ES2289553T3 - Modelos de sistema oseo. - Google Patents

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ES2289553T3 ES04767333T ES04767333T ES2289553T3 ES 2289553 T3 ES2289553 T3 ES 2289553T3 ES 04767333 T ES04767333 T ES 04767333T ES 04767333 T ES04767333 T ES 04767333T ES 2289553 T3 ES2289553 T3 ES 2289553T3
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Pierre Jurdic
Olivier Destaing
Frederic Saltel
Edith Anne-Marie Bonnelye
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Ecole Normale Superieure de Lyon
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Normale Superieure de Lyon
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Abstract

Modelo de sistema óseo que comprende una matriz mineralizada y osteoblastos, caracterizado porque los osteoblastos son depositados sobre la matriz de manera que forman una capa confluente y/o nódulos, y los osteoclastos son depositados sobre la citada capa y/o los citados nódulos.

Description

Modelos de sistema óseo.
La presente invención se refiere a modelos de sistema óseo.
Ésta se refiere, de modo más particular, a modelos de sistema óseo in vitro que comprenden una matriz resorbible, osteoclastos y osteoblastos, a un método de selección de las matrices utilizables para los modelos de acuerdo con la invención, así como a modelos de sistema óseo que imitan una patología particular.
El hueso está constituido de células y de una matriz extracelular que está mineralizada. La población celular está compuesta por dos tipos celulares: los osteoclastos que degradan la matriz ósea y los osteoblastos que la reconstruyen. Hasta ahora, la mayoría de los trabajos de investigación efectuados sobre este tema se han orientado al estudio específico de los osteoclastos, como células óseas responsables de la degradación de la matriz ósea, al estudio específico de los osteoblastos, o a la elección de matrices artificiales capaces de imitar la matriz ósea humana. En particular, los artículos de Shibutani y otros (J Blomed Mater Res, Use of glass slides coated with apatite-collagen complexes for measurement of osteoclastic resorption activity, 31:43-49, 1996), Langstaff y otros (Biomaterials, Resorbable bioceramics based estabilized calcium phosphates, 22, 2: 135-150, 2001 y Rovira y otros (Biomaterials, Colonization of a calcium phosphate/elastin-solubilized peptide-collagen composite material by human osteoblasts, 17, 15: 1535-1540, 1996), describen ejemplos de matriz mineralizada a base de colágeno.
Más recientemente, un artículo de Sun y otros (J Blomed Mater Res, The influence of hydroxiapatite particles on osteoclast cell activities, 45(4): 311-21, 1999) estudia la influencia del tamaño de las partículas de polvo de hidroxiapatita sobre la actividad de los osteoclastos. En éste se describe en particular un cocultivo de células osteoblásticas y osteoclásticas.
Los trabajos de los inventores han conducido a poner a punto un modelo de sistema óseo que comprende una matriz mineralizada y osteoclastos, caracterizado porque se depositan osteoblastos sobre la matriz de manera que forman una capa confluente y/o nódulos, siendo depositados los osteoclastos sobre la citada capa y/o los citados nódulos.
La disposición de los dos tipos celulares es particularmente importante para reconstituir este sistema óseo que sirve de modelo. En efecto, las células óseas humanas solamente se activan en un cierto entorno. Los inventores han conseguido reconstituir este entorno realizando una capa confluente de osteoblastos o nódulos de osteoblastos, y poner osteoclastos sobre esta capa o estos nódulos. De manera inesperada, los inventores han constatado que los osteoclastos, células aproximadamente 10 veces mayores que los osteoblastos, eran capaces de abrirse un camino a través de la población ensamblada de osteoblastos (en forma de capa confluente o de nódulos) con el fin de ir a ejercer su actividad de resorción directamente en la matriz ósea. Los osteoclastos se encuentran, entonces, localizados debajo de la población de osteoblastos, y esto, aproximadamente al cabo de la 2ª hora siguiente al depósito de los
osteoclastos.
Con el fin de verificar que la migración de los osteoclastos a través de la capa osteoblástica es un mecanismo específico del tejido óseo, los inventores han repetido igualmente la experiencia sobre una lámina de dentina (soporte más parecido al hueso). Ahora bien, en este soporte se ha observado, igualmente, la migración a través de la capa osteoblástica.
Esta constatación permite, por tanto, validar el modelo como adecuado para imitar el sistema óseo y, de modo más particular, el sistema óseo murino o humano. Otras observaciones, descritas en los ejemplos de la presente solicitud, confirman esta validación.
Ventajosamente, el modelo de sistema óseo de acuerdo con la invención comprende una matriz compuesta de colágeno y de fosfato de calcio y/o derivados de fosfato de calcio. Preferentemente, el derivado de fosfato de calcio es la hidroxiapatita.
Preferentemente, la relación entre los osteoclastos y los osteoblastos es de aproximadamente 1/10 a 1/25. Esta relación es variable porque depende del fenómeno que se desee observar. En efecto, si se añade un número demasiado grande de osteoclastos, se producirá una degradación demasiado importante y demasiado rápida de la matriz, dificultando, así, una eventual cuantificación del material resorbido (medición de la superficie que no está mineralizada).
El modelo de acuerdo con la invención facilita los medios para probar la eficacia de drogas conocidas o nuevas en la perspectiva de la puesta en evidencia de nuevos tratamientos terapéuticos en un contexto óseo normal o patológico.
Por "drogas", se entienden moléculas biológicamente activas.
De modo más particular, la invención permite probar el potencial de drogas cualesquiera ya conocidas (por ejemplo: biofosfonato, PTH, vitamina D...), o nuevas, en la formación ósea (osteoblastos) y/o en la invasión y/o en la migración y/o en la resorción ósea (osteoclastos), generando, así, una prueba rápida in vitro de evaluación del potencial terapéutico de todas las moléculas que pueden actuar sobre el metabolismo óseo, pero, también, efectos nefastos (efectos secundarios) de drogas cualesquiera utilizadas en otras patologías que no están relacionadas con los huesos (por ejemplo: diabetes, enfermedades cardíacas ...).
En la solicitud, el término "migración" empleado solo significa el movimiento de los osteoclastos durante la resorción. Igualmente, el término "invasión" empleado solo remite a la colonización del soporte que hay que resorber. Por el contrario, cuando estos términos se utilizan para hacer referencia al paso a través de la capa osteoblástica, estos van seguidos de una expresión que les precisa.
De acuerdo con un modo de realización, los osteoblastos y/o los osteoclastos depositados pueden estar modificados genéticamente. El depósito de células modificadas genéticamente permite el estudio del comportamiento de estas células y de la evolución del sistema óseo, de modo más particular con miras a una terapia génica. La utilización de estas células genéticamente modificadas es particularmente adecuada en los modelos de sistemas óseos que presentan una patología, tales como los descritos más adelante.
La presente invención pretende, igualmente, un método de selección de matrices que permiten reconstituir un modelo de sistema óseo, caracterizado porque se somete una matriz mineralizada al procedimiento siguiente:
-
depósito de una capa y/o nódulos de osteoblastos confluentes sobre la matriz
-
depósito de osteoclastos aislados sobre la capa y/o los nódulos,
-
observación de la invasión de los osteoclastos a través de la capa y/o de los nódulos de osteoblastos,
-
observación de la resorción de la matriz mineralizada,
-
selección de las matrices en las cuales los osteoclastos están localizados entre la matriz y la capa y/o los nódulos de osteoblastos y en las cuales se observa una resorción;
así como las matrices artificiales seleccionadas con la ayuda del citado método.
En efecto, el comportamiento de las células sobre la matriz permite determinar si el entorno elegido para imitar el sistema óseo es adecuado. Así pues, por la observación del comportamiento celular, se puede determinar si la matriz elegida es un buen modelo de matriz ósea.
Ventajosamente, el material de la matriz que hay que probar podrá elegirse entre el conjunto de los biomateriales, es decir, materiales compatibles con el tejido vivo. Una modificación de la matriz (adición de diferentes compuestos proteicos u otros) puede llevar al desarrollo de nuevos biomateriales.
Como se ha citado anteriormente, la invención propone, igualmente, modelos de sistema óseo que imitan patologías óseas. Estos modelos se realizan, preferentemente, a partir de células (osteoblastos y/o osteoclastos) extraídas de tejidos que provienen de patologías óseas cualesquiera.
En particular, la invención propone un modelo de sistema óseo canceroso, afectado de osteoporosis, de osteomalacia y/o de artritis reumatoide.
Por "modelo de sistema óseo canceroso", se entienden los modelos de sistemas óseos correspondientes a las patologías siguientes:
-
un enfermo afectado de un tumor primario canceroso,
-
un enfermo afectado de un tumor primario canceroso (mama, próstata, ...) con metástasis,
-
un enfermo afectado de un cáncer de huesos.
Estos modelos que imitan patologías utilizan el modelo de sistema óseo descrito anteriormente, pero conllevan un cierto número de modificaciones.
Por ejemplo, en el modelo de sistema óseo canceroso, las modificaciones son las siguientes:
-
los osteoblastos y/o los osteoclastos provienen de animales normales, ovariectomizados y/u orquiectomizados, etc..., y
-
se depositan además células procedentes de linajes celulares de cáncer.
Para estudiar un cáncer de huesos, las células depositadas provendrán, por ejemplo, de un linaje celular de cáncer de huesos. En los otros casos, se depositarán células procedentes de un linaje celular de tumor primario con potencial metastático (mama, próstata, ...) o no.
Este modelo permite observar los fenómenos de colonización del tejido óseo por las células tumorales y visualizar la fase de metástasis. En efecto, como muestra la invasión de los osteoclastos a través de la capa osteoblástica, las células colocadas en un entorno mimético del sistema óseo, tienen la capacidad de desplazarse dentro de este entorno.
Este modelo está adaptado, de modo más particular, para realizar una prueba de agresividad de las células tumorales (véase el ejemplo 4). La existencia de numerosos cánceres primarios (mama, próstata ...) capaces de metastasear en el hueso es ahora un hecho establecido en cancerología. Ahora bien, este cáncer de huesos que se deriva de esto, se considera en la mayoría de los casos, incurable. La invención permite probar in vitro la agresividad (invasión., migración, proliferación) de células tumorales (por ejemplo, procedentes de tumores mamarios o de próstata) obtenidas de biopsias de pacientes. Estas células tumorales son depositadas en el modelo de sistema óseo de acuerdo con la invención y permiten, así, estimar el potencial agresivo de las células del tumor primario a nivel de su capacidad de invasión, de migración y/o de proliferación, así como establecer un pronóstico sobre el desarrollo de un cáncer secundario óseo.
De modo más preciso, la invención propone una prueba rápida in vitro de evaluación del potencial terapéutico (quimioterapia y/o radioterapia) de moléculas cualesquiera que pueden ser utilizadas en cancerología con el fin de reducir la aparición y/o de contribuir al tratamiento anticanceroso de un cáncer de huesos.
El modelo de sistema óseo afectado de osteoporosis comprende las modificaciones siguientes:
-
los osteoblastos y/o los osteoclastos provienen de animales normales, ovariectomizados y/u orquiectomizados, siendo inducida, entonces, la osteoporosis químicamente in situ, y/o de animales knock-out, transgénicos, para moléculas cualesquiera en las que la modulación de la expresión induce una disminución de la masa ósea,
mientras que el modelo de sistema óseo afectado de osteomalacia se modifica como sigue:
-
los osteoblastos y los osteoclastos provienen de animales normales, siendo inducida, entonces, la osteomalacia químicamente in situ, y/o de animales knock-out para el receptor de la vitamina D o para otras moléculas cualesquiera capaces de inducir una osteomalacia.
Para inducir una osteoporosis se conocen numerosas moléculas. Pueden citarse, a título de ejemplo, la dexametasona, la hidrocortisona, la prednisolona y sus derivados, la fluocortolona, la heparina cálcica o sódica.
Asimismo, la osteomalacia puede ser inducida por las moléculas siguientes: las sales de aluminio, el barbital y sus derivados, el retinol, el betacaroteno.
Finalmente, el modelo de sistema óseo afectado de artritis reumatoide puede comprender las modificaciones siguientes:
-
los osteoblastos y/o los osteoclastos provienen de animales normales, siendo inducida, entonces, la artritis reumatoide químicamente in situ, y/o de animales knock-out, transgénicos, para moléculas cualesquiera capaces de inducir una artritis reumatoide, o de animales que hayan sufrido inyecciones de colágeno de tipo II, o de otras substancias cualesquiera susceptibles de inducir una inflamación articular que imita una artritis reumatoide.
Las moléculas que pueden inducir artritis reumatoides son, a título de ejemplo, ciertas interferonas \alpha, ciertas vacunas (BCG, hepatitis B, rubeola...) el cortivazol, ciertas sales de litio, la ampicilina.
La presente solicitud protege, igualmente, la utilización de los diferentes modelos para realizar tamizados de moléculas terapéuticas y pruebas de eficacia. Con la ayuda de las moléculas de acuerdo con la invención, podrá compararse la eficacia de las diferentes moléculas actualmente conocidas y de las que sean puestas al día. A título de ejemplo, la prueba de eficacia para la osteoporosis podrá comparar moléculas conocidas para restablecer la masa ósea, como el biofosfonato, los estrógenos y todas las nuevas moléculas puestas al día, con la ayuda del modelo utilizado para realizar un tamizado. La prueba de eficacia para la osteomalacia podrá tomar como molécula de referencia la vitamina D, mientras que la prueba para la artritis reumatoide podrá tomar como moléculas de referencia la aspirina y/o los antiinflamatorios no esteroideos.
De manera ventajosa, los modelos de acuerdo con la invención están particularmente adaptados para realizar pruebas de toxicidad de un compuesto químico, en las cuales se prueba, al menos, una concentración del citado compuesto en, al menos, un modelo de acuerdo con la invención. Tales pruebas permiten evaluar los efectos secundarios de los medicamentos sobre la fisiología ósea (por ejemplo, los medicamentos contra la diabetes, los antibióticos), los efectos tóxicos de los contaminantes (dioxina, insecticidas...), etc... Ventajosamente, se probarán varias concentraciones con el fin de establecer una relación entre la concentración del compuesto y los efectos secundarios generados en el modelo de sistema óseo.
Un modelo de sistema óseo afectado de osteomelitis y/o de infección ósea puede ser construido, igualmente, añadiendo al sistema modelo de acuerdo con la invención diferentes cepas bacterianas o virales. A título de ejemplo, se citarán las cepas siguientes: Enterobacter cloacae, el estafilococo dorado, el estreptococo beta hemolítico A, Hemófilo influenza tipo b, las salmonelas, Seudomonas, y/o los neumococos...
Otras características y ventajas de la invención se pondrán de manifiesto en los ejemplos que siguen, refiriéndose a las figuras, que representan, respectivamente:
- la figura 1, un esquema del proceso de paso de los osteoclastos a través de la capa osteoblástica y de resorción osteoclástica,
- las figuras 2 y 3, imágenes obtenidas por análisis 3D por microscopía confocal que muestran la disposición de los dos tipos celulares, A: osteoclasto, B, osteoblasto, C: corte en Z, y,
- la figura 4, imágenes por análisis 3D por microscopía confocal que muestran la disposición de los dos tipos celulares según el corte en Z, con el fin de determinar los efectos del PP2 (véase la figura 4B) en comparación con el ensayo testigo (véase la figura 4A).
Ejemplo 1
Reconstitución de una interfaz ósea celularizada para una prueba de resorción: Capa de osteoblastos confluente a. Matriz
La matriz mineralizada se prepara, ya sea en láminas de vidrio (para microscopio), o en plástico tratado para cultivo celular. El soporte es recubierto en primer lugar durante 15 h con una solución de colágeno de I a 0,1 mg/ml diluida en ácido acético de 0,1 M. Se elimina el exceso de colágeno y después se recubre el soporte durante una semana a 37ºC con una solución de TRIS 200 mM, pH (8,5), 0,4 g/L de fosfatasa alcalina, 0,4 g/L de fosvitina y 3 g/L de cloruro de dimetilo suborimidado.
Esta etapa va seguida de la mineralización propiamente dicha. Esta mineralización está constituida por 2 etapas sucesivas:
1-
se recubre el soporte con una solución TRIS 200 mM, pH (8,5), 0,4 g/L de fosfatasa alcalina, 0,4 g/L de fosvitina durante 3 h, y después,
2-
se reemplaza esta solución por una solución de TRIS 200 mM, pH (8,5) y de \beta glicerofosfato 126,06 g/L durante 20 h.
Estas dos etapas son repetidas 10 veces. La trama de colágeno I puede ser completada con otras proteínas (osteopontina, vitronectina, BSP, ostocalcina, colágeno de tipo I conjugado con un agente fluorescente, por ejemplo la rodamina, etc...) u otros sustitutos (por ejemplo, sustitutos minerales: fluor, renelato de estroncio ...).
b. Osteoblastos
Se ponen en cultivo células del linaje osteoblástico murino MC3T3 en medio \alpha-MEM completado con 10% en volumen de suero de bovino fetal, dexametasona 10^{-8} M y ácido ascórbico 0,028 mM. A continuación, las células se separan y se siembran para confluencia en el soporte mineralizado.
Los osteoblastos pueden obtenerse, igualmente, de linajes osteoblásticos de rata (Ros) o humanos (HEPM, hFOB) y prepararse de acuerdo con el mismo protocolo. Alternativamente, en el ejemplo 2 se propone un protocolo de cultivo primario de osteoblastos.
c. Osteoclastos
Los osteoclastos obtenidos de cultivos primarios humanos o murinos o de linajes (por ejemplo, el linaje RAW o linaje humano GCT23) se obtienen después de 7 días de diferenciación, como se describe en Destaing y otros (Mol Biol Cell, Podosomes display actin turnover and dynamic self-organization in osteoclasts expressing actin-green fluorescent protein, 14(2): 407-16, 2003). Los precursores de osteoclastos son cultivados en presencia de medio \alpha-MEM completado con 10% en volumen de suero de bovino fetal y de dos citocinas recombinantes: M-CSF y RANK-L (20 ng/L). Se colocan las células a 37ºC y 5% de CO_{2} y se cambia el medio cada dos días durante 7-8 días. Los osteoclastos diferenciados se separan con una solución de EDTA a 0,25 mM diluida en PBS 1X. Los osteoclastos se siembran a una densidad de 10 células/mm^{2}.
d. Fijación
La fijación se realiza en PBS 1X con adición de formaldehído 3,7% durante 10 min.
e. Resultados
La resorción de la matriz mineralizada se observa en microscopía fotónica desde la 6ª o 7ª horas siguientes al montaje del modelo (tiempo transcurrido entre el primer contacto osteoclastos-osteoblastos y la resorción de la matriz).
Se ha realizado una segunda experiencia con el fin de demostrar que los osteoclastos son capaces de atravesar la capa densa de células osteoblásticas antes de formar los agujeros de resorción.
Por análisis 3D por microscopía confocal, ha sido posible demostrar el poder invasivo de los osteoclastos y cuantificar la resorción midiendo la superficie del substrato que no está mineralizada.
La fijación de las células se realiza una hora y cuatro horas después del depósito de los osteoclastos.
La figura 2 comprende tres imágenes que muestran la localización de las diferentes células una hora después del depósito de los osteoclastos.
La figura 2A, es una imagen del osteoclasto. Éste presenta una fuerte polaridad, lo que demuestra el estado activo de las células. En efecto, un osteoclasto depositado sobre un soporte no adecuado presenta un espesor pequeño (no polarizado). Por el contrario, sobre un soporte adecuado, éste se espesa con el fin de formar un polo basal (contacto con los osteoblastos) y un polo apical (contacto con el medio). Los inventores han constatado que esta polaridad se mantenía durante el paso de la capa osteoblástica y durante la resorción. Sin embargo, el polo basal se encuentra en contacto con la matriz mientras que el polo apical está en contacto con los osteoblastos.
La figura 2B es una imagen del osteoblasto. Se constata la presencia de numerosos filamentos de actina. Las fibras de estrés de actina constituyen un marcador presente en los osteoblastos MC3T3.
La figura 2C es un corte en Z, que permite visualizar la localización según el eje Z de las dos células fotografiadas anteriormente. Esta imagen muestra que el osteoclasto está situado por encima de la capa osteoblástica (línea clara continua).
La figura 3 comprende, igualmente, tres imágenes correspondientes a las tres imágenes de la figura 2. La figura 3A es una fotografía del osteoclasto. Éste ha cambiado de forma, se ha aplanado. La figura 3B representa la capa de osteoblastos. Ésta está ahora localizada por encima del osteoclasto, estando este último en contacto directo con la matriz (véase la Figura 3C) y presenta la organización de un osteoclasto en curso de resorción (la "zona de sellado", estructura característica de las células resorbentes).
Ejemplo 2
Reconstitución de una interfaz ósea celularizada para una prueba de resorción: Nódulos de osteoblastos a. Matriz
La matriz se prepara como se ha descrito en el ejemplo 1.
b. Osteoblastos
Los osteoblastos utilizados pueden provenir de cultivos primarios humanos o murinos, o de linajes como se ha descrito en el ejemplo 1.
Las células se han aislado por digestión enzimática (colágenos (Sigma #C-0130)) a partir de calvaria de ratón de 2 días. Las células obtenidas de las cuatro últimas etapas de digestión (población II-V) son sembradas a continuación en frascos T75 en medio \alphaMEM que contiene 15% de suero bovino fetal (Flow Laboratories, McLean, VA) y 100 \mug/ml de penicilina G (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO), 50 \mug/ml de gentamicina (Sigma), y 0,3 \mug/ml de fungizona (Flow Laboratories). Después de 24 h de incubación, las células adherentes son lavadas con PBS, tratadas con tipsina (0,01%) en una solución salina de citrato, resuspendidas en el medio estándar descrito anteriormente y sembradas en placas de 12 pozos en la matriz descrita en el ejemplo 1 a 10^{4} células por pozo. Después de 24 h de incubación, se cambia el medio y se suplementa con ácido ascórbico (50 \mug/ml) y con sodio \beta-glicerofosfato (10 mM). El medio se cambia después cada dos días. Todas las placas son incubadas a 37ºC en una atmósfera a 95% de aire y 5% de CO_{2}.
Es posible, igualmente, un cultivo primario de osteoblastos humanos.
c. Osteoclastos
Los osteoclastos se preparan de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 1.
d. Fijación
La fijación se realiza de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 1.
e. Resultados
La resorción de la matriz mineralizada se observa en microscopía fotónica desde la 7ª hora siguiente al montaje del modelo.
Se ha realizado una segunda experiencia con el fin de demostrar que los osteoclastos son capaces de atravesar los nódulos de osteoblastos antes de formar los agujeros de resorción.
Por análisis 3D por microscopía confocal, es posible demostrar el poder invasivo de los osteoclastos y cuantificar la resorción midiendo la superficie del substrato que no está mineralizada.
Como en el ejemplo precedente, se ha podido observar el paso de los osteoclastos a través de los osteoblastos, así como los agujeros de resorción realizados por los osteoclastos.
Ejemplo 3
Variantes de los tipos celulares depositados
1
2
4
5
Ejemplo 4
Prueba de agresividad de células tumorales
Una mujer de cada 4 morirá de cáncer de mama y un hombre de cada 3 de un cáncer de próstata en Francia (EUCAN, cancer incidence mortality and prevalence in EU 1996).
Estos dos cánceres son, generalmente, cánceres primarios que cuando no son detenidos a tiempo metastasean en los huesos, cánceres que, entonces, se consideran irremediablemente letales. Los modelos de sistema óseo de acuerdo con la invención deberían permitir estudiar porqué estas células mamarias o de próstata metastasean casi sistemáticamente en los huesos.
El sistema de acuerdo con la invención permite, en efecto, visualizar in vitro la invasión (o el quimiotactismo de los productos secretados por las células de esta interfaz ósea celular) de células cancerosas mamarias o de próstata en la matriz ósea. Linajes de células humanas de cánceres de mama agresivas (MDA-MB-231) o no agresivas (MCF-7) o también linajes de células humanas de cánceres de próstata (LAPC-4) son depositados en el sistema de acuerdo con la invención. Esta experiencia simple permite observar el comportamiento de estas células en comparación con otros tipos de células conocidas por metastasear poco en los huesos, observar las interacciones entre las células tumorales y las células del sistema óseo o, también, la formación de masas celulares proliferativas, la eventual degradación de la matriz ósea.
Una vez realizada la formación de tumores in vitro, una segunda etapa consiste en analizar la eficacia de drogas anticancerosas ya conocidas (quimioterapia...) o, también, poner en evidencia por tamizado nuevas moléculas activas, en la proliferación celular (disminución de la masa celular o del número de foci).
Ejemplo 5
Tamizado de moléculas, con fines terapéuticos
Se ha probado un inhibidor de la tirosina kinasa Src, el PP2, en el modelo de acuerdo con la invención. Este producto es conocido por sus propiedades anti-resortivas y parece constituir una molécula terapéutica potencial para el tratamiento de la osteoporosis. Para realizar la interfaz ósea de acuerdo con la invención, se han depositado osteoclastos derivados de RAW-GFP sobre una capa de células osteoblásticas de tipo MC3T3. Al cabo de 1 hora o 1 hora 30 min, en ausencia de tratamiento, los osteoclastos han atravesado esta capa celular y se han extendido debajo de esta última. Por el contrario, si los osteoclastos son tratados con el inhibidor de tirosina kinasa Src, PP2, en una concentración de 10 \muM, los osteoclastos no atraviesan la capa de células osteoblásticas (véase la fig. 4).
Así pues, el PP2 es capaz de bloquear los mecanismos de invasión de los osteoclastos en el modelo de acuerdo con la invención, implicando, así, una disminución de la resorción ósea (incapacidad de los osteoclastos para llegar a la matriz mineralizada).
Esta experiencia permite, por tanto, demostrar que la interfaz ósea de acuerdo con la invención puede utilizarse con fines de tamizado de moléculas terapéuticas.

Claims (15)

1. Modelo de sistema óseo que comprende una matriz mineralizada y osteoblastos, caracterizado porque los osteoblastos son depositados sobre la matriz de manera que forman una capa confluente y/o nódulos, y los osteoclastos son depositados sobre la citada capa y/o los citados nódulos.
2. Modelo de sistema óseo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la matriz mineralizada es una matriz compuesta de colágeno y de fosfato de calcio y/o derivados de fosfato de calcio.
3. Modelo de sistema óseo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque la matriz mineralizada es una matriz compuesta de colágeno y de hidroxiapatita.
4. Modelo de sistema óseo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la relación entre osteoclastos y osteoblastos es de aproximadamente 1/10 a 1/25.
5. Modelo de sistema óseo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los osteoblastos y/o los osteoclastos depositados están modificados genéticamente.
6. Método de selección de una matriz que permite reconstituir un modelo de sistema óseo, caracterizado porque se somete una matriz al procedimiento siguiente:
- depósito de una capa y/o nódulos de osteoblastos confluentes sobre la matriz
- depósito de osteoclastos aislados sobre la capa y/o los nódulos,
- observación de la invasión de los osteoclastos a través de la capa y/o los nódulos de osteoblastos,
- selección de las matrices en las cuales los osteoclastos están localizados entre la matriz y la capa y/o los nódulos de osteoblastos.
7. Método de selección de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende, además, una etapa de observación de la resorción de la matriz y porque se seleccionan las matrices en las cuales se observa, igualmente, una resorción.
8. Modelo de sistema óseo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el modelo es modificado como sigue:
- los osteoblastos y/o los osteoclastos provienen de animales normales, ovariectomizados y/u orquiectomizados,
- se depositan además células obtenidas de linajes celulares de cáncer.
9. Modelo de sistema óseo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el modelo es modificado como sigue:
- los osteoblastos y/o los osteoclastos provienen de animales normales, ovariectomizados y/u orquiectomizados, siendo inducida, entonces, la osteoporosis químicamente in situ, y/o de animales knock-out, transgénicos, para moléculas cualesquiera en las que la modulación de la expresión induce una disminución de la masa ósea
10. Modelo de sistema óseo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el modelo es modificado como sigue:
- los osteoblastos y los osteoclastos provienen de animales normales, siendo inducida, entonces, la osteomalacia químicamente in situ, y/o de animales knock-out para el receptor de la vitamina D o para otras moléculas cualesquiera capaces de inducir una osteomalacia.
11. Modelo de sistema óseo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el modelo es modificado como sigue:
- los osteoblastos y/o los osteoclastos provienen de animales normales, siendo inducida, entonces, la artritis reumatoide químicamente in situ, y/o de animales knock-out, transgénicos, para moléculas cualesquiera capaces de inducir una artritis reumatoide o de animales que hayan sufrido inyecciones de colágeno de tipo II, o de otras substancias cualesquiera susceptibles de inducir una inflamación articular que imite una artritis reumatoide.
12. Modelo de sistema óseo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el modelo es modificado como sigue:
\newpage
- se añade al medio, al menos, una cepa bacteriana o viral elegida entre Enterobacter cloacae, el estafilococo dorado, el estreptococo beta hemolítico A, Hemófilo influenza tipo b, las salmonelas, Seudomonas, y/o los neumococos.
13. Utilización de los modelos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, 8 a 12, para probar el tamizado de moléculas terapéuticas.
14. Prueba de agresividad de células tumorales, caracterizada porque se depositan células tumorales de un paciente en un modelo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 9 a 12, según el estado patológico del paciente, con el fin de observar el desarrollo de cáncer secundario óseo.
15. Prueba de toxicidad de un compuesto químico, caracterizada porque se prueba, al menos, una concentración del citado compuesto en un modelo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 9 a 12.
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