FR2824562A1 - Latex de poly(n-isopropylacrylamide) comportant en surface des fonctions nitrile - Google Patents
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Abstract
Procédé de préparation de particules de polymère thermosensible et hydrophile portant des groupes fonctionnels polaires par copolymérisation radicalaire, caractérisé en ce que l'on homopolymérise un monomère hydrosoluble fonctionnalisé par lesdits groupes polaires pour obtenir un homopolymère hydrophobe fonctionnalisé par lesdits groupes puis on copolymérise avec le polymère thermosensible et hydrophile non fonctionnalisé, et particules ainsi obtenues.
Description
meq/lOOgraes et 15 meq/100 gra_es de polAre.
La présente invention a pour objet des latex hydrophiles, thermosensibles à base de poly(N-isopropylacrylamide), fonctionnalisés
S permettant la réalisation de supports particulaires.
Ces latex fonctionnalisés ont de nombreuses applications en raison de la thermosensibilité du poly(N-isopropylacrylamide), notamment dans le domaine du diagnostic, pour la séparation par immobilisation
chimique ou adsorption de molécules blologiques puis dosage.
Les molécules biologiques peuvent être immobilisées par liaison covalente ou adsorption physique à la surface des particules. Des particules de poly(N-isopropylacrylamide) comprenant un c_ur, et une surface portant des groupes fonctionnels, comme les fonctions acide carboxylique ou amine ont été développées comme supports solides pour l'immobilisation
de molécules biologiques.
Des particules, comportant une charge magnétique, comprenant un noyau à base d'un polymère, une couche interne à base d'un second polymère thermosensible dans laquelle est distribué un matériau magnétique, et une couche externe, dite couche d'encapsulation éventuellement fonctionnalisée à base d'un polymère susceptible d'interagir
avec au moins une molécule bIologique, sont décrits par exemple dans FR-
A-2749082. Le polymère de la couche d'encapsulation susceptible d'interagir avec une molécule blologique étant de préférence un polymère hydrophile éventuellement fonctionnalisé par un ou plusieurs groupes
choisis parmi les fonctions carboxylique, aldéhydique, thiol et amine.
Ces particules sont utilisées comme support solide pour l'immobilisation de molécules biologiques comme les enzymes et les
protéines, notamment sous forme de latex.
Différents modes de polymérisation peuvent être utilisés pour préparer ces supports, par polymérisaton on entend aussi bien
copolymérisation que homopolymérisation.
On conna^'t par exemple la polymérisation en réacteur fermé dite polymérisation en " batch '> dans laquelle les monomères sont introduits dans le réacteur avant le début de la réaction de polymérisation avec les autres ingrédients et sans ajout ultérieur. Cette méthode est efficace pour S la copolymérisation d'un mélange de monomères hydrophobes et hydrophiles car le monomère hydrophobe forme principalement le c_ur et le monomère hydrophile forme l'écorce si la polymérisation a lieu dans la
phase aqueuse.
On conna^'t la polymérisation en " shot ", cette technique est utilisable lorsque 1'on conna^t la cinétique de la polymérisation en réacteur fermé. Lorsque la polymérisation en réacteur fermé est en cours, une quantité supplémentaire de monomère fonctionnel seul ou en présence de mélange de monomères est introduite dans le réacteur de façon contrôlée, permettant de favoriser l'incorporation du monomère fonctionnel à la surface des particules. La sélection des conditions expérimentales (degré de conversion au moment de l'addition, composition et concentration du
mélange des monomères) permet d'optimiser les rendements de surface.
On conna^'t également la polymérisation sur semence " seed polymerization " qui consiste à introduire le monomère fonctionnel ou un mélange de monomères dans un réacteur contenant un latex déjà constitué et caractérisé, le monomère fonctionnel ou le mélange de monomères
pouvant étre additionné sur la semence en une seule étape ou en semi-
continu. Cependant pour que les dosages soient précis il est nécessaire que les biomolécules immobilisées puissent conserver leur activité biologique spécifique, et cette activité biologique, dépendante de facteurs stériques et d'orientation peut étre éventuellement diminuée, voire
supprimée, par les techniques d 'immobilisation.
Un essai d'amélioration de la technique d'immobilisation a été effectué en créant une technique mettant en _uvre des interactions
régiosélectives, comme par exemple les interactions dipolaires.
Ces interactions dipolaires mettant en _uvre des régions précises des blomolécules portant des groupes polaires, la prédictibilité de
la conservation de l'activité biologique peut étre bonne.
Les polymères portant des fonctions nitrile se sont révélés particulièrement intéressants dans cette nouvelle approche voir G. ZHOU et
al., Colloid Polym. Sci., 276: 1131-1139 (1998).
Les particules conservent des températures critiques inférieures de solubilité (LCST) du même ordre de grandeur que celles des latex non fonctionnalisés, et peuvent être préparées par les procédés classiquement utilisés en polymérisation radicalaire comme les procédés de préparation
par précipitation, dispersion, en suspension et en émuision.
Cependant seul le procédé de polymérisation par la technique de
polymérisation en " shot " permet d'obtenir des latex de poly(N-
isopropylacrylamide) fonctionnalisés par des fonctions nitrile comportant des particules sur lesquelles les fonctions nitrile sont suffisamment
nombreuses en surface.
Comme précisé précédemment cette technique de polymérisation en " shot " n'est utilisable que lorsque la cinétique de
polymérisation est connue.
Le procédé de polymérisation en réacteur fermé dite
polymérisation en << batch " appliquée à la préparation de latex de poly(N-
isopropylacrylamide) fonctionnalisés par des fonctions nitrile ne permet pas d'obtenir des particules sur lesquelles les fonctions nitrile sont suffisamment nombreuses en surface et ne permet pas d'obtenir des rendements suffisants. En effet une partie importante du monomère fonctionnel risque d'être perdue soit à l'intérieur soit sous forme de polymère hydrosoluble. On note également que du fait de l'importante solubilité dans l'eau des monomères de nature polaire, comme les dérivés acrylonitriles et méthacrylonitriles, la copolymérisation conduira à des
particules plus petites, avec un taux de conversion limité.
Pour que ces latex puissent être utilisés pour l'immobilisation par interaction dipolaire et pour que l'immobilisation soit effective, les groupes fonctionnels polaires respectifs des anticorps et des particules
doivent pouvoir être en contact les uns avec les autres facilement.
Les groupes fonctionnels polaires des particules doivent donc être présents à la surface des particules, et en grand nombre, pour que statistiquement les interactions dipolaires puissent avoir lieu et que les
immobilisations soient effectives.
Pour atteindre cet objectif, avec des temps de réaction compatibles avec une production industrielle et des rendements suffisants, un procédé de polymérisation comprenant une étape de prépolymérisation
du monomère fonctionnalisé par des groupes polaires a été mis au point.
Cette étape de prépolymérisation permet de synthétiser des homopolymères comportant des fonctions polaires mais étant insolubles
dans l'eau.
Elle permet ainsi de créer des chanes homopolymères radicalaires fonctionnalisées c'est à dire comportant des fonctions polaires, mais qui peuvent ensuite être polymérisées par des techniques comme la
polymérisaton en " batch >.
Cette étape de prépolymérisation, est applicable à tous les monomères fonctionnalisés par des groupes fonctionnels polaires, solubles
dans l'eau, dont les homopolymères sont insolubles dans l'eau.
On pourra par exemple prépolymériser des monomères fonctionnalisés hydrosolubles, c'est à dire comportant une fonction polaire, comme les dérivés acrylonitrile et méthacrylonitrile pour obtenir des homopolymères insolubles dans l'eau mais comportant une fonction polaire
et susceptible de réagir ensuite sur un polymère non fonctionnalisé.
Le procédé selon l'invention permet d'obtenir des particules comportant des fonctions nitrile en nombre suffisant en surface et avec des
rendements corrects.
Un objet de l'invention est un procédé de préparation de particules de polymère thermosensible et hydrophile portant des groupes fonctionnels polaires par copolymérisation radicalaire, caractérisé en ce que l'on homopolymérise un monomère hydrosoluble fonctionnalisé par lesUits groupes polaires pour obtenir un homopolymère hydrophobe fonctionnalisé par lesdits groupes polaires puis on copolymérise avec le polymère
thermosensible et hydrophile non fonctionnalisé.
Le procédé de préparation de particules de polymère thermosensible et hydrophile portant des groupes fonctionnels polaires par polymérisation radicalaire selon l'invention peut être défini comme un procédé par lequel on copolymérise un polymère thermosensible et hydrophile non fonctionnalisé avec un homopolymère hydrophobe
fonctionnalisé par lesdits groupes fonctionnels polaires.
Le procédé de l'invention comprend en outre les caractéristiques
suivantes considérées seules ou en mélange.
Selon l'invention les groupes fonctionnels polaires sont des fonctions nitrile et le monomère hydrosoluble fonctionnalisé est choisi parmi les dérivés acrylonitriles et méthacrylonitriles, par exemple l'acrylonitrile. Selon l'invention le polymère thermosensible et hydrophile non fonctionnalisé est obtenu par réticulation d'un monomère choisi parmi les N-alkylacrylamides et les N,N-dialkylacrylamides, et de préférence parmi le N-isopropylacrylamide, le N-éthylméthacrylamide, N-n-propylacrylamide, le
N-n-propylméthacrylamide, le N-isopropylméthacrylamide, le N-
cyclopropylacrylamide, le N,N-diéthylacrylamide, le N-méthyl-N-
isopropylacrylamide, le N-méthyl-N-n-propylacrylamide, et, est par exemple
le poly(N-isopropylacrylamide).
L'agent de réticulation est hydrosoluble et est choisi parmi le N.
N-méthylène bisacrylamide (MBA), I'éthylène glycol diméthacrylate.
Le polymère non fonctionnalisé est obtenu par réaction du monomère non fonctionnalisé avec l'agent de réticulation, par exemple le Poly(Nisopropylacrylamide) obtenu par action du MBA sur le NIPAM en
présence d'un initiateur.
Le monomère fonctionnalisé est choisi parmi les dérivés acrylonitriles et méthacrylonitriles, le monomère fonctionnalisé étant de
préférence de l'acrylonitrile.
Un autre objet de l'invention- concerne les particules de polymère thermosensible et hydrophile portant des groupes fonctionnels polaires susceptibles d'être obtenues par un procédé de préparation par copolymérisation radicalaire caractérisé en ce que l'on homopolymérise un monomère hydrosoluble fonctionnalisé par lesUits groupes polaires pour obtenir un homopolymère hydrophobe fonctionnalisé par lesUits groupes polaires puis on copolymérise avec le polymère thermosensible et
hydrophile non fonctionnalisé.
L'invention concerne également un procédé pour isoler dans un échantillon liquide au moins une molécule biologique, selon lequel: - on dispose de particules selon l'invention, - on met en contact led it échantillon avec lesUites particu les - par incubation, - on sépare les particules de l'échantillon, et un procédé d'immobilisation sélectif de molécules blologiques spécifique à partir d'un échantillon selon lequel: - on dispose de particules selon l'invention, - on met en contact ledit échantillon avec lesdites particules et - on contrôle la sélectivité et la spécificité par contrôle de la température, la température étant un paramètre critique de l'interaction
molécule biologique particule.
La désorption est favorisée en abaissant la température à une
température inférieure à la LCST.
Elle concerne également un réactif pour l'isolement de molécules blologiques comprenant une dispersion en milieu aqueux de particules selon l'invention. L'expression " isoler une molécule biologique >> selon l'invention, comprend la séparation, la détection, la purification d'une molécule bioiogique, I'enrichissement d'une fraction en une molécule blologique, selon une méthode d'isolement spécifique ou non spécifique, de manière qualitative et/ou quantitative, de manière directe ou indirecte par exemple
par l'intermédiaire d'un ligand fixé sur les particules.
Par molécule blologique on entend un composé notamment choisi parmi les protéines, les anticorps, les fragments d'anticorps, les antigènes, les polypeptides, les enzymes, les haptènes, les acides nucléiques et leurs fragments, et qui possède au moins un site de reconnaissance lui permettant de réagir avec une molécule cible d'intérêt biologique. Le terme " acide nucléique >> signifie un enchanement d'au moins 2 désoxyribonucléotides ou ribonucléotides comprenant éventuellement au moins un nucléotide modifié, par exemple au moins un nucléotide comportant une base modifiée tel que l'inosine, la méthyl-5 désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Ce polynucléotide peut aussi être modifié au niveau de la liaison internucléotidique. L'acide nucléique peut être naturel ou synthétique; un oligonucléotide, un polynucléotide un fragment d'acide nuclélque, un ARN ribosomique, un ARN messager, un ARN de transfert, un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique telle que la PCR (Polymerase Chain Reaction), la LCR (Ligase Chain Reaction), la RCR (Repair Chain Reaction), la 3SR (Self Sustained Sequence Replication), la NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) et la TMA (Transcription Mediated Amplification). Les acides nuclélques générés par une technique d'amplification enzymatique sont désignés sous le terme d'amplicons. Par " polypeptide " on entend un enchaînement d'au moins deux acides aminés. Par acides aminés, on entend les acides aminés primaires qui codent pour les protéines, les acides aminés dérivés après action enzymatique comme la trans-4-hydroxyproline et les acides aminés
naturels mais non présents dans les protéines comme la norvaline, la N-
méthyl-L leucine, la staline (voir Hunt S. dans Chemistry and Biochemistry of the amino acids, Barett G.C., ed., Chapman and Hall, London, 1985), les acides aminés protégés par des fonctions chimiques utilisables en synthèse
sur support solide ou en phase liquide et les acides aminés non naturels.
Le terme "haptène" désigne des composés non immunogènes, c'est-à-d ire incapables par eux mêmes de promo uvoir une réaction immunitaire par production d'anticorps, mais capables d'être reconnues par des anticorps obtenus par immunisation d'animaux dans des conditions
connues, en particulier par immunisation avec un conjugué haptène-
protéine. Ces composés ont généralement une masse moléculaire inférieure à 3000 Da, et le plus souvent inférieure à 2000 Da et peuvent être par exemple des peptides glycosylés, des métabolites, des vitamines, des hormones, des prostaglandines, des toxines ou divers médicaments, les
nucléosides et nucléotides.
Le terme "anticorps" inclut les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, les anticorps obtenus par recombinaison génétique, et des
fragments d'anticorps tels que des fragments Fab ou F(ab')2.
Le terme " antigène" désigne un composé susceptible de
générer des anticorps.
Le terme "protéine" inclut les holoprotéines et les hétéroprotéines comme les nucléoprotéines, les lipoprotéines, les phosphoprotéines, les métalloprotéines et les glycoprotéines aussi bien
fibreuses que globulaires sous leur forme conformationnelle caractéristique.
Exemple 1: Préparation de latex de Poly(N-isopropYlacrylamide) ensemencé
Un mélange de N-isopropylacrylamide (NIPAM) et de N'N-
méthylène bisacrylamide (MBA) est dissout dans de l'eau désionisée, exempte d'oxygène dans un réacteur de 500 ml équipé d'une agitation mécanique, d'un réfrigérant, d'un thermocouple et sous atmosphère d'azote. Pour éliminer complètement l'oxygène de la phase monomère,
la solution est mise sous agitation à 220 tours/min sous courant d'azote.
La polymérisation est initiée par addition de 20 ml d'une solution aqueuse de persulfate de potassium (KPS) à 70 C, sous une vitesse d'agitation de 303 tours/min, la polymérisation est conduite
pendant deux heures.
Le latex de Poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) est ensuite
purifié par des centrifugations et redispersions successives.
Un exemple des quantités de réactifs mis en présence est
donné dans le tableau 1.
Tableau 1
REACTIFS QUANTITES EN GRAMMES
NIPAM - MBA - KPS - EAU 10.80 - 0.80 - 0.40 - 550
Exemple 2: Préparation de latex de Poly(N-isopropylacrylamide) comportant des groupes fonctionnels nitrile à la surface Le latex de Poly(Nisopropylacrylamide) ensemencé est
désoxygéné par purge par l'azote pendant 30 minutes à 40 C.
De l'eau désionisée et exempte d'oxygène est placée dans un réacteur de 100 ml équipé comme dans l'exemple 1, également désoxygéné par purge à l'azote pendant 20 minutes, puis, une solution aqueuse d'acrylonitrile est ajoutée dans le réacteur dans lequel l'addition
d'azote est arrêtée.
Lorsque la température atteint 60 C une solution aqueuse de
persulfate de potassium (KPS), I'amorceur, est ajoutée.
La prépolymérisation de l'acrylonitrile (AN) est poursuivie pendant 5 minutes sous agitation à 220 tours/min, puis la dispersion de Poly(Nisopropylacrylamide) (PNIPAM) préparée à l'exemple 1, et exempte
d'oxygène, est additionnée dans le réacteur fermé.
S La réaction de polymérisation est ensuite poursuivie pendant
deux heures.
Le latex fonctionnalisé obtenu, est ensuite purifié selon la
méthode décrite dans le mode opératoire précédent.
Les quantités de réactifs mises en jeu dans cette préparation sont données dans le tableau 2 ci-dessous. Deux lots différents ont été
préparés. Ils sont codés ZG-1 et ZG-2.
Tableau 2
CODES DU AN KPS PNIPAM* EAU CONVERSION
LATEX (9) (9) (9) (9) %
ZG-1 0.20 0.020 20.0 35.0 85.2
ZG-2 0.40 0.020 20.0 35.0 93.8
*Teneur en solide du latex de PNIPAM: 6.37 % Exemple 3:!nfluence de la quantité d'acrylonitrile utilisée sur la taille des particules La taille des particules est mesurée en utilisant la mesure du
diamètre par diffusion dynamique de la lumière.
Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau 3 ci dessous. On observe que les tailles des particules du latex portant le code ZG-1 à la fois à 20 C et à 45 C sont plus importantes que les tailles
des particules du latex portant le code ZG-O.
Ces données permettent de conclure que les fonctions nitrile ont été introduites de façon prépondérante à la surface des particules de polymères.
Tableau 3
DIAMETRE DES PARTICULES DE PNIPAM PORTANT DES FONCTIONS NITRILE
EN SURFACE
CODE DU LATEX QUANTITE INITIALE DIAMETRE DES P.!,RTICULES (nm)
DE AN (9) A 20 C A 45 C
ZG-0 * 0 1030 206
ZG-1 0.20 1390 252
ZG-2 0.40 / 259
*Latex ensemencé de Poly(N-isopropylacrylamide) Exemple 4: Immobilisation d'un anticorps sur la surface de particules fonctionnalisées de Poly(Nisopropylacrylamide) par des fonctions nitrile Tous les essals d'adsorption ont été effectués dans des tubes
Eppendorf de 2 ml.
Pour déterminer la quantité d'anticorps immobilisés (Ac) sur les
particules de latex, la méthode classique de déplétion est utilisée.
Un volume donné de particules de latex est additionné dans le tube avec un volume donné de solution d'anticorps puis complété avec une
solution tampon (PBS) à 500 ml de volume final.
Le mélange est ensuite agité à une température de 32 C pendant trois heures, puis centrifugé à 14 000 rpm à 20 C pendant 20
minutes pour séparer les particules de latex.
Afin de déterminer la concentration résiduelle d'anticorps dans le surnageant, celui-ci est extrait et analysé en utilisant un
spectrophotomètre UVIKON.
La quantité d'anticorps immobilisés (Ac) est calculée par différence entre la concentration initiale et résiduelle d'anticorps dans le surnageant selon l'équation suivante Ns = V[(Ci-Cf)/(MS)] dans laquelle V est le volume de la solution en ml, Ci (mg ml') et Cf (mg ml') les concentrations, initiale et finale, d'anticorps dans la solution, M (g) le poids
S (mag-) les surfaces spécifiques des particules de latex.
Les résultats obtenus permettant de quantifier l'impact de la quantité de fonctions nitrile contenues dans les particules de latex PNIPAM fonctionnalisé sur l'immobilisation d'anticorps sont regroupés dans le
tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4
EFFET DE LA QUANTITE DE FONCTIONS NITRILE CONTENUES DANS LES
PARTICULES DE LATEX FONCTI ONNALISEES S UR L'ADS OR PTION D'ANTI CORPS
AC*
CODES MASSE DE CONCENTRATION QUANTITE D'ANTICORPS
DU LATEX RESTANTE D'ANTICORPS IMMOBILISES SUR LES
LATEX UTILISEE DANS LE SURNAGEANT PARTICULES DE LATEX
(-1 03g) t-1 03mg/ml) (mg/m2)Dl
ZG-0 4.00 19.20 0
ZG-1 3.96 14.65 0.0371
ZG-2 3.60 10.44 0.1 1 9 6
*Concentration initiale en anticorps dans la solution: 19.20 x 10-3 mg/ml, volume
total 500 ul, temps d'interaction: 3 heures, température: 32 C.
a) Calculé selon l'équation 1 en utilisant la surface spécifique des deux latex
fonctionnalisés (1 5.49 m2g ' et 10.18 m2g, pour ZG2).
Claims (11)
1. Procédé de préparation de particules de polymère thermosensible et hydrophile portant des groupes fonctionnels polaires par copolymérisation radicalaire, caractérisé en ce que l'on homopolymérise un monomère hydrosoluble fonctionnalisé par lesdits groupes polaires pour obtenir un homopolymère hydrophobe fonctionnalisé par lesdits groupes puis on copolymérise avec le polymère thermosensible et hydrophile non fonctionnalisé.
2. Procédé de préparation de particules de polymère thermosensible et hydrophile portant des groupes fonctionnels polaires par polymérisation radicalaire caractérisé en ce que l'on copolymérise un polymère thermosensible et hydrophile non fonctionnalisé avec un homopolymère
hydrophobe fonctionnalisé par lesdits groupes fonctionnels polaires.
3. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications
1 à 2, caractérisé en ce que les groupes fonctionnels polaires sont des
fonctions nitrile.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3
caractérisé en ce que le monomère hydrosoluble fonctionnalisé est choisi
parmi les dérivés acrylonitriles et méthacrylonitriles.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4
caractérisé en ce que le monomère hydrosoluble fonctionnalisé est l'acrylonitrile.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 2
caractérisé en ce que le polymère thermosensible et hydrophile non fonctionnalisé est obtenu par réticulation d'un monomère choisi parmi les N-alkylacrylamides et les N,N-dialkylacrylamides, et de préTérence parmi le N-isopropylacryla mide, le N-éthylméthacrylamide, N-n-propylacryla mid e, le N-n-propylméthacrylamide, le N-isopropylméthacrylamide, le N cyclopropylacrylamide, le N,N-diéthylacrylamide, le N-méthyl-N isopropylacrylamide, le N-méthyl-N-n-propylacrylamide
7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que le polymère
thermosensible et hydrophile non fonctionnalisé est le Poly(N-
isopropylacrylamide).
8. Particules thermosensibles et hydrophiles portant des groupes fonctionnels polaires caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles d'être
obtenues par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
9. Procédé pour isoler dans un échantillon liquide au moins une molécule biologique, selon lequel: - on dispose de particules selon la revendication 8, - on met en contact ledit échantillon avec lesUites particules par incubation,
- on sépare les particules de l'échantillon.
10. Réactif pour l'isolement de molécules blologiques comprenant une dispersion en milieu aqueux de particules caractérisé en ce qu'il est
constitué par des particules selon la revendication 8.
11. Procédé d'immobilisation sélectif de molécules biologiques spécifique à partir d'un échantillon selon lequel: - on dispose de particules selon la revendication 8, - on met en contact ledit échantillon avec lesdites particuies et - on contrôle la sélectivité et la spécificité par contrôle de la température, la température étant un paramètre critique de l'interaction
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| Publication number | Publication date |
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| WO2002092652A1 (fr) | 2002-11-21 |
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