FR2855975A1 - Modeles de systeme osseux - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à un modèle de système osseux comportant une matrice minéralisée et des ostéoblastes, caractérisé en ce que les ostéoblastes sont déposés sur la matrice de manière à former un tapis à confluence et/ou des nodules, et les ostéoclastes sont déposés sur ledit tapis et/ou lesdits nodules, ainsi qu'à des modèles de système osseux atteints de diverses pathologies. L'invention couvre également les utilisations pour la réalisation de criblages, de tests d'agressivité et de toxicité.
Description
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Modèles de système osseux La présente invention se rapporte à des modèles de système osseux.
Elle vise plus particulièrement des modèles de système osseux in vitro comportant une matrice résorbable, des ostéoclastes et des ostéoblastes, une méthode de sélection des matrices utilisables pour les modèles selon l'invention ainsi que des modèles de système osseux mimant une pathologie particulière.
L'os est constitué de cellules et d'une matrice extracellulaire qui est minéralisée. La population cellulaire est composée de deux types cellulaires : les ostéoclastes qui dégradent la matrice osseuse et les ostéoblastes qui la reconstruisent. Jusqu'à présent, la majorité des travaux de recherche effectuée sur le sujet s'est orientée sur l'étude spécifique des ostéoclastes, en tant que cellules osseuses responsables de la dégradation de la matrice osseuse, sur l'étude spécifique des ostéoblastes ou, sur le choix de matrices artificielles capables de mimer la matrice osseuse humaine. En particulier, l'article par Shibutani et al (J Biomed Mater Res, Use of glass slides coated with apatite-collagen complexes for measurement of osteoclastic résorption activity, 31:43-49, 1996) décrit un exemple de matrice minéralisée à base de collagène.
Plus récemment, un article par Sun et al (J Biomed Mater Res, The influence of hydroxyapatite particles on osteoclast cell activities, 45(4) 311-21, 1999) étudie l'influence de la taille des particules de poudre d'hydroxyapatite sur l'activité des ostéoclastes. Une coculture de cellules ostéoblastiques et ostéoclastiques y est en particulier décrite.
Les travaux des inventeurs les ont amené à mettre au point un modèle de système osseux comportant une matrice minéralisée et des ostéoclastes, caractérisé en ce que des ostéoblastes sont déposés sur la matrice de manière à former un tapis à confluence et/ou des nodules, les ostéoclastes étant déposés sur ledit tapis et/ou lesdits nodules.
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La disposition des deux types cellulaires est particulièrement importante pour reconstituer ce système osseux servant de modèle. En effet, les cellules osseuses humaines ne sont activées que dans un certain environnement. Les inventeurs ont réussi à reconstituer cet environnement en réalisant un tapis d'ostéoblastes à confluence ou des nodules d'ostéoblastes, et à poser sur ce tapis ou ces nodules, des ostéoclastes. De manière inattendue, les inventeurs ont constaté que les ostéoclastes, cellules 10 fois plus grandes environ que les ostéoblastes, étaient capables de se frayer un chemin à travers la population jointive d'ostéoblastes (sous forme de tapis à confluence ou de nodules) afin d'aller exercer leur activité de résorption directement sur la matrice osseuse. Les ostéoclastes se trouvent alors localisés sous la population d'ostéoblastes, et ce, au bout de la 2e heure environ, qui suit le dépôt des ostéoclastes.
Afin de vérifier que la migration des ostéoclastes à travers la couche ostéoblastique est bien un mécanisme spécifique du tissu osseux, les inventeurs ont repris l'expérience à l'identique sur une lamelle de dentine (support le plus proche de l'os). Or, sur ce support, la migration à travers la couche ostéoblastique a également été observée.
Une telle constatation permet donc de valider le modèle comme adéquat pour mimer le système osseux, et plus particulièrement, le système osseux murin ou humain. D'autres observations, décrites dans les exemples de la présente demande, confirment cette validation.
Avantageusement, le modèle de système osseux selon l'invention comporte une matrice composée de collagène et de phosphate de calcium et/ou des dérivés de phosphate de calcium. De préférence, le dérivé de phosphate de calcium est de l'hydroxyapatite.
De préférence, le rapport entre les ostéoclastes et les ostéoblastes est d'environ 1/10 à 1/25. Ce rapport est variable car dépendant du phénomène que l'on souhaite observer. En effet, si un trop grand nombre d'ostéoclastes est ajouté, il se produira une dégradation
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trop importante et trop rapide de la matrice, gênant ainsi une éventuelle quantification du matériel résorbé (mesure de la surface qui n'est plus minéralisée).
Le modèle selon l'invention fournit les moyens de tester l'efficacité de drogues connues ou nouvelles dans la perspective de la mise en évidence de nouveaux traitements thérapeutiques dans un contexte osseux normal ou pathologique.
Par drogues , on entend des molécules biologiquement actives.
Plus particulièrement, l'invention permet de tester le potentiel de toutes drogues déjà connues (ex : biphosphonate, PTH, vitamine D...) ou nouvelles sur la formation osseuse (ostéoblastes) et /ou sur l'invasion et /ou sur la migration et /ou sur la résorption osseuse (ostéoclastes) générant ainsi un test rapide in vitro d'évaluation du potentiel thérapeutique de toutes molécules pouvant agir sur le métabolisme osseux, mais aussi des effets néfastes (effet secondaires) de toutes drogues utilisées pour d'autres pathologies ne touchant pas l'os (ex : diabètes, maladies cardiaques...).
Dans la demande, le terme migration employé seul signifie le mouvement des ostéoclastes durant la résorption. De même, le terme invasion employé seul renvoie à la colonisation du support à résorber. En revanche, lorsque ces termes sont utilisés pour faire référence à la traversée de la couche ostéoblastique, ils sont suivis d'une expression le précisant.
Selon un mode de réalisation, les ostéoblastes et/ou des ostéoclastes déposés peuvent être génétiquement modifiés. Le dépôt de cellules génétiquement modifiées permet l'étude du comportement de ces cellules et de l'évolution du système osseux, plus particulièrement en vue d'une thérapie génique. L'utilisation de ces cellules génétiquement modifiées est particulièrement adéquate sur les modèles de systèmes osseux présentant une pathologie, tels que décrits par la suite.
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La présente invention vise également une méthode de sélection de matrices permettant de reconstituer un modèle de système osseux, caractérisée en ce que l'on soumet une matrice minéralisée au procédé suivant : - dépôt d'un tapis et/ou des nodules d'ostéoblastes à confluence sur la matrice, - dépôt d'ostéoclastes isolés sur le tapis et/ou les nodules, - observation de l'invasion des ostéoclastes à travers le tapis et/ou les nodules d'ostéoblastes, - observation de la résorption de la matrice minéralisée, - sélection des matrices sur lesquelles les ostéoclastes sont localisés entre la matrice et le tapis et/ou les nodules d'ostéoblastes et sur lesquelles une résorption est observée ; ainsi que les matrices artificielles sélectionnées à l'aide de ladite méthode.
En effet, le comportement des cellules sur la matrice permet de déterminer si l'environnement choisi pour mimer le système osseux est adéquat. Par l'observation du comportement cellulaire, on peut donc déterminer si la matrice choisie est un bon modèle de matrice osseuse.
Avantageusement, le matériau de la matrice à tester pourra être choisi parmi l'ensemble des biomatériaux, c'est-à-dire des matériaux compatibles avec le tissu vivant. Une modification de la matrice (ajout de différents composés protéiques ou autres) peut amener au développement de nouveaux biomatériaux.
Comme nous l'avons évoqué plus haut, l'invention propose également des modèles de système osseux mimant des pathologies osseuses. Ces modèles sont réalisés de préférence à partir de cellules (ostéoblastes et/ou ostéoclastes) extraites de tissus provenant de toutes pathologies osseuses.
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En particulier, l'invention propose un modèle de système osseux cancéreux, atteint d'ostéoporose, d'ostéomalacie et/ou d'arthrite rhumatoïde.
Par modèle de système osseux cancéreux , on entend les modèles de système osseux correspondant aux pathologies suivantes : - un malade atteint d'une tumeur primaire cancéreuse, - un malade atteint d'une tumeur primaire cancéreuse (sein, prostate, ...) avec métastases, - un malade atteint d'un cancer des os.
Ces modèles mimant des pathologies utilisent le modèle de système osseux décrit plus haut, mais portant un certain nombre de modifications.
Par exemple, pour le modèle de système osseux cancéreux, les modifications sont les suivantes : - les ostéoblastes et/ou les ostéoclastes sont issus d'animaux normaux, ovariectomisés et/ou orchiectomisés, etc..., et, - on dépose de plus des cellules issues de lignées cellulaires de cancer.
Pour étudier un cancer des os, les cellules déposées seront par exemple issues d'une lignée cellulaire de cancer des os. Dans les autres cas, on déposera des cellules issues d'une lignée cellulaire de tumeur primaire à potentiel métastatique (sein, prostate, ...) ou non.
Ce modèle permet d'observer les phénomènes de colonisation du tissu osseux par les cellules tumorales et de visualiser la phase de métastase. En effet, comme le montre l'invasion des ostéoclastes à travers la couche ostéoblastique, les cellules placées dans un environnement mimétique du système osseux, ont la capacité de se déplacer dans cet environnement.
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Ce modèle est plus particulièrement adapté pour réaliser un test d'agressivité des cellules tumorales (voir exemple 4). L'existence de nombreux cancers primaires (sein , prostate ....) capables de métastaser dans l'os est maintenant un fait établi en cancérologie.
Or, ce cancer de l'os qui en découle s'avère dans la majorité des cas, incurable. L'invention permet de tester in vitro l'agressivité (invasion, migration, prolifération) de cellules tumorales (par exemple, issues de tumeurs mammaires ou de la prostate) provenant de biopsies de patients. Ces cellules tumorales sont déposées sur le modèle de système osseux selon l'invention et permettent ainsi d'estimer le potentiel agressif des cellules de la tumeur primaire au niveau de leur capacité d'invasion, de migration et/ou de prolifération ainsi que d'établir un pronostic sur le développement d'un cancer secondaire osseux.
Plus précisément, l'invention propose un test rapide in vitro d'évaluation du potentiel thérapeutique (chimiothérapie et/ou radiothérapie) de toutes molécules pouvant être utilisées en cancérologie afin de réduire l'apparition et/ou de contribuer au traitement anti-cancéreux d'un cancer de l'os.
Le modèle de système osseux atteint d'ostéoporose comporte les modifications suivantes : - les ostéoblastes et/ou les ostéoclastes' sont issus d'animaux normaux, ovariectomisés et/ou orchiectomisés, l'ostéoporose étant alors induite chimiquement in situ et/ou d'animaux knock-out, transgéniques pour toutes molécules dont la modulation de l'expression induit une baisse de la masse osseuse, tandis que le modèle de système osseux atteint d'ostéomalacie est modifié comme suit : - les ostéoblastes et/ou les ostéoclastes sont issus d'animaux normaux, l'ostéomalacie étant alors induite chimiquement in situ et/ou knock-out pour le récepteur à la vitamine D ou pour toutes autres molécules capable d'induire une ostéomalacie.
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De nombreuses molécules sont connues pour induire une ostéoporose.
On peut citer, à titre d'exemple, la dexaméthasone, l'hydrocortisone, la prednisolone et ses dérivés, la fluocortolone, l'héparine calcique ou sodique.
De même, l'ostéomalacie peut être induite par les molécules suivantes : les sels d'aluminium, le barbital et ses dérivés, le rétinol, le bêtacarotène.
Enfin, le modèle de système osseux atteint d'arthrite rhumatoïde peut comporter les modifications suivantes : - les ostéoblastes et/ou les ostéoclastes sont issus d'animaux normaux, l'arthrite rhumatoïde étant alors induite chimiquement in situ, et/ou d'animaux knock-out, transgéniques pour toutes molécules capables d'induire une arthrite rhumatoïde ou d'animaux ayant subi des injections de collagène de type II, ou de toutes autres substances susceptibles d'induire une inflammation articulaire minant une arthrite rhumatoïde.
Les molécules pouvant induire des arthrites rhumatoïdes sont, à titre d'exemple, certains interférons a, certains vaccins (BCG, hépatite B, rubéolique...), le cortivazol, certains sels de lithium, l'ampicilline.
La présente demande protège également l'utilisation des différents modèles pour réaliser des criblages de molécules thérapeutiques et des tests d'efficacité. A l'aide des modèles selon l'invention, l'efficacité des différentes molécules actuellement connues et de celles qui seront mises à jour pourra être comparée. A titre d'exemple, le test d'efficacité pour l' ostéoporose pourra mettre en comparaison des molécules connues pour rétablir la masse osseuse comme le biphosphonate, les oestrogènes et toutes les nouvelles molécules mises à jour à l'aide du modèle utilisé pour réaliser un criblage. Le test d'efficacité pour l'ostéomalacie pourra prendre comme molécule de référence la vitamine D, tandis que le test pour
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l'arthrite rhumatoïde pourra prendre comme molécules de référence l'aspirine et/ou les anti-inflammatoires non stéroïdien.
De manière avantageuse, les modèles selon l'invention sont particulièrement adaptés pour réaliser des tests de toxicité d'un composé chimique dans lesquels au moins une concentration dudit composé est testée sur un modèle selon l'invention. De tels tests permettent d'évaluer les effets secondaires de médicaments sur la physiologie osseuse (par exemple, les médicaments contre le diabète, les antibiotiques), les effets toxiques des polluants (dioxine, insecticides...) , etc... Avantageusement, plusieurs concentrations seront testées afin d'établir une relation entre la concentration du composé et les effets secondaires engendrés dans le modèle de système osseux.
Un modèle de système osseux atteint d'ostéomyélite et/ou d'infection osseuse peut également être construit en ajoutant dans le système modèle selon l'invention différentes souches bactériennes ou virales. A titre d'exemple, on citera les souches suivantes : Enterobacter cloacae, le staphylocoque doré, le streptocoque bêta hémolytique A, Haemophilus influenzae type b, les salmonelles, Pseudomonas, et/ou les pneumocoques...
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent, avec références aux figures , qui représentent respectivement : - la figure 1 est un schéma du processus de traversée de la couche ostéoblastique par les ostéoclastes et de résorption ostéoclastique, - les figures 2 et 3 sont composées d'images obtenues par analyse
3D par microscopie confocale montrant l'agencement des deux types cellulaires, A : ostéoclaste, B : ostéoblaste, C : coupe en Z.
3D par microscopie confocale montrant l'agencement des deux types cellulaires, A : ostéoclaste, B : ostéoblaste, C : coupe en Z.
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Exemple 1 : Reconstitution d'une interface osseuse cellularisée pour un test de résorption - Tapis d'ostéoblastes à confluence. a. Matrice La matrice minéralisée est préparée soit sur lamelles de verre (pour microscopie) soit sur plastique traité pour culture cellulaire. Le support est d'abord recouvert pendant 15h d'une solution de collagène I à 0,lmg/mL diluée dans de l'acide acétique 0,1M. L'excès de collagène est éliminé puis le support est recouvert pendant une semaine à 37 C avec une solution de TRIS 200mM, pH (8,5), de phosphatase alcaline, 0,4g/L de phosvitine et 3g/L de chlorure de diméthyle suborimidate.
Cette étape est suivie de la minéralisation proprement dite. Cette minéralisation est constituée de 2 étapes successives :
1- le support est recouvert d'une solution TRIS 200mM, pH(8,5),
0,4g/L de phosphatase alcaline, 0,4g/L de phosvitine pendant
3h, puis,
2- cette solution est remplacée par une solution de TRIS 200mM, pH (8,5) et de (3-glycérophosphate 126,06g/L pendant 20h.
1- le support est recouvert d'une solution TRIS 200mM, pH(8,5),
0,4g/L de phosphatase alcaline, 0,4g/L de phosvitine pendant
3h, puis,
2- cette solution est remplacée par une solution de TRIS 200mM, pH (8,5) et de (3-glycérophosphate 126,06g/L pendant 20h.
Ces deux étapes sont répétées 10 fois. La trame de collagène I peut être complétée avec d'autres protéines (ostéopontine, vitronectine, BSP, ostéocalcine, collagène de type I conjugué à un agent fluorescent, par exemple, la rhodamine, etc...) ou d'autres substituts (par exemple, des substituts minéraux : fluor, strontium ranélate...) . b. Ostéoblastes Des cellules de la lignée ostéoblastique murine MC 3T3 sont mises en culture en milieu a-MEM complété avec 10% en volume de sérum de veau f#tal, de la dexaméthasone 10-8M et de l'acide ascorbique 0,028mM. Les cellules sont ensuite détachées et ensemencées à confluence sur le support minéralisé.
Les ostéoblastes peuvent également être issus de lignées ostéoblastiques de rat (Ros) ou humaine (HEPM, hFOB) et préparés
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selon le même protocole. Alternativement, un protocole de culture primaire d'ostéoblastes est proposé dans l'exemple 2. c. Ostéoclastes Les ostéoclastes issus de cultures primaires humains ou murins ou de lignées (par exemple, la lignée RAW ou lignée humaine GCT23) sont obtenus après 7 jours de différenciation comme décrit dans Destaing et al (Mol Biol Cell, Podosomes display actin turnover and dynamic self -organisation in osteoclasts expressing actin-green fluorescent protein, 14(2) :407-16, 2003). Les précurseurs d'ostéoclastes sont cultivés en présence de milieu a-MEM complété avec 10% en volume de sérum de veau f#tal et de deux cytokines recombinantes : M-CSF et RANK-L (20ng/L). Les cellules sont placées à 37 C et 5% de CO2 et le milieu est changé tous les deux jours pendant 7-8 jours. Les ostéoclastes différenciés sont détachés avec une solution d'EDTA à 0,25mM diluée dans du PBS 1X. Les ostéoclastes sont ensemencés à une densité de 10 cellules/mm2. d. Fixation La fixation est réalisée dans du PBS 1X additionné de formaldéhyde 3,7% pendant 10 min. e. Résultats La résorption de la matrice minéralisée est observée en microscopie photonique dès la 6e ou 7e heure suivant le montage du modèle (temps écoulé entre le premier contact ostéoclastes-ostéoblastes et la résorption de la matrice).
Une seconde expérience a été menée afin de démontrer que les ostéoclastes sont capables de traverser le tapis dense de cellules ostéoblastiques avant de former des trous de résorption.
Par analyse 3D par microscopie confocale, il a été possible de démontrer le pouvoir invasif des ostéoclastes et de quantifier la résorption en mesurant la surface du substrat qui n'est plus minéralisée.
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La fixation des cellules est réalisée une heure et quatre heures après le dépôt des ostéoclastes.
La figure 2 comporte trois images montrant la localisation des différentes cellules une heure après le dépôt des ostéoclastes.
La figure 2A est une image de l'ostéoclaste. Celui-ci présente une forte polarité, ce qui démontre l'état actif des cellules. En effet, un ostéoclaste déposé sur un support non adéquat présente une faible épaisseur (non polarisé). En revanche, sur un support adéquat, celui s'épaissit afin de former un pôle basal (contact avec les ostéoblastes) et un pôle apical (contact avec le milieu). Les inventeurs ont constaté que cette polarité était maintenue durant la traversée de la couche ostéoblastique et maintenue lors la résorption. Toutefois, le pôle basal se retrouve au contact de la matrice tandis que le pôle apical est au contact des ostéoblastes.
La figure 2B est une image de l'ostéoblaste. On constate la présence de nombreux filaments d'actine. Les fibres de stress d'actine constituent un marqueur présent dans les ostéoblastes MC3T3.
La figure 2C est une coupe en Z, permettant de visualiser la localisation selon l'axe Z des deux cellules photographiées précédemment. Cette image montre que l'ostéoclaste est situé au dessus du tapis ostéoblastique (ligne claire en continue).
La figure 3 comporte également trois images correspondant aux trois images de la figure 2. La figure 3A est une photographie de l'ostéoclaste. Celui-ci a changé de forme, il s'est aplati. La figure 3B représente le tapis d'ostéoblastes. Celui-ci est à présent localisé au-dessus de l'ostéoclaste, ce dernier étant en contact direct avec la matrice (Figure 3C)et présente l'organisation d'un ostéoclaste en cours de résorption (la sealing zone , structure caractéristique des cellules résorbantes).
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Exemple 2 : Reconstitution d'une interface osseuse cellularisée pour un test de résorption - Nodules d'ostéoblastes. a. Matrice La matrice est préparée comme décrit dans l'exemple 1. b. Ostéoblastes Les ostéoblastes utilisés peuvent être issus de cultures primaires humaines ou murines, ou de lignées comme décrit dans l'exemple 1.
Les cellules ont été isolées par digestion enzymatique (collagénase (Sigma #C-0130)) à partir de calvaria de souris de 2 jours. Les cellules obtenues des quatre dernières étapes de digestion (population II-V) sont ensuite ensemencées dans des flasques T75 dans du milieu aMEM contenant 15% de sérum de veau f#tal (Flow Laboratories, McLean, VA) et 100 g/ml pénicilline G (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 50 g/ml gentamycine (Sigma), et 0.3 g/ml fungizone (Flow Laboratories). Après 24h d'incubation les cellules adhérentes sont rincées au PBS, traitées à la trypsine (0,01%) dans une solution saline de citrate, resuspendues dans le milieu standard décrit précédemment et ensemencées sur des plaques de 12 puits sur la matrice décrite dans l'exemple 1 à 10 cellules/puit. Après 24h d'incubation, le milieu est changé et supplémenté en acide ascorbique (50 g/ml) et en sodium -glycérophosphate (10 mM). Le milieu est ensuite changé tous les deux jours. Toutes les plaques sont incubées à 37 C sous une atmosphère à 95% d'air et 5% de C02.
Une culture primaire d'ostéoblastes humains est également possible. c. Ostéoclastes Les ostéoclastes sont préparés selon la méthode décrite dans l'exemple 1. d. Fixation La fixation est réalisée comme dans l'exemple 1.
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e. Résultats La résorption de la matrice minéralisée est observée en microscopie photonique dès la 7e heure suivant le montage du modèle.
Une seconde expérience a été menée afin de démontrer que les ostéoclastes sont capables de traverser les nodules d'ostéoblastes avant de former les trous de résorption.
Par analyse 3D par microscopie confocale, il est possible de démontrer le pouvoir invasif des ostéoclastes et de quantifier la résorption en mesurant la surface du substrat qui n'est plus minéralisée.
Comme dans l'exemple précédent, nous avons pu observer la traversée des ostéoblastes par les ostéoclastes ainsi que les trous de résorption réalisés par les ostéoclastes.
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Exemple <SEP> 3 <SEP> : <SEP> Variantes <SEP> des <SEP> types <SEP> cellulaires <SEP> déposés
<tb> pathologies <SEP> osseuses <SEP> description <SEP> du <SEP> système
<tb>
<tb> pathologies <SEP> osseuses <SEP> description <SEP> du <SEP> système
<tb>
ostéoporose (dégradation de la matrice osseuse -ostéoblastes de souris ovariectomisées (femelle) ou due l'arrêt de la synthèse d'oestrogènes chez orchiectomisées (mâle) ostéoclastes normaux
<tb> la <SEP> Femme, <SEP> de <SEP> la <SEP> testostérone <SEP> chez <SEP> l'Homme.) <SEP> -ostéoblastes <SEP> normaux <SEP> + <SEP> ostéoclastes <SEP> de <SEP> souris
<tb> ovariectomisées <SEP> (OVX) <SEP> ou <SEP> orchiectomisées <SEP> (ORX)
<tb> -ostéoblastes+ostéoclastes <SEP> de <SEP> souris <SEP> OVX <SEP> (femelle) <SEP> ou
<tb> ORX <SEP> (mâle)/ <SEP> ostéoclastes+ <SEP> ostéoblastes <SEP> normaux.
<tb> ostéomalacie <SEP> (déficience <SEP> en <SEP> vitamine <SEP> D <SEP> -ostéoblastes <SEP> de <SEP> souris <SEP> KO <SEP> VDR <SEP> (récepteur <SEP> de <SEP> la <SEP> vitamine
<tb> engendrant <SEP> une <SEP> mauvaise <SEP> minéralisation <SEP> de <SEP> la <SEP> D) <SEP> + <SEP> ostéoclastes <SEP> normaux <SEP> de <SEP> souris <SEP> KO <SEP> VDR
<tb> matrice <SEP> osseuse)-ostéoblastes <SEP> normaux <SEP> ostéoclastes <SEP> de <SEP> souris <SEP> KO <SEP> VDR
<tb> matrice <SEP> osseuse) <SEP> (récepteur <SEP> de <SEP> la <SEP> vitamine <SEP> D)
<tb> -ostéoblastes+ostéoclastes <SEP> de <SEP> souris <SEP> KO <SEP> VDR <SEP> (récepteur <SEP> de
<tb> la <SEP> vitamine <SEP> D)/ <SEP> ostéoclastes+ <SEP> ostéoblastes <SEP> normaux.
<tb> arthrite <SEP> rhumatoïde <SEP> (AR) <SEP> (inflammation <SEP> causée-ostéoblastes <SEP> de <SEP> souris <SEP> (injection <SEP> collagène <SEP> type <SEP> II
<tb> par <SEP> une <SEP> augmentation <SEP> de <SEP> la <SEP> résorption <SEP> osseuse <SEP> capable <SEP> d'induire <SEP> chez <SEP> la <SEP> souris <SEP> in <SEP> vivo <SEP> une <SEP> AR) <SEP>
<tb> par <SEP> les <SEP> ostéoclastes) <SEP> ostéoclastes <SEP> normaux
<tb> par <SEP> les <SEP> osteoclastes)-ostéoblastes <SEP> normaux <SEP> + <SEP> ostéoclastes <SEP> de <SEP> souris <SEP> (injection
<tb> collagène <SEP> type <SEP> II <SEP> capable <SEP> d'induire <SEP> chez <SEP> la <SEP> souris <SEP> in
<tb> vivo <SEP> une <SEP> AR)
<tb> -ostéoblastes+ostéoclastes <SEP> de <SEP> souris <SEP> AR/ <SEP> ostéoclastes <SEP> +
<tb> Autres <SEP> pathologies <SEP> osseuses <SEP> et <SEP> tous <SEP> KO <SEP> déjà <SEP> ostéoblastes <SEP> normaux
<tb> connus <SEP> pour <SEP> présenter <SEP> un <SEP> défaut <SEP> dans <SEP> le
<tb> métabolisme <SEP> osseux <SEP> (ALP, <SEP> src, <SEP> c-fos, <SEP> OPG,
<tb> Rankl, <SEP> récepteur <SEP> des <SEP> estrogène, <SEP> aromatase,
<tb> leptine <SEP> .....) <SEP> et <SEP> qui <SEP> pourraient <SEP> être <SEP> associés <SEP> à
<tb> des <SEP> mutations <SEP> humaines <SEP> non <SEP> encore <SEP> déterminées <SEP> :
<tb>
<tb> ovariectomisées <SEP> (OVX) <SEP> ou <SEP> orchiectomisées <SEP> (ORX)
<tb> -ostéoblastes+ostéoclastes <SEP> de <SEP> souris <SEP> OVX <SEP> (femelle) <SEP> ou
<tb> ORX <SEP> (mâle)/ <SEP> ostéoclastes+ <SEP> ostéoblastes <SEP> normaux.
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<tb> engendrant <SEP> une <SEP> mauvaise <SEP> minéralisation <SEP> de <SEP> la <SEP> D) <SEP> + <SEP> ostéoclastes <SEP> normaux <SEP> de <SEP> souris <SEP> KO <SEP> VDR
<tb> matrice <SEP> osseuse)-ostéoblastes <SEP> normaux <SEP> ostéoclastes <SEP> de <SEP> souris <SEP> KO <SEP> VDR
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<tb> -ostéoblastes+ostéoclastes <SEP> de <SEP> souris <SEP> KO <SEP> VDR <SEP> (récepteur <SEP> de
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<tb> arthrite <SEP> rhumatoïde <SEP> (AR) <SEP> (inflammation <SEP> causée-ostéoblastes <SEP> de <SEP> souris <SEP> (injection <SEP> collagène <SEP> type <SEP> II
<tb> par <SEP> une <SEP> augmentation <SEP> de <SEP> la <SEP> résorption <SEP> osseuse <SEP> capable <SEP> d'induire <SEP> chez <SEP> la <SEP> souris <SEP> in <SEP> vivo <SEP> une <SEP> AR) <SEP>
<tb> par <SEP> les <SEP> ostéoclastes) <SEP> ostéoclastes <SEP> normaux
<tb> par <SEP> les <SEP> osteoclastes)-ostéoblastes <SEP> normaux <SEP> + <SEP> ostéoclastes <SEP> de <SEP> souris <SEP> (injection
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<tb> vivo <SEP> une <SEP> AR)
<tb> -ostéoblastes+ostéoclastes <SEP> de <SEP> souris <SEP> AR/ <SEP> ostéoclastes <SEP> +
<tb> Autres <SEP> pathologies <SEP> osseuses <SEP> et <SEP> tous <SEP> KO <SEP> déjà <SEP> ostéoblastes <SEP> normaux
<tb> connus <SEP> pour <SEP> présenter <SEP> un <SEP> défaut <SEP> dans <SEP> le
<tb> métabolisme <SEP> osseux <SEP> (ALP, <SEP> src, <SEP> c-fos, <SEP> OPG,
<tb> Rankl, <SEP> récepteur <SEP> des <SEP> estrogène, <SEP> aromatase,
<tb> leptine <SEP> .....) <SEP> et <SEP> qui <SEP> pourraient <SEP> être <SEP> associés <SEP> à
<tb> des <SEP> mutations <SEP> humaines <SEP> non <SEP> encore <SEP> déterminées <SEP> :
<tb>
et tous nouveaux knock out. test de l'effet de drogues connues - Oestrogènes (SERM, tamoxifène, raloxifène)- testostérone, PTH
<tb> (Parathyroïde <SEP> hormone), <SEP> prostaglandines <SEP> (PGE2), <SEP> biphosphonates <SEP> (alendronate), <SEP> vitamines <SEP> D,
<tb> osteoprotegerine <SEP> (OPG), <SEP> RANKL, <SEP> AINS <SEP> (Anti-inflammatoires <SEP> non <SEP> stéroïdien, <SEP> ex <SEP> :ibuprofène),
<tb> glucocorticoïdes, <SEP> hormone <SEP> thyroïdienne <SEP> T3.......
<tb> test <SEP> de <SEP> l'effet <SEP> de <SEP> nouvelles <SEP> drogues
<tb>
<tb> osteoprotegerine <SEP> (OPG), <SEP> RANKL, <SEP> AINS <SEP> (Anti-inflammatoires <SEP> non <SEP> stéroïdien, <SEP> ex <SEP> :ibuprofène),
<tb> glucocorticoïdes, <SEP> hormone <SEP> thyroïdienne <SEP> T3.......
<tb> test <SEP> de <SEP> l'effet <SEP> de <SEP> nouvelles <SEP> drogues
<tb>
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<tb> pathologies <SEP> cancéreuses <SEP> cellules <SEP> utilisées
<tb> cancer <SEP> du <SEP> sein <SEP> : <SEP> cancer <SEP> qui <SEP> métastase <SEP> en <SEP> -ostéoblastes <SEP> et <SEP> ostéoclastes <SEP> normaux+ <SEP> lignées <SEP> cellulaires <SEP>
<tb> tumeur <SEP> osseuse <SEP> de <SEP> cancers <SEP> mammaires <SEP> soient <SEP> agressives <SEP> (MDA-MB-231) <SEP> soient
<tb> 1/3 <SEP> des <SEP> ostéoses <SEP> métastatiques <SEP> et <SEP> plus <SEP> de <SEP> non-agressives <SEP> (MCF-7). <SEP> Observation <SEP> de <SEP> colonisation <SEP> des
<tb> 2/3 <SEP> des <SEP> cancers <SEP> féminins <SEP> cellules <SEP> mammaires, <SEP> formation <SEP> in <SEP> vitro <SEP> de <SEP> tumeurs <SEP> mammaires.
<tb>
<tb> cancer <SEP> du <SEP> sein <SEP> : <SEP> cancer <SEP> qui <SEP> métastase <SEP> en <SEP> -ostéoblastes <SEP> et <SEP> ostéoclastes <SEP> normaux+ <SEP> lignées <SEP> cellulaires <SEP>
<tb> tumeur <SEP> osseuse <SEP> de <SEP> cancers <SEP> mammaires <SEP> soient <SEP> agressives <SEP> (MDA-MB-231) <SEP> soient
<tb> 1/3 <SEP> des <SEP> ostéoses <SEP> métastatiques <SEP> et <SEP> plus <SEP> de <SEP> non-agressives <SEP> (MCF-7). <SEP> Observation <SEP> de <SEP> colonisation <SEP> des
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-ostéoblastes <SEP> et <SEP> ostéoclastes <SEP> anormaux <SEP> (OVX) <SEP> + <SEP> lignées
<tb> cellulaires <SEP> de <SEP> cancers <SEP> mammaires. <SEP> Test <SEP> du <SEP> rôle <SEP> des
<tb> estrogènes <SEP> dans <SEP> le <SEP> phénomène <SEP> de <SEP> cancérisation
<tb> cancer <SEP> de <SEP> la <SEP> prostate: <SEP> cancer <SEP> qui <SEP> métastase <SEP> -ostéoblastes <SEP> et <SEP> ostéoclastes <SEP> normaux+ <SEP> lignées <SEP> cellulaires <SEP>
<tb> en <SEP> tumeur <SEP> osseuse <SEP> de <SEP> cancers <SEP> de <SEP> la <SEP> prostate <SEP> (LAPC-4). <SEP> Observation <SEP> de
<tb> un <SEP> des <SEP> plus <SEP> fréquents <SEP> cancers <SEP> masculins <SEP> colonisation <SEP> des <SEP> cellules <SEP> de <SEP> la <SEP> prostate, <SEP> formation <SEP> in <SEP> vitro
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<tb> -ostéoblastes <SEP> et <SEP> ostéoclastes <SEP> anormaux <SEP> (ORX) <SEP> + <SEP> lignées
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<tb> testostérone <SEP> dans <SEP> le <SEP> phénomène <SEP> de <SEP> cancérisation.
<tb> autres <SEP> cancers <SEP> pouvant <SEP> métastaser <SEP> en <SEP> -lignée <SEP> cellulaire <SEP> humaine <SEP> d'adénocarcinome <SEP> du <SEP> poumon <SEP> : <SEP> A549 <SEP>
<tb> tumeurs <SEP> osseuses <SEP> : <SEP> -lignées <SEP> cellulaires <SEP> humaine <SEP> de <SEP> carcinome <SEP> du <SEP> rein: <SEP> ACHN,
<tb> -cancer <SEP> du <SEP> poumon <SEP> A704,
<tb> -cancer <SEP> du <SEP> rein <SEP> Caki-1
<tb> -cancer <SEP> de <SEP> la <SEP> thyroïde <SEP> -lignée <SEP> cellulaire <SEP> humaine <SEP> de <SEP> carcinome <SEP> de <SEP> la <SEP> thyroide: <SEP> FRO
<tb> -cancer <SEP> digestif <SEP> -lignée <SEP> cellulaire <SEP> humaine <SEP> de <SEP> carcinome <SEP> gastrique <SEP> :
<tb> -cancerde <SEP> l'utérus <SEP> -lignée <SEP> cellulaire <SEP> humaine <SEP> de <SEP> carcinome <SEP> de <SEP> l'endomètre: <SEP> HEC-1
<tb> -cancer <SEP> de <SEP> l'ovaire <SEP> -lignée <SEP> cellulaire <SEP> humaine <SEP> d'épithélium <SEP> de <SEP> cancer <SEP> ovarien:
<tb> EOC
<tb> test <SEP> de <SEP> l'effet <SEP> de <SEP> drogues <SEP> connues <SEP> pour <SEP> agir <SEP> sur <SEP> la <SEP> diminution <SEP> de <SEP> l'invasion <SEP> et <SEP> de <SEP> la <SEP> prolifération
<tb> cellulaire <SEP> agents <SEP> chimiothérapeutiques, <SEP> inhibiteur <SEP> de <SEP> la <SEP> cyclo-oxygénase <SEP> (COX), <SEP> mélatonine <SEP> ...... <SEP>
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<tb> estrogènes <SEP> dans <SEP> le <SEP> phénomène <SEP> de <SEP> cancérisation
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<tb> de <SEP> tumeurs
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<tb> test <SEP> de <SEP> nouvelles <SEP> drogues
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Exemple 4 : Test d'agressivité de cellules tumorales Une femme sur 4 mourra d'un cancer du sein et un homme sur 3 d'un cancer de la prostate en France (EUCAN, cancer incidence mortality and prevalence un EU 1996).
Ces deux cancers sont généralement des cancers primaires qui lorsqu'ils ne sont pas stoppés à temps métastasent dans l'os, cancers qui s'avèrent alors irrémédiablement létaux. Les modèles de système osseux selon l'invention devraient permettre d'étudier pourquoi ces cellules mammaires ou de la prostate métastasent quasi systématiquement dans l'os.
Le système selon l'invention permet en effet de visualiser in vitro l'invasion (ou le chimiotactisme des produits sécrétés par les cellules de cette interface osseuse cellularisée) de cellules cancéreuses mammaires ou de la prostate dans la matrice osseuse. Des lignées de cellules humaines de cancers du sein agressives (MDA-MB- 231) ou non-agressives (MCF-7) ou encore des lignées de cellules humaines de cancers de la prostate (LAPC-4) sont déposées sur le système selon l'invention. Cette expérience simple permet d'observer le comportement de ces cellules comparé à d'autres types de cellules connues pour peu métastaser dans l'os, d'observer les interactions entre les cellules tumorales et les cellules du systèmes osseux ou encore, la formation de masses cellulaires prolifératives, l'éventuelle dégradation de la matrice osseuse.
Une fois la formation de tumeurs in vitro réalisée, une seconde étape consiste à analyser l'efficacité de drogues anti-cancéreuses déjà connues (chimiothérapie...) ou encore à mettre en évidence par criblage de nouvelles molécules actives sur la prolifération cellulaire (diminution de la masse cellulaire ou du nombre de foci).
Claims (16)
- Revendications 1. Modèle de système osseux comportant une matrice minéralisée et des ostéoblastes, caractérisé en ce que les ostéoblastes sont déposés sur la matrice de manière à former un tapis à confluence et/ou des nodules, et les ostéoclastes sont déposés sur ledit tapis et/ou lesdits nodules.
- 2. Modèle de système osseux selon la revendication 1, caractérisé en ce que la matrice minéralisée est une matrice composée de collagène et de phosphate de calcium et/ou des dérivés de phosphate de calcium.
- 3. Modèle de système osseux selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la matrice minéralisée est une matrice composée de collagène et d'hydroxyapatite.
- 4. Modèle de système osseux selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le rapport ostéoclastes sur ostéoblastes est d'environ 1/10 à 1/25.
- 5. Modèle de système osseux selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les ostéoblastes et/ou des ostéoclastes déposés sont génétiquement modifiés.
- 6. Méthode de sélection de matrice permettant de reconstituer un modèle de système osseux, caractérisée en ce que l'on soumet une matrice au procédé suivant : - dépôt d'un tapis et/ou des nodules d'ostéoblastes à confluence sur la matrice, - dépôt d'ostéoclastes isolés sur le tapis et/ou les nodules, - observation de l'invasion des ostéoclastes à travers le tapis et/ou les nodules d'ostéoblastes, - sélection des matrices sur lesquelles les ostéoclastes sont localisés entre la matrice et le tapis et/ou les nodules d'ostéoblastes.<Desc/Clms Page number 18>
- 7. Méthode de sélection selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre une étape d'observation de la résorption de la matrice et que l'on sélectionne les matrices sur lesquelles on observe également une résorption.
- 8. Matrices artificielles sélectionnées à l'aide de la méthode selon les revendications 6 ou 7.
- 9. Modèle de système osseux cancéreux, caractérisé en ce qu'il correspond au modèle selon l'une des revendications 1 à 5, modifié comme suit : - les ostéoblastes et/ou les ostéoclastes sont issus d'animaux normaux, ovariectomisés et/ou orchiectomisés, - on dépose de plus des cellules issues de lignées cellulaires de cancer.
- 10. Modèle de système osseux atteint d'ostéoporose, caractérisé en ce qu'il correspond au modèle selon l'une des revendications 1 à 5, modifié comme suit : - les ostéoblastes et/ou les ostéoclastes sont issus d'animaux normaux, ovariectomisés et/ou orchiectomisés, l'ostéoporose étant alors induite chimiquement in situ et/ou d'animaux knock-out, transgéniques pour toutes molécules dont la modulation de l'expression induit une baisse de la masse osseuse.
- 11. Modèle de système osseux atteint d'ostéomalacie, caractérisé en ce qu'il correspond au modèle selon l'une des revendications 1 à 5, modifié comme suit : - les ostéoblastes et/ou les ostéoclastes sont issus d'animaux normaux, l'ostéomalacie étant alors induite chimiquement in situ et/ou knock-out pour le récepteur à la vitamine D ou pour toutes autres molécules capable d'induire une ostéomalacie.<Desc/Clms Page number 19>
- 12. Modèle de système osseux atteint d'arthrite rhumatoïde, caractérisé en ce qu'il correspond au modèle selon l'une des revendications 1 à 5, modifié comme suit : - les ostéoblastes et/ou les ostéoclastes sont issus d'animaux normaux, l'arthrite rhumatoïde étant alors induite chimiquement in situ, et/ou d'animaux knock-out, transgéniques pour toutes molécules capables d'induire une arthrite rhumatoïde ou d'animaux ayant subi des injections de collagène de type II, ou de toutes autres substances susceptibles d'induire une inflammation articulaire minant une arthrite rhumatoide.
- 13. Modèle de système osseux atteint d'ostéomyélite caractérisé en ce qu'il correspond au modèle selon l'une des revendications 1 à 5, modifié comme suit : - on ajoute dans le milieu au moins une souche bactérienne ou virale choisie parmi Enterobacter cloacae, le staphylocoque doré, le streptocoque bêta hémolytique A,Haemophilus influenzae type b, les salmonelles,Pseudomonas, et/ou les pneumocoques.
- 14. Utilisation des modèles selon les revendications 1 à 5,9 à 13, pour réaliser le criblage de molécules thérapeutiques.
- 15. Test d'agressivité de cellules tumorales caractérisé en ce que l'on dépose des cellules tumorales dans un modèle selon l'une quelconque des revendications 1 à 5,10 à 13, selon l'état pathologique du patient, afin d'observer le développement de cancer secondaire osseux.
- 16. Test de toxicité d'un composé chimique caractérisé en ce que l'on teste au moins une concentration dudit composé sur un modèle selon l'une quelconque des revendications 1 à 5,10 à 13.
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|---|---|---|---|
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011149743A1 (fr) * | 2010-05-27 | 2011-12-01 | Corning Incorporated | Surfaces multiplis marquées à la fluorescence protéine-phosphate de calcium |
| WO2011149741A1 (fr) * | 2010-05-27 | 2011-12-01 | Corning Incorporated | Surfaces de phosphate de calcium marqué par fluorescence |
Citations (2)
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| US4485097A (en) * | 1982-05-26 | 1984-11-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Bone-equivalent and method for preparation thereof |
| WO2002072842A1 (fr) * | 2001-03-13 | 2002-09-19 | Oscotec Inc. | Lignee cellulaire transfectee pouvant etre utilisee dans le depistage de masse de l'expression du facteur de transcription runx2 specifique de l'osteoblaste et utilisation de ladite lignee cellulaire |
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2003
- 2003-06-11 FR FR0307025A patent/FR2855975B1/fr not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| WO2011149743A1 (fr) * | 2010-05-27 | 2011-12-01 | Corning Incorporated | Surfaces multiplis marquées à la fluorescence protéine-phosphate de calcium |
| WO2011149741A1 (fr) * | 2010-05-27 | 2011-12-01 | Corning Incorporated | Surfaces de phosphate de calcium marqué par fluorescence |
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