FR2881656A1 - Procede pour controler la croissance microbienne - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé pour contrôler la croissance microbienne.Ledit procédé consiste à utiliser, comme agent antimicrobien, un complexe pyrazolate d'argent d<1> sous forme de filaments de longueur moyenne comprise entre 0,2 et 1 mum et de diamètre moyen compris entre 35 et 50 nm, ne comprenant pas d'argent sous sa forme métal d<0>. Un tel complexe est obtenu en mélangeant un sel d'argent et une beta-dicétone, puis à ajouter de l'hydrazine

Description

PROCEDE POUR CONTROLER LA CROISSANCE MICROBIENNE La présente invention

concerne un procédé pour contrôler la croissance microbienne.

Les propriétés antimicrobiennes de l'argent sont connues depuis de nombreuses années. Les propriétés générales pharmacologiques de l'argent sont résumées dans Heavy Metals, de Stewart C. Harvey, Antiseptics and Disinfectants: Fungicides; Ectoparasiticides de Stewart Harvey, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Sème Edition, de Louis S. Goodman et Alfred Gilman, publiés par MacMillan Publishing Company, NY, 1975. Il est maintenant connu que l'activité antimicrobienne des ions argent est liée à l'affinité de l'ion argent pour les groupes importants biologiquement, tels que les groupes thiol, amino, imidazole, carboxyles et phosphates.

La fixation des ions argent sur l'un de ces groupes réactifs appartenant à une protéine entraîne la précipitation et le dénaturation de la protéine. L'importance de la réaction est liée à la concentration en ions argents et l'interaction se fait tout d'abord avec les protéines dans un espace interstitiel lorsque la concentration en ion argent est faible. Les membranes et les espèces intracellulaires sont affectées lorsque la concentration en ion argent est élevée. La diffusion des ions argent dans les tissus est elle-même régulée par leurs préférences intrinsèques pour se lier aux protéines, par les différents groupes importants biologiquement appartenant aux protéines. Ainsi la grande affinité des ions argent pour un grand nombre de groupes chimiques biologiquement importants, qui est responsable de leurs actions comme agent antiviraUfongicide/bactéricide, limite également leurs actions systémiques, l'argent n'étant pas facilement absorbé dans le corps. Ceci explique le grand intérêt à utiliser des espèces contenant de l'argent comme antimicrobien. Selon la définition acceptée par tous les experts, l'agent antimicrobien appartient au groupe général des agents biocides actifs dans les organismes vivants. Les antimicrobiens comprennent deux familles, les agents microbicides qui tuent les micro- organismes et les agents biostatiques inhibant la multiplication des micro-organismes. Ces deux familles s'appliquent aux micro-organismes que sont les bactéries, les levures, les champignons et les algues. Les micro-organismes sont définis comme de petits organismes de la taille du m, avec des structures à une ou plusieurs cellules. Une plus grande accumulation de cellules est considérée comme une colonie et non comme un organisme individuel.

En plus de l'affinité des ions argent pour les espèces importantes biologiquement, qui conduit à la dénaturation et à la précipitation des protéines, il est connu que certains composés comprenant de l'argent qui ont une faible capacité de dissolution ou d'ionisation fonctionnent efficacement comme antiseptiques. De l'eau distillée en contact avec de l'argent métallique devient antibactérienne, même si la concentration en ions argent dissous est inférieure à 100 ppb. Il y a de nombreux mécanismes par lesquels se manifeste cet effet oligodynamique, par lequel les ions argent interfèrent avec les activités métaboliques de base des bactéries au niveau cellulaire, conduisant ainsi à un effet bactéricide et/ou bactériostatique.

Une description détaillée de l'effet oligodynamique de l'argent peut être trouvée dans Oligodynamic Metals, de 1.13. Romans, dans Disinfection, Sterilization et Preservation, de C.A. Lawrence et S.S. Bloek, publié par Lea et Fibiger (1968), The Oligodynamic Effect of Silver, de A. Goetz, R. L. Tracy et F.S. Harris, Jr. et Silver in Industry de L. Addicks, publié par Reinhold Publishing Corporation (1940). Ces publications décrivent les résultats qui démontrent que l'argent est efficace comme agent antimicrobi en pour une large gamme de bactéries. Les auteurs du premier article affirment que "les résultats montrent qu'il y a une forme oligodynamique des métaux, en particulier l'argent, qui est antimicrobien et stable" et les auteurs du deuxième article affirment que "l'argent est un désinfectant chimique quasi-parfait pour les substances en contact avec les êtres humains et les animaux".

Cependant, ces publications sur les propriétés antibactériennes de l'argent indiquent clairement que l'efficacité de l'argent en tant qu'agent antimicrobien dépend d'une manière critique de l'identité chimique et physique de 30 la source d'argent, l'argent pouvant être sous la forme de particules métalliques de tailles variables, l'argent pouvant être modérément soluble, tel que le chlorure d'argent, l'argent pouvant être un sel très soluble comme le nitrate d'argent, etc..., ainsi que l'identité moléculaire des espèces actives (ions Ag+ ou complexes tels que (AgC12)-, etc...) et également du mécanisme par lequel les espèces d'argent actives interagissent avec l'organisme, cela dépendant du type d'organisme, tel que l'adsorption sur la paroi de la cellule, entraînant sa rupture ou sa plasmolyse, moment où les espèces d'argent pénètrent la membrane cytoplasmique et se fixent sur elle, ou l'adsorption suivie de la coagulation du protoplasme, ou la précipitation de l'albumine protoplasmique de la cellule de la bactérie, etc. L'efficacité antibactérienne de l'argent est déterminée par la nature et la concentration en espèces actives, le type de bactéries, la surface des bactéries qui est disponible pour l'interaction avec les espèces actives, la concentration en bactéries, la concentration et/ou la surface des espèces qui pourraient consommer les espèces actives et diminuer leurs activités, les mécanismes de désactivation, etc. Pour le contrôle microbien, en milieu aqueux, on préfère utiliser un composé d'argent peu soluble dans l'eau afin d'éviter une diffusion trop rapide des ions argent dans le milieu et de prolonger l'efficacité antimicrobienne du composé.

Le problème rencontré avec les composés d'argent peu solubles ou insolubles dans l'eau est qu'ils présentent généralement une faible activité 20 antimicrobienne.

Les composés à base d'argent plus solubles dans l'eau, tel que le chlorure d'argent, présentent une forte activité antimicrobienne, mais du fait de leur solubilité dans le milieu, leur efficacité antimicrobienne est écourtée.

La présente invention propose un procédé pour contrôler la croissance microbienne qui utilise un composé à base d'argent insoluble dans l'eau mais qui présente une forte activité antimicrobienne.

Ainsi, la présente invention a:pour objet un procédé pour contrôler la croissance microbienne consistant à utiliser un complexe pyrazolate d'argent d' sous forme de filaments de longueur moyenne comprise entre 0, 2 et 1 p.m et de diamètre moyen compris entre 35 et 50 nm, ne comprenant pas d'argent sous sa forme métal d . Un tel complexe pyrazolate d'argent d' est susceptible d'être obtenu par un procédé de préparation qui comprend les étapes suivantes: a) mélanger un sel d'argent et une 13dicétone, le rapport molaire t3- dicétone/ion argent étant compris entre 10 et 50, b) ajouter de l'hydrazine, le rapport molaire hydrazine/(3dicétone étant inférieur à 1, c) récupérer le précipité de pyrazolate d'argent d' formé d) éliminer les sels résiduels.

L'utilisation comme agent antimicrobien d'un tel complexe d'argent, 10 insoluble dans l'eau et présentant une forte activité antimicrobi enne, permet de contrôler efficacement la croissance microbienne.

D'autres caractéristiques apparaîtront à la lecture de la description qui suit, faite en référence aux dessins dans lesquels: la figure 1 représente une photographie TEM d'un complexe 15 pyrazolate d'argent utilisé dans le procédé selon l'invention, et la figure 2 représente le spectre Raman d'un complexe pyrazolate d'argent utilisé dans le procédé selon l'invention.

La publication N. Masciocchi, P. Cairati, A. Sironi, Crystal structure determination of molecular compounds from conventional powder diffraction data: trimeric silver(I) 3,5-dimethylpyrazolate, Powder Diffraction 13(1), March 1998 35-40, décrit un complexe 3,5-diméthylpyrazolate d'argent obtenu en mélangeant de l'ammoniac et une solution de nitrate d'argent, puis en ajoutant du pyrazole. Le complexe obtenu est un matériau cristallin dont chaque molécule est un ensemble trimère cyclique de fragments Ag(dmpz), dmpz signifiant diméthylpyrazolate, de formule chimique Ag3C15H22N6, avec un ligand dmpz pontant, dans un mode exobidentate, des arêtes Ag...Ag non liés.

Contrairement à ce procédé qui consiste à ajouter à un composé à base d'argent un ligand pyrazole, le procédé de préparation du complexe pyrazolate d'argent d' utilisé dans la présente invention consiste à former le groupe pyrazole in situ à partir d'hydrazine. Ce procédé comprend les étapes suivantes: a) mélanger un sel d'argent et une 13dicétone, le rapport molaire [3-dicétone/ion argent étant compris entre 10 et 50, b) ajouter de l'hydrazine, le rapport molaire hydrazine/(3dicétone étant inférieur à 1, c) récupérer le précipité de pyrazolate d'argent d' formé, d) éliminer les sels résiduels.

Le solvant du milieu réactionnel est choisi de sorte que tous les composés de départ sont solubles dans ledit solvant. De préférence, la synthèse est réalisée en phase alcoolique, avec de l'éthanol. ou du méthanol.

Le sel d'argent est de préférence du nitrate d'argent.

La (3-dicétone a la formule

O O

où R, R' et R" sont indépendamment identiques ou différents les uns des autres, et 15 chaque R, R' et R" est indépendamment H, un groupe alkyle en C1-C4, CH2F, CHF2, CF3.

La 13-dicétone doit pouvoir former un énol stable pour former un chélate en présence de l'ion argent. De préférence, la [3-dicétone est l'acétylacétone, avec R étant H, R' et R" étant un groupe méthyle.

De préférence, on utilise de l'hydrazine non substituée de formule H2NNH2.

Le rapport molaire (i-dicétone/ion argent doit être de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur ou égal à 12, et de préférence supérieur ou égal à 24.

Le rapport molaire (3-dicétone/ion argent doit être de préférence inférieur à 50, de préférence inférieur ou égal à 48.

Le rapport molaire hydrazine/[3-dicétone doit être inférieur à 1. De préférence, le rapport molaire hydrazine/(3-dicétone est proche de 1, mais doit rester inférieur à 1.

Dans la pratique, on réalise tout d'abord le mélange de la (3-dicétone avec le sel d'argent en milieu alcoolique sous agitation, à température ordinaire entre 15 C et 35 C, de préférence entre 20 C et 25 C. Puis on ajoute l'hydrazine sous forme de solution aqueuse ou alcoolique. Il se forme un précipité qui est récupéré par différentes techniques connues, telles que la centrifugation. Puis le précipité est lavé. Les sels résiduels peuvent être éliminés soit avant la centrifugation par des techniques de filtration soit après centrifugation par lavages. Les sels résiduels peuvent aussi être éliminés par dialyse.

Le précipité obtenu sous forme de poudre est ensuite séché. Le précipité obtenu est un complexe pyrazolate d'argent dl sous forme de filaments de longueur moyenne comprise entre 0,2 et 1 m et de diamètre moyen compris entre 35 et 50 nm, ne comprenant pas d'argent sous sa forme métal d .

Le groupe pyrazolate a la formule où R, R' et R" sont indépendamment identiques ou différents les uns des autres, et chaque R, R' et R" est indépendamment H, un groupe alkyle en C1-C4, CH2F, CHF2, CF3. De préférence, on obtient le groupe pyrazolate avec R étant H, R' et R" étant un groupe méthyle, correspondant au 3,5-diméthylpyrazolate.

De préférence, on forme le complexe 3,5-diméthylpyrazolate d'argent d'.

Le complexe pyrazolate d'argent dl utilisé dans la présente invention est insoluble dans l'eau, et présente une forte activité antimicrobienne.

Le procédé selon la présente invention consiste à utiliser ce complexe pyrazolate d'argent dl comme agent antimicrobien dans tous les types d'applications connues pour lesquelles on recherche un effet antimicrobien. Par exemple le complexe pyrazolate d'argent dl décrit cidessus peut être intégré dans des revêtements de surface, ou pulvérisé en surcouche, ou utilisé comme additif, et être utilisé dans le domaine de l'alimentaire ou de l'hygiène, pour lesquels le contrôle microbien est fondamental.

Les exemples suivants illustrent la présente invention sans toutefois en limiter la portée.

1) Synthèse du complexe pyrazolate d'argent dl On utilise les réactifs listés dans le tableau I suivant:

Tableau I

Réactif Poids moléculaire ou densité Concentration AgNO3 169 g/mol 0,1 M dans l'éthanol Hydrazine hydratée 55% en poids (35% hydrazine) diluée 10 fois dans l'eau (1,11 M) Acétylacétone 99%, D= 0,975, M=100,12 9,64 M A 5 mL (48 mmol) d'acétylacétone, on ajoute 20 mL de la solution éthanolique de nitrate d'argent (2 mmol). L'hydrazine hydratée est ensuite ajoutée goutte à goutte. Il se forme pratiquement immédiatement un précipité jaune. L'addition d'hydrazine est arrêtée après un ajout total de 20 mL de solution d'hydrazine (22 mmol). Le précipité est récupéré par centrifugation à 14 500 trs/minute pendant 15 minutes puis lavé avec un mélange eau/acétone.

On obtient le composé 1. Par analyse TEM (Transmission Electronic Microscopy) on obtient le composé 1 tel que représenté sur la figure 1. Le composé 1 est un complexe 3,5-diméthylpyrazolate d'argent dl sous forme de filaments de longueur moyenne comprise entre 0,2 et 1 m et de diamètre moyen compris entre 35 et 50 nm, qui ne comprend pas de particules d'argent métal d .

Le composé 1 comprend 51% d'argent en masse.

Le spectre Raman du composé 1 est représenté par la figure 2.

On reproduit le procédé de synthèse ci-dessus, mais en faisant varier les quantités de réactifs.

Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau II suivant: Tableau] [I Synthèse Rapport molaire Rapport molaire Observations f3-dicétone/ion hydrazine/(3- métallique dicétone 2 1 0,6 Précipité noir 3 6 0,5 Précipité noir 4 12 0,9 Précipité jaune 12 1 Particules noires 6 24 0, 16 Précipité jaune 7 24 0,25 Précipité jaune 8 24 0,5 Précipité jaune 9 24 0, 9 Précipité jaune 24 1 Précipité brun 11 48 0,45 Précipité jaune 12 96 0, 1 Pas de précipité Les résultats montrent que lorsque les rapports (3dicétone/sel 5 d'argent/hydrazine sont respectés, on obtient un précipité jaune de 3,5-diméthylpyrazolate d'argent dl sous forme de filaments.

Lorsque la quantité de f3-dicétone est insuffisante, on obtient un précipité noir d'argent sous forme métal d . De même, lorsque la quantité d'hydrazine est supérieure ou égale à la quantité de (3-dicétone, en terme de rapport lo molaire, on observe un changement progressif de la couleur, de jaune à brun, indiquant une changement de morphologie du produit en solution obtenu et une disparition des nanofilaments, les particules prenant d'autres formes et d'autres dimensions.

2) Synthèse de filaments d'argent d A titre comparatif, on réalise la synthèse de filaments d'argent d , adaptée de la synthèse décrite par J. Sharma, N.K. Chaki, S. Mahima, R. Gonnade, I. Mulla, K. Vijayamohanan, Physical Chemistry Division, National Chemical Laboratory, Pune, India, Journal of Materials Chemistry (2004), 14(6), 970-975.

On utilise les réactifs listés dans le tableau III suivant:

Tableau III

Réactif Poids moléculaire g/mol Concentration AgNO3 169 0,01 M dans l'eau 4-aminothiophenol 129,15 0,01 M dans (4-ATP) l'acétonitrile On mélange 2 ml de la solution d'AgNO3 et 10 ml de la solution de 4-ATP, puis on agite le mélange pendant une nuit à température ambiante. Il se forme un précipité récupéré par centrifugation à 14 500 trs/minute pendant 15 minutes, puis séché à 70 C. On obtient le composé 2, qui est de l'argent d sous forme de filaments. Il comprend 54% d'argent en masse.

Exemples 1-10

On teste l'activité antimicrobienne des composés 1 et 2 obtenus selon les synthèses ci-dessus. Pour cela, on utilise une méthode quantitative par dispersion, le composé n'étant pas soluble en solution aqueuse. La procédure de test utilisée est inspirée des méthodes normalisées JIS Z2801 test of activity and efficacy of Antimicrobial products et ASTME2149-01 determining the antimicrobial activity of immobilized antimicrobial agents under dynamic contact conditions Le principe de la méthode est de placer une quantité connue du composé en contact avec un milieu de culture inoculé avec les micro-organismes. Dans le cas d'une suspension non soluble des composés synthétisés, le contact étroit entre les micro-organismes et les particules permet d'obtenir un effet de l'argent sur la croissance des micro-organismes. Le suivi du nombre de micro-organismes au cours du temps visualise l'effet ou le non effet biocide ou biostatique des composés. Si le nombre de micro-organismes diminue, on a un effet biocide, s'il est constant on a un effet statique, s'il augmente il n'y a pas d'effet ou peu. Cet effet est proportionnel à la quantité d'argent, des micro-organismes en présence et des conditions environnementales (température, agitation...).

Pour des conditions définies comme dans les méthode normalisée citées plus haut, il est possible de faire varier les concentration des composés afin d'estimer la valeur limite au-dessus de laquelle il y a une activité biocide et en-dessous de laquelle il n'y a pas d'activité antimicrobienne. Cette limite se nomme Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) Les conditions opératoires sont les suivantes: Une quantité exacte de composé sous forme de poudre est ajoutée au milieu de culture liquide (Trypcase Soja dilué 1/10). Cette quantité est calculée pour obtenir les teneur en argent listées dans le Tableau N, à savoir environ 100 mg/1 de solution de culture.

Une dilution en série, suivant les règle de l'art en microbiologie, permet de fabriquer une série de solutions jusqu'à la concentration minimale de 0.2 mg/1. Chaque solution est inoculée par 100 000 bactéries / ml de Escherichia coli (ATCC 11775) qui est le représentant commun des bactéries GRAM-négatives. Les échantillons sont incubés à 37 C pendant plusieurs jours. Chaque jour un aliquot est prélevé et le nombre de bactéries est évaluée suivant la méthode de comptage sur boite en milieu Trypcase Soja Agar (TSA) à 3 7 C. Les résultats sont exprimés en Unité Formant Colonie (UFC/mll), ou en bactéries / ml. Plus leur nombre est faible plus l'activité antimicrobienne est élevée.

Les exemples 1-5 correspondent au composé 1 (complexe 3,5diméthylpyrazolate d'argent dl), et les exemples 6-10 correspondent au composé 2 (argent d ).

Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau IV suivant:

Tableau TV

Exemples Concentration Bactéries/ml Bactéries/ml Bactéries/ml en Ag (ppm) 24 h 48 h 72 h Ex 1 (inv.) 102 0 0 0 Ex 2 (inv.) 20 0 0 0 Ex 3 (inv.) 4 3 000 000 >500 000 000 >500 000 000 Ex 4 (inv.) 0,8 > 500 000 000 >500 000 000 >500 000 000 Ex 5 (inv.) 0,2 >500 000 000 >500 000 000 >500 000 000 Ex 6 (comp.) 108 >500 000 000 > 500 000 000 >500 000 000 Ex 7 (comp.) 22 >500 000 000 >500 000 000 >500 000 000 Ex 8 (comp.) 4 >500 000 000 >500 000 000 > 500 000 000 Ex 9 (comp.) 0,9 >500 000 000 >500 000 000 >500 000 000 Ex 10 (comp.) 0,2 >500 000 000 >500 000 000 >500 000 000 Les résultats ci-dessus montrent que seul le complexe 3,5-diméthylpyrazolate d'argent dl présente une activité antibactérienne. La CMI se situe entre 4 et 20 ppm. Le composé 2 d'argent d ne présente pas d'activité antibactérienne pour des concentrations inférieures à 100 ppm.

A titre de comparaison, la CM[ de AgNO3 dans les mêmes conditions est de 5 ppm. Un autre type de filament est aussi peu soluble en solution aqueuse, il s'agit des filaments d'argents métalliques qui présentent peu io d'activité antibactérienne dans des conditions identiques, même à concentration élevée en argent (>1000 ppm Ag).

Le complexe 3,5-diméthylpyrazolate d'argent dl est donc un très bon agent antimicrobien.

L'utilisation du complexe 3,5-diméthylpyrazolate d'argent dl selon 15 le procédé de la présente invention permet donc de contrôler la croissance microbienne.

Claims (8)

REVENDICATIONS

1 - Procédé pour contrôler la croissance microbienne consistant à utiliser un complexe pyrazolate d'argent dl sous forrne de filaments de longueur moyenne comprise entre 0,2 et 1 m et de diamètre moyen compris entre 35 et 5 50 nm, ne comprenant pas d'argent sous sa forme métal d .

2- Procédé selon la revendication 1, dans lequel le groupe pyrazolate a la formule R R" N N où R, R' et R" sont indépendamment identiques ou différents les uns des autres, et chaque R, R' et R" est indépendamment H, un groupe alkyle en Cl-C4, CH2F, CHF2, CF3.

3 - Procédé selon la revendication 2, dans lequel le groupe pyrazolate est le 3,5-diméthylpyrazolate, avec R étant H, R' et R" étant un groupe méthyle.

4 - Procédé selon la revendication 1, dans lequel le complexe pyrazolate d'argent dl est susceptible d'être obtenu par un procédé de préparation qui comprend 20 les étapes suivantes: a) mélanger un sel d'argent et une 13-dicétone, le rapport molaire (3-dicétone/ion argent étant compris entre 10 et 50, b) ajouter de l'hydrazine, le rapport molaire hydrazine/13-dicétone étant inférieur à 1, c) récupérer le précipité de pyrazolate d'argent dl formé, d) éliminer les sels résiduels.

- Procédé selon la revendication 4, dans lequel le rapport molaire (3dicétone/ion argent est supérieur ou égal à 12.

6 - Procédé selon la revendication 4, dans lequel le rapport molaire (3dicétone/ion argent est supérieur ou égal à 24.

7 - Procédé selon la revendication 4, dans lequel la (3-dicétone a la formule

O O

où R, R' et R" sont indépendamment identiques ou différents les uns des autres, et chaque R, R' et R" est indépendamment H, un groupe alkyle en C1-C4, CH2F, CHF2, CF3.

8 - Procédé selon la revendication 7, dans lequel la f3-dicétone est l'acétylacétone, avec R étant H, R' et R" étant un groupe méthyle.

9 - Utilisation comme agent antimicrobien d'un complexe pyrazolate d'argent dl sous forme de filaments de longueur moyenne comprise entre 0, 2 et 11.tm et de diamètre moyen compris entre 35 et 50 nm, ne comprenant pas d'argent sous sa forme métal d .