémentaire. L'hybridation entre deux séquences complémentaires ou suffisamment complémentaires dépend des conditions opératoires qui sont utilisées, et notamment de la stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases des deux séquences nucléiques, ainsi que par le degré de mésappariement entre ces deux séquences nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier.

D'une façon plus précise, la NASBA est une technologie d'amplification isotherme de l'acide nucléique reposant sur l'action conjointe de trois enzymes (transcriptase inverse AMV, Rnase-H et polymérase-ARN T7). Associée à des amorces d'amplification spécifiques d'une séquence cible, elle amplifie les cibles ARN plus d'un milliard de fois en 90 minutes. La réaction d'amplification se produit à 41 C et donne des molécules d'ARN simple brin comme produit final. La NASBA nécessite une paire d'amorce, dont au moins une comprend un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7. Une telle amorce est préférentiellement choisie parmi les SEQ ID N 11 et 12. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ladite paire d'amorce comprend au moins une amorce d'amplification comprenant un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ladite paire d'amorces, utilisée de l'étape B, est choisie parmi les paires d'amorce suivantes: ^ une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 1 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 2; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N 1, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N 2, on obtient un amplicon, spécifique du gène codant PAI-1, d'une taille de 216 paires de base, qui correspond à la séquence 394 - 610 sur la séquence du gène codant PAI-1 de référence (Genbank NM_000602.1).

^ une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 3 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 4; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N 3, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N 4, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène codant PAI-1, d'une taille de 1058 paires de base, qui correspond à la séquence 88 1146 sur la séquence codant PAI-1 de référence (Genbank NM 000602.1).

^ une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 5 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 6; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N 5, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N 6, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène UPA, d'une taille de 194 paires de base, qui correspond à la séquence 1661 - 1855 sur la séquence codant UPA de référence (Genbank NM 002658.1).

^ une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 7 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 8; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N 7, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N 8, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène codant UPA, d'une taille de 927 paires de base, qui correspond à la séquence 1228 - 2155 sur la séquence codant UPA de référence (Genbank NM_002658.1).

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ladite paire d'amorces, utilisée de l'étape B, comprend une première amorce comprenant un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7, est choisie parmi les paires d'amorce suivantes: ^ une première amorce d'amplification de SEQ ID N 11 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 2; ^ une première amorce d'amplification de SEQ ID N 12 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de h séquence nucléotidique SEQ ID N 6.

Afin de tenir compte de la variabilité d'efficacité enzymatique qui peut être observée lors des différentes étapes de la réaction d'amplification, on peut normaliser l'expression d'un gène cible par la détermination simultanée de l'expression d'un gène dit de ménage, dont l'expression est similaire chez les différents groupes de patients. En réalisant un i0 rapport entre l'expression du gène cible et l'expression du gène de ménage, on corrige ainsi toute variabilité entre les différentes expérimentations. L'homme du métier pourra se référer notamment aux publications suivantes: Bustin SA Journal of molecular endocrinology, 2002, 29: 23-39; Giulietti A Methods, 2001, 25: 386-401. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on utilise, en outre, lors de l'étape B, au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons spécifiques d'un gène de ménage. Par gène de ménage, on entend un gène dont l'expression est stable dans un tissu donné, et quelque soit la situation physiologique. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le gène de ménage est le gène PPIB qui code la cyclophyline B. L'homme du métier se référera notamment à la demande PCT/FR04/050661 qui est inclut par référence dans la présente demande.

Lors de l'étape C, on utilise au moins une sonde de détection pour détecter la présence desdits amplicons. Cette étape de détection, peut être réalisée par tous les protocoles connus de l'homme du métier concernant la détection d'acides nucléiques.

Au sens de la présente invention, on entend par sonde d'hybridation, une séquence nucléique de 10 à 100 motifs nucléotidiques, notamment de 15 à 35 motifs nucléotidiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec une séquence nucléique cible. La sonde d'hybridation peut comprendre un marqueur permettant sa détection. On parle alors de sondes de détection. Par détection on entend soit une détection directe par une méthode physique, soit une détection indirecte par une méthode de détection à l'aide d'un marqueur. De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques. [Voir par exemple Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, n 45(4), p.453- 458 ou Keller G. H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p. 173-249]. Par marqueur, on entend un traceur capable d'engendrer un signal que l'on peut détecter. Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la bêta galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants; les groupements à densité électronique détectables par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme 32P 35S ou 125I.

Au sens de la présente invention, la sonde d'hybridation peut être une sonde dite de détection. Dans ce cas, la sonde dite de détection est marquée au moyen d'un marqueur tel que défini précédemment. Grâce à la présence de ce marqueur, on peut détecter la présence d'une réaction d'hybridation entre une sonde de détection donnée et la séquence cible spécifique d'une espèce donnée.

La sonde de détection peut être notamment une sonde de détection molecular beacons telle que décrite par Tyagi & Kramer (Nature biotech, 1996, 14:303-308). Ces "molecular beacons" deviennent fluorescentes lors de l'hybridation. Elles possèdent une structure de type tige-boucle et contiennent un fluorophore et un groupe "quencher". La fixation de la séquence de boucle spécifique avec sa séquence complémentaire d'acide nucléique cible provoque un déroulement de la tige et l'émission d'un signal fluorescent lors de l'excitation à la longueur d'onde qui convient. La sonde d'hybridation peut être égale ment une sonde dite de capture. Dans ce cas, la sonde dite de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption. On détecte alors la Faction d'hybridation entre une sonde de capture donnée et une séquence cible.

Pour la détection de la réaction d'hybridation, on peut utiliser des séquences cibles marquées, directement (notamment par l'incorporation d'un marqueur au sein de la séquence cible) ou indirectement (notamment par l'utilisation d'une sonde de détection telle que définie précédemment) la séquence cible. On peut notamment réaliser avant l'étape d'hybridation une étape de marquage et/ou de clivage de la séquence cible, par exemple en utilisant un désoxyribonucléotide triphosphate marqué lors de la réaction d'amplification enzymatique. Le clivage peut être réalisé notamment par l'action de l'imidazole et de chlorure de manganèse. La séquence cible peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde de détection selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO 91/19812. Un autre mode particulier préférentiel de marquage d'acides nucléiques est décrit dans la demande FR 2 780 059.

Comme support solide, on peut utiliser des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose ou le dextrane, des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques; des latex; des particules magnétiques; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane comme décrit dans la demande WO 94/12670, d'une particule.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la sonde de détection comprend un flurophore et un quencher. Selon un mode encore plus préféré de réalisation de l'invention, la sonde d'hybridation comprend un flurophore FAM (6-carboxyfluorescein) ou ROX (6-carboxy-X- rhodamine) en son extrémité 5' et un quencher (Dabsyl) en son extrémité 3'. Dans la suite de l'exposé, une telle sonde d'hybridation est appelée molecular beacon .

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, les étapes B et C sont effectuées en même temps. Ce mode préféré peut être mise en oeuvrepar NASBA en temps réel qui regroupe en une étape unique la technique d'amplification NASBA et la détection en temps réel qui fait appel à des "molecular beacons". La réaction NASBA intervient dans le tube, produisant de l'ARN simple brin avec lequel les "molecular beacons" spécifiques peuvent s'hybrider simultanément pour donner un signal fluorescent. La formation des nouvelles molécules d'ARN est mesurée en temps réel par contrôle continu du signal dans un lecteur fluorescent. Contrairement à une amplification par RT-PCR, l'amplification en NASBA peut se faire en présence d'ADN dans l'échantillon, c'est à dire même si l'ADN n'a pas été complètement éliminé lors de l'extraction des ARN.

Tel que présenté dans l'exemple ci après, lorsque l'on souhaite détecter le gène cible codant PAI-1 (séquence de référence NCBI accession number: NM_000602.1), on utilise préférentiellement lors de l'étape b) ^ une première amorce de SEQ ID N 1 ou 11 ^ une deuxième amorce de SEQ ID N 2 et lors de l'étape c) ^ une sonde de détection comprenant la SEQ ID N 9.

Tel que présenté dans l'exemple ci après, lorsque l'on souhaite détecter le gène cible codant UPA (séquence de référence NCBI accession number: NM_002658.1), on utilise préférentiellement lors de l'étape b) ^ une première amorce de SEQ ID N 5 ou 12 ^ une deuxième amorce de SEQ ID N 6 et lors de l'étape c) ^ une sonde de détection comprenant la SEQ ID N 10 Lorsqu'on utilise, lors de l'étape B, une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons spécifiques d'un gène de ménage, lesdits amplicons spécifiques d'un gène de ménage peuvent être détectés comparablement à ce qui est décrit précédemment, par notamment l'utilisation d'une sonde de détection. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le gène de ménage est le gène PPIB qui code la cyclophyline B. Préférentiellement, la sonde de détection comprend un flurophore et un quencher.

L'invention concerne également une amorce d'amplification comprenant au moins 10, 25 préférentiellement 15, et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N 1 à SEQ ID N 8.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'amorce d'amplification comprend un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7. Cette amorce peut être notamment l'une quelconque des SEQ ID N 11 à 12, et est préférentiellement utilisée dans une réaction d'amplification NASBA.

L'invention concerne également une paire d'amorce choisi parmi les paires d'amorces suivantes: ^ une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 1 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 2; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N 1, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N 2, on obtient un amplicon, spécifique du gène codant PAI-1, d'une taille de 216 paires de base, qui correspond à la séquence 394 - 610 sur la séquence du gène codant PAI-1 de référence (Genbank NM_000602.1).

^ une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 3 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 4; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N 3, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N 4, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène codant PAI-1, d'une taille de 1058 paires de base, qui correspond à la séquence 88 1146 sur la séquence codant PAI-1 de référence (Genbank NM_000602.1).

^ une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 5 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 6; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N 5, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N 6, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène UPA, d'une taille de 194 paires de base, qui correspond à la séquence 1661 - 1855 sur la séquence codant UPA de référence (Genbank NM 002658.1) ^ une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 7 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 8; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N 7, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N 8, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène codant UPA, d'une taille de 927 paires de base, qui correspond à la séquence 1228 - 2155 sur la séquence codant UPA de référence (Genbank NM_002658.1).

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ladite première amorce comprend un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7. Cette amorce peut être notamment l'une quelconque des SEQ ID N 11 à 12. Lorsque première amorce comprend un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7, cette première amorce est préférentiellement comprise dans une paire d'amorces choisie parmi les paires d'amorce suivantes: ^ une première amorce d'amplification de SEQ ID N 21 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 2; ^ une première amorce d'amplification de SEQ ID N 22 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 4; L'invention concerne également l'utilisation d'au moins une amorce d'amplification telle que définie précédemment et/ou d'au moins une paire d'amorce telle que définie 30 précédemment lors d'une réaction d'amplification NASBA.

L'invention concerne également une sonde de détection comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N 9 à SEQ ID N 10.

Préférentiellement, cette sonde de détection comprend un flurophore et un quencher.

L'invention concerne également l'utilisation d'au moins une amorce telle que définie précédemment et/ou d'au moins une paire d'amorces telle que définie précédemment et/ou d'au moins une sonde de détection telle que définie précédemment pour le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein.

L'invention concerne enfin un kit pour le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein comprenant au moins une amorce telle que définie précédemment et/ou d'au moins une paire d'amorces telle que définie précédemment et/ou d'au moins une sonde de détection telle que définie précédemment.

Tel que présenté dans l'exemple ci après, lorsque l'on souhaite détecter le gène cible codant PAI-1, le kit comprend préférentiellement ^ une première amorce de SEQ ID N 1 ou 11 ^ une deuxième amorce de SEQ ID N 2 ^ une sonde de détection comprenant la SEQ ID N 9.

Tel que présenté dans l'exemple ci après, lorsque l'on souhaite détecter le gène cible codant UPA, le kit comprend préférentiellement ^ une première amorce de SEQ ID N 5 ou 12 ^ une deuxième amorce de SEQ ID N 6 ^ une sonde de détection comprenant la SEQ ID N 10 L'invention concerne également un kit pour le diagnostic/pronostic d'un cancer 25 du sein qui permet de déterminer É si une patiente atteinte d'un cancer du sein peut bénéficier d'une hormonothérapie (Tamoxifene) ou d'une immunotherapie (Herceptin) É si le cancer en question est de bon ou de mauvais pronostic É l'agressivité de la tumeur Pour cela, le kit comprend les réactifs nécessaires, tels que amorces et/ou sondes, pour la détection des gènes ER, PR, HER-2, UPA, PAI-1. Pour les amorces et sondes nécessaires à la détection des gènes ER, PR, HER-2, l'homme du métier se réfèrera notamment à la demande de brevet PCT/FR04/050661 qui est inclut par référence. Pour les amorces et sondes nécessaires à la détection des gènes UPA et PAI-1, l'homme du métier se réfèrera à l'exposé précédemment développé.

La figure suivante est donnée à titre illustrative et n'a aucun caractère limitatif. Elle permettra de mieux comprendre l'invention.

La figure 1 représente les courbes standards obtenues pour les gènes PAI1 et PPIB (fig la, PAI-1 en trait plein, PPIB en pointillés), UPA et PPIB (fig lb, UPA en trait plein, PPIB en pointillés, telles que décrites dans l'exemple ci dessous. Chaque courbe standard, obtenue pour chaque gène à partir d'une séquence de référence qui est spécifique du gène, transcrits en ARN in vitro à partir du produit PCR spécifique du gène UPA et PAI-1 respectivement et d'un plasmide pour le gène PPIB, représente le temps d'apparition de la phase exponentielle de l'amplification (on parle également de TTP: time to positivity, temps seuil) en fonction du nombre de copies d'ARN présentes au début de l'amplification par NASBA (plus la quantité de départ de copies d'ARN est importante au début de l'amplification, plus le temps d'apparition de la phase exponentielle est court).

Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention.

Exemple 1 - Amplification et détection en temps réel des ARNm codant PAI1 et UPA 1/ Obtention et préparation des échantillons Cet exemple a été réalisé à partir de trois lignées de cellules tumorales, dont l'expression des protéines UPA et PAI-1 a préalablement été déterminée par ELISA, ont été utilisées: MDA-MD-231 (exprimant les facteurs UPA et PAI-1), et MCF7 (n'exprimant ni UPA, ni PAI-1). Ces lignées proviennent de l'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA). Ces lignées cellulaires ont été mises en culture dans un milieu DMEM (MCF-7) ou Leibovitz (MDA-MD-231), supplémenté en sérum foetal de boeuf (10%), acides aminés non essentiels (1%) et pénicilline (50 000U) -streptomycine (501ag) à 37 C sous atmosphère comprenant 5% de CO2 pour MCF7 et 0% de MDA-MD-231.

Cet exemple a également été réalisé à partir de tumeurs de patientes (n = 77) atteintes d'un cancer du sein dont l'expression en UPA et PAI-1 a préalablement été déterminée par ELISA selon une technique classique connue de l'homme du métier. La technique ELISA nous renseignait sur l'expression de la protéine.

2/ Extraction des ARN totaux Les ARN totaux ont été extraits de lignées cellulaires, par l'utilisation de Trizol Reagent selon les recommandations des fournisseur du kit (Invitrogen, Canada). La qualité et la quantité en ARN ont été déterminées à 260 et 280 nm et contrôlées sur gel agarose. Les ARN ont ensuite été congelés à -70 C jusqu'à utilisation.

Des ARN totaux ont également été extraits d'une façon comparable de tumeurs de 15 patientes atteintes d'un cancer du sein.

3) Amplification par NASBA La réaction d'amplification par NASBA est basée sur l'activité simultanée d'une reverse transcriptase du virus aviaire myéloblaste (AMV-RT), d'une RNAse H d'E. coli et d'une ARN polymerase du bacteriophage T7 (Compton J, 1991, Nature, 350: 91-92). La détection en temps réel des amplicons est réalisée par l'utilisation d'un lecteur Nuclisens EasyQ (bioMérieux BV, The Netherland) et sondes de détection molecular beacons , telles que définies précédemment. La quantification en NASBA est basée sur l'utilisation d'une courbe standard, obtenue à partir d'une séquence de référence, spécifique du gène cible, transcrits en ARN in vitro dans un plasmide. Cette courbe standard représente le temps d'apparition de la phase exponentielle de l'amplification en fonction du nombre de copies d'ARN présentes au début de l'amplification par NASBA (plus la quantité de départ de copies d'ARN est importante au début de l'amplification, plus le temps d'apparition de la phase exponentielle est court).

a) Amplification des gènes PAI-1 et UPA et du gène de ménage PPIB Obtention d'une courbe standard Courbe standard du gène cible codant PAII (Figure la) Pour le gène cible codant PAI-1 (séquence de référence NCBI accession number NM_000602.1), il a été utilisée une première amorce de SEQ ID N 3 5' CCAGCCCTCA CCTGCCTAGT 3' possédant une séquence supplémentaire correspondant au promoteur SP6 et une deuxième amorce de SEQ ID N 4 5' CACCGTGCCA CTCTCGTTCA 3', localisées respectivement en position 88 - 107 et 1127 - 1146 de la séquence de référence, afin de générer en PCR (un 1er cycle de dénaturation (95 C; 1 min); puis 35 cycles comprenant les étapes suivantes dénaturation: 94 C; 1 min; hybridation: 60 C; 1 min; élongation: 72 C; 2 min) et un dernier cycle comprenant une étape de dénaturation: 72 C; 7 min) un amplicon de 1058 + 23 (de la séquence SP6) paires de bases, spécifique du gène codant PAI-1 (on parlera d < amplicon PAI-1 ).

Les amplicons PAI-1 obtenus tels que décrit ci dessus, ont ensuite été purifié (colonne Qiaquick Qiagen, Hilden, Germany) puis transcrits directement en ARN in vitro par l'utilisation d'une ARN polymerase (SP6 (Megascript kit, Ambion, Austin, USA), selon l'orientation de l'amplicon) . Après élimination du plasmide par traitement à la DNAse, les ARN ont été purifiés par Rneasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) et quantifiés (RNA6000Nano, Agilent Technologies, Walbronn, Germany). Les amplicons obtenus étaient bien spécifiques du gène PAI-1.

Les ARN obtenus ci dessus ont été dilués à différentes concentrations (solution stock 0,2.1011 copies/ l, dilution en cascade 0, 2.1011 copies/ l à 0,2.102 copies/ l). Ces dilutions en cascade sont amplifiées par NASBA à l'aide du kit Nuclisens basic (bioMérieux BV, The Netherlands) en présence des amorces spécifiques PAI-1 SEQ ID N 1 et PAI1 N 2 et du molecular beacons SEQ ID N 9: ^ 0,2 M d'une première amorce PAI-1 de SEQ ID N 1 5' CTCCTTTCCC AAGCAAGTTG 3', comprenant, en son extrémité 5', et indiqué en minuscule, une séquence comprenant le promoteur de la polymérase T7, c'est à dire une première amorce dont la séquence entière est la SEQ ID N 11: 5' aattctaatacgactcactatagggagaaggCTCCTTTCCCAAGCAAGTTG 3' ^ 0,2 M d'une deuxième amorce PAI-1 de SEQ ID N 2 5' GGGCCATGGA ACAAGGATGA 3').

^ 0,1 M de molecular beacons comprenant la SEQ ID N 9 5' 3', marquées avec un fluorophore FAM (6-carboxy-fluorescein) en 5', et d'un quencher (Dabsyl) en 3' (séquence complète: 5' TGTTCCGGAG CACGGTCAAG 3'. FAMcgatcgTGTTCCGGAGCACGGTCAAGcgatcg- D ab s yl Au cours de l'amplification le signal s'intensifie proportionnellement à la quantité d'amplicons produits. La courbe de fluorescence en fonction du temps permet de définir le temps ou la phase exponentielle de l'amplification démarrera (encore appelé TTP: time to positivity, temps seuil). La courbe standard PAI-1 relie le nombre de transcrit présent au départ dans la solution en fonction du TTP détecté lors de l'amplification NASBA. A l'aide d'une courbe standard, on calcule de manière absolue le nombre de copies du gène cible. Enfin cette valeur est normalisée grâce à un gène de ménage, en l'occurrence le gène PPIB. Cette courbe standard PAI-1, représentée figure la (courbe en trait plein).

Courbe standard du gène cible codant UPA La courbe du gène cible codant UPA a été réalisée selon le même principe que pour PA 1, à l'exception des amorces d'amplification utilisées et des molecular beacons , qui étaient spécifiques de UPA.

Ainsi, pour le gène cible codant UPA (séquence de référence NCBI accession number: NM 002658.1), il a été utilisée une première amorce de SEQ ID N 7 5' CCAAGGCCGC ATGACTTTGA 3' et une deuxième de SEQ ID N 8 5' GCCAAGAAAG GGACATCTATG 3', localisées respectivement en position 1228- 1248 et 2135-2155 de la séquence de référence.

Les amplicons ont alors été transcrits en ARN in vitro par l'utilisation d'une ARN polymerase (T7 ou SP6 (Megascript kit, Ambion, Austin, USA), selon l'orientation de l'amplicon). Après élimination du plasmide par traitement à la DNAse, les ARN ont été purifiés par Rneasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) et quantifiés (RNA6000Nano, Agilent Technologies, Walbronn, Germany). Les amplicons obtenus étaient bien spécifiques du gène PAI-1.

Les ARN obtenus ci dessus ont été dilués à différentes concentrations (solution stock: 0,2.1011 copies/ l, dilution en cascade 0, 2.1011 copies/ l à 0,2.102 copies/ l). Ces dilutions en cascade sont amplifiées par NASBA à l'aide du kit Nuclisens basic (bioMérieux BV, The Netherlands) en présence ^ 0,2 M d'une première amorce UPA de SEQ ID N 5 5' AGCCCTGCCC TGAAGTCGTT A 3', comprenant, en son extrémité 5', et indiqué en minuscule, une séquence comprenant le promoteur de la polymérase T7, c'est à dire une première amorce dont la séquence entière est SEQ ID N 12: 5' aattctaatacgactcactatagggagaaggAGCCCTGCCCTGAAGTCGTTA 3', ^ 0,2 M d'une deuxième amorce UPA de SEQ ID N 6 5' CAGGGCATCT CCTGTGCATG 3', ^ 0,1 M de molecular beacons utilisées comprenant la SEQ ID N 10 5' TGTAAGCAGC TGAGGTCT 3', marquées avec un fluorophore FAM (6-carboxy-fluorescein) à leur extremité 5', et d'un quencher (Dabsyl) à son extremité 3' (séquence complète: 5' FAM-cgatcg TGTAAGCAGC TGAGGTCT cgatcg-Dabsyl 3').

La courbe standard UPA est représentée figure lb. Courbe standard du gène cible PPIB La courbe du gène cible PPIB a été réalisée selon le même principe que pour PAI-1, à 20 l'exception des amorces d'amplification et des molecular beacons , qui étaient spécifiques de PPIB Ainsi, pour le gène de ménage PPIB (séquence de référence NCBI accession number: M60857), il a été utilisée une première amorce de SEQ ID N 13 5' ACATGAAGGT GCTCCTTGCC 3' et une deuxième amorce de SEQ ID N 14 5' GTCCCTGTGC CCTACTCCTT 3', localisées respectivement en position 11-30 et 631-650 de la séquence de référence. La séquence de ces amplicons PPIB a été vérifiée par séquençage (Biofidal, Vaulx en Velin, France), afin de s'assurer qu'il correspondait bien à la séquence du gène cible que l'on souhaitait amplifier. Les amplicons obtenus étaient bien spécifiques du gène PPIB.

Les amplicons ont alors été transcrits en ARN in vitro par l'utilisation d'une ARN polymerase (T7 ou SP6 (Megascript kit, Ambion, Austin, USA), selon l'orientation de l'amplicon). Après élimination du plasmide par traitement à la DNAse, les ARN ont été purifiés par Rneasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) et quantifiés (RNA6000Nano, Agilent Technologies, Walbronn, Germany).

Les ARN obtenus ci dessus ont été dilués à différentes concentrations (solution stock: 0,2.1011 copies/ l, dilution en cascade 0, 2.1011 copies/ l à 0,2.102 copies/ l). Ces dilutions en cascade sont amplifiées par NASBA à l'aide du kit Nuclisens basic (bioMérieux BV, The Netherlands) en présence de: ^ 0,2 M d'une première amorce PPIB de SEQ ID N 13 5' CAGGCTGTCT TGACTGTCGT GA 3', comprenant, en son extrémité 5', et indiqué en minuscule une séquence comprenant le promoteur de la polymérase T7, c'est à dire une première amorce dont la séquence entière est SEQ ID N 16: 5' aattctaata cgactcacta tagggagaag gCAGGCTGTCTTGACTGTCG TGA 3', ^ 0,2 M d'une deuxième amorce PPIB de SEQ ID N 14 5' AGGAGAGAAA GGATTTGGCT 3' ^ 0,1 M de molecular beacons comprenant la SEQ ID N 15 5' GATCCAGGGCGGAGACTTCA 3', marquées avec un fluorophore ROX (6-carboxy-Xrhodamine) en 5', et d'un quencher (Dabsyl) en 3' (séquence complète: 5' ROX-cgatcgGATCCAGGGCGGAGACTTCAcga cg-Dabsyl 3'.

La courbe standard PPIB est représentée figure lA et 1B (courbes en pointillés).

b) réaction d'amplification par NASBA: b l) Amplification en duplex des gènes PAI-1 et PPIB Cette réaction d'amplification a été réalisée a l'aide d'un kit Nuclisens basic (bioMérieux BV, The Netherlands). Pour cela, 5 ng d'ARN totaux, extraits des différentes lignées cellulaires, ont été ajouté à 10 l de tampon NASBA (concentration finale dans 20 l de milieu réactionnel: 40 mM de Tris HC1 pH 8,5, 12mM MgC12, 70mM KC1, 5mM dithiotreitol, 15% v/v DMSO, 1mM de chaque dNTP, 2mM de chaque NTP).

Dans ce milieu a été ajouté, 0,1 M de molecular beacons comprenant ^ la SEQ ID N 9, marquées avec un fluorophore FAM (6-carboxy-fluorescein) en 5', et d'un quencher (Dabsyl) en 3', pour la détection des ARN du gène PAI-1 ^ la SEQ ID N 15, marquées avec un fluorophore ROX (6-carboxyX-rhodamine) en 5', et d'un quencher (Dabsyl) en 3' (, pour la détection des ARN du gène PPIB, Dans ce milieu a également été ajouté : ^ 0,2 M d'une première amorce PAI-1 de SEQ ID N 1, comprenant, en son extremité 5' une séquence comprenant le promoteur de la polymérase T7, ^ 0,2 M d'une deuxième amorce PAI-1 de SEQ ID N 2, ^ 0,2 M d'une première amorce PPIB de SEQ ID N 13 comprenant, en son extrémité 5' une séquence comprenant le promoteur de la polymérase T7 ^ 0,2 M d'une deuxième amorce PPIB de SEQ ID N 14.

Une préincubation a été réalisée durant 2 minutes à 65 C avant une incubation de 2 minutes à 41 C. Un volume de 5 l d'un mélange d'enzyme (0,08U de RNAse H, 32U d'ARN polymerase T7, 6,4 U d'AMV-RT) a été ajoutée, et une incubation de 90 minutes a été réalisée à 41 C.

La quantification des ARN transcrits a été déterminée en temps réel (NucliSens EasyQ, bioMérieux), la réaction NASBA produisant des amplicons avec lequel les "molecular beacons" spécifiques peuvent s'hybrider simultanément pour donner un signal fluorescent. La formation des nouvelles molécules d'ARN est mesurée en temps réel par contrôle continu du signal dans un lecteur fluorescent, l'analyseur NucliSens EasyQ. L'analyse et la communication automatisée des données sont assurées par le logiciel Nuclisens TTP (bioMérieux BV, The Netherlands). La courbe standard, telle que définie précédemment (dilution ARN transcrits: 108 à 102 copies) a été utilisée pour la quantification de l'expression de chacun du gène cible ESR1 et du gène de ménage PPIB, afin d'extrapoler le nombre de copies d'ARNm par échantillon. La quantification de l'expression d'un gène cible a été exprimé par nombre de copies d'ARNm/ 5ng d'ARN totaux.

Le tableau 1 présente l'expression du gène PAI-1 quantifiée à partir de 5 ng d'ARN totaux provenant des lignées cellulaires MDA-MD-231, MCF7.

Nbre copies ARNm PAI 1 Nbre copies ARNm PPIB PAI-1/PPIB MDA-MD-231 2, 52x10' 3,04x104 8,29 MCF7 NC 2.60x10b NC Tableau 1 - Expression du gène PAI-1 dans les cellules MCF7, T47D, (NC: non calculable) L'expression du gène PAI-1 a été exprimée par le ratio entre le nombre de copies d'ARNm du gène cible et le nombre de copies d'ARNm du gène de ménage. Ainsi, des ARNm de PAI-1 étaient exprimés dans les cellules MDA-MD-231 alors qu'ils n'étaient pas détectées dans les cellules MCF7, en accord avec l'expression de ces cellules:.

Le tableau 2 présente l'expression du gène PAI-1 quantifiée à partir de 50 ng d'ARN totaux provenant de tumeurs ELISA+ c'est à dire exprimant la protéine PAI-1, ou de 10 tumeurs ELISA.

Moyenne copies ARNm PAI-1 Moyenne copies ARNm PPIB PAI 1/PPIB Tumeurs ELISA- 2,83 x104 1,121x10b 2,5 x10.2 Tumeurs ELISA+ 7,70 x104 1. 269x10b 6,1 x10.2 Tableau 2 - Expression du gène PAI-1 dans les tumeurs ELISA + et ELISA - L'expression du gène PAI-1 a été exprimée par le ratio entre le nombre de copies 15 d'ARNm du gène cible et le nombre de copies d'ARNm du gène de ménage. Une surexpression du gène PAI-1 était observée dans les tumeurs ELISA +.

A partir des courbes standards PAI-1 et PPIB réalisées précédemment, la limite de détection et la limite de quantification ont été déterminées pour les gènes PAI-1 et PPIB amplifiés en duplex. La limite de quantification était observée à 1000 copies d'ARNm pour PAI-1 et PPIB. La limite de détection était de 100 copies d'ARNm pour PAI-1 et PPIB.

Aucun signal n'était observé lorsque la NASBA était réalisé à partir d'ARN totaux issus de la lignée cellulaire MCF7, PAI-1 négative.

Tous ces résultats ont été confirmés par l'utilisation d'une autre technique d'amplification (RT-PCR quantitative) (PAI-1: r = 0,7886, p< 0,0001, n=80; test statistique de corrélation Spearman). De plus, les résultats obtenus au niveau ARN messager par la technique NASBA pour le gène PAI-1 était corrélés à ceux obtenus au niveau protéique par ELISA (PAI-1: r = 0,3590, p=0,0013, n=77; test statistique de corrélation Spearman). Ces résultats démontrent que l'expression des ARNm est corrélé à la présence dans le cytosol et le noyau, confirmant l'intérêt d'étudier au niveau ARNm l'expression de ce gène.

Ces résultats démontrent que le duplex PAI-1/PPIB en NASBA permet une quantification de l'expression du gène PAI-1 à partir d'une très faible quantité d'ARN totaux, et, d'une façon plus large, à partir d'une très faible quantité de cellules tumorales, et est parfaitement adapté pour étudier le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein, et la réponse d'un patient à un traitement donné.

b2) Amplification en duplex des gènes UPA et PPIB Cette réaction d'amplification a été réalisée a l'aide d'un kit Nuclisens basic (bioMérieux BV, The Netherlands). Pour cela, 5 ng d'ARN totaux, extraits des différentes lignées cellulaires, ont été ajouté à 10 l de tampon NASBA (concentration finale dans 20 l de milieu réactionnel: 40 mM de Tris HC1 pH 8,5, 12mM MgC12, 70mM KC1, 5mM dithiotreitol, 15% v/v DMSO, 1mM de chaque dNTP, 2mM de chaque NTP).

Dans ce milieu a été ajouté, 0,1 M de molecular beacons comprenant ^ la SEQ ID N 10, marquées avec un fluorophore FAM (6-carboxy-fluorescein) à leur extremité 5', et d'un quencher (Dabsyl) à son extremité 3' pour la détection des ARN codant UPA lors du duplex UPA / cyclophyline B, ^ la SEQ ID N 15, marquées avec un fluorophore ROX (6-carboxy-X-rhodamine) en 5', et d'un quencher (Dabsyl) en 3', pour la détection des ARN du gène PPIB, Dans ce milieu a également été ajouté : ^ 0,2 M d'une première amorce UPA de SEQ ID N 5 comprenant, en son extrémité 5', une séquence comprenant le promoteur de la polymérase T7, ^ 0,2 M d'une deuxième amorce UPA de SEQ ID N 6, ^ 0,2 M d'une première amorce PPIB de SEQ ID N 13, comprenant, en son extrémité 5' une séquence comprenant le promoteur de la polymérase T7, ^ 0,2 M d'une deuxième amorce PPIB de SEQ ID N 15 Une préincubation a été réalisée durant 2 minutes à 65 C avant une incubation de 2 minutes à 41 C. Un volume de 5 l d'un mélange d'enzyme (0,08U de RNAse H, 32U d'ARN polymerase T7, 6,4 U d'AMV-RT) a été ajoutée, et une incubation de 90 minutes a été réalisée à 41 C.

La quantification des ARN transcrits a été déterminée en temps réel selon un principe comparable à ce qui a été décrit pour UPA. La courbe standard, telle que définie précédemment (dilution ARN transcrits: 108 à 102 copies) a été utilisée pour la quantification de l'expression du gène cible UPA etdu gène de ménage PPIB, afin d'extrapoler le nombre de copies d'ARNm par échantillon. La quantification de l'expression d'un gène cible a été exprimé par nombre de copies d'ARNm/ 5ng d'ARN totaux.

Le tableau 3 présente l'expression du gène UPA quantifiée à partir de 5 ng d'ARN totaux provenant des lignées cellulaires MCF-7 et MDA-MD-231.

Nbre copies ARNm UPA Nbre copies ARNm PPIB UPA/PPIB MDA-MD-231 1, 67x10' 2,96x10' 5,62 x10- MCF-7 NC 9,49x10' NC Tableau 3 - Expression du gène UPA dans les cellules MCF-7 et MDA-MD-231 L'expression du gène UPA a été exprimée par le ratio entre le nombre de copies d'ARNm du gène cible et le nombre de copies d'ARNm du gène de ménage. Ainsi, des ARNm de UPA étaient exprimés dans les cellules MDA321 alors qu'ils n'étaient pas détectées dans les cellules MCF-7, en accord avec l'expression en de ces cellules.

Le tableau 4 présente l'expression du gène UPA quantifiée à partir de 50 ng d'ARN totaux provenant de tumeur s ELISA + ou de tumeurs ELISA-.

Moyenne copies ARNm UPA Moyenne copies ARNm PPIB UPA/PPIB Tumeurs ELISA 3,70 x104 9,82 x104 3,8 x10- Tumeurs ELISA + 6,70 x104 8,39 x10' 8,0 x10Tableau 4 - Expression du gène UPA dans les tumeurs ELISA + et ELISA L'expression du gène UPA a été exprimée par le ratio entre le nombre de copies d'ARNm du gène cible et le nombre de copies d'ARNm du gène de ménage. Une surexpression du gène UPA était observée dans les tumeurs ELISA +.

A partir des courbes standards UPA et PPIB réalisées précédemment, la limite de détection et la limite de quantification ont été déterminées pour les gènes UPA et PPIB amplifiés en duplex. La limite de quantification a été déterminée à 1000 et 104 copies d'ARNm pour UPA et PPIB respectivement. La limite de détection était de 100 copies d'ARNm pour UPA et PPIB.

De même, aucun signal n'était observé lorsque la NASBA était réalisé à partir d'ARN totaux issus de la lignée cellulaire MCF7, UPA négative.

Tous ces résultats ont été confirmés par l'utilisation d'une autre technique d'amplification (RT-PCR quantitative) (UPA: r=0,8029, p<0, 0001, n=81; test statistique de corrélation Spearman). De plus, les résultats obtenus au niveau ARN messager par la technique NASBA pour le gène UPA était corrélés à ceux obtenus au niveau protéique par ELISA (UPA: r 0,5784, p<0,0001, n=77; test statistique de corrélation Spearman). Ces résultats démontrent que l'expression des ARNm est corrélé à la présence de protéines dans le cytosol et le noyau, confirmant l'intérêt d'étudier au niveau ARNm l'expression de ce gène.

Ces résultats démontrent que le duplex UPA/PPIB en NASBA permet une quantification de l'expression du gène UPA à partir d'une très faible quantité d'ARN totaux, et, d'une façon plus large, à partir d'une très faible quantité de cellules tumorales, et est parfaitement adapté pour étudier le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein, et la réponse d'un patient à un traitement donné.

Claims (1)

1. 28 REVENDICATIONS

   1. Procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein comprenant les étapes suivantes: A - on extrait le matériel nucléique d'un échantillon biologique, B - on utilise au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons d'au moins une séquence cible du matériel nucléique C - on utilise au moins une sonde de détection pour détecter la présence desdits amplicons caractérisé en ce que, lors de l'étape B, ladite paire d'amorce comprend au moins une amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nuc léotidique choisie parmi SEQ ID N 1 à SEQ ID N 8 et/ou lors de l'étape C), ladite sonde de détection comprend au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N 9 à SEQ ID N 10.

   2. Procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein selon la revendication 1 caractérisé en ce que, lors de l'étape B, ladite paire d'amorces est choisie parmi les paires d'amorce suivantes: ^ une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 1 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 2; ^ une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 3 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 4; ^ une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 5 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 6; ^ une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 7 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 8.

   3. Procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein selon l'une quelconque des revendication 1 ou 2 dans lequel ladite paire d'amorce comprend au moins une amorce d'amplification comprenant un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7.

   4. Procédé pour le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans lequel, lors de l'étape C, la sonde de détection comprend un flurophore et un quencher.

   5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans lequel la séquence cible est comprise dans un gène choisi parmi PAI-1, UPA-1.

   6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans lequel les étapes B et C sont effectuées en même temps.

   7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'on on utilise, en outre, lors de l'étape B, au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons spécifiques d'un gène de ménage.

   8. Amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N 1 à SEQ ID N 8;.

   9. Amorce d'amplification selon la revendication 8 comprenant un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage 30 T7.

   10. Paire d'amorce d'amplification choisie parmi les paires d'amorces suivantes: ^ une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 1 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 2; ^ une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 3 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 4; ^ une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 5 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 6; ^ une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 7 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N 8; 11. Paire d'amorce selon la revendication 10 dans laquelle ladite première amorce comprend un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7.

   12. Utilisation d'au moins une amorce d'amplification selon la revendication 8 ou 9 et/ou d'une paire d'amorce selon la revendication 10 ou 11 lors d'une réaction d'amplification NASBA 13. Sonde de détection comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N 9 à SEQ ID N 10.

   14. Sonde de détection selon la revendication 13 comprenant un flurophore et un 30 quencher.

   15. Utilisation d'au moins une amorce selon la revendication 8 ou 9 et/ou d'au moins une paire d'amorces selon la revendication 10 ou 11 et/ou d'au moins une sonde de détection selon la revendication 13 ou 14 pour le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein.

   16. Kit pour le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein comprenant au moins une amorce selon la revendication 8 ou 9 et/ou d'au moins une paire d'amorces selon la revendication 10 ou 11 et/ou d'au moins une sonde de détection selon la revendication 13 ou 14.