EP1891238A2 - Procede pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein - Google Patents

Procede pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein

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Publication number
EP1891238A2
EP1891238A2 EP06764851A EP06764851A EP1891238A2 EP 1891238 A2 EP1891238 A2 EP 1891238A2 EP 06764851 A EP06764851 A EP 06764851A EP 06764851 A EP06764851 A EP 06764851A EP 1891238 A2 EP1891238 A2 EP 1891238A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
primer
seq
nucleotide
amplification
nucleotide sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP06764851A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Thibaut Verjat
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP1891238A2 publication Critical patent/EP1891238A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for the diagnosis / prognosis of breast cancer.
  • the invention also relates to amplification primers and hybridization probes that can be used in this method, as well as a breast cancer diagnosis / prognosis kit.
  • hormone therapy which is a general treatment in breast cancer, is used in hormone-dependent breast cancer, that is to say in the case of tumors expressing hormone receptors on the surface of their cells.
  • hormone therapy may be used alone or in combination with adjuvant chemotherapy.
  • hormone therapy may be prescribed either alone, or associated or relay chemotherapy.
  • Chemotherapy for its part, is a general treatment for cancer because the drugs, carried by the bloodstream, can act everywhere in the body. Chemotherapy has an important place in the therapeutic arsenal, especially since a decade, with the appearance of new molecules. The drugs are most often administered by intravenous vein infusion, subcutaneously, intramuscularly.
  • hormonal receptors on the surface of the hormonal cells, the treatment will be oriented towards a hormonal therapy or not.
  • PR progesterone receptor
  • UPA Ultrakinase-type Plasminogen Activator
  • PAI-I Pasminogen Activator Inhibitor Type I
  • the present invention provides a novel method for the diagnosis / prognosis of breast cancer.
  • This method makes use, in particular, of analyzing the expression of the UPA and PAI-I genes by the use of new nucleotide sequences which can be used as amplification primers or hybridization probes.
  • the method according to the invention makes it possible in particular to determine what is the prognosis of a patient suffering from breast cancer, in order to offer him a suitable treatment.
  • the invention relates to a method for the diagnosis / prognosis of breast cancer comprising the following steps:
  • a - the nucleic material is extracted from a biological sample
  • step B at least one pair of amplification primers is used to obtain amplicons of at least one target sequence of the nucleic material
  • C at least one detection probe is used to detect the presence of said amplicons characterized in that, in step B, said primer pair comprises at least one amplification primer comprising at least 10 nucleotide motifs of a nucleotide sequence selected from SEQ ID N 0 I to SEQ ID NO: 8 and / or in step C), said detection probe comprises at least 10 nucleotide units of a nucleotide sequence selected from SEQ ID No. 9 to SEQ ID NO : 10.
  • nucleotide sequence comprising at least 10 nucleotide motifs of a nucleotide sequence chosen from SEQ IDs. No. 1 to SEQ ID NO: 8 is highly relevant as an amplification primer for amplifying target sequences, such as the gene encoding UPA and PAI-I.
  • nucleotide sequence comprising at least 10 nucleotide units of a nucleotide sequence chosen from SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO : 10 as a hybridization probe is very relevant for specific hybridization on target sequences, such as the genes encoding UPA and PAI-I.
  • the term "biological sample” means any sample that may contain a nucleic material as defined below.
  • This biological sample may be taken from a patient and may include a sample of tissues, blood, serum, saliva, circulating cells of the patient. Preferably, this biological sample is taken from a tumor.
  • This biological sample is available by any type of sampling known to those skilled in the art.
  • the nucleic material comprises a nucleic acid sequence such as a deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA) sequence.
  • the nucleic material comprises a deoxyribonucleic acid sequence.
  • the nucleic material is extracted from a biological sample taken from a patient.
  • nucleotide sequence or nucleic acid sequences or nucleotide fragment or oligonucleotide or polynucleotide
  • nucleotide sequence is meant a sequence of nucleotide units assembled together by phosphoric ester bonds, characterized by the informational sequence of the naturally occurring nucleic acids, which may hybridize to another nucleic acid sequence, the sequence may contain monomers of different structures and be obtained from a natural nucleic acid molecule and / or or by genetic recombination and / or chemical synthesis.
  • nucleotide motif is meant a derivative of a monomer which may be a natural nucleotide nucleic acid whose constituent elements are a sugar, a phosphate group and a nitrogen base; in the DNA sugar is deoxy-2-ribose, in RNA the sugar is ribose; depending on whether it is DNA or RNA, the nitrogenous base is chosen from adenine, guanine, uracil, cytosine, thymine; or the monomer is a modified nucleotide in at least one of the three constituent elements; for example, the modification can take place either at the level of the bases, with modified bases such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, deoxyuridine, dimethylamino-5-deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo Deoxyuridine or any other modified base capable of hybridization, either at the sugar level, for example the replacement of at least one deoxyribose with a polyamide (PE Nielsen
  • the nucleotide sequence is specific for a target gene, such as, preferably, the gene encoding UPA or PAI-I According to a preferred embodiment of the invention, the target sequence is included in a gene. selected from the genes encoding UPA or PAI-I. In the rest of the talk, we will talk about the target sequence whether it is single-stranded or double-stranded.
  • the nucleic material is extracted from a biological sample by any protocol known to those skilled in the art.
  • the nucleic acid extraction may be carried out by a step of the cells present in the biological sample, in order to release the nucleic acids contained in the protein and / or lipid envelopes of the cells (such as debris). cells that disrupt subsequent reactions).
  • lysis methods such as described in patent applications WO 00/05338 on magnetic and mechanical mixed lysis, WO 99/53304 on electrical lysis, and WO 99/15321 on mechanical lysis.
  • lysis step may also be followed by a purification step, allowing the separation between the nucleic acids and the other cellular constituents released in the lysis step.
  • This step generally allows the nucleic acids to be concentrated, and may be suitable for DNA or RNA purification.
  • magnetic particles optionally coated with oligonucleotides by adsorption or covalence (see in this regard US Pat. No. 4,672,040 and US Pat. No.
  • nucleic acids that have attached to these magnetic particles.
  • This nucleic acid purification step is particularly advantageous if it is desired to subsequently amplify said nucleic acids.
  • a particularly interesting embodiment of these magnetic particles is described in patent applications WO 97/45202 and WO 99/35500.
  • Another interesting example of a method for purifying nucleic acids is the use of silica either in the form of a column or in the form of inert particles (Boom R. et al., J. Clin Microbiol., 1990, No. 28 ( . 3), pp 495-503) or magnetic (Merck: Silica MagPrep ®, Promega: MagneSil TM Paramagnetic particles).
  • amplification primer means a nucleic sequence comprising from 10 to 100 nucleotide units, preferably from 15 to 25 nucleotide units.
  • This amplification primer comprises at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of a sequence chosen from SEQ ID NO : 1 to 8.
  • a pair of amplification primers allows the initiation of an enzymatic polymerization, such as in particular an enzymatic amplification reaction.
  • enzymatic amplification reaction is meant a process generating multiple copies (or amplicons) of a nucleic sequence by the action of at least one enzyme.
  • amplicons refers to the copies of the target sequence obtained during an enzymatic amplification reaction.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • LCR Liigase Chain Reaction
  • RCR Repair Chain Reaction
  • 3SR Self Sustained Sequence Replication
  • NASBA Nucleic Acid Sequence-B ased Amplification
  • TMA Transcription Mediated Amplification
  • these enzymatic amplification reactions generally put a succession of cycles comprising the following steps: denaturation of the target sequence if it is double-stranded in order to obtain two complementary target strands, where hybridization of each of the target strands, obtained during the preceding denaturation step with at least one amplification primer, where the formation from the amplification primers of the complementary strands to the strands on which they are hybridized in the presence of a polymerase enzyme and nucleoside triphosphate (ribonucleoside triphosphate and / or deoxyribonucleoside triphosphate according to the techniques) this cycle being repeated a number of times determined to obtain the target sequence in a proportion sufficient to allow its detection.
  • Hybridization is understood to mean the process in which, under appropriate conditions, two nucleic sequences, such as in particular an amplification primer and a target sequence or a hybridization probe and a target sequence, bind with stable hydrogen bonds and specific to form a double strand. These hydrogen bonds are formed between the complementary bases Adenine (A) and thymine (T) (or uracil (U)) (we speak of A-T bond) or between the complementary bases Guanine (G) and cytosine (C) (on talk about GC link). Hybridization of two nucleic sequences can be complete (called complementary sequences), that is to say that the double strand obtained during this hybridization comprises only AT bonds and CG bonds.
  • Hybridization between two complementary or sufficiently complementary sequences depends on the operating conditions that are used, and in particular on stringency.
  • the stringency is defined in particular according to the base composition of the two nucleic sequences, as well as by the degree of mismatch between these two nucleic sequences.
  • the stringency may also be a function of the parameters of the reaction, such as the concentration and type of ionic species present in the hybridization solution, the nature and the concentration of denaturing agents and / or the hybridization temperature. All these data are well known and the appropriate conditions can be determined by those skilled in the art.
  • NASBA is an isothermal amplification technology for nucleic acid based on the joint action of three enzymes (AMV reverse transcriptase, Rnase-H and T7-RNA polymerase). Combined with specific amplification primers of a target sequence, it amplifies RNA targets more than a billion times in 90 minutes. The amplification reaction occurs at 41 ° C. and gives single-stranded RNA molecules as final product.
  • NASBA requires a primer pair, at least one of which comprises a promoter for initiating transcription by bacteriophage T7 polymerase.
  • a primer is preferably chosen from SEQ ID Nos. 11 and 12.
  • said pair of primer comprises at least one amplification primer comprising a promoter allowing the initiation of transcription by a bacteriophage T7 polymerase.
  • said pair of primers, used in step B is chosen from the following primer pairs: a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and more more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID NO 1 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No.
  • a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide motifs of the nucleotide sequence SEQ ID N 0 3 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 units nucleotides of the nucleotide sequence SEQ ID No.
  • a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 5 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 units; nucleotides of the SEQ nucleotide sequence ID No. 6; as an indication, when the first primer has the sequence SEQ ID No.
  • a amplicon, specific for the UPA gene a size of 194 pairs base, which corresponds to the 1661 - 1855 sequence on the reference UPA coding sequence (Genbank NM_002658.1).
  • a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 7 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 units; nucleotides of the nucleotide sequence SEQ ID NO : 8; as an indication, when the first primer has the sequence of SEQ ID No. 7, and the second primer is SEQ ID No. 8, then an amplicon, specific for the gene encoding UPA, having a size of 927 is obtained. base pairs, which corresponds to the sequence 1228-2155 on the reference UPA coding sequence (Genbank NM_002658.1).
  • said pair of primers used in step B, comprises a first primer comprising a promoter allowing the initiation of transcription by a bacteriophage T7 polymerase, is chosen from the pairs following primer: a first amplification primer of SEQ ID No. 11 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 2; a first primer for amplifying SEQ ID NO 0 12 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide motifs of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 6.
  • the expression of a target gene can be normalized by the simultaneous determination of the expression of a said gene. cleaning whose expression is similar in different groups of patients. By realizing a relationship between the expression of the target gene and the expression of the household gene, this corrects any variability between the different experiments.
  • Those skilled in the art may refer in particular to the following publications: Bustin SA Journal of Molecular Endocrinology, 2002, 29: 23-39; Giulietti A Methods, 2001, 25: 386-401.
  • at least one pair of amplification primers is used, in addition, during step B to obtain amplicons specific for a household gene.
  • household gene is meant a gene whose expression is stable in a given tissue, and whatever the physiological situation.
  • the household gene is the PPIB gene which encodes cyclophyllin B.
  • step C at least one detection probe is used to detect the presence of said amplicons.
  • This detection step can be carried out by any protocol known to those skilled in the art concerning the detection of nucleic acids.
  • the expression "hybridization probe” is intended to mean a nucleic sequence of from 10 to 100 nucleotide motifs, in particular from 15 to 35 nucleotide units, having hybridization specificity under determined conditions to form a hybridization complex. with a target nucleic sequence.
  • the hybridization probe may comprise a marker for its detection. We then speak of detection probes. By detection is meant either direct detection by a physical method, or indirect detection by a detection method using a marker. Many detection methods exist for the detection of nucleic acids.
  • marker is meant a tracer capable of generating a signal that can be detected.
  • a non-limiting list of these tracers includes enzymes that produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence or luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, beta galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase; chromophores like fluorescent, luminescent or coloring compounds; electron density groups detectable by electron microscopy or by their electrical properties such as conductivity, by amperometry or voltammetry methods, or by impedance measurements; groups detectable by optical methods such as diffraction, surface plasmon resonance, contact angle variation or by physical methods such as atomic force spectroscopy, tunneling effect, etc. ; radioactive molecules such as 32 P, 35 S or 125 I.
  • the hybridization probe may be a so-called detection probe
  • the so-called detection probe is labeled by means of a marker as defined above. Thanks to the presence of this marker, it is possible to detect the presence of a hybridization reaction between a given detection probe and the specific target sequence of a given species.
  • the detection probe may in particular be a "molecular beacon” detection probe as described by Tyagi & Kramer (Nature biotech, 1996, 14: 303-308). These "molecular beacons” become fluorescent during hybridization. They have a stem-loop structure and contain a fluorophore and a "quencher” group. Attachment of the specific loop sequence with its target nucleic acid complement sequence causes stem unwinding and fluorescent signal emission upon excitation at the appropriate wavelength.
  • the hybridization probe may also be a so-called capture probe. In this case, the so-called capture probe is immobilized or immobilizable on a solid support by any appropriate means, that is to say directly or indirectly, for example by covalence or adsorption. The hybridization reaction between a given capture probe and a target sequence is then detected.
  • labeled target sequences can be used directly (in particular by the incorporation of a marker within the target sequence) or indirectly (especially by the use of a detection probe as defined above) the target sequence.
  • the cleavage can be achieved in particular by the action of imidazole and manganese chloride.
  • the target sequence may also be labeled after the amplification step, for example by hybridizing a detection probe according to the sandwich hybridization technique described in WO 91/19812. Another particular preferred mode of nucleic acid labeling is described in application FR 2 780 059.
  • a solid support it is possible to use synthetic materials or natural materials, optionally chemically modified, in particular polysaccharides such as cellulose-based materials, for example paper, cellulose derivatives such as cellulose acetate and cellulose. nitrocellulose or dextran, polymers, copolymers, especially based on styrene-type monomers, natural fibers such as cotton, and synthetic fibers such as nylon; mineral materials such as silica, quartz, glasses, ceramics; latexes; magnetic particles; metal derivatives, gels etc.
  • the solid support may be in the form of a microtiter plate, a membrane as described in patent application WO 94/12670, of a particle.
  • the detection probe comprises a flurophore and a quencher.
  • the hybridization probe comprises a FAM (6-carboxy-fluorescein) or ROX (6-carboxy-X-rhodamine) flurophore at its 5 'end and a quencher (Dabsyl). ) at its end 3 '.
  • FAM 6-carboxy-fluorescein
  • ROX 6-carboxy-X-rhodamine
  • steps B and C are performed at the same time.
  • This preferred mode can be implemented by "NASBA in real time” which combines in a single step the NASBA amplification technique and real-time detection that uses "molecular beacons".
  • the NASBA reaction occurs in the tube, producing single-stranded RNA with which specific "molecular beacons” can hybridize simultaneously to give a fluorescent signal.
  • the formation of the new RNA molecules is measured in real time by continuous control of the signal in a fluorescent reader.
  • amplification in NASBA can be done in the presence of DNA in the sample, ie even if the DNA was not completely removed during RNA extraction.
  • step b) when it is desired to detect the target gene encoding PAI-I (reference sequence NCBI accession number: NM_000602.1), it is preferentially used in step b) o a first primer of SEQ ID N 0 I 11 or a second primer of SEQ ID NO: 2 and in step c) o a detection probe comprising SEQ ID N 0 9.
  • step b) when it is desired to detect the target gene encoding UPA (reference sequence NCBI accession number: NM_002658.1), it is preferentially used in step b) o a first primer of SEQ ID No. 5 or 12 o a second primer of SEQ ID N 0 6 and in step c) o a detection probe comprising SEQ ID N 0 IO
  • the household gene is the PPIB gene which encodes cyclophyllin B.
  • the detection probe comprises a flurophore and a quencher.
  • the invention also relates to an amplification primer comprising at least 10, preferably 15, and even more preferably 20 nucleotide units of a nucleotide sequence selected from SEQ ID NO : 1 to SEQ ID NO : 8.
  • the amplification primer comprises a promoter allowing the initiation of transcription by a polymerase of the bacteriophage T7.
  • This primer can be in particular any one of SEQ ID N 0
  • the invention also relates to a primer pair chosen from the following pairs of primers: a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide motifs of the nucleotide sequence SEQ ID N 0 I and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No.
  • a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide motifs of the nucleotide sequence SEQ ID N 0 3 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 units nucleotides of the nucleotide sequence SEQ ID No.
  • a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 5 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 units; nucleotides of the nucleotide sequence SEQ ID No. 6; as an indication, when the first primer has the sequence SEQ ID No.
  • a amplicon, UPA gene specific, 194 base pairs in length which corresponds to the 1661-1855 sequence on the UPA reference coding sequence (Genbank NM_002658.1) o a first amplification primer comprising at least 10, preferentially and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 7 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID NO : 8; as an indication, when the first primer has the sequence of SEQ ID No. 7, and the second primer is SEQ ID No. 8, then an amplicon, specific for the gene encoding UPA, having a size of 927 is obtained. base pairs, which corresponds to the sequence 1228-2155 on the reference UPA coding sequence (Genbank NM_002658.1).
  • said first primer comprises a promoter for initiating transcription by a bacteriophage T7 polymerase.
  • This primer may in particular be any of SEQ ID Nos. 11 to 12.
  • this first primer is preferably included in a primer pair. selected from the following primer pairs: a first amplification primer of SEQ ID No. 21 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide motifs of the nucleotide sequence SEQ ID N 2; a first amplification primer of SEQ ID No. 22 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide motifs of the nucleotide sequence SEQ ID No. 4;
  • the invention also relates to the use of at least one amplification primer as defined above and / or at least one primer pair as defined above during a NASBA amplification reaction.
  • the invention also relates to a detection probe comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of a nucleotide sequence selected from SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO : 10.
  • this detection probe comprises a flurophore and a quencher.
  • the invention also relates to the use of at least one primer as defined above and / or at least one primer pair as defined above and / or at least one detection probe as defined previously for the diagnosis / prognosis of breast cancer.
  • the invention finally relates to a kit for the diagnosis / prognosis of a breast cancer comprising at least one primer as defined above and / or at least one primer pair as defined above and / or at least one a detection probe as defined above.
  • the kit when it is desired to detect the target gene encoding PAI-I, the kit preferably comprises o a first primer of SEQ ID No. 1 or 11 o a second primer of SEQ ID No. 2 o a detection probe comprising SEQ ID N 0 9.
  • the kit when it is desired to detect the target gene encoding UPA, the kit preferably comprises o a first primer of SEQ ID No. 5 or 12 o a second primer of SEQ ID N 0 6 o a detection probe comprising SEQ ID N 0 IO
  • the invention also relates to a kit for the diagnosis / prognosis of breast cancer which makes it possible to determine
  • the kit comprises the necessary reagents, such as primers and / or probes, for the detection of genes ER, PR, HER-2, UPA, PAI-I.
  • primers and probes necessary for the detection of genes ER, PR, HER-2 those skilled in the art will refer in particular to patent application PCT / FR04 / 050661 which is included by reference.
  • primers and probes necessary for the detection of UPA and PAI-I genes those skilled in the art will refer to the previously developed discussion.
  • FIG. 1 represents the standard curves obtained for the PAI-1 and PPIB genes (FIG. 1a, PAI-I in solid lines, PPIB in dashed lines), UPA and PPIB (FIG. 1b, UPA in solid lines, PPIB in dashed lines, such as described in the example below:
  • Each standard curve, obtained for each gene from a reference sequence which is specific for the gene, transcribed in vitro in RNA from the UPA and PAI-I gene-specific PCR product respectively and of a plasmid for the PPIB gene represents the time of appearance of the exponential phase of the amplification (we also speak of TTP: time to positivity, threshold time) as a function of the number of RNA copies present at the beginning of amplification by NASBA (the higher the starting amount of RNA copies is important at the beginning of the amplification, the shorter the time of appearance of the exponential phase).
  • MDA-MD-231 expressing the factors UPA and PAI-I
  • MCF7 not expressing UPA, ri PAI-I
  • ATCC American Type Culture Collection
  • MCF7 not expressing UPA, ri PAI-I
  • ATCC American Type Culture Collection
  • MCF7 not expressing UPA, ri PAI-I
  • ATCC American Type Culture Collection
  • MCF7 not expressing UPA, ri PAI-I
  • These lines come from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA). These cell lines were cultured in DMEM (MCF-7) or Leibovitz (MDA-MD-231), supplemented with fetal beef serum (10%), non-essential amino acids (1%) and penicillin (50%).
  • 000U - streptomycin (50 ⁇ g) at 37 ° C. under an atmosphere comprising 5% of CO2 for MCF7 and 0% of MD A-MD-231.
  • the ELISA technique informed us about the expression of the protein.
  • RNAs were extracted from cell lines by the use of Trizol® Reagent as recommended by the kit supplier (Invitrogen, Canada). The quality and quantity of RNA were determined at 260 and 280 nm and checked on agarose gel. The RNAs were then frozen at -70 ° C. until use. Total RNAs have also been similarly extracted from tumors of patients with breast cancer.
  • the amplification reaction by NASBA is based on the simultaneous activity of a reverse transcriptase of avian myeloblast virus (AMV-RT), a RNAse H of E. coli and bacteriophage T7 RNA polymerase (Compton J, 1991, Nature, 350: 91-92).
  • AMV-RT avian myeloblast virus
  • RNAse H of E. coli and bacteriophage T7 RNA polymerase Compton J, 1991, Nature, 350: 91-92
  • the real-time detection of the amplicons is achieved by the use of a Nuclisens EasyQ® reader (bioMérieux BV, The Netherland) and "molecular beacon" detection probes, as defined above.
  • Quantification in NASBA is based on the use of a standard curve, obtained from a reference sequence, specific for the target gene, transcribed in vitro in RNA in a plasmid.
  • This standard curve represents the time of onset of the exponential phase of amplification as a function of the number of RNA copies present at the beginning of amplification by NASBA (the greater the starting amount of RNA copies is important at the beginning of the amplification, the time of appearance of the exponential phase is short).
  • a first primer of SEQ ID NO: 3 '' CCAGCCCTCA CCTGCCTAGT 3 '' having an additional sequence corresponding to the SP6 promoter was used.
  • RNAs obtained above were diluted to different concentrations (stock solution: 0.2 10 11 copies / ⁇ l, dilution in cascade 0.2 10 11 copies / ⁇ l at 0.2 ⁇ 10 2 copies / ⁇ l).
  • stock solution 0.2 10 11 copies / ⁇ l
  • cascade dilutions were amplified by NASBA using the kit Nuclisens Basic ® (bioMérieux BV, The Netherlands) in the presence of PAI-1 specific primers SEQ ID N 0 1 and PAI-1 # 2 and "molecular beacons"
  • SEQ ID NO: 9 a 0.2 ⁇ M of a first PAI-I primer of SEQ ID NO : 5 CTCCTTTCCC
  • AAGCAAGTTG 3 ' comprising, at its end 5', and indicated in lower case, a sequence comprising the promoter of the T7 polymerase, that is to say a first primer whose entire sequence is SEQ ID No. 11 : 5 'aattctaatacgactcactatagggagaaggCTCCTTTCCC AAGC AAGTTG 3' to 0.2 ⁇ M of a second primer PAI-I of SEQ ID NO: 2 5 'GGGCCATGGA
  • the fluorescence curve as a function of time makes it possible to define the time or the exponential phase of the amplification will start (also called TTP: time to positivity, threshold time).
  • the standard PAI-I curve links the number of transcripts initially present in the solution according to the TTP detected during NASBA amplification. Using a standard curve, the number of copies of the target gene is calculated absolutely. Finally, this value is normalized thanks to a household gene, in this case the PPIB gene.
  • This standard curve PAI-I shown in Figure la (curve in solid line).
  • the curve of the target gene coding for UPA was carried out according to the same principle as for PA-1, with the exception of the amplification primers used and the "molecular beacons", which were specific for UPA.
  • a first primer of SEQ ID No. 7 5 'CCAAGGCCGC ATGACTTTGA 3' and a second one of SEQ ID No. 8 was used.
  • RNA polymerase T7 or SP6 (Megascript® kit, Ambion, Austin, USA), depending on the orientation of the amplicon).
  • T7 or SP6 Megascript® kit, Ambion, Austin, USA
  • the RNAs were purified by Rneasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) and quantified. (RNA6000Nano, Agilent Technologies, Walbronn, Germany).
  • the amplicons obtained were well specific to the PAI-I gene.
  • RNAs obtained above were diluted to different concentrations (stock solution: 0.2 10 11 copies / ⁇ l, dilution in cascade 0.2 10 11 copies / ⁇ l at 0.2 ⁇ 10 2 copies / ⁇ l). These cascade dilutions are amplified by NASBA using the Nuclisens basic® kit (bioMérieux BV, The Netherlands) in the presence of 0.2 ⁇ M of a first UPA primer of SEQ ID No.
  • CCTGTGCATG 3 ' o 0.1 ⁇ M of "molecular beacons” used comprising SEQ ID NO : 10' TGTAAGCAGC TGAGGTCT 3 ', labeled with a FAM fluorophore (6-carboxy-fluorescein) at their 5' end, and a "quencher” (Dabsyl) at its 3 'end (complete sequence: 5' FAM-TGTAAGCAGC TGAGGTCT cgatcg-Oabsyl 3 ').
  • the standard curve UPA is represented in FIG.
  • the curve of the target gene PPIB was carried out according to the same principle as for PAI-I, with the exception of the amplification primers and the "molecular beacons", which were specific to PPIB.
  • PPIB housekeeping gene NCBI accession number: M60857
  • a first primer of SEQ ID N 0 13 5 'AC ATGAAGGT GCTCCTTGCC 3' and a second primer of SEQ ID N 0 14 5 'GTCCCTGTGC CCTACTCCTT 3' respectively located in positions 11-30 and 631-650 of the reference sequence.
  • the sequence of these PPIB amplicons was verified by sequencing (Biofidal, Vaulx en Velin, France) to ensure that it matched the sequence of the target gene that was to be amplified.
  • the amplicons obtained were well specific to the PPIB gene.
  • RNA polymerase T7 or SP6 (Megascript® kit, Ambion, Austin, USA), depending on the orientation of the amplicon).
  • T7 or SP6 Megascript® kit, Ambion, Austin, USA
  • the RNAs were purified by Reasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) and quantified (RNA6000Nano, Agilent Technologies, Walbronn, Germany).
  • RNAs obtained above were diluted to different concentrations (stock solution: 0.2 10 11 copies / ⁇ l, dilution in cascade 0.2 10 11 copies / ⁇ l at 0.2 ⁇ 10 2 copies / ⁇ l). These cascade dilutions are amplified by NASBA using the Nuclisens basic® kit (bioMérieux BV, The Netherlands) in the presence of: a 0.2 ⁇ M of a first PPIB primer of SEQ ID No.
  • GGATTTGGCT 3 'o 0, l ⁇ M of "molecular beacons” comprising SEQ ID No. 15 5' GATCCAGGGCGGAGACTTCA 3 ', labeled with a fluorophore ROX (6-carboxy-X-rhodamine) in 5', and a "quencher” (Dabsyl) at 3 '(complete sequence: 5' ROX-cgatcgGATCCAGGGCGGAGACTTCAcga cg-Dabsyl 3 'The standard curve PPIB is shown in FIGURE 1A and IB (dashed lines).
  • This amplification reaction was carried out using a Nuclisens basic® kit (bioMérieux BV, The Netherlands). For this, 5 ng of total RNA, extracted from the various cell lines, were added to 10 ⁇ l of NASBA buffer (final concentration in 20 ⁇ l of reaction medium: 40 mM Tris HCl pH 8.5, 12 mM MgCl 2, 70 mM KCl , 5mM dithiotreitol, 15% v / v DMSO, 1mM each dNTP, 2mM each NTP).
  • 0.1 ⁇ M of "molecular beacons” comprising SEQ ID NO: 9, labeled with a 5 'FAM (6-carboxy-fluorescein) fluorophore, and a 3' quencher (Dabsyl) for the detection of PAI-1 gene RNAs.
  • SEQ ID NO : 15 labeled with a 5 'ROX (6-carboxy-X-rhodamine) fluorophore, and a 3''quencher (Dabsyl) for the detection of RNAs of the PPIB gene, medium was also added: o 0.2 ⁇ M of a first PAI-I primer of SEQ ID NO : 1, comprising, at its 5 'end, a sequence comprising the T7 polymerase promoter, o 0.2 ⁇ M of a second primer PAI-1 of SEQ ID No.
  • Preincubation was carried out for 2 minutes at 65 ° C. before incubation for 2 minutes at 41 ° C.
  • a volume of 5 ⁇ l of an enzyme mixture (0.08 ⁇ l of RNAse H, 32 ⁇ l of T7 RNA polymerase, 6.4 U of AMV-RT) was added, and a 90 minute incubation was carried out at 41 ° C.
  • the quantification of the transcribed RNAs was determined in real time (NucliSens EasyQ, bioMérieux), the NASBA reaction producing amplicons with which the specific "molecular beacons" can hybridize simultaneously to give a fluorescent signal.
  • the formation of the new RNA molecules is measured in real time by continuous monitoring of the signal in a fluorescent reader, the NucliSens EasyQ analyzer. Automated data analysis and communication is provided by Nuclisens TTP software (bioMérieux BV, The Netherlands).
  • the standard curve, as defined previously RNA dilution transcribed: 10 8 to 10 2 copies
  • Table 1 shows the expression of the PAI-I gene quantified from 5 ng of total RNA from the MDA-MD-231, MCF7 cell lines.
  • Table 2 shows the expression of the PAI-I gene quantified from 50 ng of total RNA originating from ELISA + tumors, ie expressing the PAI-I protein, or of ELISA- tumors.
  • the expression of the PAI-I gene was expressed by the ratio between the number of mRNA copies of the target gene and the number of mRNA copies of the housekeeping gene. Overexpression of the PAI-1 gene was observed in ELISA + tumors.
  • PAI-1 / PPIB duplex in NASBA allows quantification of PAI-I gene expression from a very small amount of total RNA, and, more broadly, from a very small amount of tumor cells, and is perfectly suited to study the diagnosis / prognosis of breast cancer, and the response of a patient to a given treatment.
  • This amplification reaction was carried out using a Nuclisens basic® kit (bioMérieux BV, The Netherlands). For this, 5 ng of total RNA, extracted from the various cell lines, were added to 10 ⁇ l of NASBA buffer (final concentration in 20 ⁇ l of reaction medium: 40 mM Tris HCl pH 8.5, 12 mM MgCl 2, 70 mM KCl , 5mM dithiotreitol, 15% v / v DMSO, 1mM each dNTP, 2mM each NTP).
  • 0.1 ⁇ M of "molecular beacons" comprising SEQ ID NO : 10, labeled with a FAM fluorophore (6-carboxy-fluorescein) at their 5 'end, and a quencher were added.
  • Preincubation was carried out for 2 minutes at 65 ° C. before incubation for 2 minutes at 41 ° C.
  • a volume of 5 ⁇ l of an enzyme mixture (0.08 ⁇ l of RNAse H, 32 ⁇ l of T7 RNA polymerase, 6.4 U of AMV-RT) was added, and a 90 minute incubation was carried out at 41 ° C.
  • RNA dilution transcribed 10 8 to 10 2 copies
  • Quantification of target gene expression was expressed as the number of mRNA copies / 5ng of total RNA.
  • Table 3 shows the expression of the UPA gene quantified from 5 ng of total RNA from MCF-7 and MDA-MD-231 cell lines.
  • UPA gene expression was expressed as the ratio of the target gene mRNA copy number to the mRNA copy number of the housekeeping gene. Thus, UPA mRNAs were expressed in MDA321 cells whereas they were not detected in MCF-7 cells, consistent with the expression of these cells.
  • Table 4 shows the expression of the UPA gene quantified from 50 ng of total RNA from ELISA + tumors or ELISA- tumors.
  • UPA gene expression was expressed as the ratio of the target gene mRNA copy number to the mRNA copy number of the housekeeping gene. Overexpression of the UPA gene was observed in ELISA + tumors.
  • the detection limit and the limit of quantification were determined for the duplex amplified UPA and PPIB genes.
  • the limit of quantification was determined at 1000 and 4 copies of mRNA for UPA and PPIB, respectively.
  • the detection limit was 100 copies of mRNA for UPA and PPIB.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein comprenant les étapes suivantes : A - on extrait le matériel nucléique d'un échantillon biologique, B - on utilise au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons d'au moins une séquence cible du matériel nucléique, C - on utilise au moins une sonde de détection pour détecter la présence desdits amplicons caractérisé en ce que, lors de l'étape B, ladite paire d'amorce comprend au moins une amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N° I à SEQ ID N°8 et/ou lors de l'étape C), ladite sonde de détection comprend au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°9 à SEQ ID N°10. L'invention concerne également des amorces d'amplification et des sondes d'hybridation qui peuvent être mises en œuvre dans ce procédé, ainsi qu'un kit de diagnostic/pronostic du cancer du sein.

Description

Procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein
La présente invention concerne un procédé pour le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein. L'invention concerne également des amorces d'amplification et des sondes d'hybridation qui peuvent être mises en oeuvre dans ce procédé, ainsi qu'un kit de diagnostic/pronostic du cancer du sein.
Le cancer du sein est une maladie fréquente : une femme sur onze développe un cancer du sein au cours de sa vie. Cependant, parce qu'il existe différents types de cancers du sein, et différents pronostic du cancer du sein, les femmes qui en sont atteintes ne suivent pas toutes le même traitement : le médecin propose à chaque patiente un traitement adapté à sa situation, afin d'obtenir les meilleures chances de guérison. Ainsi, l'hormonothérapie, qui est un traitement général dans les cancers du sein, est utilisé dans les cancers du sein hormono- dépendants, c'est à dire dans le cas de tumeurs exprimant des récepteurs hormonaux à la surface de leurs cellules. En post-opératoire, l'hormonothérapie peut être utilisée seule ou en relais de la chimiothérapie adjuvante. Dans le cadre d'une récidive de la maladie, l'hormonothérapie peut être prescrite soit seule, soit associée ou en relais d'une chimiothérapie.
La chimiothérapie, est quant à elle, un traitement général du cancer puisque les médicaments, portés par la circulation sanguine, peuvent agir partout dans l'organisme. La chimiothérapie a une place importante dans l'arsenal thérapeutique, particulièrement depuis une dizaine d'années, avec l'apparition de nouvelles molécules. Les médicaments sont le plus souvent administrés en perfusion par voie veineuse, en voie sous -cutanée, en intra- musculaire.
Ainsi, en fonction de l'expression des récepteurs hormonaux à la surface des cellules hormonales, le traitement sera orienté vers une hormonotérapie ou non. On peut citer notamment les récepteurs à l'œstrogène ER et le récepteur à la progestérone (PR), qui sont les paramètres les plus connus pour prédire la réponse à une hormono thérapie dans le cancer du sein. L'analyse de l'expression des gènes UPA (Urokinase-type Plasminogen Activator) et PAI-I (Plasminogen Activator Inhibitor type I) permet également de bénéficier d'un outil de pronostic du cancer du sein. Ces gènes sont impliqués dans la destruction de la matrice extracellulaire, et sont donc de ce fait des facteurs impliqués dans le développement métastasique des tumeurs (Andreasen et al, Int. J. Cancer, 1997).
Afin de proposer aux patientes un traitement adapté, il est donc essentiel de connaître l'expression des récepteurs hormonaux, tels que ER et PR. Cette expression est étudiée le plus souvent sur la tumeur primitive par immunohistochimie. En outre, il est important de connaître l'expression du récepteur HER2, dont la surexpression, étudiée par immunohistochimie, est un facteur de mauvais pronostique. Dans les cas douteux, l'étude d'une amplification génique du gène HER2 par hybridation in situ (FISH) est la méthode alternative utilisée. Enfin, l'analyse de l'expression de UPA et PAI-I, facteurs d'agressivité de la tumeur est étudié par ELISA (Enzyme -Linked Immunosorbent
Assay).
Depuis quelques années, des tumeurs de petites tailles peuvent être détectées, permettant un diagnostic précoce d'un cancer du sein, mais le pronostic de ce cancer reste alors difficile de part la faible quantité de tissu tumoral qui rend difficile la quantification protéique des récepteurs hormonaux et facteurs mentionnés précédemment.
La présente invention propose un nouveau procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein. Ce procédé met notamment en oeuvre l'analyse de l'expression des gènes UPA et PAI-I par l'utilisation de nouvelles séquences nucléotidiques qui peuvent être utilisées en tant qu'amorces d'amplification ou de sondes d'hybridation. Le procédé selon l'invention permet notamment de déterminer quel est le pronostic d'un patient atteint d'un cancer du sein, afin de lui proposer un traitement adapté.
A ce titre, l'invention concerne un procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein comprenant les étapes suivantes :
A - on extrait le matériel nucléique d'un échantillon biologique,
B - on utilise au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons d'au moins une séquence cible du matériel nucléique C - on utilise au moins une sonde de détection pour détecter la présence desdits amplicons caractérisé en ce que, lors de l'étape B, ladite paire d'amorce comprend au moins une amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N0I à SEQ ID N°8 et/ou lors de l'étape C), ladite sonde de détection comprend au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°9 à SEQ ID N0IO.
D'une manière surprenante, les inventeurs ont ainsi découvert que l'utilisation, dans un procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein, d'une séquence nucléotidique comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi les SEQ ID N0I à SEQ ID N°8 est très pertinent en tant qu'amorce d'amplification pour amplifier des séquences cibles, tels que le gène codant UPA et PAI-I. Les inventeurs ont également découvert que l'utilisation d'une séquence nucléotidique comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi les SEQ ID N°9 à SEQ ID N0IO en tant que sonde d'hybridation est très pertinente pour une hybridation spécifique sur des séquences cibles, tels que les gènes codant UPA et PAI-I.
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon biologique, tout échantillon susceptible de contenir un matériel nucléique tel que défini ci après. Cet échantillon biologique peut être prélevé chez un patient et peut être notamment un échantillon de tissus, de sang, de sérum, de salive, de cellules circulantes du patient. Préférentiellement, cet échantillon biologique est prélevé d'une tumeur. On dispose de cet échantillon biologique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier. Au sens de la présente invention, le matériel nucléique comprend une séquence d'acides nucléiques telle que une séquence d'acides désoxyribonucléiques (ADN) ou d'acides ribonucléiques (ARN). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel nucléique comprend une séquence d'acides désoxyribonucléiques. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel nucléique est extrait d'un échantillon biologique prélevé chez un patient.
Par séquence nucléotidique (ou séquences d'acides nucléiques ou fragment nucléotidique ou oligonucléotide, ou polynucléotide), on entend un enchaînement de motifs nucléotidiques assemblés entre eux par des liaisons ester phosphorique, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à une autre séquence d'acides nucléiques, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures différentes et être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique. Par motif nucléotidique, on entend un dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose ; selon qu'il s'agisse de l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le monomère est un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5désoxyuridine, la diamino - 2,6 - purine, la bromo - 5 désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide (P.E. Nielsen et al, Science, 254, 1497-1500 (1991), soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl - et aryl-phosphonates et phosphorothioates. Ce matériel nucléique comprend au moins une séquence cible. Par séquence cible, on entend une séquence dont l'enchaînement en motifs nucléotidiques est spécifique d'un gène cible, tel que préférentiellement le gène codant UPA ou PAI-I. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la séquence cible est comprise dans un gène choisi parmi les gènes codant UPA ou PAI-I. Dans la suite de l'exposé, on parlera de séquence cible qu'elle soit en simple brin ou en double brin.
Lors de l'étape A, on extrait le matériel nucléique d'un échantillon biologique par tout protocole connu de l'homme du métier. A titre indicatif, l'extraction d'acides nucléique peut être réalisée par une étape de Iy se des cellules présentes dans l'échantillon biologique, afin de libérer les acides nucléiques contenus dans les enveloppes protéiques et/ou lipidiques des cellules (comme des débris cellulaires qui perturbent les réactions ultérieures). A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrite dans les demandes de brevet WO 00/05338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique, WO 99/53304 sur la lyse électrique, et WO 99/15321 sur la lyse mécanique. L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues, telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les lyses chimiques par des agents chaotropiques tels que les sels de guanidium (US 5,234,809). Cette étape de lyse peut également être suivie d'une étape de purification, permettant la séparation entre les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse. Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques, et peut être adapté à la purification d'ADN ou d'ARN. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnétiques éventuellement revêtues d'oligonucléotides, par adsorption ou covalence (voir à ce sujet les brevets US 4,672,040 et US 5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet WO 97/45202 et WO 99/35500. Un autre exemple intéressant de méthode de purification des acides nucléiques est l'utilisation de silice soit sous forme de colonne, soit sous forme de particules inertes (Boom R. et al., J. Clin. Microbiol., 1990, n°28(3), p. 495-503) ou magnétiques (Merck: MagPrep® Silica, Promega: MagneSil™ Paramagnetic particles). D'autres méthodes très répandues reposent sur des résines échangeuses d'ions en colonne ou en format particulaire paramagnétique (Whatman: DEAE-Magarose) (Levison PR et al., J. Chromatography, 1998, p. 337-344). Une autre méthode très pertinente mais non exclusive pour l'invention est celle de l' adsorption sur support d'oxyde métallique (société Xtrana: matrice Xtra-Bind™). Lorsque l'on souhaite extraire spécifiquement l'ADN d'un échantillon biologique, on peut notamment réaliser une extraction par du phénol, du chloroforme et de l'alcool pour éliminer les protéines et précipiter l'ADN avec de l'alcool 100%. L'ADN peut alors être culoté par centrifugation, lavé et remis en suspension .
Lors de l'étape B, on utilise au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons d'au moins une séquence cible du matériel nucléique. Au sens de la présente invention, on entend par amorce d'amplification, une séquence nucléique comprenant de 10 à 100 motifs nucléotidiques, préférentiellement de 15 à 25 motifs nucléotidiques. Cette amorce d'amplification comprend au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques d'une séquence choisie parmi les SEQ ID N0I à 8.
Une paire d'amorces d'amplification permet l'initiation d'une polymérisation enzymatique, telle que notamment une réaction d'amplification enzymatique. Par réaction d'amplification enzymatique, on entend un processus générant de multiples copies (ou amplicons) d'une séquence nucléique par l'action d'au moins une enzyme. Au sens de la présente invention, on entend par amplicons les copies de la séquence cible obtenues lors d'une réaction d'amplification enzymatique. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment la PCR (Polymerase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US-A-4,683,195, US-A-4,683,202 et US-A-4,800,159 ; la LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP-A-O 201 184 ; la RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO-A- 90/01069 ; la 3SR (Self Sustained Séquence Replication) avec la demande de brevet WO-A-90/06995 ; la NASBA (Nucleic Acid Séquence- B ased Amplification) avec la demande de brevet WO-A-91/02818, ou encore la TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A-5, 399,491. D'une manière générale, ces réactions d'amplification enzymatique mettent généralement une succession de cycle comprenant les étapes suivantes : o la dénaturation de la séquence cible si celle ci est en double brin afin d'obtenir deux brins cibles, comp lémentaires, o l'hybridation de chacun des brins cibles, obtenus lors de l'étape de dénaturation précédente avec au moins une amorce d'amplification , o la formation à partir des amorces d'amplification des brins complémentaires aux brins sur lesquels elles sont hybridées en présence d'une enzyme polymerase et de nucléosides triphosphate (ribonucléoside triphosphate et/ou desoxyribonucléoside triphosphate selon les techniques) ce cycle étant répété un nombre de fois déterminé pour obtenir la séquence cible dans une proportion suffisante pour permettre sa détection. Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux séquences nucléiques telle que notamment une amorce d'amplification et une séquence cible ou une sonde d'hybridation et une séquence cible, se lient avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques pour former un double brin. Ces liaisons hydrogènes se forment entre les bases complémentaires Adénine (A) et thymine (T) (ou uracile (U)) (on parle de liaison A-T) ou entre les bases complémentaires Guanine (G) et cytosine (C) (on parle de liaison GC). L'hybridation de deux séquences nucléiques peut être totale (on parle alors de séquences complémentaires), c'est à dire que le double brin obtenu lors de cette hybridation comprend uniquement des liaisons AT et des liaisons C-G. Cette hybridation peut être partielle (on parle alors de séquences suffisamment complémentaires), c'est à dire que le double brin obtenu comprend des liaisons AT et des liaisons C-G permettant de former le double brin, mais également des bases non liées à une base complémentaire. L'hybridation entre deux séquences complémentaires ou suffisamment complémentaires dépend des conditions opératoires qui sont utilisées, et notamment de la stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases des deux séquences nucléiques, ainsi que par le degré de mésappariement entre ces deux séquences nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier.
D'une façon plus précise, la NASBA est une technologie d'amplification isotherme de l'acide nucléique reposant sur l'action conjointe de trois enzymes (transcriptase inverse AMV, Rnase-H et polymérase-ARN T7). Associée à des amorces d'amplification spécifiques d'une séquence cible, elle amplifie les cibles ARN plus d'un milliard de fois en 90 minutes. La réaction d'amplification se produit à 410C et donne des molécules d'ARN simple brin comme produit final. La NASBA nécessite une paire d'amorce, dont au moins une comprend un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7. Une telle amorce est préférentiellement choisie parmi les SEQ ID N0Il et 12. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ladite paire d'amorce comprend au moins une amorce d'amplification comprenant un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ladite paire d'amorces, utilisée de l'étape B, est choisie parmi les paires d'amorce suivantes : o une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N0I et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N0I, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°2, on obtient un amplicon, spécifique du gène codant PAI-I, d'une taille de 216 paires de base, qui correspond à la séquence 394 - 610 sur la séquence du gène codant PAI-I de référence (Genbank NM_000602.1). o une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N03 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°4 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°3, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°4, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène codant PAI-I, d'une taille de 1058 paires de base, qui correspond à la séquence 88 - 1146 sur la séquence codant PAI-I de référence (Genbank NM_000602.1). o une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°5 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°6 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°5, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°6, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène UPA, d'une taille de 194 paires de base, qui correspond à la séquence 1661 - 1855 sur la séquence codant UPA de référence (Genbank NM_002658.1). o une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°7 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N08 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°7, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°8, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène codant UPA, d'une taille de 927 paires de base, qui correspond à la séquence 1228 - 2155 sur la séquence codant UPA de référence (Genbank NM_002658.1).
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ladite paire d'amorces, utilisée de l'étape B, comprend une première amorce comprenant un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7, est choisie parmi les paires d'amorce suivantes : o une première amorce d'amplification de SEQ ID N0Il et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2; o une première amorce d'amplification de SEQ ID N012 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°6.
Afin de tenir compte de la variabilité d'efficacité enzymatique qui peut être observée lors des différentes étapes de la réaction d'amplification, on peut normaliser l'expression d'un gène cible par la détermination simultanée de l'expression d'un gène dit de ménage, dont l'expression est similaire chez les différents groupes de patients. En réalisant un rapport entre l'expression du gène cible et l'expression du gène de ménage, on corrige ainsi toute variabilité entre les différentes expérimentations. L'homme du métier pourra se référer notamment aux publications suivantes : Bustin SA Journal of molecular endocrinology, 2002, 29 : 23-39 ; Giulietti A Methods, 2001, 25 : 386-401. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, on utilise, en outre, lors de l'étape B, au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons spécifiques d'un gène de ménage. Par gène de ménage, on entend un gène dont l'expression est stable dans un tissu donné, et quelque soit la situation physiologique. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le gène de ménage est le gène PPIB qui code la cyclophyline B. L'homme du métier se référera notamment à la demande PCT/FR04/050661 qui est inclut par référence dans la présente demande.
Lors de l'étape C, on utilise au moins une sonde de détection pour détecter la présence desdits amplicons. Cette étape de détection, peut être réalisée par tous les protocoles connus de l'homme du métier concernant la détection d'acides nucléiques. Au sens de la présente invention, on entend par sonde d'hybridation, une séquence nucléique de 10 à 100 motifs nucléotidiques, notamment de 15 à 35 motifs nucléotidiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec une séquence nucléique cible. La sonde d'hybridation peut comprendre un marqueur permettant sa détection. On parle alors de sondes de détection. Par détection on entend soit une détection directe par une méthode physique, soit une détection indirecte par une méthode de détection à l'aide d'un marqueur. De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques. [Voir par exemple Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, n° 45(4), p.453- 458 ou Keller G.H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p.173-249]. Par marqueur, on entend un traceur capable d'engendrer un signal que l'on peut détecter. Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la bêta galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ; les groupements à densité électronique détectables par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme 32P, 35S ou 125I.
Au sens de la présente invention, la sonde d'hybridation peut être une sonde dite de détection Dans ce cas, la sonde dite de détection est marquée au moyen d'un marqueur tel que défini précédemment. Grâce à la présence de ce marqueur, on peut détecter la présence d'une réaction d'hybridation entre une sonde de détection donnée et la séquence cible spécifique d'une espèce donnée.
La sonde de détection peut être notamment une sonde de détection « molecular beacons » telle que décrite par Tyagi & Kramer (Nature biotech, 1996, 14 :303-308). Ces "molecular beacons" deviennent fluorescentes lors de l'hybridation. Elles possèdent une structure de type tige- boucle et contiennent un fluorophore et un groupe "quencher". La fixation de la séquence de boucle spécifique avec sa séquence complémentaire d'acide nucléique cible provoque un déroulement de la tige et l'émission d'un signal fluorescent lors de l'excitation à la longueur d'onde qui convient. La sonde d'hybridation peut être également une sonde dite de capture. Dans ce cas, la sonde dite de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption. On détecte alors la réaction d'hybridation entre une sonde de capture donnée et une séquence cible.
Pour la détection de la réaction d'hybridation, on peut utiliser des séquences cibles marquées, directement (notamment par l'incorporation d'un marqueur au sein de la séquence cible) ou indirectement (notamment par l'utilisation d'une sonde de détection telle que définie précédemment) la séquence cible. On peut notamment réaliser avant l'étape d'hybridation une étape de marquage et/ou de clivage de la séquence cible, par exemple en utilisant un désoxyribonucléotide triphosphate marqué lors de la réaction d'amplification enzymatique. Le clivage peut être réalisé notamment par l'action de l'imidazole et de chlorure de manganèse. La séquence cible peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde de détection selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO 91/19812. Un autre mode particulier préférentiel de marquage d'acides nucléiques est décrit dans la demande FR 2 780 059.
Comme support solide, on peut utiliser des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose ou le dextrane, des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane comme décrit dans la demande WO 94/12670, d'une particule.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la sonde de détection comprend un flurophore et un quencher. Selon un mode encore plus préféré de réalisation de l'invention, la sonde d'hybridation comprend un flurophore FAM (6-carboxy- fluorescein) ou ROX (6-carboxy-X-rhodamine) en son extrémité 5' et un quencher (Dabsyl) en son extrémité 3'. Dans la suite de l'exposé, une telle sonde d'hybridation est appelée « molecular beacon ».
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, les étapes B et C sont effectuées en même temps. Ce mode préféré peut être mise en oeuvre par «NASBA en temps réel » qui regroupe en une étape unique la technique d'amplification NASBA et la détection en temps réel qui fait appel à des "molecular beacons". La réaction NASBA intervient dans le tube, produisant de l'ARN simple brin avec lequel les "molecular beacons" spécifiques peuvent s'hybrider simultanément pour donner un signal fluorescent. La formation des nouvelles molécules d'ARN est mesurée en temps réel par contrôle continu du signal dans un lecteur fluorescent. Contrairement à une amplification par RT-PCR, l'amplification en NASBA peut se faire en présence d'ADN dans l'échantillon, c'est à dire même si l'ADN n'a pas été complètement éliminé lors de l'extraction des ARN.
Tel que présenté dans l'exemple ci après, lorsque l'on souhaite détecter le gène cible codant PAI-I (séquence de référence NCBI accession number : NM_000602.1), on utilise préférentiellement lors de l'étape b) o une première amorce de SEQ ID N0I ou 11 o une deuxième amorce de SEQ ID N°2 et lors de l'étape c) o une sonde de détection comprenant la SEQ ID N09.
Tel que présenté dans l'exemple ci après, lorsque l'on souhaite détecter le gène cible codant UPA (séquence de référence NCBI accession number: NM_002658.1), on utilise préférentiellement lors de l'étape b) o une première amorce de SEQ ID N°5 ou 12 o une deuxième amorce de SEQ ID N06 et lors de l'étape c) o une sonde de détection comprenant la SEQ ID N0IO
Lorsqu'on utilise, lors de l'étape B, une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons spécifiques d'un gène de ménage, lesdits amplicons spécifiques d'un gène de ménage peuvent être détectés comparablement à ce qui est décrit précédemment, par notamment l'utilisation d'une sonde de détection. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le gène de ménage est le gène PPIB qui code la cyclophyline B. Préférentiellement, la sonde de détection comprend un flurophore et un quencher.
L'invention concerne également une amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15, et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N0I à SEQ ID N08. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'amorce d'amplification comprend un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7. Cette amorce peut être notamment l'une quelconque des SEQ ID N0
11 à 12, et est préférentiellement utilisée dans une réaction d'amplification NASBA.
L'invention concerne également une paire d'amorce choisi parmi les paires d'amorces suivantes : o une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N0I et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N0I, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°2, on obtient un amplicon, spécifique du gène codant PAI-I, d'une taille de 216 paires de base, qui correspond à la séquence 394 - 610 sur la séquence du gène codant PAI-I de référence (Genbank NM_000602.1). o une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N03 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°4 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°3, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°4, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène codant PAI-I, d'une taille de 1058 paires de base, qui correspond à la séquence 88 - 1146 sur la séquence codant PAI-I de référence (Genbank NM_000602.1). o une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°5 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°6 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°5, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°6, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène UPA, d'une taille de 194 paires de base, qui correspond à la séquence 1661 - 1855 sur la séquence codant UPA de référence (Genbank NM_002658.1) o une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°7 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N08 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°7, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°8, on obtient alors un amplicon, spécifique du gène codant UPA, d'une taille de 927 paires de base, qui correspond à la séquence 1228 - 2155 sur la séquence codant UPA de référence (Genbank NM_002658.1).
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ladite première amorce comprend un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7. Cette amorce peut être notamment l'une quelconque des SEQ ID N0Il à 12. Lorsque première amorce comprend un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7, cette première amorce est préférentiellement comprise dans une paire d'amorces choisie parmi les paires d'amorce suivantes : o une première amorce d'amplification de SEQ ID N°21 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2; o une première amorce d'amplification de SEQ ID N°22 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°4 ;
L'invention concerne également l'utilisation d'au moins une amorce d'amplification telle que définie précédemment et/ou d'au moins une paire d'amorce telle que définie précédemment lors d'une réaction d'amplification NASBA. L'invention concerne également une sonde de détection comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°9 à SEQ ID N0IO. Préférentiellement, cette sonde de détection comprend un flurophore et un quencher. L'invention concerne également l'utilisation d'au moins une amorce telle que définie précédemment et/ou d'au moins une paire d'amorces telle que définie précédemment et/ou d'au moins une sonde de détection telle que définie précédemment pour le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein.
L'invention concerne enfin un kit pour le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein comprenant au moins une amorce telle que définie précédemment et/ou d'au moins une paire d'amorces telle que définie précédemment et/ou d'au moins une sonde de détection telle que définie précédemment.
Tel que présenté dans l'exemple ci après, lorsque l'on souhaite détecter le gène cible codant PAI-I, le kit comprend préférentiellement o une première amorce de SEQ ID N0I ou 11 o une deuxième amorce de SEQ ID N°2 o une sonde de détection comprenant la SEQ ID N09.
Tel que présenté dans l'exemple ci après, lorsque l'on souhaite détecter le gène cible codant UPA, le kit comprend préférentiellement o une première amorce de SEQ ID N°5 ou 12 o une deuxième amorce de SEQ ID N06 o une sonde de détection comprenant la SEQ ID N0IO
L'invention concerne également un kit pour le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein qui permet de déterminer
• si une patiente atteinte d'un cancer du sein peut bénéficier d'une hormonothérapie (Tamoxifene) ou d'une immunothérapie (Herceptin)
• si le cancer en question est de bon ou de mauvais pronostic
• l'agressivité de la tumeur Pour cela, le kit comprend les réactifs nécessaires, tels que amorces et/ou sondes, pour la détection des gènes ER, PR, HER-2, UPA, PAI-I. Pour les amorces et sondes nécessaires à la détection des gènes ER, PR, HER-2, l'homme du métier se référera notamment à la demande de brevet PCT/FR04/050661 qui est inclut par référence. Pour les amorces et sondes nécessaires à la détection des gènes UPA et PAI-I, l'homme du métier se référera à l'exposé précédemment développé.
La figure suivante est donnée à titre illustrative et n'a aucun caractère limitatif. Elle permettra de mieux comprendre l'invention.
La figure 1 représente les courbes standards obtenues pour les gènes PAI- 1 et PPIB (fig la, PAI-I en trait plein, PPIB en pointillés), UPA et PPIB (fig Ib, UPA en trait plein, PPIB en pointillés, telles que décrites dans l'exemple ci dessous. Chaque courbe standard, obtenue pour chaque gène à partir d'une séquence de référence qui est spécifique du gène, transcrits en ARN in vitro à partir du produit PCR spécifique du gène UPA et PAI-I respectivement et d'un plasmide pour le gène PPIB, représente le temps d'apparition de la phase exponentielle de l'amplification (on parle également de TTP : time to positivity, temps seuil) en fonction du nombre de copies d' ARN présentes au début de l'amplification par NASBA (plus la quantité de départ de copies d'ARN est importante au début de l'amplification, plus le temps d'apparition de la phase exponentielle est court).
Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention.
Exemple 1 - Amplification et détection en temps réel des ARNm codant PAI-I et UPA
1/ Obtention et préparation des échantillons
Cet exemple a été réalisé à partir de trois lignées de cellules tumorales, dont l'expression des protéines UPA et PAI-I a préalablement été déterminée par ELISA, ont été utilisées : MDA- MD- 231 (exprimant les facteurs UPA et PAI-I), et MCF7 (n'exprimant ni UPA, ri PAI-I). Ces lignées proviennent de l' American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA). Ces lignées cellulaires ont été mises en culture dans un milieu DMEM (MCF- 7) ou Leibovitz (MDA-MD-231), supplémenté en sérum fœtal de bœuf (10%), acides aminés non essentiels (1%) et pénicilline (50 000U) - streptomycine (50μg) à 370C sous atmosphère comprenant 5% de CO2 pour MCF7 et 0% de MD A-MD- 231.
Cet exemple a également été réalisé à partir de tumeurs de patientes (n = 77) atteintes d'un cancer du sein dont I expression en UPA et PAI-I a préalablement été déterminée par ELISA selon une technique classique connue de l'homme du métier. La technique ELISA nous renseignait sur l'expression de la protéine.
2/ Extraction des ARN totaux
Les ARN totaux ont été extraits de lignées cellulaires, par l'utilisation de Trizol® Reagent selon les recommandations des fournisseur du kit (Invitrogen, Canada). La qualité et la quantité en ARN ont été déterminées à 260 et 280 nm et contrôlées sur gel agarose. Les ARN ont ensuite été congelés à -7O0C jusqu'à utilisation. Des ARN totaux ont également été extraits d'une façon comparable de tumeurs de patientes atteintes d'un cancer du sein.
3) Amplification par NASBA
La réaction d'amplification par NASBA est basée sur l'activité simultanée d'une reverse transcriptase du virus aviaire myéloblaste (AMV-RT), d'une RNAse H d'E. coli et d'une ARN polymerase du bacteriophage T7 (Compton J, 1991, Nature, 350 : 91-92). La détection en temps réel des amplicons est réalisée par l'utilisation d'un lecteur Nuclisens EasyQ® (bioMérieux BV, The Netherland) et sondes de détection « molecular beacons », telles que définies précédemment. La quantification en NASBA est basée sur l'utilisation d'une courbe standard, obtenue à partir d'une séquence de référence, spécifique du gène cible, transcrits en ARN in vitro dans un plasmide. Cette courbe standard représente le temps d'apparition de la phase exponentielle de l'amplification en fonction du nombre de copies d'ARN présentes au début de l'amplification par NASBA (plus la quantité de départ de copies d'ARN est importante au début de l'amplification, plus le temps d'apparition de la phase exponentielle est court).
a) Amplification des gènes PAI-I et UPA et du gène de ménage PPIB - Obtention d'une courbe standard
Courbe standard du gène cible codant PAI-I (Figure la)
Pour le gène cible codant PAI-I (séquence de référence NCBI accession number : NM_000602.1), il a été utilisée une première amorce de SEQ ID N°3 5' CCAGCCCTCA CCTGCCTAGT 3' possédant une séquence supplémentaire correspondant au promoteur SP6 et une deuxième amorce de SEQ ID N°4 5' CACCGTGCCA CTCTCGTTCA 3', localisées respectivement en position 88 - 107 et 1127 - 1146 de la séquence de référence, afin de générer en PCR (un 1er cycle de dénaturation (950C; 1 min); puis 35 cycles comprenant les étapes suivantes : dénaturation: 940C; 1 min ; hybridation: 6O0C; 1 min ; élongation: 720C; 2 min) et un dernier cycle comprenant une étape de dénaturation: 720C; 7 min) un amplicon de 1058 + 23 (de la séquence SP6) paires de bases, spécifique du gène codant PAI- 1 (on parlera d' « amplicon PAI- 1 »).
Les amplicons PAI-I obtenus tels que décrit ci dessus, ont ensuite été purifié (colonne Qiaquick® Qiagen, Hilden, Germany) puis transcrits directement en ARN in vitro par l'utilisation d'une ARN polymerase (SP6 (Megascript® kit, Ambion, Austin, USA), selon l'orientation de l' amplicon). Après élimination du plasmide par traitement à la DNAse, les ARN ont été purifiés par Rneasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) et quantifiés (RNA6000Nano, Agilent Technologies, Walbronn, Germany). Les amplicons obtenus étaient bien spécifiques du gène PAI-I.
Les ARN obtenus ci dessus ont été dilués à différentes concentrations (solution stock : 0,2.1O11 copies/μl, dilution en cascade 0,2.1O11 copies/μl à 0,2.102 copies/μl). Ces dilutions en cascade sont amplifiées par NASBA à l'aide du kit Nuclisens basic® (bioMérieux BV, The Netherlands) en présence des amorces spécifiques PAI- 1 SEQ ID N0 1 et PAI- 1 N°2 et du « molecular beacons » SEQ ID N°9 : a 0,2μM d'une première amorce PAI-I de SEQ ID N0I 5' CTCCTTTCCC
AAGCAAGTTG 3', comprenant, en son extrémité 5', et indiqué en minuscule, une séquence comprenant le promoteur de la polymérase T7, c'est à dire une première amorce dont la séquence entière est la SEQ ID N0Il : 5' aattctaatacgactcactatagggagaaggCTCCTTTCCC AAGC AAGTTG 3 ' a 0,2 μM d'une deuxième amorce PAI-I de SEQ ID N°2 5' GGGCCATGGA
ACAAGGATGA 3'). o 0,1 μM de «molecular beacons» comprenant la SEQ ID N°9 5' 3', marquées avec un fluorophore FAM (6-carboxy-fluorescein) en 5', et d'un « quencher » (Dabsyl) en 3' (séquence complète : 5' TGTTCCGGAG CACGGTC AAG 3'. FAM-cgαrcgTGTTCCGGAGCACGGTCAAGcgαrcg-Dabsyl
Au cours de l'amplification le signal s'intensifie proportionnellement à la quantité d'amplicons produits. La courbe de fluorescence en fonction du temps permet de définir le temps ou la phase exponentielle de l'amplification démarrera (encore appelé TTP : time to positivity, temps seuil). La courbe standard PAI-I relie le nombre de transcrit présent au départ dans la solution en fonction du TTP détecté lors de l'amplification NASBA. A l'aide d'une courbe standard, on calcule de manière absolue le nombre de copies du gène cible. Enfin cette valeur est normalisée grâce à un gène de ménage, en l'occurrence le gène PPIB. Cette courbe standard PAI-I, représentée figure la (courbe en trait plein).
Courbe standard du gène cible codant UPA
La courbe du gène cible codant UPA a été réalisée selon le même principe que pour PA- 1, à l'exception des amorces d'amplification utilisées et des «molecular beacons », qui étaient spécifiques de UPA.
Ainsi, pour le gène cible codant UPA (séquence de référence NCBI accession number : NM_002658.1), il a été utilisée une première amorce de SEQ ID N°7 5' CCAAGGCCGC ATGACTTTGA 3' et une deuxième de SEQ ID N°8 5' GCCAAGAAAG GGACATCTATG 3', localisées respectivement en position 1228- 1248 et 2135-2155 de la séquence de référence.
Les amplicons ont alors été transcrits en ARN in vitro par l'utilisation d'une ARN polymérase (T7 ou SP6 (Megascript® kit, Ambion, Austin, USA), selon l'orientation de l'amplicon). Après élimination du plasmide par traitement à la DNAse, les ARN ont été purifiés par Rneasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) et quantifiés (RNA6000Nano, Agilent Technologies, Walbronn, Germany). Les amplicons obtenus étaient bien spécifiques du gène PAI-I.
Les ARN obtenus ci dessus ont été dilués à différentes concentrations (solution stock : 0,2.1O11 copies/μl, dilution en cascade 0,2.1O11 copies/μl à 0,2.102 copies/μl). Ces dilutions en cascade sont amplifiées par NASBA à l'aide du kit Nuclisens basic® (bioMérieux BV, The Netherlands) en présence a 0,2 μM d'une première amorce UPA de SEQ ID N°5 5' AGCCCTGCCC TGAAGTCGTT A 3', comprenant, en son extrémité 5', et indiqué en minuscule, une séquence comprenant le promoteur de la polymérase T7, c'est à dire une première amorce dont la séquence entière est SEQ ID N012 : 5' aattctaatacgactcactatagggagaaggAGCCCTGCCCTG AAGTCGTTA 3 ' , a 0,2 μM d'une deuxième amorce UPA de SEQ D N°6 5' CAGGGCATCT
CCTGTGCATG 3', o 0,1 μM de « molecular beacons » utilisées comprenant la SEQ ID N0IO 5' TGTAAGCAGC TGAGGTCT 3', marquées avec un fluorophore FAM (6- carboxy-fluorescein) à leur extrémité 5', et d'un « quencher » (Dabsyl) à son extrémité 3' (séquence complète : 5' FAM- cgatcg TGTAAGCAGC TGAGGTCT cgatcg-Oabsyl 3'). La courbe standard UPA est représentée figure Ib.
Courbe standard du gène cible PPIB
La courbe du gène cible PPIB a été réalisée selon le même principe que pour PAI-I, à l'exception des amorces d'amplification et des « molecular beacons », qui étaient spécifiques de PPIB
Ainsi, pour le gène de ménage PPIB (séquence de référence NCBI accession number : M60857), il a été utilisée une première amorce de SEQ ID N013 5' AC ATGAAGGT GCTCCTTGCC 3' et une deuxième amorce de SEQ ID N014 5' GTCCCTGTGC CCTACTCCTT 3', localisées respectivement en position 11-30 et 631-650 de la séquence de référence. La séquence de ces amplicons PPIB a été vérifiée par séquençage (Biofidal, Vaulx en Velin, France), afin de s'assurer qu'il correspondait bien à la séquence du gène cible que l'on souhaitait amplifier. Les amplicons obtenus étaient bien spécifiques du gène PPIB. Les amplicons ont alors été transcrits en ARN in vitro par l'utilisation d'une ARN polymerase (T7 ou SP6 (Megascript® kit, Ambion, Austin, USA), selon l'orientation de l'amplicon). Après élimination du plasmide par traitement à la DNAse, les ARN ont été purifiés par Rneasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) et quantifiés (RNA6000Nano, Agilent Technologies, Walbronn, Germany).
Les ARN obtenus ci dessus ont été dilués à différentes concentrations (solution stock : 0,2.1O11 copies/μl, dilution en cascade 0,2.1O11 copies/μl à 0,2.102 copies/μl). Ces dilutions en cascade sont amplifiées par NASBA à l'aide du kit Nuclisens basic® (bioMérieux BV, The Netherlands) en présence de : a 0,2 μM d'une première amorce PPIB de SEQ ID N°13 5' CAGGCTGTCT TGACTGTCGT GA 3', comprenant, en son extrémité 5', et indiqué en minuscule une séquence comprenant le promoteur de la polymerase T7, c'est à dire une première amorce dont la séquence entière est SEQ ID N016 : 5' aattctaata cgactcacta tagggagaag gCAGGCTGTCTTGACTGTCG TGA 3', a 0,2 μM d'une deuxième amorce PPIB de SEQ ID N014 5' AGG AGAGAAA
GGATTTGGCT 3' o 0,lμM de « molecular beacons » comprenant la SEQ ID N°15 5' GATCCAGGGCGGAGACTTCA 3', marquées avec un fluorophore ROX (6- carboxy-X-rhodamine) en 5', et d'un « quencher » (Dabsyl) en 3' (séquence complète : 5' ROX-cgatcgGATCCAGGGCGGAGACTTCAcga cg-Dabsyl 3'. La courbe standard PPIB est représentée figure IA et IB (courbes en pointillés).
b) réaction d'amplification par NASBA : bl) Amplification en duplex des gènes PAI-I et PPIB
Cette réaction d'amplification a été réalisée a l'aide d'un kit Nuclisens basic® (bioMérieux BV, The Netherlands). Pour cela, 5 ng d'ARN totaux, extraits des différentes lignées cellulaires, ont été ajouté à 10 μl de tampon NASBA (concentration finale dans 20 μl de milieu réactionnel : 40 mM de Tris HCl pH 8,5, 12mM MgC12, 7OmM KCl, 5mM dithiotreitol, 15% v/v DMSO, ImM de chaque dNTP, 2mM de chaque NTP). Dans ce milieu a été ajouté, 0,1 μM de « molecular beacons » comprenant o la SEQ ID N°9, marquées avec un fluorophore FAM (6-carboxy-fluorescein) en 5', et d'un «quencher » (Dabsyl) en 3', pour la détection des ARN du gène PAI- 1 o la SEQ ID N015, marquées avec un fluorophore ROX (6-carboxy-X-rhodamine) en 5', et d'un «quencher » (Dabsyl) en 3' (, pour la détection des ARN du gène PPIB, Dans ce milieu a également été ajouté : o 0,2μM d'une première amorce PAI-I de SEQ ID N0I, comprenant, en son extrémité 5' une séquence comprenant le promoteur de la polymérase T7, o 0,2 μM d'une deuxième amorce PAI- 1 de SEQ ID N°2, o 0,2 μM d'une première amorce PPIB de SEQ ID N013 comprenant, en son extrémité 5' une séquence comprenant le promoteur de la polymérase T7 a 0,2 μM d'une deuxième amorce PPIB de SEQ ID N014.
Une préincubation a été réalisée durant 2 minutes à 650C avant une incubation de 2 minutes à 410C. Un volume de 5 μl d'un mélange d'enzyme (0,08U de RNAse H, 32U d'ARN polymérase T7, 6,4 U d' AMV-RT) a été ajoutée, et une incubation de 90 minutes a été réalisée à 410C.
La quantification des ARN transcrits a été déterminée en temps réel (NucliSens EasyQ, bioMérieux), la réaction NASBA produisant des amplicons avec lequel les "molecular beacons" spécifiques peuvent s'hybrider simultanément pour donner un signal fluorescent. La formation des nouvelles molécules d'ARN est mesurée en temps réel par contrôle continu du signal dans un lecteur fluorescent, l'analyseur NucliSens EasyQ. L'analyse et la communication automatisée des données sont assurées par le logiciel Nuclisens TTP (bioMérieux BV, The Netherlands). La courbe standard, telle que définie précédemment (dilution ARN transcrits : 108 à 102 copies) a été utilisée pour la quantification de l'expression de chacun du gène cible ESRl et du gène de ménage PPIB, afin d'extrapoler le nombre de copies d'ARNm par échantillon. La quantification de l'expression d'un gène cible a été exprimé par nombre de copies d'ARNm/ 5ng d'ARN totaux.
Le tableau 1 présente l'expression du gène PAI-I quantifiée à partir de 5 ng d'ARN totaux provenant des lignées cellulaires MDA-MD-231, MCF7.
Tableau 1 - Expression du gène PAI-I dans les cellules MCF7, T47D, (NC : non calculable) L'expression du gène PAI-I a été exprimée par le ratio entre le nombre de copies d'ARNm du gène cible et le nombre de copies d'ARNm du gène de ménage. Ainsi, des ARNm de PAI-I étaient exprimés dans les cellules MDA- MD- 231 alors qu'ils n'étaient pas détectées dans les cellules MCF7, en accord avec l'expression de ces cellules?
Le tableau 2 présente l'expression du gène PAI-I quantifiée à partir de 50 ng d'ARN totaux provenant de tumeurs ELISA+ c'est à dire exprimant la protéine PAI-I, ou de tumeurs ELISA- .
Tableau 2 - Expression du gène PAI-I dans les tumeurs ELISA + et ELISA -
L'expression du gène PAI-I a été exprimée par le ratio entre le nombre de copies d'ARNm du gène cible et le nombre de copies d'ARNm du gène de ménage. Une surexpression du gène PAI- 1 était observée dans les tumeurs ELISA +.
A partir des courbes standards PAI-I et PPIB réalisées précédemment, la limite de détection et la limite de quantification ont été déterminées pour les gènes PAI- 1 et PPIB amplifiés en duplex. La limite de quantification était observée à 1000 copies d'ARNm pour PAI-I et PPIB. La limite de détection était de 100 copies d'ARNm pour PAI-I et
PPIB.
Aucun signal n'était observé lorsque la NASBA était réalisé à partir d'ARN totaux issus de la lignée cellulaire MCF7, PAI- 1 négative.
Tous ces résultats ont été confirmés par l'utilisation d'une autre technique d'amplification (RT-PCR quantitative) (PAI-I : r = 0,7886, p<0,0001, n=80; test statistique de corrélation Spearman). De plus, les résultats obtenus au niveau ARN messager par la technique NASBA pour le gène PAI- 1 était corrélés à ceux obtenus au niveau protéique par ELISA (PAI-I : r = 0,3590, p=0,0013, n=77; test statistique de corrélation Spearman). Ces résultats démontrent que l'expression des ARNm est corrélé à la présence dans le cytosol et le noyau, confirmant l'intérêt d'étudier au niveau ARNm l'expression de ce gène.
Ces résultats démontrent que le duplex PAI-1/PPIB en NASBA permet une quantification de l'expression du gène PAI-I à partir d'une très faible quantité d'ARN totaux, et, d'une façon plus large, à partir d'une très faible quantité de cellules tumorales, et est parfaitement adapté pour étudier le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein, et la réponse d'un patient à un traitement donné.
b2) Amplification en duplex des gènes UPA et PPIB
Cette réaction d'amplification a été réalisée a l'aide d'un kit Nuclisens basic® (bioMérieux BV, The Netherlands). Pour cela, 5 ng d'ARN totaux, extraits des différentes lignées cellulaires, ont été ajouté à 10 μl de tampon NASBA (concentration finale dans 20 μl de milieu réactionnel : 40 mM de Tris HCl pH 8,5, 12mM MgC12, 7OmM KCl, 5mM dithiotreitol, 15% v/v DMSO, ImM de chaque dNTP, 2mM de chaque NTP). Dans ce milieu a été ajouté, 0,1 μM de « molecular beacons » comprenant o la SEQ ID N0IO, marquées avec un fluorophore FAM (6-carboxy-fluorescein) à leur extrémité 5', et d'un « quencher » (Dabsyl) à son extrémité 3' pour la détection des ARN codant UPA lors du duplex UPA / cyclophyline B, o la SEQ ID N015, marquées avec un fluorophore ROX (6-carboxy-X-rhodamine) en 5', et d'un «quencher » (Dabsyl) en 3', pour la détection des ARN du gène PPIB, Dans ce milieu a également été ajouté : o 0,2 μM d'une première amorce UPA de SEQ ID N°5 comprenant, en son extrémité 5', une séquence comprenant le promoteur de la polymérase T7, a 0,2 μM d'une deuxième amorce UPA de SEQ ID N°6, o 0,2 μM d'une première amorce PPIB de SEQ ID N013, comprenant, en son extrémité 5' une séquence comprenant le promoteur de la polymérase T7, a 0,2 μM d'une deuxième amorce PPIB de SEQ ID N°15
Une préincubation a été réalisée durant 2 minutes à 650C avant une incubation de 2 minutes à 410C. Un volume de 5 μl d'un mélange d'enzyme (0,08U de RNAse H, 32U d'ARN polymérase T7, 6,4 U d' AMV-RT) a été ajoutée, et une incubation de 90 minutes a été réalisée à 410C.
La quantification des ARN transcrits a été déterminée en temps réel selon un principe comparable à ce qui a été décrit pour UPA. La courbe standard, telle que définie précédemment (dilution ARN transcrits : 108 à 102 copies) a été utilisée pour la quantification de l'expression du gène cible UPA et du gène de ménage PPIB, afin d'extrapoler le nombre de copies d'ARNm par échantillon. La quantification de l'expression d'un gène cible a été exprimé par nombre de copies d'ARNm/ 5ng d'ARN totaux.
Le tableau 3 présente l'expression du gène UPA quantifiée à partir de 5 ng d'ARN totaux provenant des lignées cellulaires MCF-7 et MDA- MD- 231.
Tableau 3 - Expression du gène UPA dans les cellules MCF-7 et MDA-MD-231
L'expression du gène UPA a été exprimée par le ratio entre le nombre de copies d'ARNm du gène cible et le nombre de copies d'ARNm du gène de ménage. Ainsi, des ARNm de UPA étaient exprimés dans les cellules MDA321 alors qu'ils n'étaient pas détectées dans les cellules MCF-7, en accord avec l'expression en de ces cellules.
Le tableau 4 présente l'expression du gène UPA quantifiée à partir de 50 ng d'ARN totaux provenant de tumeurs ELISA + ou de tumeurs ELISA-.
Tableau 4 - Expression du gène UPA dans les tumeurs ELISA + et ELISA -
L'expression du gène UPA a été exprimée par le ratio entre le nombre de copies d'ARNm du gène cible et le nombre de copies d'ARNm du gène de ménage. Une surexpression du gène UPA était observée dans les tumeurs ELISA +.
A partir des courbes standards UPA et PPIB réalisées précédemment, la limite de détection et la limite de quantification ont été déterminées pour les gènes UPA et PPIB amplifiés en duplex. La limite de quantification a été déterminée à 1000 et 104 copies d'ARNm pour UPA et PPIB respectivement. La limite de détection était de 100 copies d'ARNm pour UPA et PPIB.
De même, aucun signal n'était observé lorsque la NASBA était réalisé à partir d'ARN totaux issus de la lignée cellulaire MCF7, UPA négative.
Tous ces résultats ont été confirmés par l'utilisation d'une autre technique d'amplification (RT-PCR quantitative) (UPA : r=0,8029, p<0,0001, n=81; test statistique de corrélation Spearman). De plus, les résultats obtenus au niveau ARN messager par la technique NASBA pour le gène UPA était corrélés à ceux obtenus au niveau protéique par ELISA (UPA : r=0,5784, p<0,0001, n=77; test statistique de corrélation Spearman). Ces résultats démontrent que l'expression des ARNm est corrélé à la présence de protéines dans le cytosol et le noyau, confirmant l'intérêt d'étudier au niveau ARNm l'expression de ce gène.
Ces résultats démontrent que le duplex UPA/PPIB en NASBA permet une quantification de l'expression du gène UPA à partir d'une très faible quantité d'ARN totaux, et, d'une façon plus large, à partir d'une très faible quantité de cellules tumorales, et est parfaitement adapté pour étudier le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein, et la réponse d'un patient à un traitement donné.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein comprenant les étapes suivantes :
A - on extrait le matériel nucléique d'un échantillon biologique,
B - on utilise au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons d'au moins une séquence cible du matériel nucléique C - on utilise au moins une sonde de détection pour détecter la présence desdits amplicons caractérisé en ce que, lors de l'étape B, ladite paire d'amorce comprend au moins une amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N0I à SEQ ID N°8 et/ou lors de l'étape C), ladite sonde de détection comprend au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°9 à SEQ ID N0IO.
2. Procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein selon la revendication 1 caractérisé en ce que, lors de l'étape B, ladite paire d'amorces est choisie parmi les paires d'amorce suivantes : o une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N0I et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2 ; o une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°3 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°4 ; o une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°5 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N06 ; o une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°7 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N08 .
3. Procédé pour le diagnostic/pronostic du cancer du sein selon l'une quelconque des revendication 1 ou 2 dans lequel ladite paire d'amorce comprend au moins une amorce d'amplification comprenant un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage TJ.
4. Procédé pour le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans lequel, lors de l'étape C, la sonde de détection comprend un flurophore et un quencher.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans lequel la séquence cible est comprise dans un gène choisi parmi PAI-I, UPA- I.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans lequel les étapes B et C sont effectuées en même temps.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'on on utilise, en outre, lors de l'étape B, au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons spécifiques d'un gène de ménage.
8. Amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N0I à SEQ ID N°8 ;.
9. Amorce d'amplification selon la revendication 8 comprenant un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage
T7.
10. Paire d'amorce d'amplification choisie parmi les paires d'amorces suivantes : o une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N0I et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2 ; o une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°3 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°4 ; o une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°5 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°6 ; o une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°7 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N08 ;
11. Paire d'amorce selon la revendication 10 dans laquelle ladite première amorce comprend un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7.
12. Utilisation d'au moins une amorce d'amplification selon la revendication 8 ou 9 et/ou d'une paire d'amorce selon la revendication 10 ou 11 lors d'une réaction d'amplification NASBA
13. Sonde de détection comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°9 à SEQ ID N0IO.
14. Sonde de détection selon la revendication 13 comprenant un flurophore et un quencher.
15. Utilisation d'au moins une amorce selon la revendication 8 ou 9 et/ou d'au moins une paire d'amorces selon la revendication 10 ou 11 et/ou d'au moins une sonde de détection selon la revendication 13 ou 14 pour le diagnostic /pronostic d'un cancer du sein.
16. Kit pour le diagnostic/pronostic d'un cancer du sein comprenant au moins une amorce selon la revendication 8 ou 9 et/ou d'au moins une paire d'amorces selon la revendication 10 ou 11 et/ou d'au moins une sonde de détection selon la revendication 13 ou 14.
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