FR2808286A1 - Nouvelle glucosidase i de plante et son application a la production de proteines recombinantes a glycosylation modifiee - Google Patents
Nouvelle glucosidase i de plante et son application a la production de proteines recombinantes a glycosylation modifiee Download PDFInfo
- Publication number
- FR2808286A1 FR2808286A1 FR0005317A FR0005317A FR2808286A1 FR 2808286 A1 FR2808286 A1 FR 2808286A1 FR 0005317 A FR0005317 A FR 0005317A FR 0005317 A FR0005317 A FR 0005317A FR 2808286 A1 FR2808286 A1 FR 2808286A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- nucleic acid
- plant
- glucosidase
- transformed
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01106—Mannosyl-oligosaccharide glucosidase (3.2.1.106), i.e. glucosidase I
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
La présente invention concerne une nouvelle glucosidase I végétale et des acides nucléiques codant pour cette enzyme participant à la N-glycosylation des protéines en cours de traduction. Elle concerne aussi des moyens de détection de cette protéine et de ces acides nucléiques, tels que des anticorps ou encore des sondes et des amorces nucléotidiques.
Description
<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention concerne une nouvelle glucosidase # végétale et des acides nucléiques codant pour cette enzyme participant à la Nglycosylation des protéines en cours de traduction. Elle concerne aussi des moyens de détection de cette protéine et de ces acides nucléiques, tels que des anticorps ou encore des sondes et des amorces nucléotidiques.
L'invention est également relative à des vecteurs recombinants comprenant un acide nucléique codant pour la nouvelle glucosidase 1 de plante, à des cellules hôtes transformées par un acide nucléique ou un vecteur recombinant selon l'invention, ainsi qu'à des plantes transgéniques dont une partie ou la totalité des cellules sont transformées avec un acide nucléique ou un vecteur recombinant selon l'invention.
L'invention a également trait à des moyens destinés à augmenter ou au contraire à inhiber l'expression d'un acide nucléique codant pour la nouvelle glucosidase 1 dans des plantes, dans le but de produire des protéines, tout particulièrement des protéines recombinantes, dont la glycosylation est modifiée.
Chez les plantes, comme chez tous les eucaryotes, la Nglycosylation consiste en la fixation covalente d'un oligosaccharide plus ou moins complexe sur une protéine, au niveau d'un site de glycosylation constitué de la séquence en acides aminés NXS/T, X représentant n'importe lequel des acides aminés, à l'exception de la proline (P) et de l'acide aspartique (D).
Le processus de N-glycosylation débute dans le réticulum endoplasmique avec le transfert d'un oligosaccharide précurseur du type (GIC3 Mang GlcNAc2) sur le résidu N d'un site de glycosylation de la protéine en cours de traduction.
Cet oligosaccharide précurseur subit des modifications dans le réticulum endoplasmique. En premier lieu, la glucosidase # coupe un glucose et la glucosidase Il coupe les deux glucoses suivants, l'oligosaccharide fixé sur le site de glycosylation ayant alors la forme (Mang GlcNAc2).
Dans un second temps, la protéine est transférée dans l'appareil de Golgi au sein duquel l'oligosaccharide va subir de nombreuses modifications additionnelles. En particulier, des résidus a-1,3 fucose et p-1,2 xylose peuvent être ajoutés. Les résidus a-1,3 fucose et P-1,2 xylose sont spécifiques des plantes et semblent être présents chez les mollusques, les
<Desc/Clms Page number 2>
insectes et les nématodes ; ils n'ont jamais été identifiés chez les mammifères.
Les glycannes fixés sur les sites de glycosylation des protéines jouent un rôle important dans de nombreux mécanismes. Ils permettent notamment le maintien de la structure de la protéine dans une conformation biologiquement active, ils assurent une protection de la chaîne peptidique vis-à-vis de l'attaque des enzymes protéolytiques et peuvent intervenir dans les phénomènes de reconnaissance cellulaire (Weil et al., 1989).
La glucosidase # est aussi désignée mannosyl-oligosaccharide glucosidase, dont le classement international est EC : La glucosidase # est une enzyme membranaire du réticulum endoplasmique de type II, dont l'extrémité C-terminale se trouve dans le lumen du réticulum endoplasmique.
Cette enzyme catalyse la première étape de la N-glycosylation, en hydrolysant le résidu glucose terminal de l'oligosaccharide précurseur. Cette protéine a été purifiée et caractérisée chez plusieurs espèces.
Chez la levure, la glucosidase # a une taille de 95 kDa (Bause et al.,
1986). La glucosidase # a également été isolée et caractérisée à partir du foie de porc (Bause et al., 1989), de la glande mammaire de bovin où elle semble être présente sous forme de tétramère (Schailubhai et al., 1987) et du foie de veau (Hettkamp et al., 1984). Dans ces trois espèces, la glucosidase # a une taille de 85 kDa et les similarités dans leurs séquences d'acides aminés respectives montrent que cette protéine est assez bien conservée au cours de l'évolution (Pukkazhenti et al., 1993).
1986). La glucosidase # a également été isolée et caractérisée à partir du foie de porc (Bause et al., 1989), de la glande mammaire de bovin où elle semble être présente sous forme de tétramère (Schailubhai et al., 1987) et du foie de veau (Hettkamp et al., 1984). Dans ces trois espèces, la glucosidase # a une taille de 85 kDa et les similarités dans leurs séquences d'acides aminés respectives montrent que cette protéine est assez bien conservée au cours de l'évolution (Pukkazhenti et al., 1993).
Un ADNc humain de 2881 pb codant pour une glucosidase # a également été isolé (Kalz-Füller et al.,1995). L'analyse de la séquence en acides aminés déduite de la séquence de l'ADNc a mis en évidence un site potentiel de glycosylation sur l'acide aminé en position 655, la présence d'une zone très hydrophobe correspondant à la région transmembranaire putative allant de l'acide aminé en position 38 à l'acide aminé en position 58 vers l'extrémité N-terminale et en présence d'une région cytosolique de 37 acides aminés à l'extrémité N-terminale ainsi que d'une région C-terminale étendue située dans le lumen du réticulum endoplasmique. Il s'agit d'une protéine membranaire de type II.
<Desc/Clms Page number 3>
Chez les végétaux, la glucosidase # a été isolée à partir de plantules de haricot (Mung Bean) par (Szumilo et al. 1986), cette enzyme ayant été étudiée en détail par Zeng et al. en 1998. Cette glucosidase # a une taille de 97 kDa et se distingue des glucosidases # animales par une sensibilité différente à des agents modifiant les acides aminés.
Par exemple, un agent modifiant des histidines inactive la glucosidase # de haricot mais pas celle de foie de porc, alors qu'un agent modifiant des cystéines n'inactive que la glucosidase 1 de foie de porc.
Qu'elles soient originaires d'une levure, d'un mammifère ou d'une plante, les glucosidases # connues possèdent en commun certains caractéristiques : il s'agit d'une a-1,2-glucosidase dont l'activité catalytique ne nécessite pas la présence d'un ion métallique, et qui est N-glycosylée sur un seul site .
A ce jour, aucun ADN génomique ou ARN messager codant pour une glucosidase 1 végétale n'a encore été isolé et caractérisé.
Or, il existe actuellement un besoin très important de moyens permettant de produire des polypeptides d'intérêt industriel dans les plantes, notamment de protéines recombinantes, et dont la glycosylation est modifiée.
En particulier, il existe un besoin accru de protéines produites dans les plantes, ne possédant pas des caractéristiques allergisantes conférées par les résidus fucose et xylose contenus dans les oligosaccharides complexes fixés au niveau des sites de glycosylation des protéines d'origine végétale.
Il existe aussi un besoin accru en protéines provenant de céréales dépourvues d'effet allergisant ou encore de protéines recombinantes d'intérêt alimentaire ou thérapeutique ne provoquant pas de phénomène d'allergie chez le consommateur ou le patient.
Afin de modifier la nature de la N-glycosylation chez les plantes, il a été envisagé de stopper la cascade des réactions enzymatiques de glycosylation, avant les étapes de maturation des glycannes, ou encore de faire produire aux plantes, par transgénèse, des oligosaccharides complexes de type animal (Chrispeels et Faye, 1998).
Il a également été envisagé d'utiliser de la castanospermine, qui est un agent inhibiteur de la glucosidase I, notamment dans des cultures de
<Desc/Clms Page number 4>
cellules végétales en fermenteur, de manière à synthétiser des protéines portant un N-glycanne de structure proche du précurseur commun à tous les eucaryotes.
L'invention a permis d'isoler et de caractériser pour la première fois le produit de transcription d'un gène codant pour une glucosidase # végétale catalysant le clivage du premier résidu glucose externe de l'oligosaccharide précurseur (Glc3 Man9 Glc NAc2) et ainsi de rendre accessibles à l'homme du métier des moyens permettant de moduler l'expression du gène correspondant chez une plante et en particulier d'inhiber ou de bloquer la traduction de la glucosidase 1 chez une plante, de manière à produire chez cette plante des protéines glycosylées ne comportant pas de résidus osidiques allergéniques et/ou immunogènes, tels que les résidus fucose et xylose.
Le demandeur a ainsi isolé et caractérisé un ADN complémentaire correspondant à l'ARN messager codant pour une glucosidase 1 chez Arabidopsis thaliana, le gène correspondant étant désigné AtGCS1.
Le demandeur a également montré que l'interruption de la séquence génomique du gène AtGCS1 chez une plante conduisait à la production de protéines dont la glycosylation est modifiée.
Plus particulièrement, il a été montré que le blocage de l'expression du gène AtGCS1 selon l'invention provoquait la production de protéines dont les sites de glycosylation étaient occupés par des oligosaccharides précurseurs et non des N-glycannes matures. L'analyse des protéines produites par les plantes dans lesquelles l'expression du gène AtGCS1 a été bloquée a permis de déterminer une absence totale de résidus xylose et fucose allergènes. Le blocage de l'expression du gène de la glucosidase # végétale AtGCS1 entraîne l'arrêt du développement de la graine.
Un mutant d'insertion d'ADN-T affecté dans la N-glycosylation des protéines a été isolé. L'ADN-T est inséré dans un gène localisé sur le BAC T1 F15 issu de la banque d'ADN de Arabidopsis thaliana TAMU de l'écotype Columbia qui est répertoriée dans la base de données Gen Bank sous le numéro d'accès AC004393.
La séquence répertoriée dans la base de données précitée est annotée comme étant similaire à la glucosidase # humaine.
<Desc/Clms Page number 5>
La séquence génomique du gène AtGCS1 possède également une forte similarité (66% d'identité en acides nucléiques) avec une séquence du BAC F316 de la banque de données IGF répertoriée dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès AC002396.
La séquence contenue dans le BAC F316 est également annotée comme étant similaire à la glucosidase 1 humaine. Des homologies entre la séquence codante du gène AtGCS1 ont été retrouvées, par exemple avec la glucosidase 1 de souris, de rat et de l'homme (38% d'identité en acides nucléiques) d'une protéine putative de C. elegans (36% d'identité en acides nucléiques) ou de Schizzo. pombe (31% d'identité en acides nucléiques) ou encore de levure (28 % d'identité en acides nucléiques).
La séquence du gène décrit dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès AC004353 comprendrait 20 exons et 19 introns.
Selon une telle analyse, la séquence du gène contenu dans le BAC T1 F15 serait transcrite en un ARN messager codant pour une protéine putative d'une longueur de 864 acides aminés.
Le gène AtGCS1 selon l'invention, qui comprend 22 exons et 21 introns, permet la synthèse d'un ARN messager codant pour une glucosidase 1 d'une longueur de 852 acides aminés.
Ainsi, un premier objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide codant pour une glucosidase # ayant la séquence en acides aminés SEQ ID N 1, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
De manière préférée, un acide nucléique selon l'invention se présente sous une forme isolée et/ou purifiée.
Le terme " isolé " au sens de la présente invention, désigne un matériel biologique (acide nucléique ou protéine) qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement).
Par exemple, un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante ou un animal n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante ou de l'animal est considéré comme " isolé ".
Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer
<Desc/Clms Page number 6>
néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.
Le terme " purifié " ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucléotide est à l'état " purifié " après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur.
Aux fins de la présente invention, l'expression " séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Les termes " acide nucléique ", " polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique englobent des séquences d'ARN, d'ADN , d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple chaîne ou sous la forme de duplex.
Le terme " nucléotide " désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (1) un analogue d'une purine, (2) un analogue d'une pyrimidine, ou (3) un sucre analogue, des exemples de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N WO 95/04 064.
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée.
Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), ou C et G.
L'invention concerne également un acide nucléique comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs de l'ADNc de séquence nucléotidique SEQ ID N 2 codant pour la glucosidase # végétale selon l'invention ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
En particulier, l'invention est relative à un acide nucléique comprenant la séquence nucléique SEQ ID N 2, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
<Desc/Clms Page number 7>
L'invention a encore pour objet un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec l'un des acides nucléiques suivants : a) un acide nucléique comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide codant pour une glucosidase # ayant la séquence en acides aminés SEQ ID N 1, ou un acide nucléique de séquence complémentaire; b) un acide nucléique comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotide SEQ ID N 2, ou un acide nucléique de séquence complémentaire; c) un acide nucléique comprenant la séquence nucléotidique SEQ ID N 2, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins 80% d'identité avec un second acide nucléique de référence, possédera au moins 85%, de préférence au moins 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,8% d'identité en nucléotides avec ce second polynucléotide de référence, le pourcentage d'identité entre deux séquences étant déterminé comme décrit ci-après.
Le " pourcentage d'identité " entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des " gaps") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.
Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence.
<Desc/Clms Page number 8>
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus contenus dans l'outil logiciel de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, Wisconsin.
De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité entre deux séquences est effectué à l'aide du logiciel BLAST (version BLAST 2. 06 de Septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut (S.F.
ALTSCHUL et al., 1990); SF ALTSCHUL et al.,1997).
Chacun des acides nucléiques selon l'invention qui comprend tout ou partie de l'ARNm ou de l'ADNc correspondant aux produits de transcription du gène AtGCS1 codant pour une glucosidase 1 végétale peut être aisément obtenu par l'homme du métier qui en connaît sa séquence nucléotidique divulguée dans la présente description.
L'homme du métier peut également reproduire l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention en construisant, sur la base des séquences divulguées dans la présente description, des amorces oligonucléotidiques capables d'amplifier tout ou partie de ces acides nucléiques, par exemple en extrayant les ARN totaux à partir de différents tissus végétaux, puis en synthétisant les ADN complémentaires à l'aide d'une enzyme transcriptase inverse avant de réaliser plusieurs cycles d'amplification des ADNc obtenus à l'aide d'une ou plusieurs amorces hybridant spécifiquement avec les séquences cibles dont l'obtention est recherchée.
Un tel mode de reproduction des acides nucléiques selon l'invention est par exemple décrit dans l'exemple 1.
Après amplification spécifique d'un acide nucléique selon l'invention à l'aide des amorces appropriées, les différents acides nucléiques amplifiés peuvent alors être soumis à une étape de ligation dans un vecteur selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
D'une manière générale, un acide nucléique ayant au moins 20 nucléotides consécutifs d'une séquence selon l'invention possède avantageusement au moins 25, 30, 35, 40,50, 75, 100,150, 200,300, 400, 500,1000, 2000 ou 2500 nucléotides consécutifs de la séquence de
<Desc/Clms Page number 9>
référence, la longueur de nucléotides consécutifs étant naturellement limitée par la longueur de la séquence de référence.
L'homme du métier peut aussi reproduire un acide nucléique selon l'invention par synthèse chimique directe, telle que la méthode au phosphodiester décrite par Narang et al. (1979), la méthode au phosphodiester décrite par Brown et al. (1979), la méthode au diéthylphosphoramidite décrite par Beaucage et al. (1981), ainsi que la méthode sur support solide décrite dans la demande de brevet européen n EP 0 707 792.
Un acide nucléique selon l'invention peut également être synthétisé, à partir de l'information de séquence polynucléotidique de référence SEQ ID N 2 et SEQ ID N 5, à l'aide des techniques décrites par Wheeler et al.
(1996, Gene, Vol. 10 : 251-255), par Wade et al .( 1996, Biomédical Peptides, Proteins and nucleic acids,Vol.2 : 27-32), par Martinez et al. (1996, Taxicon, Vol. 34 (11):1413-1419), par Prapunwattana et al. (1996, Molecular and Biochemical Parasitoly, vo1.83: 93-106) et par Skopek et al. (1996, Mutation Research, vol.349:163-172).
Comme déjà mentionné, le demandeur a également isolé et caractérisé, chez un écotype d'Arabidopsis thaliana, l'écotype Wassilevskja, une plante dans le génome de laquelle le gène AtGCS1 codant pour la glucosidase # selon l'invention a été artificiellement interrompu, par l'insertion d'une construction contenant un ADN-T de Agrobacterium tumefaciens.
Après séquençage du gène AtGCS1 au niveau de l'ADN-T, il a été établi que l'ADN exogène a été inséré au début du huitième intron L'insertion de l'ADN-T exogène a en outre créé une délétion de 30 pb de l'ADN génomique ainsi qu'une insertion de deux fragments nucléotidiques d'une longueur respective de 26 et 22 pb, de part et d'autre de l'ADN-T.
Ainsi, le demandeur a isolé et caractérisé un gène Atgcsl comportant, par rapport à la séquence du gène AtGCS1 retrouvée naturellement, plusieurs additions et délétions de nucléotides dans la séquence codante.
Il a été montré selon l'invention que les plantes portant un gène Atgcs1 muté pouvaient être notamment caractérisées par le phénotype de
<Desc/Clms Page number 10>
leurs graines qui sont, pour un quart d'entre elles , ridées et incapables de germer.
Il a en outre été montré qu'une mutation du gène AtGCS1, lorsqu'elle est présente à l'état homozygote dans le génome, est létale pour la plante.
De plus, il a été montré selon l'invention que la glycosylation des protéines exprimées dans des plantes dans lesquelles l'expression du gène Atgcs1 est fortement altérée, voire complètement bloquée ou inexistante était profondément modifiée et qu'en particulier les glycannes présents au niveau des sites de glycosylation de ces protéines étaient complètement dépourvus de résidus oligosaccharidiques allergènes tels que le fucose et le xylose.
En conséquence, la séquence génomique du gène Atgcs1 ainsi que la séquence nucléotidique SEQ ID N 2 selon l'invention sont utiles notamment pour la mise au point de divers moyens destinés à inhiber ou bloquer la synthèse de la glucosidase 1 codée par le gène AtGCS1. La séquence nucléotidique SEQ ID N 2 selon l'invention est également utile pour la mise au point de divers moyens de détection spécifiques du gène Atgcs1 ou de son produit de transcription, de tels moyens de détection permettant à l'homme du métier de déterminer si une plante d'intérêt contient dans son génome un gène AtGCS1 fonctionnel ou au contraire un gène Atgcs1 muté, étant entendu que la détection de la présence d'au moins une copie du gène Atgcs1 muté dans le génome d'une plante permet de sélectionner cette plante en vue de la production de protéines non allergènes pour l'homme.
Un acide nucléique tel que défini ci-dessus code pour au moins une partie de la glucosidase 1 selon l'invention et peut notamment être inséré dans un vecteur recombinant destiné à l'expression du produit de traduction correspondant dans une cellule hôte ou dans une plante transformée avec ce vecteur recombinant.
Une tel acide nucléique peut aussi être utilisé pour la synthèse de sondes et d'amorces nucléotidiques destinées à la détection ou à l'amplification de séquences nucléotidiques comprises dans l'ADN génomique, l'ARN messager ou encore l'ADNc du gène AtGCS1 dans un échantillon
<Desc/Clms Page number 11>
Aux fins de la détection, on peut également uiliser des acides nucléiques de séquence complémentaire à ceux définis ci-dessus.
Font également partie de l'invention les sondes et les amorces nucléiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique de séquence nucléotidique SEQ ID N 2.
Par conditions d'hybridation de forte stringence au sens de l'invention, on entend les conditions d'hybridation suivantes: - L'ADN à tester est immobilisé sur des membranes de type GenScreenPlus#NENTMLife Science Product selon les instructions du fabriquant, en présence de 0,4 M NaOH ; une nuit.
- Les membranes sont lavées avec un tampon 2 x SSC (1 x SSC idem) puis sont préhybridées au moins 30 min à 65 C dans un tampon d'hybridation (Tampon : 7% SDS, 0.25M Na2HP04, pH 7,4, 2 mM EDTA, 20 mg/l d'héparine, 0,1 mg/l d'ADN simple brin de thymus de veau).
- Les sondes.sont ajoutées aux membranes et incubées à 65 C pendant une nuit; - Après l'étape d'hybridation, les membranes sont lavées dans un tampon 2 x SSC, 0,5 % sarcosyl, 0,2 % pyrophosphate de sodium pendant 30 min à 65 C - Un second lavage est opéré dans un tapon 0,2 x SSC, 0,5 % sarcosyl, 0,2 % pyrophosphate de sodium pendant 10 min à 65 C.
Les conditions d'hybridation décrites ci-dessus sont adaptées à l'hybridation dans des conditions de forte stringence d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur de 300 à 400 nucléotides.
Il va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de AUSUBEL et al; (1989).
Les sondes ou les amorces nucléotidiques selon l'invention comprennent au moins 15 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N 2 ou de sa séquence complémentaire, d'un acide nucléique ayant au
<Desc/Clms Page number 12>
moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence SEQ ID N 2 ou de sa séquence complémentaire ou encore d'un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec la séquence SEQ ID N 2 ou sa séquence complémentaire.
De préférence, des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention ont une longueur d'au moins 15,20, 25,30, 35,40, 50,75, 100, 150,200, 300,400 ou 500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier de l'acide nucléique de séquence nucléotidique SEQ ID N 2, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
Selon un autre aspect, une sonde ou une amorce nucléotidique selon l'invention consistera et/ou comprendra des fragments d'une longueur de 15, 20,25, 30, 35, 40, 50, 75,100, 150, 200,300, 400 ou 500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, plus particulièrement de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N 2, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
Des exemples d'amorces et de couples d'amorces sont par exemple les séquences SEQ ID N 3 et SEQ ID N 4, qui permettent d'amplifier la totalité du cadre de lecture ouvert de l'ARN messager du gène Atgcs1.
Il peut s'agir également des amorces de séquences SEQ ID N 5 à SEQ ID N 15 selon l'invention.
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon les techniques, telles que les méthodes de phosphodiester de Narang et al. (1979) ou de Brown et al. (1979) précitées.
Chacun des acides nucléiques selon l'invention ainsi que les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peuvent être marqués , si désiré, en incorporant un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P, 3H, 35S), des molécules fluorescentes (5-bromodéoxyuridine,
<Desc/Clms Page number 13>
fluorescéine, acétylaminofluorène, digoxigènine) ou encore des ligands tels que la biotine.
Le marquage d'un acide nucléique est réalisé de préférence par incorporation de molécules marquées au sein de ces nucléotides par extension d'amorces, ou bien par ajout sur les extrémités 5' ou 3'.
Des exemples de marquage non radioactif de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet FR 78 19 175 ou encore dans les articles de URDEA et al. (1988), ou SANCHEZ-PESCADOR et al.
(1988).
De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une amplification du signal, telles que les sondes décrites par URDEA et al; (1991) ou encore dans le brevet européen n EP 0 225 807 (Chiron).
Les sondes oligonucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN génomique, ou encore dans des hybridations à l'ARN messager du gène Atgcsi, lorsqu'une visualisation de l'expression du transcrit correspondant est recherchée dans un échantillon.
Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements.
Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaque de microtitration, des billes de polystyrène, des billes magnétiques, des bandes de nitrocellulose ou encore des microparticules telles que des particules de latex.
La présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique du gène AtGCS1 dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes consistant à : - mettre en contact une sonde ou une pluralité de sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester, susceptible de contenir un acide nucléique du gène AtGCS1;
<Desc/Clms Page number 14>
- détecter l'hybride éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de détection selon l'invention, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support.
Selon un autre aspect, les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection de la présence d'un acide nucléique du gène AtGCS1(ADNg, ADNc, ARNm) dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant: a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques, telles que décrites cidessus ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotides comprennent un marqueur détectable.
Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit cidessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui pourront être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt du gène AtGCS1 ou encore détecter des mutations dans les régions codantes du gène AtGCS1, plus particulièrement dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID N 2 où un acide nucléique de séquence complémentaire.
Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier un fragment nucléotidique quelconque (ADNg, ADNc, ARNm) de AtGCS1, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N 2.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique du gène AtGCS1, et plus
<Desc/Clms Page number 15>
particulièrement un acide nucléique de séquence SEQ ID N 2 ou un fragment ou encore un acide nucléique de séquence complémentaire à ce dernier, contenu dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec un couple d'amorces nucléotidiques selon l'invention ; b) réaliser au moins un cycle d'amplification de l'acide nucléique contenu dans l'échantillon; c) détecter de l'acide nucléique éventuellement amplifié.
Selon le procédé d'amplification ci-dessus, on réalise au moins un cycle d'amplification de l'acide nucléique contenu dans l'échantillon préalablement à la détection de l'acide nucléique éventuellement amplifié, de préférence au moins 10, et de manière tout à fait préférée au moins 20, cycles d'amplification.
Pour mettre en oeuvre le procédé d'amplification ci-dessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucléotidiques précédemment décrites dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de la région de l'acide nucléique cible de AtGCSI dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification .
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique du gène AtGCS1 (ADNg, ADNc ou ARNm) selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N 2, ledit nécessaire ou kit comprenant: a) un couple d'amorces nucléotidiques conformes à l'invention; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
<Desc/Clms Page number 16>
Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucléotidiques telle que précédemment décrites dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du coté 3' de l'acide nucléique cible du gène AtGCS1 dont l'amplification est recherchée.
Selon un mode de réalisation préféré, des amorces selon l'invention comprennent tout ou partie d'un polynucléotide choisi parmi des séquences nucléotidiques SEQ ID N 3 et SEQ ID N 4.
L'invention a également trait à des procédés destinés à inhiber ou bloquer l'expression du gène AtGCS1 dans les cellules de tissus de plantes, en vue de la production de protéines glycosylées par des glycannes non allergènes, par des techniques appropriées bien connues de l'homme du métier.
Afin d'inhiber ou de bloquer l'expression du gène AtGCS1 chez une plante, l'homme du métier pourra notamment recourir à l'utilisation de polynucléotides antisens, ou encore à des techniques de co-suppression.
Ainsi, l'invention concerne aussi un polynucléotide antisens capable de cibler spécifiquement une région déterminée du gène AtGCSI et plus particulièrement à une région déterminée de la séquence nucléotidique SEQ ID N 2,capable d'inhiber ou de bloquer sa transcription et/ou sa traduction.
Un tel polynucléotide répond à la définition générale des sondes et des amorces selon l'invention.
Selon un premier aspect, un polynucléotide antisens selon l'invention hybride avec une séquence correspondant à une séquence localisée dans une région de l'extrémité 5' de l'ARN messager du gène AtGCS1, et de manière tout à fait préférée à proximité du codon d'initiation de la traduction (ATG) du gène AtGCS1.
Pour construire un tel polynucléotide antisens, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à la séquence de l'ADNc du gène AtGCS1 référencée comme la séquence nucléotidique SEQ ID N 2.
Selon un second aspect, un polynucléotide antisens selon l'invention comprend une séquence correspondant à une des séquences localisées au niveau des jonctions exon/intron du gène AtGCS1 et de manière préférée aux séquences correspondant à un site d'épissage, qui peuvent être déterminées selon des techniques bien connues de l'homme
<Desc/Clms Page number 17>
du métier, sur la base de la description des séquences de l'invention, tout particulièrement des séquences SEQ ID N 5 et SEQ ID N 2.
Selon un troisième aspect, un polynucléotide antisens conforme à l'invention comprend la totalité de l'ADNc correspondant au produit de transcription du gène AtGCS1. De manière tout à fait préférée, un polynucléotide antisens selon l'invention comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N 2, ou consiste en la séquence SEQ ID N 2.
Pour synthétiser des polynucléotides antisens tels que définis cidessus, l'homme du métier pourra se référer aux positions des différents exons et introns du gène AtGCS1 dans la séquence nucléotidique SEQ ID N 5.
De manière générale, les polynucléotides antisens doivent avoir une longueur et une température de fusion suffisantes pour permettre la formation d'un hybride duplex intracellulaire ayant une stabilité suffisante pour inhiber l'expression de l'ARNm de AtGCS1.
Des stratégies pour construire des polynucléotides antisens sont notamment décrites par GREEN et al. (1986) et IZANT et WEINTRAUB (1984).
Des méthodes de construction de polynucléotides antisens sont également décrites par ROSSI et al. (1991) ainsi que dans les demandes PCT n WO 94/23 026, WO 95/04141, WO 92/18522 et dans la demande de brevet européen n EP 0 572 287.
Avantageusement, un polynucléotide antisens selon l'invention a une longueur de 15 à 4000 nucléotides. Un polynucléotide antisens de l'invention a préférentiellement une longueur de 15 , 20,25, 30,35, 40,45 ou 50 à 75, 100,200, 500, 1000, 2000,3000 ou 4000 nucléotides.
Parmi les polynucléotides antisens selon l'invention, sont préférés ceux ayant respectivement une longueur d'environ 300 nucléotides ou une longueur d'environ 4000 nucléotides.
Afin d'inhiber ou de bloquer l'expression du gène AtGCS1, on peut aussi avoir recours simultanément à une pluralité de polynucléotides antisens tels que définis ci-dessus, chacun des polynucléotides antisens hybridant avec une région distincte du gène AtGCS1 ou de son ARN messager.
<Desc/Clms Page number 18>
D'autres méthodes de mise en oeuvre des polynucléotides antisens sont par exemple celles décrites par SCZAKIEL et al. (1995).
L'invention a encore pour objet tout procédé bien connu de l'homme du métier permettant de créer des modifications, par exemple une ou plusieurs additions, délétions ou substitutions d'au moins un nucléotide dans la séquence du gène AtGCS1, de telles modifications ayant pour conséquence soit une inhibition ou un blocage de la transcription du gène AtGCS1, soit un défaut dans l'épissage du pré-ARN messager, soit une inhibition ou un blocage de la traduction de l'ARN messager mature, dans la glucosidase # selon l'invention, soit encore dans la production d'une glucosidase 1 mutée ayant une activité catalytique réduite ou nulle.
Des techniques de mutagénèse de la séquence génomique du gène AtGCSI appropriées sont par exemple décrites par Hohn et Puchta (1999).
Une plante dont le génome a été modifié comme décrit ci-dessus est capable de synthétiser des protéines à glycosylation modifiée non allergènes et/ou non immunogènes, en particulier l'ensemble des protéines produites naturellement par la plante et destinées à l'alimentation humaine ou animale, telles que celles décrites par Zeng et al. (1997).
En outre, une telle plante affectée dans l'expression de l'activité catalytique de la glucosidase # selon l'invention, peut être utilisée afin de produire des protéines recombinantes déterminées non allergènes et/ou non immunogènes destinées à une utilisation chez l'homme ou l'animal.
De préférence, les plantes rendues déficientes dans l'activité catalytique de la glucosidase 1 selon l'invention sont utilisées en vue de la production de protéines immunogènes et de protéines antigéniques non allergéniques destinées à la préparation de vaccins pour l'immunisation de l'homme ou de l'animal. Tout type de peptide ou protéine immunogène ou antigénique recombinant peut ainsi être produit par une plante dont le gène AtGCS1 a subi au moins une addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides consécutifs.
Selon un autre aspect, les N-glycannes ayant subi un processus partiel de maturation dû à l'absence, ou à un taux réduit, de glucosidase # catalytiquement active dans des plantes dans lesquelles le gène AtGCS1 a été modifié comme décrit ci-dessus, et qui comprennent essentiellement la
<Desc/Clms Page number 19>
structure (Glc3 Man7 GlcNAc2) peuvent être utilisés, après séparation et purification, comme vecteurs de composés d'intérêt thérapeutique vers des cellules cibles déterminées chez les mammifères et en particulier chez l'homme. En effet, ces glycannes partiellement modifiés ont une affinité particulière pour des lectines exprimées spécifiquement à la surface membranaire de certaines catégories cellulaires et ont déjà permis l'adressage d'agents antiviraux vers les hépatocytes et les macrophages (Murray et al , 1987).
Selon un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, une surexpression du gène AtGCS1 ou de son produit de transcription, ou encore de la protéine glucosidase # selon l'invention sera recherchée.
Une forte expression du gène AtGCS1 chez une plante peut être atteinte soit par la surexpression du gène AtGCS1, soit par l'insertion de multiples copies d'un polynucléotide codant pour la glucosidase # selon l'invention dans la plante, soit encore par une combinaison de ces deux stratégies.
Pour l'insertion de multiples copies d'un polynucléotide codant pour la glucosidase 1 selon l'invention dans le génome d'une plante, on aura avantageusement recours à un vecteur recombinant selon l'invention.
L'invention est également relative à un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'invention.
Avantageusement, un tel vecteur recombinant comprend un acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques suivants : a) un acide nucléique comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide codant pour une glucosidase # ayant la séquence en acides aminés SEQ ID N 1 ; ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; b) un acide nucléique comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotidique SEQ ID N 2, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ;
<Desc/Clms Page number 20>
c) un acide nucléique comprenant une séquence ayant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID N 2, ou un acide nucléique de séquence complémentaire; d) un polynucléotide antisens ou un polynucléotide homopurine ou homopyrimidine, tel que défini plus haut, utile pour inhiber l'expression du gène Atgcs1.
Par " vecteur au sens de la présente invention, on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme de simple brin ou double brin.
Un vecteur recombinant selon l'invention est indifféremment un vecteur de clonage, un vecteur d'expression, ou plus spécifiquement un vecteur d'insertion, un vecteur de transformation ou un vecteur d'intégration.
Il peut s'agir d'un vecteur d'origine bactérienne ou virale.
Selon un premier mode de réalisation, un vecteur recombinant selon l'invention est utilisé dans le but d'amplifier l'acide nucléique qui y est inséré après transformation ou transfection de l'hôte cellulaire désiré.
Selon un second mode de réalisation, il s'agit d'un vecteur d'expression comprenant, outre un acide nucléique codant pour un polypeptide conforme à l'invention, en particulier le polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID N 1, des séquences régulatrices permettant d'en diriger la transcription et/ou la traduction.
En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification ou leur expression est recherchée ainsi que des marqueurs de sélection.
Dans un mode de réalisation particulier, un vecteur recombinant selon l'invention comprend un polynucléotide antisens ou un polynucléotide homopurine ou homopyridine, tel que défini précédemment, le cas échéant placé sous le contrôle des séquences de régulation appropriées permettant d'en assurer l'expression dans une cellule hôte ou une plante choisie. Un tel vecteur recombinant est utilisé de préférence pour inhiber l'expression du gène Atgcsl dans la cellule ou dans la plante.
<Desc/Clms Page number 21>
Selon un autre mode de réalisation particulier, un vecteur recombinant selon l'invention comprend un polynucléotide codant pour le polypeptide ATGCS1 ou un polypeptide ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec ce dernier et conservant l'activité biologique de ATGCS1, placé sous le contrôle de séquence (s) régulation permettant une expression à haut niveau de ATGCS1 ou de son homologue dans une cellule hôte ou dans une plante choisie. Un tel vecteur recombinant est utile pour permettre un haut niveau d'expression de ATGCS1 chez une plante .
Selon un aspect avantageux, un tel vecteur recombinant est un vecteur intégratif permettant l'insertion de multiples copies de la séquence codante de ATGCS1 dans le génome d'une plante.
A titre d'exemple, les promoteurs bactériens pourront être les promoteurs Lacl, LacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du bactériophage T3 ou T7, les promoteurs PR, ou PL du phage lambda.
Des promoteurs pour l'expression d'un acide nucléique codant pour une glucosidase # selon l'invention dans les plantes sont le promoteur CaMV 35 S du virus de la mosaïque du chou-fleur (Odell et al., 1985) ou encore le promoteur du gène de l'actine 1 du riz (McElroy et al. 1990).
On peut aussi utiliser le promoteur de la FAH (Brevet numéro : Fn 9907362) qui permet d'exprimer un gène de façon forte et constitutive dans toutes les parties de la plantes sauf dans les graines, utilisable pour les stratégies sens et antisens, ou encore des promoteurs inductibles du système à deux composantes (ref McNellis T. W. et al. 1998, " Glucocorticoid-inducible expression of bacterial avirulence gene in transgenic arabidopsis induces hypersensitive cell death. " Plant Journal, 14 (2) : 247-257
D'autres promoteurs utilisables par l'homme du métier pour l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans les plantes sont décrits dans les brevets n US 5,750,866 et US n 5,633,363.
D'autres promoteurs utilisables par l'homme du métier pour l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans les plantes sont décrits dans les brevets n US 5,750,866 et US n 5,633,363.
De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) précité ou encore aux techniques décrites par Fuller et al. (1996), et Ausubel et al. (1989).
Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR 322 (ATCC N 37017) ou encore des vecteurs tels pAA223-
<Desc/Clms Page number 22>
3 (Pharmacia Uppsala, Suède) et pGEM1, pBSSK et pGEM-T (Promega Biotech, Madison, WU, USA) et pUC19 (commercialisé par Boehringer Mannheim, Germany).
On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen, psuX 174, pBluescript SA, pNH8A, pMH16A, pMH18A, pMH46A, pWLNEO, pSG2CAT, pOG44, pXTI, pSG (Stratagene).
Il peut s'agir également de vecteurs de type baculovirus tels que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATC N CRL 1711) dérivée de Spodoptera frugidera.
Préférentiellement, on aura recours à des vecteurs spécialement adaptés pour l'expression de séquences d'intérêts dans des cellules de plantes, tels que les vecteurs suivants: # vecteur pBIN19 (Bevan et al., Nucleic Acids Research, Vol.12:8711-8721, commercialisé par la Société Clontech , Palo Alto, Californie, USA); # vecteur pB101 (Jefferson 1987, Plant Molecular Biology Reporter, vol. 5 : 387-405, commercialisé par la Société Clotench); # vecteur pBI121 (Jefferson et al. 1987, Plant Molecular Biology Reporter, vol. 5 :387:405, commercialisé par la Société Clotench); # vecteur pEGFP (Cormack BP et al. , 1996, commercialisé par la Société Clotench); # vecteurs pAOV, pOV2, pSOV, pSOV2, pkMB et pSMB (Mylne et al., 1996).
Pour permettre l'expression des polynucléotides selon l'invention, ces vecteurs doivent être introduits dans une cellule hôte. L'introduction des polynucléotides selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de l'homme du métier pour
<Desc/Clms Page number 23>
transformer ou transfecter des cellules, soit en culture primaire, soit sous la forme de lignées cellulaires.
L'invention a en outre pour objet une cellule hôte transformée avec un acide nucléique ou par un vecteur recombinant selon l'invention.
Une telle cellule hôte transformée est préférentiellement d'origine procaryote ou eucaryote, notamment bactérienne, fongique ou végétale.
Ainsi, peuvent être notamment utilisées des cellules bactériennes de différentes souches de E. coli ou encore d'Agrobacterium tumefaciens.
De manière préférée, la cellule hôte transformée est une cellule de plante ou encore un protoplaste de plante.
De manière tout à fait préférée, il s'agit d'une cellule ou d'un protoplaste de colza, de tabac, de maïs, d'orge, de blé, de luzerne, de tomate, de pomme de terre, de bananier ou d'Arabidopsis thaliana.
L'invention concerne aussi un organisme multicellulaire végétal transformé, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule hôte transformée ou une pluralité de cellules hôtes transformées avec un acide nucléique selon l'invention ou avec un vecteur recombinant selon l'invention.
Selon un premier aspect, l'organisme multicellulaire végétal est transformé avec un ou plusieurs nucléotides antisens et/ou un plusieurs polynucléotides homopurine ou homopyrimidine afin d'inhiber ou de bloquer l'expression du gène AtGCS1 chez cet organisme.
Selon un second aspect, l'organisme multicellulaire végétal est transformé avec une ou plusieurs copies d'un polynucléotide codant pour la glucosidase 1 selon l'invention ou pour un polypeptide ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la glucosidase 1 et conservant l'activité biologique permettant la maturation normale des glycannes fixés sur les sites de glycosylation des protéines en cours de synthèse..
L'invention a encore pour objet une plante transgénique, c'est-àdire une plante transformée comprenant, préférentiellement sous une forme intégrée dans son génome, un acide nucléique du gène AtGCS1 et préférentiellement un polynucléotide antisens ou encore un acide nucléique codant pour le polypeptide ATGCS1 ou un polypeptide homologue, ledit acide nucléique ayant été inséré dans le génome de la plante par transformation avec un acide nucléique de AtGCS1 ou un vecteur recombinant selon l'invention.
<Desc/Clms Page number 24>
Préférentiellement, une plante transformée selon l'invention est un colza, un tabac, un maïs, un soja, un blé, une orge, une luzerne, une tomate, une pomme de terre, une plante à fruits telle le bananier ou Arabidopsis thaliana.
Selon un premier aspect, les plantes transgéniques telles que définies ci-dessus présentent une expression réduite, une expression indétectable ou une absence d'expression du gène AtGCS1 et sont ainsi susceptibles de permettre la production de protéines à glycosylation modifiée et non allergènes et/ou non immunogènes pour l'homme ou l'animal. Selon un mode de réalisation particulier, de telles plantes synthétisent une protéine d'intérêt dont la séquence codante a été introduite artificiellement, cette séquence codante pouvant être sous une forme non intégrée au génome de la plante, ou au contraire sous une forme intégrée dans le génome de la plante. La protéine d'intérêt peut être de toute nature, préférentiellement une protéine destinée à l'alimentation ou à la thérapie de l'homme ou l'animal, en particulier l'immunothérapie ou la vaccination.
L'invention concerne ainsi également une protéine à glycosylation modifiée, caractérisée en ce qu'elle est produite par une plante transformée selon l'invention, ou encore par une cellule hôte transformée selon l'invention, dans laquelle l'expression du gène AtGCS1 est inhibée ou bloquée, ou caractérisée en ce qu'elle est contenue dans une semence d'une plante transformée selon l'invention. De préférence, la protéine à glycosylation modifiée est une protéine recombinante. Il peut s'agir d'une protéine recombinante destinée à l'alimentation ou à la thérapie humaine ou animale. Une telle protéine recombinante peut être un antigène ou un immunogène utile dans une composition de vaccin.
L'invention concerne aussi l'addition d'un ou de plusieurs site (s) de N-glycosylation dans une protéine recombinante d'intérêt afin de modifier son ciblage et/ou sa stabilité, dans des cellules végétales, un tissu végétal ou une plante transformée selon l'invention.
Selon un second aspect, les plantes transgéniques telles que définies ci-dessus ont la propriété d'exprimer fortement une glucosidase # selon l'invention.
<Desc/Clms Page number 25>
L'invention a en outre pour objet un procédé d'obtention d'une plante transgénique transformée avec un acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) obtention d'une cellule hôte transformée végétale telle que définie ci-dessus; b) régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte végétale transformée obtenue à l'étape a); c) sélection des plantes obtenues à l'étape b) ayant intégré l'acide nucléique d'intérêt.
L'invention est également relative à un procédé d'obtention d'une plante transgénique, transformée avec un acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : a) transformer une cellule de plante avec un acide nucléique du gène AtGCS1 ou avec un vecteur recombinant selon l'invention; b) régénérer une plante entière à partir de cellules de plantes transformées obtenues à l'étape a); c) sélectionner les plantes ayant intégré l'acide nucléique du gène AtGCS1 d'intérêt.
L'invention concerne aussi un procédé d'obtention d'une plante transformée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) obtention d'une cellule hôte d'Agrobacterium tumefaciens transformée avec un acide nucléique ou un vecteur recombinant selon l'invention; b) transformation de la plante choisie par infection avec des cellules d'Agrobacterium tumefaciens obtenues à l'étape a);
<Desc/Clms Page number 26>
c) sélection des plantes ayant intégré l'acide nucléique selon l'invention.
L'un quelconque des procédés d'obtention d'une plante transgénique ci-dessus décrit peut en outre comporter les étapes additionnelles suivantes : d) croisement entre elles des deux plantes transformées telles qu'obtenues à l'étape c); e) sélection des plantes hétérozygotes pour le transgène.
Selon un autre aspect, l'un quelconque des procédés ci-dessus décrits pourra en outre comprendre les étapes suivantes: d) croisement d'une plante transformée obtenue à l'étape c) avec une plante de la même espèce ; e) sélection des plantes issues du croisement de l'étape d) ayant conservé le transgène.
L'homme du métier est capable de mettre en oeuvre de nombreux procédés de l'état de la technique afin d'obtenir des plantes transformées avec un acide nucléique du gène AtGCS1 selon l'invention.
L'homme du métier pourra se référer avantageusement à la technique décrite par BECHTOLD et al. (1993) afin de transformer une plante à l'aide de la bactérie Agrobacterium tumefaciens.
Les techniques utilisées dans d'autres types de vecteurs peuvent également être utilisées telles que les techniques décrites par BOUCHEZ et al. (1993) ou encore par HORSCH et al. (1984).
L'homme du métier peut encore se référer à la technique décrite par Gomord et al. (1998).
L'invention a en outre pour objet une plante transformée telle qu'obtenue selon l'un quelconque des procédés d'obtention décrits cidessus.
<Desc/Clms Page number 27>
L'invention concerne également une semence de plante dont une partie ou la totalité des cellules constitutives comprennent un acide nucléique du gène AtGCS1 selon l'invention qui a été artificiellement inséré dans leur génome.
L'invention a encore pour objet une semence d'une plante transgénique telle que définie ci-avant.
L'invention concerne aussi une cellule végétale comprenant un acide nucléique du gène AtGCS1. De préférence, l'acide nucléique du gène AtGC1 se présente sous une forme intégrée au génome de ladite cellule végétale.
L'invention concerne également un tissu végétal constitué d'un ensemble de cellules végétales transformées telles que définies ci-dessus.
Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation d'un acide nucléique du gène AtGCSt selon l'invention pour l'expression in vitro ou in vivo, de préférence in planta, de la glucosidase # selon l'invention ou d'un fragment peptidique de celle-ci.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un acide nucléique antisens, selon l'invention pour inhiber ou pour bloquer l'expression du gène codant pour la glucosidase # selon l'invention.
De manière préférée, les utilisations ci-dessus sont caractérisées en ce qu'il s'agit d'une expression in vivo chez une plante transformée avec un tel acide nucléique.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un acide nucléique antisens selon l'invention pour inhiber ou pour bloquer l'expression in vitro ou in vivo du gène codant pour la glucosidase # selon l'invention, et tout particulièrement la glucosidase 1 ayant la séquence en acides aminés SEQ ID N 1.
L'acide nucléique antisens ou l'acide nucléique homopurine ou homopyrimidine est préférentiellement utilisé pour inhiber ou bloquer l'expression du gène AtGCS1 in vivo, dans la plante transformée avec un tel acide nucléique.
La glucosidase # selon l'invention ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID N 1 a une longueur de 852 acides aminés. Cette protéine a un poids moléculaire calculé de 97,5 kDa. Après analyse de la séquence, le
<Desc/Clms Page number 28>
demandeur a identifié une région hydrophile contenant plusieurs arginines dont la partie N-terminale du polypeptide de séquence SEQ ID N 1, cette région hydrophile contenant le signal consensus de rétention dans le réticulum endoplasmique des protéines membranaires de type II, dont l'extrémité C-terminale se trouve dans le lumen.
Cette région hydrophile est constituée de la région allant de l'acide aminé en position # à l'acide aminé en position 38 de la séquence en acides aminés SEQ ID N 1.
La glucosidase # selon l'invention comprend aussi une région hydrophobe correspondant à un domaine transmembranaire, cette région hydrophobe allant de l'acide aminé en position 38 jusqu'à l'acide aminé en position 17 de la séquence en acides aminés SEQ ID N 1.
La glucosidase 1 selon l'invention comprend un site unique de fixation au glycanne localisé de l'acide aminé en position 598 à l'acide aminé en position 606 de la séquence en acides aminés SEQ ID N 1. Un site unique de glycosylation a également été identifié, qui s'étend de l'acide aminé en position 662 à l'acide aminé en position 664 de la séquence en acides aminés SEQ ID N 1.
De plus, la glucosidase 1 selon l'invention comprend une large région hydrophile, probablement localisée dans le lumen du réticulum endoplasmique, s'étendant de l'acide aminé en position 68 jusqu'à l'acide aminé C-terminal en position 852 de la séquence en acides aminés SEQ ID N 1.
Comme déjà rappelé, le demandeur a montré que des mutations dans la séquence du gène AtGCS1 codant pour la glucosidase # de séquence SEQ ID N 1 selon l'invention conduisent à l'absence d'activité glucosidase # dans la plante ainsi mutée et simultanément à l'expression d'un phénotype de glycosylation modifiée dans les protéines produites par cette plante mutée.
Selon un autre aspect l'invention concerne également un polypeptide codé par un acide nucléique du gène AtGCS1, et de préférence un polypeptide comprenant au moins 7 acides aminés consécutifs de la glucosidase # de séquence en acides aminés SEQ ID N 1.
De préférence, un tel polypeptide comprend au moins 20,25, 30, 40,50, 60,70, 80,90, 100, 150,200, 250, 300, 350, 400, 450,500, 600,
<Desc/Clms Page number 29>
700, ou 800 acides aminés consécutifs du polypeptide ATGCS1 de séquence en acides aminés SEQ ID N 1
L'invention est également relative à un polypeptide comprenant les séquences en acides aminés ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence du polypeptide ATGCS1 SEQ ID N 1, ou à un fragment peptidique de ce dernier.
L'invention est également relative à un polypeptide comprenant les séquences en acides aminés ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence du polypeptide ATGCS1 SEQ ID N 1, ou à un fragment peptidique de ce dernier.
Avantageusement, fait partie de l'invention un polypeptide ayant au moins 60%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% d'identité en acides aminés avec la séquence du polypeptide ATGCS1 de séquence SEQ ID N 1, ou un fragment peptidique de ce dernier.
De manière générale, les polypeptides selon l'invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée.
L'invention est également relative à un procédé pour la production du polypeptide ATGCS1 de séquence SEQ ID N 1, ou d'un fragment peptidique de ce dernier.
Un procédé préféré pour la production du polypeptide ATGCS1 de séquence SEQ ID N 1 les étapes suivantes consistant à : a) insérer un acide nucléique codant pour le polypeptide ATGCS1 ou un fragment peptidique de ces derniers, dans un vecteur approprié; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfectée avec le vecteur recombinant de l'étape a); c) récupérer le milieu de culture conditionné ou lysé la cellule hôte transformée, par exemple par sonication ou par choc osmotique; d) séparer et purifier à partir du milieu de culture ou encore à partir des lysats cellulaires obtenus à l'étape c), ledit polypeptide; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
Les peptides selon l'invention peuvent être caractérisés par fixation sur une colonne de chromatographie d'immunoaffinité sur laquelle les
<Desc/Clms Page number 30>
anticorps dirigés contre ces polypeptides où un fragment ou un variant de ces derniers ont été préalablement immobilisés.
Selon un autre aspect, un polypeptide recombinant selon l'invention peut être purifié par passage sur une colonne de chromatographie selon les méthodes connues de l'homme de l'art et décrites par exemple par AUSUBEL F. et al. (1989) précité.
Un polypeptide selon l'invention peut être également préparé par les techniques classiques de synthèse chimique indifféremment en solution homogène ou en phase solide.
A titre illustratif, un polypeptide selon l'invention pourra être préparé par la technique en solution homogène décrite dans HOUBEN WEYL (1974) ou encore la technique de synthèse en phase solide décrite par MERRIFIELD (1965a, 1965b).
Font également partie de l'invention des polypeptides dits " homologues " aux polypeptides ATGCS1 , ou de leurs fragments.
De tels polypeptides homologues ont des séquences d'acides aminés possédant une ou plusieurs substitutions d'un acide aminé par un acide aminé équivalent, par rapport au polypeptide de référence.
On entendra par acides aminés équivalents selon la présente invention, par exemple le remplacement d'un résidu sous la forme L par un résidu sous la forme D ou encore le remplacement d'un acide glutamique (E) par un acide pyro-glutamique selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
A titre illustratif, la synthèse de peptides contenant au moins un résidu sous la forme D est décrite par KOCH et al. (1977).
Selon un autre aspect, sont également considérés comme des acides aminés équivalents deux acides aminés appartenant à la même classe, c'est-à-dire deux acides aminés acides, basiques, non polaires ou encore polaires non chargés.
Fait également partie de l'invention un polypeptide comprenant des modifications d'acides aminés de 1,2, 3,4, 5,10 à 20 substitutions, additions ou délétions d'un acide aminé par rapport à la séquence d'acides aminés du polypeptide ATGCS1 selon l'invention.
De préférence, les polypeptides selon l'invention comprenant une ou plusieurs additions, délétions, substitutions d'au moins un acide aminé
<Desc/Clms Page number 31>
conservent leur capacité à catalyser la coupure du premier résidu glucose du N-glycanne précurseur de structure (Glc3Man9GlcNAc2), qui peut être aisément déterminée par l'homme du métier, par exemple en utilisant les techniques décrites par Sambrook et al., (1989).
Selon un autre mode préférentiel de réalisation, les polypeptides selon l'invention comprenant une ou plusieurs additions, délétions, substitutions d'au moins un acide aminé conservent leur capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre le polypeptide ATGCS1 de séquence SEQ ID N 1.
L'invention est également relative à un acide nucléique codant pour un polypeptide tel que défini ci-dessus.
Un polypeptide dérivé de la protéine ATGCS1 est utile notamment pour la préparation d'anticorps destinés à la détection de la présence de ce polypeptide ou encore d'un fragment peptidique de ce dernier dans un échantillon.
Outre la détection de la présence du polypeptide ATGCS1 ou encore d'un fragment peptidique de ce dernier dans un échantillon, des anticorps dirigés contre ces polypeptides sont utilisés pour quantifier la synthèse de glucosidase I, par exemple dans les cellules d'une plante, et déterminer ainsi la capacité de cette plante à synthétiser des glycannes mâtures au niveau des sites de glycosylation produits par les cellules de ladite plante.
Des anticorps préférés selon l'invention sont les anticorps reconnaissant spécifiquement la séquence d'acides aminés allant de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 38 ( région hydrophile Nterminale) de la séquence du polypeptide ATGCS1 de séquence SEQ ID N 1.
Une seconde classe d'anticorps préférés selon l'invention sont les anticorps reconnaissant spécifiquement la séquence d'acides aminés allant de l'acide aminé en position 39 à l'acide aminé en position 67 (domaine transmembranaire) de la séquence du polypeptide ATGCS1 de SEQ ID N 1.
Une troisième classe d'anticorps préférés selon l'invention sont les anticorps reconnaissant spécifiquement la séquence d'acides aminés allant de l'acide aminé en position 68 à l'acide aminé en position 852 (région
<Desc/Clms Page number 32>
hydrophile comprenant le site catalytique) du polypeptide ATGCS1 de séquence SEQ ID N 1.
Une quatrième classe d'anticorps préférés selon l'invention sont les anticorps reconnaissant spécifiquement le site de fixation au glycanne de la protéine ATGCS1, et plus particulièrement ceux reconnaissant un peptide de séquence ERHVDLRCW .
Par " anticorps " au sens de la présente invention, on entendra notamment des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments (par exemple des fragments F(ab)'2, F (ab) ou encore tout polypeptide comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le polypeptide ou le fragment de polypeptide cible selon l'invention.
Les anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par KOHLER et MILSTEIN (1975).
La présente invention concerne également des anticorps dirigés contre un polypeptide tel que décrit ci-dessus ou un fragment ou un variant de ce dernier, tel que produit dans la technique du triome ou encore la technique d'hybridome décrit par KCZBOR et al. (1983).
L'invention a également trait à des fragments d'anticorps simple chaîne Fv (ScFv) tels que décrits dans le brevet US N 4,946,768 ou encore par MARTINEAU et al. (1998).
Les anticorps selon l'invention comprennent également des fragments d'anticorps obtenus à l'aide de banques de phages (RIDDER et al., 1995), REINMANN K. A. et al., 1997).
Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles dans des tests de détection immunologiques destinés à l'identification de la présence et/ou de la quantité de la glucosidase # selon l'invention ou encore d'un fragment peptidique de cette protéine, présent dans un échantillon.
Un anticorps selon l'invention pourra comprendre en outre un marqueur détectable isotopique ou non isotopique, par exemple fluorescent, ou encore être couplé à une molécule telle que la biotine, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Ainsi, l'invention a en outre pour objet un procédé pour détecter la présence d'une glucosidase 1 végétale ou encore d'un fragment peptidique de l'un de ces polypeptides conformes à l'invention, dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes consistant à :
<Desc/Clms Page number 33>
a) mettre en contact l'échantillon à tester avec un anticorps tel que défini ci-dessus; b) détecter le complexe antigène/anticorps formé.
L'invention est également relative à un nécessaire ou kit de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant: a) un anticorps tel que défini ci-dessus; b) le cas échéant, un réactif néessaire à la détection du complexe antigène/anticorps formé.
L'invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et exemples suivants.
La figure 1 illustre des gels d'électrophorèse des protéines extraites des cellules de graines d'Arabidopsis thaliana de type sauvage (écotype sauvage Ws) et de cellules de graines écotype dans lesquelles le gène AtGCS1 a été interrompu par l'insertion d'une séquence de l'ADN-T de Agrobacterium tumefaciens (M), provenant aussi de l'écotype Ws..
Le gel N 1 de gauche est un gel d'électrophorèse SDS-PAGE sur lequel les protéines ayant migré ont été colorées à l'aide du nitrate d'argent.
Le gel n 2 a été incubé en présence d'un anticorps anti-xylose.
Le gel n 3 a été incubé en présence d'un anticorps anti-fucose.
Le gel n 4 a été incubé en présence de concanavaline A.
Figure 2. Chromatogrammes HPAEC-PAD des N-glycannes libérés des graines sauvages (A) et du mutant atgcs1 (B) par traitement à l'Endo H.
Les nombres 5 à 9 réfèrent aux structures des N-glycans oligomannosidiques Man5GlcNAc à MangGIcNAc représentées dans le Tableau I.
Figure 3 : de masse MALDI-TOF des N-glycannes isolés des graines sauvages (Fig. 3A) et des graines portant le gène AtGCS1 muté (Fig 3B). En abscisse, valeur m/z représentant le rapport masse/charge.
<Desc/Clms Page number 34>
Exemple 1 : Isolement de l'ADNc codant pour la glucosidase 1 de
Arabidopsis thaliana
1. Extraction d'ARN de différents tissus végétaux
Les ARN totaux de plantules âgées de 8 jours sont extraits grâce au kit RNeasy Plant Minikit de QUIAGEN (Allemagne), selon le protocole fourni par le fabricant. Une étape de dégradation de l'ADN a été réalisée systématiquement sur la colonne d'extraction (RNase free DNase, QIAGEN, Allemagne), selon les instructions du fabricant. Toutes les manipulations sont effectuées avec du matériel exempt de Rnase et de l'eau DEPC est utilisée (0,1% de diéthyl pyrocarbonate autoclavé après une agitation de 12 heures).
Arabidopsis thaliana
1. Extraction d'ARN de différents tissus végétaux
Les ARN totaux de plantules âgées de 8 jours sont extraits grâce au kit RNeasy Plant Minikit de QUIAGEN (Allemagne), selon le protocole fourni par le fabricant. Une étape de dégradation de l'ADN a été réalisée systématiquement sur la colonne d'extraction (RNase free DNase, QIAGEN, Allemagne), selon les instructions du fabricant. Toutes les manipulations sont effectuées avec du matériel exempt de Rnase et de l'eau DEPC est utilisée (0,1% de diéthyl pyrocarbonate autoclavé après une agitation de 12 heures).
Des plantules agées de 8 jours cultivées in vitro sont prélevées et directement mises dans de l'azote liquide et conservés à -80 C, jusqu'à l'extraction. Les pipettes et le matériel utilisé pour l'extraction des ARNs sont préalablement traités à la soude 0,4M pour détruire les éventuelles RNases.
L'eau est traitée au DEPC (1 ml de DEPC dans 1I d'eau, homogénéisation toute la nuit sous une Sorbonne), puis autoclavée pour éliminer cet agent. Les centrifugations en colonne plus tube collecteur s'effectuent en centrifugeuse de type " Micro Centaure " (MSE, UK).
Le matériel végétal est broyé dans l'azote liquide, dans des Eppendorfs stériles à l'aide d'un broyeur électrique. Le broyat est immédiatement plongé dans l'azote liquide après broyage. L'extraction proprement dite s'effectue avec le kit " RNAeasy Plant Mini Extraction Kit ", (QIAGEN, Allemagne). Brièvement, 450 l du tampon de lyse " RLT " additionné de p-mercaptoéthanol (10 l/1ml) sont vortexés avec 100 mg de tissus broyé.
Les étapes suivantes sont exactement celles décrites dans le manuel du kit fournit par QUIAGEN. Le lysat, placé dans une colonne et son tube collecteur de 2 ml, est centrifugé 2 min.
Le filtrat est récupéré et lavé avec 0,5 volume d'éthanol 96-100%.
L'échantillon est ensuite déposé sur une colonne et son tube collecteur de 2 ml pour être centrifugé 15 sec à 10. 000 rpm, les ARNs sont retenus par la colonne. 350 l de tampon de lavage RW1 sont ajoutés sur cette colonne pour laver les ARNs par une centrifugation de 15sec à 10. 000 rpm. Un
<Desc/Clms Page number 35>
traitement à la DNase est ensuite effectué (10 l de Dnase et 70 l de tampon, QIAGEN) pendant 15min à température ambiante. Du tampon de lavage RW1 (350 l) est de nouveau appliqué pour terminer le lavage. La colonne est ensuite installée dans un nouveau tube collecteur de 2ml et deux lavages successifs sont effectués avec 500 l du tampon de lavage RPE additionné d'éthanol. Pour finir, les ARNs sont élués de la colonne par 30 à 50 l d'eau traitée au DEPC après une centrifugation 1 min à 10.000rpm.
*Les ARNs sont conservé à -80 C.
2. PCR inverse (Reverse Transcriptase-PCR)
Les ADNc, simples brins, ainsi que les produits d'amplifications sont obtenus avec le système " Enhanced avian RT-PCR kit " (SIGMA, USA).
Les ADNc, simples brins, ainsi que les produits d'amplifications sont obtenus avec le système " Enhanced avian RT-PCR kit " (SIGMA, USA).
La rétrotranscription a lieu dans les conditions suivantes : - 10 l de l'extraction d'ARN - 1 NI d'un mélange de déoxynucléotides - lui d'oligonucléotide dT - 4,5 l H2O (qsp 16,5 l) pendant 10min à 70 C, pour dénaturer les ARNs, y sont ensuite ajoutés : - 2 l de tampon 10X AMV-RT - 1 l de l'enzyme Enhancer avian RT - 0,5 l d'inhibiteur de Rnase
Le mélange est incubé 15min à 25 C pour permettre l'hybridation de l'oligonucléotide dT, et ensuite la rétrotranscription se fait pendant 50min à 42 C. Les ADNc synthétisés sont ensuite amplifiés par PCR.
Le mélange est incubé 15min à 25 C pour permettre l'hybridation de l'oligonucléotide dT, et ensuite la rétrotranscription se fait pendant 50min à 42 C. Les ADNc synthétisés sont ensuite amplifiés par PCR.
La réaction de PCR a été menée sur un thermocycleur (MJ Research PTC100-96, Prolabo, France), dans des tubes de 0,2 ml (Prolabo, France) contenant le mélange suivant : - 2 l /20(il du produit de la RT - 5U d'enzyme PfuTurboTMAND Polymérase (Stratagène, USA) - 10 l tampon 10x de la Pfu - 4 l dNTP 5mM (GIBCO BRL, Ecosse) - 2 l de chaque oligonucléotide 10 M (GENSET, France).
<Desc/Clms Page number 36>
qsp 100 l H2O
Des oligonucléotides spécifiques de AtGCS1 ont été choisi pour amplifier la séquence codante. Il s'agit de " ATG " (5'ATGACCGGAGCTAGCCGTCG) et " FO " (5'AAGTTTCGTTCCCGAAGAGG), se situant respectivement sur l'ATG putatif et à 30 pb en aval du stop putatif de T1F15.4.
Des oligonucléotides spécifiques de AtGCS1 ont été choisi pour amplifier la séquence codante. Il s'agit de " ATG " (5'ATGACCGGAGCTAGCCGTCG) et " FO " (5'AAGTTTCGTTCCCGAAGAGG), se situant respectivement sur l'ATG putatif et à 30 pb en aval du stop putatif de T1F15.4.
La réaction a été effectuée dans les conditions suivantes : 1 étape de dénaturation initiale à 94 C pendant 3 min puis 35 cycles, chaque cycles étant composé des étapes suivantes : - 94 C : 30 sec - 60 C : 1 min - 72 C : 3 min - une étape élongation à 72 C pendant 10 min
EXEMPLE 2: Identification du gène AtGCSI
L'identification du gène interrompu atgcs1 a été réalisée par l'isolement des bordures génomiques de l'ADN-T provenant de l'écotype de A. thalmiana atgcs1 (mutant d'insertion), par la technique de marche par PCR (walk-PCT) décrite par Devic et al. (1997).
EXEMPLE 2: Identification du gène AtGCSI
L'identification du gène interrompu atgcs1 a été réalisée par l'isolement des bordures génomiques de l'ADN-T provenant de l'écotype de A. thalmiana atgcs1 (mutant d'insertion), par la technique de marche par PCR (walk-PCT) décrite par Devic et al. (1997).
Les séquences des fragments d'ADN ainsi clonés ont été comparés à celles contenues dans les bases de données. Ces séquences présentent une similarité très forte avec la séquence du bac T1 F15 issue de la banque d'ADN d'Arabidopsis thaliana TAMU et répertoriée dans la base de données Gen Bank sous la référence AC004393.
L'insert d'ADN d'Arabidopsis thaliana contenu dans le bac T1 F15 est une portion du chromosome 1 et a été cartographie comme se situant entre les positions cM98 et cM99 du chromosome 1, c'est-à-dire sur une région du chromosome 1 à l'extrémité opposée du centromère.
Une seconde similarité assez forte d'environ 66% d'identité en nucléotides a également été identifiée avec l'insert d'ADN d'Arabidopsis thaliana contenu dans le BAC F316 de la banque IGF. L'insert du bac F316 a
<Desc/Clms Page number 37>
également été cartographie sur le chromosome 1, entre les positions cM30 et cM40.
La structure exacte introns/exons du gène Atgcsl a pu être établie par alignement de la séquence de l'ADNc avec celle du clone génomique répertorié dans la base de données Gen Bank sous la référence AC004393.
Des différences sont à noter par rapport à la séquence codante prédite du gène T1F15.4 dans les bases de données. Le gène Atgcsl présente en fait 22 exons et 21 introns. Les exons n 4 et 16 ont été ajoutés et les exons n 5, 6,15 et 17 raccourcis par rapport aux prédictions de la base. Les sites d'épissages AG en fin d'intron et GT au début sont à chaque fois retrouvés, sauf pour le neuvième intron qui commence par GC. Il existe également quelques différences ponctuelles. Elles peuvent être dues à la différence d'écotypes utilisés pour réaliser la banque BAC (Columbia) et ou pour amplifier l'ADNc (Wassilevskija).
Exemple 3: Analyse de la structure de la glucosidase 1 de
Arabidopsis thaliana codée par le gène AtGCSI.
Arabidopsis thaliana codée par le gène AtGCSI.
1. Similarités de séquences avec d'autres glucosidases réelles ou putatives.
La protéine AtGCS1 a une taille de 852 acides aminés et une masse moléculaire estimée de 97,5 kDa. Ceci correspond bien aux données de la bibliographie, les glucosidases # purifiées jusqu'à maintenant ayant une masse moléculaire comprise entre 85 et 95 kDa. (Pukazhenthi et al., 1993) A partir de cette nouvelle séquence protéique, les recherches sur les bases de données ont été approfondies. Le tableau ci-dessous présente la similarité entre les protéines AtGCS1 et les glucosidases # déjà caractérisées.
<Desc/Clms Page number 38>
<tb>
<tb>
<tb>
AtGCS1 <SEP> AtGCS1
<tb> identifié <SEP> similarité
<tb> Homme <SEP> (activité <SEP> 38 <SEP> 54
<tb> montrée)
<tb> Souris <SEP> (gène <SEP> 38 <SEP> 55
<tb> cloné)
<tb> 38 <SEP> 55
<tb> C. <SEP> elegans <SEP> 36 <SEP> 53
<tb> (putative)
<tb> S.pombe <SEP> (putative) <SEP> 31 <SEP> 45
<tb>
<tb> identifié <SEP> similarité
<tb> Homme <SEP> (activité <SEP> 38 <SEP> 54
<tb> montrée)
<tb> Souris <SEP> (gène <SEP> 38 <SEP> 55
<tb> cloné)
<tb> 38 <SEP> 55
<tb> C. <SEP> elegans <SEP> 36 <SEP> 53
<tb> (putative)
<tb> S.pombe <SEP> (putative) <SEP> 31 <SEP> 45
<tb>
Les pourcentages d'identité (38 %) et de similarité (54 %) obtenus entre la séquence d' AtGCS1 et la protéine humaine sont insuffisants pour conclure à l'activité glucosidase 1 de AtGCS1. Les pourcentages d'identité et de similarité ont été obtenus à l'aide du logiciel DNA STIDERTM 1. 3.
2. Comparaison avec des fragments peptidiques d'une glucosidase # végétale purifiée
La glucosidase 1 de plantules de haricot (Vigna radiata, Zeng et Albein, 1998), a été purifiée et le séquençage de quatre peptides a été effectué. Les séquences de ces quatre peptides s'alignent sur la séquence protéique de ATGCS1 et de la glucosidase # de l'homme.
La glucosidase 1 de plantules de haricot (Vigna radiata, Zeng et Albein, 1998), a été purifiée et le séquençage de quatre peptides a été effectué. Les séquences de ces quatre peptides s'alignent sur la séquence protéique de ATGCS1 et de la glucosidase # de l'homme.
<tb>
<tb> peptide <SEP> 1 <SEP> NYQQSGFLWEQYDQIK
<tb> ATGCS1 <SEP> 810 <SEP> NYYETGYIWEQYDQVK <SEP> peptide3 <SEP> DFG <SEP> QVLVDIGM
<tb> HOMME <SEP> 800 <SEP> QYQATGFLWEQYSDRD <SEP> ATGCS1 <SEP> 168 <SEP> DYGRQELVENDM
<tb> HOMME <SEP> 155 <SEP> SFGRQHIQDGAL
<tb> peptide <SEP> 2 <SEP> SLLWTNYGLR <SEP> peptide4 <SEP> EDIGDWQLRFK
<tb> ATGCS1 <SEP> 741 <SEP> SILWSDYGLV <SEP> ATGCS1 <SEP> 253 <SEP> EDVGDWQIHLK
<tb> HOMME <SEP> 719 <SEP> RHLWSPFGLR <SEP> HOMME <SEP> 178 <SEP> QHGGDWSWRVT
<tb>
<tb> peptide <SEP> 1 <SEP> NYQQSGFLWEQYDQIK
<tb> ATGCS1 <SEP> 810 <SEP> NYYETGYIWEQYDQVK <SEP> peptide3 <SEP> DFG <SEP> QVLVDIGM
<tb> HOMME <SEP> 800 <SEP> QYQATGFLWEQYSDRD <SEP> ATGCS1 <SEP> 168 <SEP> DYGRQELVENDM
<tb> HOMME <SEP> 155 <SEP> SFGRQHIQDGAL
<tb> peptide <SEP> 2 <SEP> SLLWTNYGLR <SEP> peptide4 <SEP> EDIGDWQLRFK
<tb> ATGCS1 <SEP> 741 <SEP> SILWSDYGLV <SEP> ATGCS1 <SEP> 253 <SEP> EDVGDWQIHLK
<tb> HOMME <SEP> 719 <SEP> RHLWSPFGLR <SEP> HOMME <SEP> 178 <SEP> QHGGDWSWRVT
<tb>
<Desc/Clms Page number 39>
Le peptide 1 identifié chez le haricot permet de retrouver dans les banques de données la séquence homologue chez Arabidopsis. Cependant ces données seules ne suffisent pas pour démontrer que le gène ainsi identifié (T1 F15.4) code pour l'homologue fonctionnel de la glucosidase # de haricot. Cette donnée est du même niveau que les indications des bases de données sur T1 F15.4 (gène putatif), qui par ailleurs ne permettent pas d'obtenir la séquence codante vraie.
3. Motif de rétention dans le reticulum endoplasmique
La glucosidase # est une protéine membranaire de type Il (l'extrémité C-terminale se trouve dans le lumen), et devrait posséder, comme les protéines situées dans le lumen, un signal consensus de rétention dans le RE du type : deux arginines dans les premiers AA en NTerm (Shütze et al., 1994). La séquence protéique N-terminale (MTGASRR), présente deux arginines dans les premiers acides aminés. (pour l'homme, la séquence commence par : MARGER).
La glucosidase # est une protéine membranaire de type Il (l'extrémité C-terminale se trouve dans le lumen), et devrait posséder, comme les protéines situées dans le lumen, un signal consensus de rétention dans le RE du type : deux arginines dans les premiers AA en NTerm (Shütze et al., 1994). La séquence protéique N-terminale (MTGASRR), présente deux arginines dans les premiers acides aminés. (pour l'homme, la séquence commence par : MARGER).
4. Profil d'hydrophobicité
Une zone hydrophile s'étend des résidus 1 à 38, ce qui pourrait correspondre au domaine cytoplasmique de la protéine humaine (1 à 39).
Une zone hydrophile s'étend des résidus 1 à 38, ce qui pourrait correspondre au domaine cytoplasmique de la protéine humaine (1 à 39).
Ensuite un domaine hydrohobe s'étend jusqu'à l'aa 67, ce qui correspond au domaine transmembranaire de la protéine humaine (39 à 5). Le reste de la protéine est plutôt hydrophile, c'est la partie se trouvant probablement dans le lumen.
5. Site de N-glycosylation
Les glucosidases 1 caractérisées au niveau biochimique présentent toutes un site unique de N-glycosylation, que l'on retrouve en position équivalente dans la protéine humaine (NHT 657-659), et dans la protéine d'Arabidopsis (NHT 662-664).
Les glucosidases 1 caractérisées au niveau biochimique présentent toutes un site unique de N-glycosylation, que l'on retrouve en position équivalente dans la protéine humaine (NHT 657-659), et dans la protéine d'Arabidopsis (NHT 662-664).
6. Site de fixation au substrat
Le site de fixation au glycanne a été décrit dans la protéine humaine comme étant le peptide ERHLDLRCW (Romaniouk et Vijay, 1997).
Le site de fixation au glycanne a été décrit dans la protéine humaine comme étant le peptide ERHLDLRCW (Romaniouk et Vijay, 1997).
Ce peptide se situe en position 594. Dans la protéine ATGCS1, on trouve un peptide similaire (ERHVDLRCW) en position 598.
<Desc/Clms Page number 40>
EXEMPLE 4: Analyse cytologique sur les tissus et les graines des plantes d'Arabidopsis thaliana dont le gène AtGCS1 est interrompu par l'ADN-T de Agrobacterium tumefaciens
Des observations préliminaires ont montré que, jusqu'au stade coeur de l'embryon, on ne peut pas observer de différences phénotypiques entre les graines. Puis les embryons sauvages et hétérozygotes (qui sont identiques) se différencient et continuent leur développement, alors que la plante homozygote pour la mutation sur le gène Atgcs1 reste au stade coeur et augmente de volume. La plante mutée ne se différencie absolument pas, son hypocotyle est très réduit, ses cotylédons et sa racine ne sont pas allongés. Les coupes réalisées au cours du développement de l'embryon chez la plante mutante montrent que l'albumen se cellularise normalement.
Des observations préliminaires ont montré que, jusqu'au stade coeur de l'embryon, on ne peut pas observer de différences phénotypiques entre les graines. Puis les embryons sauvages et hétérozygotes (qui sont identiques) se différencient et continuent leur développement, alors que la plante homozygote pour la mutation sur le gène Atgcs1 reste au stade coeur et augmente de volume. La plante mutée ne se différencie absolument pas, son hypocotyle est très réduit, ses cotylédons et sa racine ne sont pas allongés. Les coupes réalisées au cours du développement de l'embryon chez la plante mutante montrent que l'albumen se cellularise normalement.
Les cellules paraissent plus grosses et moins nombreuses que celles de la plante sauvage d'un âge identique, surtout au niveau de la couche la plus externe, le protoderme. Chez l'embryon homozygote mature, on peut distinguer des faisceaux vasculaires dans l'hypocotyle réduit et un petit méristème apical. L'épiderme est très altéré, les cellules sont énormes et présentent des espaces " vides La radicule semble très peu développée, elle n'est absolument pas différenciée.
Une approche en microscopie électronique à transmission a permis de mieux visualiser la désorganisation des cellules du mutant homozygote.
Les observations ont été effectuées dans les cotylédons et dans le protoderme. Les corps protéiques, chez la plante sauvage, non mutée ont des structures organisées, circulaires et présentant des zones peu denses.
On peut en visualiser de 2 à 5 par cellules. Les corps lipidiques remplissent toute la cellule, un noyau peut être observé dans chaque cellule. Chez la plante mutante, les corps lipidiques ne sont pas altérés, ils sont présents en grand nombre et remplissent la quasi-totalité de la cellule. Les corps protéiques, par contre, sont altérés. Ils ne sont pas présents dans toutes les cellules, et lorsqu'on peut en observer un, il n'est pas circulaire et entoure généralement une vacuole. Dans chaque cellule se trouvent une ou plusieurs vacuoles, au contenu plus ou moins dense, ce qui ne s'observe jamais chez la plante non mutée sauvage.
<Desc/Clms Page number 41>
EXEMPLE 5: Analyse biochimique: mise en évidence de l'absence d'activité glucosidase 1 dans les graines de la plante mutée sur le gène Atgcs1.
5. 1. Matériels et Méthodes.
Les méthodes utilisées sont décrites dans Fichette-Lainé et al., (1998) Methods in Biotechnology 3 :271-290.
Electrophorèse des protéines
L'extraction et le transfert des protéines du gel d'électrophorèse sur une membrane de nitrocellulose (Schleicher & Schuell, BA 85,0,45 m) est effectué selon la technique décrite par Towbin et al. (1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 : Pendant l'électrophorèse, le matériel utilisé pour le transfert (membrane de nitrocellulose, papier Whatmann 3 MM, scotch brite) est équilibré 15 à 30 min dans le tampon de transfert (Tris 25 mM; glycine 120 mM ; méthanol 10%). A la fin de l'électrophorèse, la cassette de transfert est disposée dans une cuve de transfert contenant 600 ml du tampon décrit ci-dessus Un transfert satisfaisant des protéines du gel d'électrophorèse sur la membrane de nitrocellulose est obtenu en 2 h sous un champ électrophorétique de 10 V.cm-1. Un contrôle d'efficacité du transfert est réalisé par une coloration réversible de la membrane de nitrocellulose au rouge Ponceau S (1% (p/v) dans TCA 3%). La décoloration de la membrane de nitrocellulose après le traitement au rouge Ponceau S est obtenue après rinçage avec un tampon TBS (NaCI 500 mM; Tris-HCI 20 mM, pH 7,4). Toutes ces étapes de traitement de la membrane de nitrocellulose, appelée empreinte après le transfert, sont effectuées sous agitation douce à température ambiante.
L'extraction et le transfert des protéines du gel d'électrophorèse sur une membrane de nitrocellulose (Schleicher & Schuell, BA 85,0,45 m) est effectué selon la technique décrite par Towbin et al. (1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 : Pendant l'électrophorèse, le matériel utilisé pour le transfert (membrane de nitrocellulose, papier Whatmann 3 MM, scotch brite) est équilibré 15 à 30 min dans le tampon de transfert (Tris 25 mM; glycine 120 mM ; méthanol 10%). A la fin de l'électrophorèse, la cassette de transfert est disposée dans une cuve de transfert contenant 600 ml du tampon décrit ci-dessus Un transfert satisfaisant des protéines du gel d'électrophorèse sur la membrane de nitrocellulose est obtenu en 2 h sous un champ électrophorétique de 10 V.cm-1. Un contrôle d'efficacité du transfert est réalisé par une coloration réversible de la membrane de nitrocellulose au rouge Ponceau S (1% (p/v) dans TCA 3%). La décoloration de la membrane de nitrocellulose après le traitement au rouge Ponceau S est obtenue après rinçage avec un tampon TBS (NaCI 500 mM; Tris-HCI 20 mM, pH 7,4). Toutes ces étapes de traitement de la membrane de nitrocellulose, appelée empreinte après le transfert, sont effectuées sous agitation douce à température ambiante.
Immunodetection
Une fois la membrane équilibrée dans le TBS, les sites de couplage de la nitrocellulose encore disponibles après le transfert des protéines sont saturés par une incubation d'une heure dans une solution de saturation
Une fois la membrane équilibrée dans le TBS, les sites de couplage de la nitrocellulose encore disponibles après le transfert des protéines sont saturés par une incubation d'une heure dans une solution de saturation
<Desc/Clms Page number 42>
(gélatine 3% dissoute dans le tampon TBS). Après saturation de la membrane, l'immunodétection des protéines est réalisée. L'empreinte est incubée pendant 90 min en présence d'un immunserum polyclonal de lapin dilué au 1/1000ème dans une solution de gélatine à 1% (p/v) dans le tampon TBS. Après cette incubation, les anticorps non fixés sont éliminés par une série de 4 lavages de 15 min dans du tampon TTBS (Tampon TBS + 0.1 % Tween 20). L'empreinte est ensuite soumise à une incubation en présence d'un second anticorps couplé à la peroxydase de raifort (IgG de chèvre, antiIgG de lapin, couplée à la peroxydase de raifort, Bio-Rad). Ce second anticorps est dilué au 1/3000ème dans une solution de gélatine à 1% (p/v) dans le tampon TBS pendant 90 min. L'excès de second anticorps conjugué est éliminé par 4 lavages de 15 min dans du tampon TTBS. Le Tween 20 est éliminé à la fin du traitement par un lavage de 15 min de l'empreinte dans le tampon TBS. Les protéines reconnues par les immunoglobulines IgG de lapin sont révélées par incubation de la membrane dans un mélange contenant 30 mg de 4-chloro-1-naphtol (HRP color reagent, Bio-Rad) dissous dans 10 mL de méthanol et additionné de 50 ml de tampon TBS contenant 30 pL de H202 30%.
Affinodétection des protéines sur membrane par la concanavaline A.
La concanavaline A (ConA) est une lectine de graine de légumineuse Canavalia ensiformis qui reconnaît spécifiquement les résidus mannoses p- liés des glycannes oligomannosidiques associés aux protéines et également la peroxidase. Une fois la membrane équilibrée dans le TBS, les sites de couplage de la nitrocellulose encore disponibles après le transfert sont saturés par une incubation d'une heure minimum dans du tampon TTBS. La membrane est alors incubée pendant 90 min dans du tampon TTBS additionné de sels (CaCI2 1 mM; MgCI2 1 mM) permettant l'activation de la lectine et contenant 25 g.mL-1 de ConA (Sigma). Après cette incubation, la membrane est lavée par 4 bains de 15 min dans du TTBS complémenté en sels, afin d'éliminer la ConA non fixée ou fixée sur des sites non spécifiques. La membrane est ensuite incubée pendant 60 min dans du TTBS complémenté en sels en présence de 50 g.mL-1 de peroxydase de raifort.
<Desc/Clms Page number 43>
L'excès de peroxydase est éliminé par 4 lavages successifs de 15 min dans du TTBS complémenté en sels. Un lavage de l'empreinte dans du tampon TBS additionné de sels permet l'élimination du Tween 20. La révélation de l'activité peroxidase est réalisée comme décrit pour l'immunoétection.
5. 2. Résultats
L'analyse de la N-glycosylation des protéines des graines homozygotes a été réalisée et les résultats obtenus sont présentés à la figure 1.
L'analyse de la N-glycosylation des protéines des graines homozygotes a été réalisée et les résultats obtenus sont présentés à la figure 1.
La détection des précurseurs: les N-glycannes, a été réalisée par la concanavaline A : c'est une lectine qui se lie spécifiquement aux glycannes non matures. De nombreuses bandes supplémentaires apparaissent chez le mutant, il y a donc une forte accumulation des précurseurs. La détection des oligosaccharides complexes est réalisée à l'aide d'anticorps anti-xylose et anti-fucose ; toutes les bandes disparaissent chez le mutant, il n'y a aucun Nglycanne complexe. La plantée mutée est donc bien affectée dans la maturation des N-glycannes, au niveau de la glucosidase 1.
Les résultats ci-dessus illustrent bien que le mutant Atgcs1 est incapable de catalyser la réaction d'addition d'un résidu xylose en position p 1-2 ou d'un résidu fucose en position a 1-3 sur les glycannes des glycoprotéines qu'il produit.
De plus, le profil des glycoprotéines présentant les glycannes de type oligomannosidique (empreinte 4) est fortement modifié chez le mutant.
Exemple 6: Analyse des glycannes fixés sur les protéines synthétisées chez des plantes mutées sur le gène AtGCS1.
6. 1 Matériels et Méthodes Préparation des N-glycannes à partir des graines d'Arabidopsis thaliana :
Des extraits protéiques bruts ont été obtenus par broyage de 100mg de graines d'A. thaliana dans 10 mL de tampon 50 mM Hepes, pH 7,5 contenant 2 mM de bisulfite de sodium et 0,1 % de SDS. Le matériel insoluble a été éliminé par centrifugation puis les protéines ont été précipitées par addition de deux volumes d'éthanol à -20 C. Le culot a
Des extraits protéiques bruts ont été obtenus par broyage de 100mg de graines d'A. thaliana dans 10 mL de tampon 50 mM Hepes, pH 7,5 contenant 2 mM de bisulfite de sodium et 0,1 % de SDS. Le matériel insoluble a été éliminé par centrifugation puis les protéines ont été précipitées par addition de deux volumes d'éthanol à -20 C. Le culot a
<Desc/Clms Page number 44>
ensuite été chauffé pendant 3 min dans 2 mL de tampon Tris HCI 50 mM pH 7,5 contenant 0,1 % de SDS. Après refroidissement de la solution, 0,1 U d'Endo H a été ajouté et la solution a été incubée pendant 18 h à 37 C. Les N-glycannes ont été ensuite purifiés par élutions successives sur colonnes C18 (Bond Elut), d'AG 50W-X2 et de carbograph comme décrit précédemment dans la littérature (Bardor et al., 1999).
Chromatographie HPAE-PAD
Les chromatographies HPAE-PAD ont été réalisées sur un appareil Dionex DX500 équipé d'un système de pompage GP50, d'un détecteur ED40 et d'une colonne Carbopac PA1 (4,6x250 mm). Les N-glycannes ont été élués au moyen d'un gradient linéaire de 60 min allant de 0 à 200 mM d'acétate de sodium dans de la soude 100 mM.
Les chromatographies HPAE-PAD ont été réalisées sur un appareil Dionex DX500 équipé d'un système de pompage GP50, d'un détecteur ED40 et d'une colonne Carbopac PA1 (4,6x250 mm). Les N-glycannes ont été élués au moyen d'un gradient linéaire de 60 min allant de 0 à 200 mM d'acétate de sodium dans de la soude 100 mM.
Spectrométrie de masse MALDI-TOF
Les spectre de masse MALDI-TOF ont été enregistrés sur un appareil Micromass Tof spec E. Les spectres ont été réalisés en mode positif et réflectron avec un voltage d'accélération de 20 kV, une pression de 10-7 mbars dans la source et de 10-6 mbars dans l'analyseur. Le laser à azote a été réglé à 337 nm avec une durée d'impulsion de 4 ns. L'appareil a été calibré avec la substance P (1347,7 Da) et l'hormone adrénocorticotropique humaine (2465,2 Da). La solution contenant l'échantillon a été préparée à une concentration approximative de 10 pmole. L-1 dans l'eau. Deux !-IL de cette solution ont été dissous dans le même volume d'une solution de matrice obtenue par dissolution de 2 mg d'acide 5, 5-dihydroxybenzoïque dans 200 !-IL d'acétonitrile à 70% contenant 0,1 % de TFA. Le mélange échantillon matrice a ensuite été homogénéisé puis déposé sur la cible et séché sous vide.
Les spectre de masse MALDI-TOF ont été enregistrés sur un appareil Micromass Tof spec E. Les spectres ont été réalisés en mode positif et réflectron avec un voltage d'accélération de 20 kV, une pression de 10-7 mbars dans la source et de 10-6 mbars dans l'analyseur. Le laser à azote a été réglé à 337 nm avec une durée d'impulsion de 4 ns. L'appareil a été calibré avec la substance P (1347,7 Da) et l'hormone adrénocorticotropique humaine (2465,2 Da). La solution contenant l'échantillon a été préparée à une concentration approximative de 10 pmole. L-1 dans l'eau. Deux !-IL de cette solution ont été dissous dans le même volume d'une solution de matrice obtenue par dissolution de 2 mg d'acide 5, 5-dihydroxybenzoïque dans 200 !-IL d'acétonitrile à 70% contenant 0,1 % de TFA. Le mélange échantillon matrice a ensuite été homogénéisé puis déposé sur la cible et séché sous vide.
Abréviations : Endo H, endoglycosidase F/ HPAEC-PAD, High pH Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Détection/ MALDITOF, Matrix-Assisted Laser Desorption lonization-Time of Flight/
<Desc/Clms Page number 45>
6. 2 Résultats
Les N-glycannes ont été libérés des extraits protéiques de graines par traitement à l'Endo H. Cette endoglycosidase clive spécifiquement la liaison glycosidique entre les deux GIcNAc de l'unité chitobiose des Nglycannes oligomannosidiques. Le profil chromatographique HPAE-PAD des N-glycannes libérés des graines sauvages (Figure 2A) présente six pics majeurs. Ces pics ont été attribués aux structures Man5GIcNAc à MangGIcNAc (voir Tableau 1) par comparaison de leurs temps de rétention avec des structures standards comme précédemment décrit dans la littérature (Rayon et al., 1996). Ces structures oligomannosidiques ont été précédemment caractérisées à partir de plantes d'Arabidopsis sauvages par Rayon et al. (1999). Les structures de ces composés ont pu être confirmées par analyse en spectrométrie de masse MALDI-TOF (Figure 3A). Le spectre présente cinq ions (M+Na+) à m/z= 1054,1216, 1378,1540 et 1702 correspondant aux masses attendues pour les adduits sodiques des oligosaccharides Man5GlcNAc to MangGIcNAc.
Les N-glycannes ont été libérés des extraits protéiques de graines par traitement à l'Endo H. Cette endoglycosidase clive spécifiquement la liaison glycosidique entre les deux GIcNAc de l'unité chitobiose des Nglycannes oligomannosidiques. Le profil chromatographique HPAE-PAD des N-glycannes libérés des graines sauvages (Figure 2A) présente six pics majeurs. Ces pics ont été attribués aux structures Man5GIcNAc à MangGIcNAc (voir Tableau 1) par comparaison de leurs temps de rétention avec des structures standards comme précédemment décrit dans la littérature (Rayon et al., 1996). Ces structures oligomannosidiques ont été précédemment caractérisées à partir de plantes d'Arabidopsis sauvages par Rayon et al. (1999). Les structures de ces composés ont pu être confirmées par analyse en spectrométrie de masse MALDI-TOF (Figure 3A). Le spectre présente cinq ions (M+Na+) à m/z= 1054,1216, 1378,1540 et 1702 correspondant aux masses attendues pour les adduits sodiques des oligosaccharides Man5GlcNAc to MangGIcNAc.
Les N-glycannes associés aux protéines des graines mutantes ont été analysés selon le même principe à partir du mélange de graines homozygotes et hétérozygotes. Le profil HPAE-PAD (Figure 2B) montre un ensemble de pics entre 16 et 22 min, analogues à ceux détectés à partir des graines sauvages (Figure 2A). Ces pics ont été attribués aux N-glycannes oligomannosidiques Man5GlcNAc à MangGIcNAc. En addition des ces structures, un pic à 29 min a été détecté. La nature du ou des oligosaccharide(s) contenu (s) dans ce pic a d'abord été étudiée par comparaison de son temps de rétention en HPAE-PAD avec des composés de structures connues. Il a été établi (non illustré) que le pic élué à 29 min présente le même temps de rétention que la structure Glc3Man7GlcNAc (Tableau 1) isolée au laboratoire lors d'une précédente étude sur l'effet de la castanospermine, inhibiteur de l'a-glucosidase I, sur la maturation des Nglycannes dans des cultures cellulaires de sycomore (Lerouge et al., 1996).
Le spectre MALDI-TOF des N-glycannes isolés des graines mutantes (Figure 3B) montre également la présence de structures supplémentaires à celles identifiées à partir des graines sauvages. En addition des ions (M+Na+) à m/z= 1054, 1216, 1378,1540 et 1702 correspondant aux espèces
<Desc/Clms Page number 46>
Man5GIcNAc à Man9GlcNAc, deux ions à m/z= 1864 et 2026 ont été détectés. Ces ions moléculaires correspondent à des structures ayant un et deux hexoses supplémentaires. Afin de confirmer que ces deux ions sont attribuables au pic supplémentaire observé dans le profil présenté dans la figure 2B, ce pic a été collecté, désallé sur colonne carbograph (Parker et al., 1998) puis analysé en spectrométrie MALDI-TOF. Seuls les ions à m/z= 1864 et 2026 ont été détectés confirmant ainsi que le pic chromatographique à 29 min (Figure 2B) résulte de la coélution de deux oligosaccharides constitués d'un résidu N-acétylglucosamine et de respectivement dix et onze résidus hexose. Ces données nous permettent de proposer que chez les graines mutantes, deux oligosaccharides, non observés dans les graines sauvages, soient accumulés et présentent les structures Glc3Man7GlcNAc et Glc3Man8GlcNAc (Tableau 1). La première structure a précédemment été caractérisée à partir de cellules de sycomore après traitement par la castanospermine (Lerouge et al., 1996), la seconde structure porte un résidu mannose supplémentaire résultant probablement de l'action partielle de l'[alpha]- mannosidase 1 au niveau de l'appareil de Golgi.
<Desc/Clms Page number 47>
(Man al-2)Man al Man al (Man al-2)Man 1 3 Man 1- 4GlcNAc (Man O1-2Man OEl-2)Man 1 1 3 Man5GIcNAc to Man9GlcNAc Man al ,, 6 Man OEL Man0Cl Man 6 14GIcNAc GIcal-2Glc l-3Glc l-3Man l-2Man l-2Man 1 GIC3Man7GIcNAc Man al-2Man l Man 1 Man (XI Man 1-4GIcNAc Glc al-2Glc l-3GIc al-3Man al-2Man al-2Man 1 GIC3Man8GIcNAc Tableau I: Structures et désignations des oligosaccharides
<Desc/Clms Page number 48>
Références Bibliographiques #ALTSCHUL, S. F., Gish, W, Miller, W., Myers, E. W., and Lipman, D. 1990.
Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215,403-410.
*ALTSHUL S. F et al, (1997), Nucleic Acids Research, voi.25:33896-3402.
#AUSUBEL et al., (1989), Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and WLILEY Interscience, New-York.
# BAUSE, E. SCHWEDEN, J., GROSS, A. AND ORTHEN, B. (1989) Purification and characterization of trimming glucosidase 1 from pig liver.
Eur. J. Biochem. 183:661-669.
# BAUSE, E., ERKENS, R., SCHWEDEN, J. AND JAENIK, L. (1986) Purification and characterization of trimming glucosidase 1 from Saccharomyces cerevisiae. FEBS 206(2):206-212.
# BECHTOLD, N. ELLIS, J. PELLETIER , G. (1993). In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants, C. R. Acad. Sci. Paris, 316 : 1194-1199.# BOUCHEZ, D. CAMILLERI, C. CABOCHE, M. (1993). A binary vector based on Basta resistance for in planta transformation of Arabidopsis thaliana. C. R. Acad. Sci Paris. 316 : 1188-1193.# BEAUCAGE étal., (1981), Tetrahedron Lett., vol.22:1859-1862 # BROWN EL. et al., (1979) Methods Enzymol., 68 : 109-151.
# BEVAN et al., (1984) Nucleic Acids Research, 12: 8711-8721.
# BOUCHEZ et al., 1993, C. R. Acad. Sci. Paris, Science de la Vie/Life Sciences, 316:1188-1193.
<Desc/Clms Page number 49>
# BARDOR M., LOUTELIER-BOURHIS C., MARVIN L., CABANES-
MACHETEAU M, LANGE C., LEROUGE P. AND FAYE L. (1999)
Analysis of plant glycoproteins by Matrix-Assisted Laser Desorption onization Mass Spectrometry . Application to the N-glycosylation analysis of bean phytohemagglutinin. Plant Physiol. Biochem., 37,319-325.
MACHETEAU M, LANGE C., LEROUGE P. AND FAYE L. (1999)
Analysis of plant glycoproteins by Matrix-Assisted Laser Desorption onization Mass Spectrometry . Application to the N-glycosylation analysis of bean phytohemagglutinin. Plant Physiol. Biochem., 37,319-325.
# CHO R.J. et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.95 (7) :3752 # CORMACK B , VALDIVIA R.H. FALKOW S. 1996. Gene 173, 33-38.
# CHRISPEELS, M. ET FAYE, L. (1998) Rien ne sert de produire, il faut glycosyler. Biofutur, 184 : 53-57.# DEVIC, M. ALBERT, S. DELSENY, M., ROSCOE, J. (1997). Efficient PCR walking on plant genomic DNA. Plant Physiol. Biochem. 35 (4) : 331-339.
# FULLER S. A. et al (1996), Immunology in Current Protocols in Molecular Biology.
# JEFFERSON R.A., KAVANACH, T.A., and BEVAN , M. W. (1987). Embo J. 3901-3907.
# FICHETTE-LAINE étal., 1998, Methods in Biotechnology, 3#271-290 # GREEN et al. ,(1986) , Ann. Rev. Biochem., vo1.55: 569-597.
# GRIFFIN et al. (1989), Science, vol.245:967-971.
# GARCIA-CASADO, G. SANCHEZ-MONGE, R. CHRISPEELS, M.
ARMANTIA, A., SALCEDO, G. AND GOMEZ, L. (1996) Role of complex asparagine-linked glycans in the allergenicity of plant glycoprotein Glycobiology, 6 (4) 471-477.
. GOMORD, V., FITCHETTE-LAINE, A-C., DENMAT, L-A., MICHAUD, D.
AND FAYE, L. (1998) Production of Foreign Proteins in Tobacco Cell
<Desc/Clms Page number 50>
Suspension Culture. Methods in Biotechnology. Cunningam, C and Porter,
A (Eds) Humana Press Inc, Totwa, NJ. 3 : 15.
A (Eds) Humana Press Inc, Totwa, NJ. 3 : 15.
. HAMES B. D. and HIGGINS S.J., (1985), Nucleic Acid Hybridization: The Practical Approach , HANES and HIGGINS Ed., IRL Press, Oxford.
# HAQ, T., MANSON, H., CLEMENTS, J. AND ARNTZEN, C. (1995) Oral Immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants. Science, 268 (5211) : 714-716.
# HETTKAMP, H., LEGLER, G. AND BAUSE, E. (1984). Purification by affinity chromatography of glucosidase 1, an endoplasmic reticulum hydrolase involved in the processing of asparagine-linked oligosaccharides.
Eur. J. Biochem. 142(1): 85-90.
# HOHN AND PUCHTA, 1999, Gene Therapy in Plant, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 96 :8321-8323 # HOUBEN WEYL, (1974), In Methoder Organischen Chemie, E.Wunsch Ed. vol.15-I et 15-11, Thieme, Stuttgart.
# HORSCH étal., (1984).
# IZANT JJ, WEINTRAUB H., (1984), Cell, Vol.36 (4):1007-1015 . KOCH Y. (1977), Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol.74:488-491.
# KOHLER G. and MILSTEIN C., (1975) Nature, vol.256:495.
# KOZBOR et al. (1983), Hybridoma, vol.2 (1) : 7-16.
# KALZ-FÜLLER, B., BIEBERICH, E. AND BAUSE, E. (1995). Cloning and expression of glucosidase 1 from human hippocampus. Eur. J. Biochem 231 344-351.
# KHAN, F., Varma, G. and Vijay, I. (1999). Genomic organisation and promoter activity of glucosidase 1 gene. Glycobiology, 9 (8): 797-806.
<Desc/Clms Page number 51>
# LEROUGE, P., CABANES-MACHETEAU, M., RAYON, C., FISCHETTELAINE, A-C, GOMORD, V. AND FAYE, L. (1998) N-Glycoprotein biosynthesis in plants : recent developments and future trends. Plant Molecular Biology, 38 : 31-48.
# LEROUGE P., FITCHETTE-LAINE A. C., CHEKKAFI A., AVIDGOR V.
AND FAYE L. (1996). Castanospermine inhibits the processing of N- glycans in sycamore cells without affecting the sécrétion of glycoproteins.
Plant J., 10, 713-719.
# MARTINEAU et al. , JOHNS P. WINTER G.(1998), J. Mol. Biol., vol.280 (1):117-127.
# MERRIFIELD RB, (1965a), Nature, vol.207 (1996: 522-523) # MERRIFIELD R. B., (1965b), Science, vol. 150 (693): 178-185.
. MYLNE, J., and BOTELLA, J., R. (1998). Binary vectors for sense and antisense expression of Arabidopsis ESTs. Plant Molecular. Biology Reporter 16, p257-262.
# McELROY D., ZHANG W, CAO J, WU R (1990) Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation. Plant Cell 2, p 163-171.
# MANSFIELD, S. AND BRIARTY, L. 1991, Early embryogenesis in
Arabidopsis thaliana Il The Developing embryo ; Can. J. Biol., 69 : 461-
476.
Arabidopsis thaliana Il The Developing embryo ; Can. J. Biol., 69 : 461-
476.
# MURRAY ET AL. 1987, Lectin-specific targeting of lysosomal enzymes to reticuloendothelial cells. Methods Enzymol; 149 : 25-42.
# NARANG S. A. et al., (1979), Methods Enzymol., vol.68, 90-98.
<Desc/Clms Page number 52>
# ODELL JT, NAGY F. CHUA NH. (1985). Identification of DNA séquences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature 313, p. 810-812.
# PALACPAC, N., Yoshida, S. Sakai, H., Kimura, Y., Fujiyama, K. Yoshid, T. and Seki, T. (1999) Stable expression of human P-1,4- galactosyltransferase in plant cell modified N-linked glycosyltion patterns.
Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 96 : 4692-4697.# PACKER H. N., MARGARET A. L., JARDINE D. R., REDMOND J. W (1998) A general approach to desalting oligosaccharides released from glycoproteins, Glycoconjugate J., 15,563-570.
# PUKAZHENTHI, B., VARMA, G. AND VIJAY, I. (1993) Conserved structural features in glycoprotein processing glucosidase 1 from several tissues and species. Indian J Biochem Biophys. 30(6):333-40.
# ROSSI étal. (1991), Pharmacol. Ther., vol.5O:245-254 # RIDDER R. et al., (1995), Biotechnology (NY), vol.13 (3) : 255-260 ou encore des anticorps humanisés # REINMANN K. A. et al., (1997), Aids, Res. Hum. Retroviruses, vol.13 (11):933-943 # RAYON R., GOMORD V., FAYE L., LEROUGE P. (1996). N-glycosylation of phytohemagglutinin expressed in bean cotyledons or in transgenic tobacco plants, Plant Physiol. Biochem., 34,273-281.
# RAYON C., CABANES-MACHETEAU M., LOUTELIER-BOURHIS C.,
SALIOT-MAIRE I., LEMOINE J., REITER W. D., LEROUGE P. AND FAYE
L. (1999) Characterization of N-glycans from Arabidopsis thaliana.
SALIOT-MAIRE I., LEMOINE J., REITER W. D., LEROUGE P. AND FAYE
L. (1999) Characterization of N-glycans from Arabidopsis thaliana.
Application to a fucose-deficient mutant Plant Physiol., 119,725-733.
<Desc/Clms Page number 53>
# ROMANIOUK, A. AND VIJAY, I. (1997) Structure-function relashionships in glucosidase 1 amino-acids invoved in binding the substrate to the enzyme. Glycobiology. 7 (3) 399-404.
# SHAILUBHAI, K. PRATTA, M. AND VIJAY, I (1987). Purification and characterization of glucosidase 1 involved in N-linked glycoprotein processing in bovi:ne mammary gland. Biochem. J. 247 (3) : 555-562.
# SHAILUBHAI, K. PUKAZHENTI, B. SEXENA, E., VARMA, G. AND VIJAY, 1. (1991) Glucosidase 1, a transmembrane endoplasmic reticular glycoprotein with a luminal catalytic domain. J. Biol. Chem. 266 (25): 16587-93.# SAMBROOK J., FRITSCH E. F. and T. MANIATIS, (1989), Molecular Cloning- A Laboratory Manual 2ème ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NEW YORK.
# SCZAKIEL G. et al. (1995) Trends. Microbiol , vol.3 (6) :213-217.
# SANCHEZ-PESCADOR R., (1988), J. Clin Microbiol. , vol.26(10):1934, 1938.
# SCHUTZE, M., PETERSON, P., AND JACKSON, M. (1994) An N-terminal double arginine motif maintains type Il membrane proteins in the endoplasmic reticulum. EMBO Journal 13(7):1696-1705.
# SZUMILO, T. KAUSHAL, G. AND ELBEIN, A. (1986). Purification and properties of Glucosidase 1 from Mung Bean Seddlings. Archives of
Biochemistry and Biophysics (247) : 261-271.
Biochemistry and Biophysics (247) : 261-271.
# URDEA NS et al. (1988) , Nucleic Acids Research, vo1.11: 4937-4957.
# URDEA NS et al., (1991), Nucleic Acids Symp. Ser., vol.24:197-200.
# WEIL, J. H. BONNET, J. BOULANGER, Y., CHAMBON, P. DUBERTET, G. GAUTHERON, D. KEDINGER, C., LADZUNSKI, M., MONTREUIL, J.,
<Desc/Clms Page number 54>
PATTE, J. C., REBEL, G., ROSSIGNOL, J. M. ET WRIGHT, M. (1989) Biochimie Générale, 5ème édition. Eds Masson, PARIS.
# WABIKO H. et al., (1986), DBA, vol.5.(4). 305-314.
#WOO, S. -S, Jiang J., Gill, B.S., Paterson, A. H. and Wing, R. A. 1994.
Nue. Acid Res. 22, p 4922-4931.
# ZENG, Y-C. AND ELBEIN, A. (1998) Purification to homogeneity and properties of plant glucosidase I. Arch Biochem Biophys. 355(1) : 26-34.
# . ZENG ET AL, 1997 : ZENG Y, BANNON G, THOMAS V., RICE K.,
DRAKE R AND ELBEIN, A. (1997) Purification and Specificity of 1,2-
Xylosyltransferase, an Enzyme That Contributes to the Allergenicity of
Some Plant Proteins. J. Biol. Chem. 272 (50) : 31340-31347.
DRAKE R AND ELBEIN, A. (1997) Purification and Specificity of 1,2-
Xylosyltransferase, an Enzyme That Contributes to the Allergenicity of
Some Plant Proteins. J. Biol. Chem. 272 (50) : 31340-31347.
Claims (47)
1. Acide nucléique comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide codant pour une glucosidase de type 1 de séquence en acides aminés SEQ ID N 1, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
2. Acide nucléique selon la revendication 1, comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence nucléotidique SEQ ID N 2, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
3. Acide nucléique selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il s'agit de la séquence nucléotidique SEQ ID N 2 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire.
4. Acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3.
5. Acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
6. Acide nucléique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une sonde oligonucléotidique.
7. Acide nucléique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une amorce oligonucléotidique.
8. Acide nucléique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les polynucléotides de séquences SEQ ID N 3 à SEQ ID N 15.
9. Séquence nucléotidique antisens comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
10. Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5.
11. Vecteur recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est un vecteur d'expression fonctionnel dans une cellule hôte végétale.
12. Vecteur recombinant selon l'une des revendications 10 et 11, caractérisé en ce qu'il est un vecteur d'origine fongique, bactérienne ou virale.
<Desc/Clms Page number 56>
13. Cellule hôte transformée avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 et 9 ou avec un vecteur recombinant selon l'une des revendications 10 à 12.
14. Cellule hôte transformée selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule d'origine procaryote ou eucaryote.
15. Cellule hôte transformée selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule d'Agrobacterium tumefaciens.
16. Cellule hôte transformée selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule végétale.
17. Organisme multicellulaire végétal recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cellule hôte transformée selon l'une des revendications 13 à 16.
18. Plante transformée avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 et 9 ou un vecteur recombinant selon l'une des revendications 10 à 12.
19. Plante transformée comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 et 9 ou un vecteur recombinant selon l'une des revendications 10 à 12.
20. Procédé d'obtention d'une plante transformée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) obtention d'une cellule hôte transformée végétale selon l'une des revendications 13 ou 16; b) régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte transformée obtenue à l'étape a); c) sélection des plantes obtenues à l'étape b) ayant intégré un polynucléotide d'intérêt choisi parmi les acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 5 et 9.
21. Procédé d'obtention d'une plante transformée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) obtention d'une cellule hôte d'Agrobacterium tumefaciens transformée selon la revendication 15; b) transformation de la plante par infection avec des cellules d'Agrobactium tumefaciens obtenues à l'étape a); c) sélection des plantes ayant intégré un polynucléotide d'intérêt choisi parmi les acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 5 et 9.
<Desc/Clms Page number 57>
22. Procédé d'obtention d'une plante transformée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: a) transformer une cellule de plante avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 et 9 ou un vecteur recombinant selon l'une des revendications 10 à 12; b) régénérer une plante entière à partir des cellules de plantes recombinantes obtenues à l'étape a); c) sélectionner les plantes ayant intégré l'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 et 9 ou le vecteur recombinant selon l'une des revendications 10 à 12.
23. Procédé d'obtention d'une plante transformée selon l'une des revendications 20 à 22, caractérisé en ce qu'il comporte en outre les étapes de: d) croisement entre elles de deux plantes transformées telles qu'obtenues à l'étape c); e) sélection des plantes hétérozygotes pour l'acide nucléique d'intérêt.
24. Procédé d'obtention d'une plante transformée selon l'une des revendications 20 à 22, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes de: d) croisement d'une plante transformée obtenue à l'étape c) avec une plante de la même espèce ; e) sélection des plantes issues du croisement de l'étape d) ayant conservé l'acide nucléique d'intérêt.
25. Plante transformée telle qu'obtenue selon l'une quelconque des revendications 20 à 24.
26. Semence d'une plante transformée selon l'une quelconque des revendications 18,19 et 25.
27. Semence de plante dont une partie ou la totalité des cellules constitutives comprennent un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 et 9.
28. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5 pour l'expression in vitro ou in vivo d'une glucosidase # végétale.
<Desc/Clms Page number 58>
29. Utilisation selon la revendication 28, caractérisée en ce qu'elle implique une expression in vivo chez une plante transformée avec un tel acide nucléique.
30. Utilisation d'une séquence nucléotidique selon la revendication 9, ou d'un vecteur recombinant comprenant une séquence nucléotidique selon la revendication 9, pour inhiber ou pour bloquer l'expression du gène codant pour la glucosidase # d'Arabidopsis thaliana.
31. Procédé de détection d'un acide nucléique constitutif de l'ARN messager, de l'ADNc ou de l'ADN génomique du gène de la glucosidase 1 d'Arabidopsis thaliana dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à- a) mettre en contact une sonde ou une pluralité de sondes selon la revendication 6 avec l'acide nucléique susceptible d'être contenu dans l'échantillon; b) détecter l'hybride éventuellement formé entre l'acide nucléique de l'échantillon et la ou les sondes.
32 Kit ou nécessaire de détection d'un acide nucléique constitutif de l'ARN messager, de l'ADNc ou de l'ADN génomique du gène de la glucosidase 1 d'Arabidopsis thaliana dans un échantillon, comprenant: a) une sonde ou une pluralité de sondes selon la revendication 6; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
33. Procédé pour amplifier un acide nucléique constitutif de l'ARN messager, de l'ADNc ou de l'ADN génomique du gène de la glucosidase 1 d'Arabidopsis thaliana dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact un couple d'amorces selon l'une des revendications 7 et 8 avec l'acide nucléique susceptible d'être contenu dans l'échantillon; b) réaliser au moins un cycle d'amplification de l'acide nucléique contenu dans l'échantillon; c) détecter l'acide nucléique éventuellement amplifié.
34. Kit ou nécessaire pour l'amplification d'un acide nucléique constitutif de l'ARN messager, de l'ADNc ou de l'ADN génomique du gène de la glucosidase 1 d'Arabidopsis thaliana dans un échantillon, comprenant :
<Desc/Clms Page number 59>
a) un couple d'amorces selon l'une des revendications 7 ou 8; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réalisation de la réaction d'amplification
35. Polypeptide codé par un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
36. Polypeptide selon la revendication 35, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence en acides aminés SEQ ID N 1 ou un polypeptide ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N 1, ou un fragment peptidique de ce polypeptide.
37. Polypeptide comprenant des modifications d'acides aminés de 1,2 , 3,4 , 5,10 à 20 substitutions, additions ou délétions d'au moins un acide aminé par rapport à la séquence d'acides aminés d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 ou 36.
38. Polypeptide comprenant au moins 7 acides aminés consécutifs d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 à 37.
39. Acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 35 à 38.
40. Anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 35 à 38.
41. Procédé pour détecter la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 à 38 dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact l'échantillon avec un anticorps selon la revendication 40; b) détecter le complexe antigène/anticorps éventuellement formé.
42. Kit ou nécessaire de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 à 38 dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend : a) un anticorps selon la revendication 40; b) le cas échéant, un réactif nécessaire à la détection du complexe antigène/anticorps éventuellement formé.
43. Kit ou nécessaire de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 à 38 dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend: a) un anticorps selon la revendication 40;
<Desc/Clms Page number 60>
b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la détection des complexes antigène/anticorps éventuellement formés.
44. Protéine à glycosylation modifiée, caractérisée en ce qu'elle est produite par une plante transformée selon l'une des revendications 18,19 et 25, ou par une cellule hôte transformée selon l'une des revendications 13 zr 16.
45. Protéine à glycosylation modifiée, caractérisée en ce qu'elle est contenue dans une semence de plante transformée selon l'une des revendications 26 ou 27.
46. Protéine à glycosylation modifiée selon l'une des revendications 44 et 45, caractérisée en ce qu'elle est une protéine recombinante.
47. Protéine à glycosylation modifiée selon la revendication 46, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un antigène ou d'un immunogène.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0005317A FR2808286B1 (fr) | 2000-04-26 | 2000-04-26 | Nouvelle glucosidase i de plante et son application a la production de proteines recombinantes a glycosylation modifiee |
| EP01929701A EP1278872A1 (fr) | 2000-04-26 | 2001-04-25 | Nouvelle glucosidase i de plante et son application a la production de proteines recombinantes a glycosylation modifiee |
| US10/257,967 US20050177891A1 (en) | 2000-04-26 | 2001-04-25 | Novel plant glucosidase I and use thereof for producing recombinant proteins with modified glycosylation |
| PCT/FR2001/001266 WO2001081591A1 (fr) | 2000-04-26 | 2001-04-25 | Nouvelle glucosidase i de plante et son application a la production de proteines recombinantes a glycosylation modifiee |
| CA002409706A CA2409706A1 (fr) | 2000-04-26 | 2001-04-25 | Nouvelle glucosidase i de plante et son application a la production de proteines recombinantes a glycosylation modifiee |
| AU2001256404A AU2001256404A1 (en) | 2000-04-26 | 2001-04-25 | Novel plant glucosidase i and use thereof for producing recombinant proteins with modified glycosylation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0005317A FR2808286B1 (fr) | 2000-04-26 | 2000-04-26 | Nouvelle glucosidase i de plante et son application a la production de proteines recombinantes a glycosylation modifiee |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2808286A1 true FR2808286A1 (fr) | 2001-11-02 |
| FR2808286B1 FR2808286B1 (fr) | 2004-12-17 |
Family
ID=8849613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR0005317A Expired - Fee Related FR2808286B1 (fr) | 2000-04-26 | 2000-04-26 | Nouvelle glucosidase i de plante et son application a la production de proteines recombinantes a glycosylation modifiee |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20050177891A1 (fr) |
| EP (1) | EP1278872A1 (fr) |
| AU (1) | AU2001256404A1 (fr) |
| CA (1) | CA2409706A1 (fr) |
| FR (1) | FR2808286B1 (fr) |
| WO (1) | WO2001081591A1 (fr) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2264177B1 (fr) | 1998-12-09 | 2015-09-30 | Phyton Holdings, LLC | Glycoproteines avec glycosilation humaine |
| ATE365219T1 (de) | 1999-10-26 | 2007-07-15 | Plant Res Int Bv | Glykolisierung des säugetiertyps in pflanzen |
| IL156879A0 (en) | 2001-01-19 | 2004-02-08 | Dow Chemical Co | Method for secretory production of glycoprotein having human-type sugar chain using plant cell |
| US7897842B2 (en) | 2002-03-19 | 2011-03-01 | Plant Research International B.V. | GnTIII expression in plants |
| CA2923247A1 (fr) | 2002-03-19 | 2003-09-25 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Optimisation du traitement du glycane chez les plantes |
| AR042145A1 (es) | 2002-11-27 | 2005-06-08 | Dow Agrociences Llc | Produccion de inmunoglobulinas en plantas con una fucocilacion reducida |
| KR20090079258A (ko) * | 2006-11-08 | 2009-07-21 | 상뜨르 나쇼날 드 라 러쉐르쉬 샹띠피끄 (쎄엔알에스) | 타겟팅 발현 및 재조합 폴리펩타이드의 번역 후 변형 조절을 위한 서열 세트 |
| MX341988B (es) | 2007-04-17 | 2016-09-08 | Stichting Dienst Landbouwkunding Onderzoek | Glicosilacion tipo mamifera en plantas para la expresion de glicosil-transferasas no mamiferas. |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999029879A1 (fr) * | 1997-12-09 | 1999-06-17 | Antje Von Schaewen | SEQUENCES DE GntI VEGETALES ET UTILISATION DE CELLES-CI POUR L'OBTENTION DE PLANTES NE PRESENTANT PAS UNE ACTIVITE DE N-ACETYLGLUCOSYLAMINYLTRANSFERASE I GnTI OU BIEN SEULEMENT UNE TELLE ACTIVITE REDUITE |
| WO2000034490A1 (fr) * | 1998-12-09 | 2000-06-15 | Tatsuji Seki | Procede de production de glycoproteines a glycosilation de type humain |
| EP1033405A2 (fr) * | 1999-02-25 | 2000-09-06 | Ceres Incorporated | Fragments d'ADN avec des séquences déterminées et polypeptides encodées par lesdits fragments |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5565340A (en) * | 1995-01-27 | 1996-10-15 | Clontech Laboratories, Inc. | Method for suppressing DNA fragment amplification during PCR |
| US6455248B1 (en) * | 1996-05-20 | 2002-09-24 | Miami University | Reagents and kits for detecting fungal pathogens in a biological sample |
| GB9914210D0 (en) * | 1999-06-17 | 1999-08-18 | Danisco | Promoter |
| AU6551300A (en) * | 1999-08-04 | 2001-03-05 | University Of British Columbia, The | Regulation of embryonic transcription in plants |
-
2000
- 2000-04-26 FR FR0005317A patent/FR2808286B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-04-25 EP EP01929701A patent/EP1278872A1/fr not_active Withdrawn
- 2001-04-25 AU AU2001256404A patent/AU2001256404A1/en not_active Abandoned
- 2001-04-25 CA CA002409706A patent/CA2409706A1/fr not_active Abandoned
- 2001-04-25 US US10/257,967 patent/US20050177891A1/en not_active Abandoned
- 2001-04-25 WO PCT/FR2001/001266 patent/WO2001081591A1/fr not_active Application Discontinuation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999029879A1 (fr) * | 1997-12-09 | 1999-06-17 | Antje Von Schaewen | SEQUENCES DE GntI VEGETALES ET UTILISATION DE CELLES-CI POUR L'OBTENTION DE PLANTES NE PRESENTANT PAS UNE ACTIVITE DE N-ACETYLGLUCOSYLAMINYLTRANSFERASE I GnTI OU BIEN SEULEMENT UNE TELLE ACTIVITE REDUITE |
| WO2000034490A1 (fr) * | 1998-12-09 | 2000-06-15 | Tatsuji Seki | Procede de production de glycoproteines a glycosilation de type humain |
| EP1033405A2 (fr) * | 1999-02-25 | 2000-09-06 | Ceres Incorporated | Fragments d'ADN avec des séquences déterminées et polypeptides encodées par lesdits fragments |
Non-Patent Citations (14)
| Title |
|---|
| CHRISPEELS, M.J., ET AL.: "Rien ne sert de produire, il faut glycosyler", BIOFUTUR, vol. 184, December 1998 (1998-12-01), pages 53 - 57, XP002157284 * |
| DATABASE EMBL 16 March 1998 (1998-03-16), THEOLOGIS A.: "Arabidopsis thaliana chromosome 1 BAC T1F15 sequence, complete sequence.", XP002157289 * |
| DATABASE EMBL 20 October 1999 (1999-10-20), SHOEMAKER, R., ET AL.: "sd86e12.y1 Gm-c1009 Glycine max cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID:Gm-c1009-1319 5' similar to TR:O64796 O64796 T1F15.4 PROTEIN. ;, mRNA sequence.", XP002157294 * |
| DATABASE EMBL 6 October 1999 (1999-10-06), LIN, X., ET AL.: "Arabidopsis thaliana chromosome 1 BAC F12B7 genomic sequence, complete sequence.", XP002157288 * |
| DATABASE EMBL 7 August 1997 (1997-08-07), FEDERSPIEL, N.A., ET AL.: "Arabidopsis thaliana chromosome I BAC F3I6 genomic sequence, complete sequence.", XP002157292 * |
| DATABASE EMBL 9 September 1999 (1999-09-09), CHEN, J., ET AL.: "701555287 A. thaliana, Columbia Col-0, rosette-3 Arabidopsis thaliana cDNA clone 701555287, mRNA sequence.", XP002157291 * |
| DATABASE TREMBL 1 August 1998 (1998-08-01), VYSOTSKAIA V.S.: "T1F15.4 PROTEIN.", XP002157290 * |
| DATABASE TREMBL 1 June 1998 (1998-06-01), FEDERSPIEL, N.A., ET AL.: "F3I6.26 PROTEIN.", XP002157293 * |
| DATABASE TREMBL 1 May 2000 (2000-05-01), LIN X.: "PUTATIVE GLUCOSIDASE I." * |
| GOMEZ L AND CHRISPEELS M J: "Complementation of an Arabidopsis thaliana mutant that lacks complex asparagine-linked glycans with the human cDNA encoding N-acetylglucosaminyltransferase I", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA,NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON,US, vol. 91, March 1994 (1994-03-01), pages 1829 - 1833, XP002100921, ISSN: 0027-8424 * |
| LEROUGE PATRICE ET AL: "N-glycoprotein biosynthesis in plants: Recent developments and future trends.", PLANT MOLECULAR BIOLOGY, vol. 38, no. 1-2, 1998, pages 31 - 48, XP002157287, ISSN: 0167-4412 * |
| LEROUGE PATRICE ET AL: "N-linked oligosaccharide processing is not necessary for glycoprotein secretion in plants.", PLANT JOURNAL, vol. 10, no. 4, 1996, pages 713 - 719, XP002157285, ISSN: 0960-7412 * |
| PALACPAC NQ ET AL: "Stable expression of human beta1,4-galactosyltransferase in plant cells difies N-linked glycosylation patterns", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA,NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON,US, vol. 96, no. 8, 13 April 1999 (1999-04-13), pages 4692 - 4697, XP002133652, ISSN: 0027-8424 * |
| ZENG Y -C ET AL: "Purification to homogeneity and properties of plant glucosidase I.", ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS, vol. 355, no. 1, 1 July 1998 (1998-07-01), pages 26 - 34, XP002157286, ISSN: 0003-9861 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20050177891A1 (en) | 2005-08-11 |
| CA2409706A1 (fr) | 2001-11-01 |
| AU2001256404A1 (en) | 2001-11-07 |
| FR2808286B1 (fr) | 2004-12-17 |
| EP1278872A1 (fr) | 2003-01-29 |
| WO2001081591A1 (fr) | 2001-11-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gillmor et al. | α-Glucosidase I is required for cellulose biosynthesis and morphogenesis in Arabidopsis | |
| Moneger et al. | Nuclear restoration of cytoplasmic male sterility in sunflower is associated with the tissue‐specific regulation of a novel mitochondrial gene. | |
| Marraccini et al. | Biochemical and molecular characterization of α-D-galactosidase from coffee beans | |
| CA2750997C (fr) | Polynucleotide comprenant des sequences de gliadines de ble et son utilisation pour le silencage par arni | |
| FR2744134A1 (fr) | Proteines de reserve de plantes enrichies en acides amines, notamment alpha-zeine de mais enrichie en lysine plantes exprimant ces proteines | |
| WO1998005785A1 (fr) | Phytases de plantes et applications biotechnologiques | |
| JP2002509696A (ja) | 植物ＧｎｔＩ配列、及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）活性が減少または欠如した植物の産生のためにそれを用いる方法 | |
| PL205710B1 (pl) | Sposoby otrzymywania rekombinowanych glikoprotein, sposób otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza lub roślin z wytłumioną lub całkowicie wyłączoną produkcją GlcNAc-α1,3-fukozylotransferazy, sposób otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza lub roślin, rekombinowane komórki roślinne, rekombinowane rośliny, sposób otrzymywania rekombinowanych komórek roślinnych z zablokowaną ekspresją GlcNAc-α1,3-fukozylotransferazy, sposoby otrzymywania rekombinowanych ludzkich glikoprotein, zwłaszcza do zastosowań medycznych oraz sposób selekcjonowania cząsteczek DNA | |
| FR2808286A1 (fr) | Nouvelle glucosidase i de plante et son application a la production de proteines recombinantes a glycosylation modifiee | |
| Ambikapathy et al. | The role of proline in osmoregulation in Phytophthora nicotianae | |
| FR2911608A1 (fr) | Nouvelles compositions vaccinales anti paludique et ses utilisations. | |
| JPH10502521A (ja) | 植物アラビノガラクタン蛋白質（ａｇｐ）遺伝子 | |
| FR2774379A1 (fr) | Procede de production, par des cellules vegetales, d'alpha 1-antitrypsine et de ses variantes, et produits contenant l'alpha-antitrypsine ainsi obtenue | |
| JP2004535789A (ja) | デンプン分解酵素をコードする核酸分子 | |
| FR2913694A1 (fr) | Elements regulateurs d'expression | |
| US20210010014A1 (en) | Peanut with reduced allergen levels | |
| WO2004005334A2 (fr) | Molecule d'acide nucleique codant une preproproteine d'allergene d'un acarien du genre dermatophagoides ou euroglyphus et son utilisation pour la production dudit allergene dans les plantes | |
| WO2001025439A1 (fr) | Promoteurs specifiques de l'albumen des graines de vegetaux | |
| JP4767420B2 (ja) | 目的の組換えポリペプチドを含有するデンプン顆粒、それを得る方法、及びその用途 | |
| WO2002036788A2 (fr) | Acides nucleiques et polypeptides exprimes specifiquement dans les cellules de la zone de transfert d'un grain de plante et leurs applications | |
| WO1995020046A1 (fr) | Aconitases vegetales et acides nucleiques codant pour ces aconitases | |
| EP1138771A1 (fr) | Endo-Mannanase de café | |
| JP3848183B2 (ja) | ｆｌｏ２変異の形質が導入された低アレルゲン植物およびその作出方法 | |
| Coimbra | Three Decades of Advances in Arabinogalactan-Protein Biosynthesis | |
| WO2003008585A2 (fr) | Acides nucleiques codant pour un polypeptide isum2a et utilisation de ces acides nucleiques pour l'obtention de plantes transformees produisant des graines affectees dans le developpement du germe |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20061230 |