WO1995020046A1 - Aconitases vegetales et acides nucleiques codant pour ces aconitases - Google Patents

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WO1995020046A1
WO1995020046A1 PCT/EP1995/000263 EP9500263W WO9520046A1 WO 1995020046 A1 WO1995020046 A1 WO 1995020046A1 EP 9500263 W EP9500263 W EP 9500263W WO 9520046 A1 WO9520046 A1 WO 9520046A1
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aconitase
protein
gene
plant
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PCT/EP1995/000263
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Pierre Peyret
Monique Alric
Pascual Perez
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Biocem
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • the invention relates to plant aconitase, nucleic acid sequences encoding aconitase, and the aconitase gene and fragments derived therefrom.
  • the invention also relates to the promoter regions of the aconitase gene and of chimeric genes comprising this promoter region.
  • the invention relates to a method for modifying the metabolism of a plant by the introduction into the plant of a nucleic acid sequence capable of modifying the natural expression of the aconitase gene.
  • Aconitase (EC4.2.I.3.), Also known as aconitate hydratase or citrate (isocitrate) hydro-lyase, is a protein with an iron-sulfur center catalyzing the reversible interconversion reaction of citrate into isocitrate via cis-aconitate as an intermediate.
  • IRE-BP Iron Responsive Element - Binding Protein
  • mitochondrial aconitases and cytosolics could be purified and cloned.
  • pig mitochondrial aconitase Zheng et al. 1990, J. Biol. Che., 265: 2814-2821
  • yeast yeast
  • 8998-9002 has been cloned, as well than human cytosolic aconitase (Rouault et al., 1990, PNAS, 87: 7958-7962) and bacterial (Promodrou et al., 1991, J. Gen. Microbiol., 137: 2505-2515).
  • cytosolic aconitase and mitochondrial aconitase are encoded by two different genes and are easily separable, for example by chromatography on DEAE - cellulose.
  • the mitochondrial potato aconitase could be purified from mitochondria of tubers (Verniquet et al., 1991, Bioche. J., 276: 643-948). It is a monomeric protein with a molecular weight of about 90KDa, of an acidic nature, similar to bacterial and yeast aconitases.
  • the present invention relates to the cloning of the plant aconitase cDNA and the characterization of the gene, including the promoter region.
  • An inter-specific hybridisation that is to say, the screening of a cDNA library of Arabidopsis thaliana with a probe from 1'ADNc melon 1'aconitase, _ therefore been 'completed.
  • the inter-specific hybridization conditions were specially designed for this stage of cloning because the homology between the sequences was not known. An entire cDNA clone of Arabidopsis thaliana could thus be identified.
  • This cDNA was then used as a probe to screen a genomic library of Arabidopsis thaliana and allowed the identification of the gene, including the promoter region. From this gene, the inventors have identified a pair of primers which could have been used in other species, in particular in corn, in an amplification reaction, allowing the identification of the gene for aconitase from other species.
  • Arabidopsis thaliana aconitase has been shown to have strong homology (70%) in protein with human IRE-BP, and with aconitase in other plant species (around 90%) . Plant proteins are closer to animal cytosolic aconitases than animal mitochondrial aconitases.
  • aconitase in particular cytosolic aconitase, plays the role of an IRE-BP and allows post-transcriptional regulation in the metabolism of metal ions such as iron, or that it plays the role of RNA-BP, which binds to a structure similar or similar to animal IRE, which would intervene in post-transcriptional regulation of the metabolism of the plant or seed;
  • This gene could therefore code for the two protein forms, its expression being optionally directed by two promoters; to hypothesize that the mitochondrial form of aconitase differs from the cytosolic form essentially by the presence, at the NH 2 end, of a mitochondrial signal peptide.
  • the protein is extremely conserved (90% homology) between the two types of plants, and presents regions specific to plants, and others conserved, among all the species studied, including animals and microorganisms.
  • the genomic organization is identical in monocotyledons and dicots.
  • the object of the present invention is a protein having an enzymatic activity of aconitase. More particularly, the invention relates to a protein having an enzymatic aconitase activity characterized in that it comprises either i) the amino acid sequence illustrated in FIG. 1 or a sequence having at least 75% homology with this- ci, either: ii) a variant of the sequence i) comprising a deletion of up to approximately 40 amino acids at the NH 2 end.
  • an aconitase enzymatic activity is defined as being the capacity to catalyze the reaction of isomerization of citrate into iso-citrate via cis-aconitate. This activity can be measured by the method described by Rose and O'Connel (J. Biol. Chem.,
  • NADP NADP-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N
  • Another method for assaying the aconitase enzyme activity is that described by Kennedy et al. (J. Biol. Chem., 258: 11098-11105, 1983) which makes it possible to follow at 240 nm the appearance of the cis-aconitate from the isocitrate.
  • the enzymatic reaction takes place at 25 ° C in a 50mM phosphate buffer at pH 6 with 50mM isocitrate as substrate.
  • the molar extinction coefficient of cis-aconitate is given as being equal to 3.6 mM ⁇ 1 , an enzymatic unit (U) corresponding to the formation of one micro-mole of cis-aconitate per minute.
  • This assay easy to to implement, is used to determine the enzymatic constants of the aconitase and to follow its purification.
  • the protein of the invention in addition to its aconitase activity, can also exhibit an activity of IRE-BP, that is to say, is capable of binding to mRNAs having a secondary structure close to that of 1 » Iron-responsive element (IRE) animal.
  • IRE Iron-responsive element
  • the protein of the invention having an enzymatic activity of aconitase, can be that whose amino acid sequence is illustrated in Figure 1, which represents the aconitase of Arabidopsis thaliana.
  • the invention also encompasses proteins having at least 75% homology with the sequence illustrated in Figure 1 and having aconitase activity.
  • the percentage of homology between two amino acid sequences is calculated as being the number of identical amino acids plus the number of similar amino acids in the alignment of the two sequences, divided by the length of the sequences between two given positions. If, between the two given positions, the two sequences do not have the same length, the percentage of homology is the number of identical and similar amino acids, divided by the length of the longest sequence.
  • Similar amino acids are known in the art, see for example R.F. Feng, M.S. Jobson and R.F. Doolittle, 1985, J. Mol. Evol., 21: 112-115. They are normally considered to be those who, within a permutation matrix, have a positive substitution coefficient.
  • the homologous proteins of the invention have at least 80, and more particularly at least 85, for example 90 or 95% homology, and preferably at least 80% for example 85% or 90% identity, with the one illustrated in figure 1.
  • melon aconitases purified by the inventors from melon seeds.
  • the two forms seem to have the same amino acid sequence in common.
  • the partial amino acid sequence is illustrated in Figure 2. It shows 86.5% identity with that of Arabidopsis thaliana (91.8% homology).
  • the two forms of melon aconitase purified by the inventors, according to the method described in the examples below, have an apparent molecular weight estimated in polyacrylamide gel under denaturing conditions close to 97KDa.
  • the isoelectric points of these two proteins (called “Acol” and "AcoII”) are estimated at 5.2 and 5.0 respectively.
  • the proteins having at least 75% homology with that of FIG. 1 also include the aconitase of other plant species, in particular the Angiosperms.
  • Mention may in particular be made of dicotyledon aconitase comprising legumes, crucifers, solanaceae, cucurbits, chenopodiaceae, umbelliferae, sunflowers, soybeans.
  • Cucurbits and species of the genus Brassica, for example B. napus, B. oleracea etc. are particularly preferred.
  • Mention may also be made of the aconitase of monocotyledons comprising cereals such as wheat, corn, barley, triticale and rice.
  • proteins of the invention can also be defined as proteins or protein sequences comprising at least one of the following protein sequences, or a sequence having at least 60%, and preferably at least 70% or 80% of homology with one of these sequences, these sequences being specific to plant aconitases:
  • PLKEMKADWHSCLDNRV III AVPKEAQSKAVEFNFNGTTAQLR
  • proteins of the invention also contain several highly conserved areas within all of the species studied. These zones will be called in the following "regions phylogenetically conserved". These are amino acid sequences having a length of at least 7 amino acids and being conserved with at least 75% homology (approximately 60% identity), and often at least 80% homology, in plants, animals and microorganisms. As an example of this type of region, the following sequences can be cited (the numbers in parentheses being the amino acids of A. thaliana, numbered according to FIG. 2):
  • the invention also encompasses variants of the sequence illustrated in FIG. 1 and those having at least 75% homology with it, the variants comprising a deletion of up to 40 amino acids approximately at the NH 2 end.
  • This deletion does not affect the enzyme aconitase activity of the protein. From the physiological point of view, this deletion corresponds either to the elimination of the mitochondrial signal peptide or to the elimination of the part of the sequence which differentiates the mitochondrial form from the cytosolic form.
  • the deletion ranges from amino acid 1 to amino acid 30 approximately.
  • the deletion at the NH 2 end preferably extends from amino acid 1 to amino acid 27 (numbering according to Figure 1) or even from amino acid 1 to acid amino 29.
  • the inventors demonstrate that the mitochondrial form of 1 • aconitase of Arabidopsis thaliana starts with amino acid 28 (Ser Ser Met ). This means that amino acids 1 to 27 probably correspond to the mitochondrial signal peptide.
  • the cytosolic form of Arabidopsis thaliana aconitase probably starts at amino acid 30 (Met).
  • the proteins having an aconitase activity and comprising the sequence of FIG. 1, or a sequence having at least 70% or 75% homology with the latter, or alternatively the variants comprising an NH 2 deletion -terminal will be called "the proteins of the invention”.
  • the invention also relates to protein fragments, or "amino acid chains", comprising at least 6 amino acids of the protein of the invention, and preferably at least 8 or at least 10 amino acids.
  • the maximum length of the fragments of the invention corresponds to the length of the whole protein minus an amino acid.
  • the fragments of the invention have a length of between 10 and 900 amino acids, for example between 20 and 800, or between 30 and 500 amino acids, in particular 50, 200, 300, 400, etc. amino acids.
  • Protein fragments of considerable length may optionally exhibit an enzymatic activity of aconitase.
  • the fragments can therefore be peptides, polypeptides or proteins. These protein fragments can be recognized by antibodies capable of recognizing the whole protein, the fragments therefore having an immunological homology with the "mother" protein.
  • the fragments have a length of between 6 and 40 amino acids and have, over their entire length, homology of at least 90%, and preferably at least 90% of identity, with the corresponding part of the protein of figure 1.
  • the expression "the corresponding part” means the part of the protein illustrated in figure 1 with which the alignment is made to calculate the homology.
  • These fragments are typically between 8 and 30 amino acids in length.
  • the fragments of the invention may be less than 40 amino acids in length and have only 60% homology with the corresponding part of the protein of FIG. 1. This is the case when it comes to fragments corresponding to plant specific protein regions.
  • plant specific means an amino acid sequence having a length of at least 6 and preferably at least 8 amino acids, having less than 40%, and often less than 30% d homology with the corresponding sequences in mammals and in unicellular organisms. Within the plant kingdom, these regions are preserved with a homology of at least 60%, typically at least 80%.
  • the regions specific to plant aconitases include the following sequences:
  • the fragment can consist of a fragment of the NH 2 end of the protein illustrated in FIG. 1, the expression "NH 2 end", meaning the part of the protein extending from amino acid 1 to amino acid 40, for example between 1 and 30.
  • the fragment can also consist of a subfragment of a sequence having a length of approximately 40 amino acids and having at least 60% d homology with the NH 2 end of the protein illustrated in FIG. 1.
  • the NH 2 -terminal fragment normally has a length of between 6 and 40 amino acids, for Example 30.
  • these fragments have at least 70%, and more particularly at least 80% homology, with amino acids 1 to 40 of that illustrated in FIG. 1.
  • the NH 2 end probably corresponds to the signal peptide mitochondrial responsible for the transport of aconitase in the mitochondria.
  • the fragments according to this aspect of the invention therefore constitute signal peptides and can be used, for example in the production of fusion proteins to ensure transport in the mitochondria.
  • the protein fragments have a length greater than 40 amino acids, for example 40 to 100, and have over their entire length at least 75%, and preferably at least 80 or 90% of homology. with the corresponding part of the protein in FIG. 1.
  • this type of fragment mention may be made of the NH 2 terminal half of the protein, the COOH half terminal or even the central part.
  • nucleic acid sequences of the invention can comprise, in addition to the fragment derived from the plant aconitase described above, other regions exhibiting no relationship with the aconitase.
  • This variant includes fusion proteins and other "hybrid" proteins.
  • the proteins and protein fragments of the invention can be obtained by purification from the plant, using the experimental protocol described in the examples below, optionally followed by cleavage of the protein to obtain fragments. They can also be produced recombinantly after insertion into a competent cellular host of an appropriate nucleic acid sequence followed by purification of the protein thus produced. They can also be obtained by chemical synthesis.
  • the invention also relates to the genes of plant aconitase, and all the nucleic acid sequences derived from the genomic sequence, all the coding sequences including the degenerate sequences, the regulatory sequences, the introns. , the sequences likely to hybridize with the plant aconitase gene and fragments of these sequences.
  • the invention relates to a nucleic acid sequence characterized in that it comprises either: i) a sequence which, if appropriate after transcription, splicing and translation, gives rise to the protein of the invention, or ii ) the transcript of the sequence i) or its cDNA equivalent, either iii) a sequence complementary to the sequence i) or ii), or iv) a sequence having a length of at least 25 bases and capable of hybridizing, on its entire length, with the sequences i), ii) or iii) under stringent or moderately stringent conditions, or v) a fragment consisting of at least 6, and preferably at least 25 or 30, consecutive nucleotides of any one sequences i), ii), or iii).
  • nucleic acid means in the context of the present invention DNA or RNA, or optionally a mixture of the two.
  • a nucleic acid sequence of type i) is the genomic sequence of Arabidopsis thaliana illustrated in the FIG. 1 or that of the corn illustrated in FIG. 18. Mention may also be made of the plant genomic sequences of the aconitase gene in other species, for example monocotyledons, such as cereals, etc., and dicots, by example of many vegetables. These sequences can be identified by the use of a nucleic acid amplification reaction, preferably Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), the primers and the conditions being, for example, those used in the Example 11 below, the substrate being poly A + RNA. It is also possible to use other primers derived from the plant aconitase gene, for example the sequences encoding all or part of the amino acid sequences I to XI mentioned above.
  • RT-PCR Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • genomic sequences can also be identified in species other than those specifically exemplified in this application by the use of a probe specific to the plant aconitase gene, for example a probe containing the sequences I to VI mentioned above.
  • the hybridization conditions are those cited in Example 6.
  • sequences of type ii As an example of nucleic acid sequences of type ii), mention may be made of the transcripts (mRNA) of the plant aconitase gene, or its cDNA equivalent, for example the cDNAs illustrated in FIGS. 3 and 4, as well as all degenerate sequences capable of coding for the protein of claim 1. Sequences of type ii) also include the primary transcript (pre-mRNA), that is to say the transcript of genomic DNA before splicing. The pre-mRNA contains in particular the introns.
  • the invention also encompasses sequences of type iii), that is to say the sequences complementary to sequences i) and ii).
  • complementary normally means 100% complementarity, but can also mean a sufficiently high degree of complementarity to allow stable hybridization between the sequence and its complementary sequence under stringent conditions. The presence of a certain number of mismatches, for example up to 10%, or possibly up to 20%, can be tolerated.
  • the invention also relates to sequences of type iv), that is to say nucleic acid sequences having at least 25 bases and being capable of hybridizing with the sequences i), ii) and iii) such that defined above, under stringent or moderately stringent conditions.
  • sequences of type iv that is to say nucleic acid sequences having at least 25 bases and being capable of hybridizing with the sequences i), ii) and iii) such that defined above, under stringent or moderately stringent conditions.
  • these sequences have a length between 25 and 1000 bases, for example 30 to 900 or 50 to 500.
  • the stringent conditions are as follows:
  • hybridization is carried out on the nitro-cellulose filters in 20 ml of hybridization solution (SSC 6X, SDS 5%, DENHARDT 5X, DNA of salmon sperm 50 mg / ml).
  • the filters undergo the following washes:
  • the average stringency conditions are as follows: - the hybridization conditions are made by varying the concentration of formamide 10, 20, 30, 40, 50% at a fixed temperature of 40 ° C. in a hybridization buffer SSC 6X, SDS 0.1%, DENHARDT 5X, DNA salmon sperm 50mg / ml.
  • the washing conditions are as follows:
  • stringent conditions allow hybridization of two nucleic acid sequences having at least 85% -90% homology.
  • the moderately stringent conditions allow the hybridization of sequences having at least 60% or at least 65% homology.
  • homology at the nucleic acid level means identity.
  • the invention also relates to sequences of type (v), that is to say nucleic acid fragments consisting of at least 6, and preferably at least 20, 25 or 30, for example 40, 50, 60 or more consecutive nucleotides of any of the sequences (i), (ii), or (iii) previously described.
  • the fragment comprises between 10 and 500 nucleotides, for example between 30 and 300.
  • the fragment may be able to act as a primer in a nucleic acid amplification reaction.
  • a pair of fragments is used, each sequence having a length of approximately 15 to 300 bases, preferably between 18 and 50 bases.
  • the fragments chosen as primers must advantageously correspond to areas of the protein separated from each other by less than 900 amino acids, preferably less than 500, for example about fifty amino acids.
  • the fragment derived from the aconitase gene can be part of a larger "hybrid" sequence, comprising on the one hand at least one fragment according to the invention and on the other hand, one or more sequences not having any related to the aconitase gene, for example a sequence derived from a second gene.
  • the fragment can be labeled by means known per se, for example radioactive, fluorescent, enzymatic means, or by labeling with avidin or biotin.
  • the labeled fragment serves as a nucleotide probe.
  • the length of the fragment is preferably between 6 and 900 bases, for example between 50 and 350 bases.
  • the nucleic acid sequence is a so-called "complementary" sequence which comprises one or more fragments having a length of at least 6 nucleotides, for example at least 10 nucleotides, the said (s) (s) fragment (s) being complementary (s) to at least part of the transcript of the aconitase gene.
  • This kind of structure capable of inhibiting the expression of the gene Aconitase, more particularly includes antisense sequences and ribozymes directed against the transcript of the aconitase gene.
  • the sequence normally comprises a single fragment, complementary to at least part of the transcript, this fragment having a length of at least twenty nucleotides.
  • antisense sequences can be linked to each other either contiguously or alternately with other sequences.
  • the inhibitory sequence is a ribozyme directed against the transcript of the aconitase gene, the ribozyme comprising a sequence complementary to at least part of the transcript of the aconitase gene and, included within this complementary sequence, a catalytic region originating from a ribozyme, preferably a hammerhead type ribozyme (see for example EP-A-321 201).
  • the ribozyme can be a mono-ribozyme or a poly-ribozyme.
  • the antisense sequences and the ribozymes are normally produced in vivo by transcription of the corresponding DNA sequence, inserted stably into the genome of the plant.
  • the translation of the transcript of the aconitase gene is then prevented, either by hybridization of the antisense sequence, or by cleavage of the transcript by the ribozyme, thus affecting the functioning of the Krebs cycle and the glyoxylate cycle, as well as the or the metabolic pathway (s) regulated post-transcriptionally by cytosolic aconitase thanks to its RNA-binding activity.
  • aconitase leads to a reduction in the rate of production of organic acids in these two cycles, but to an increase in the production of acetyl coenzyme-A.
  • the latter is the product of the degradation of carbon skeletons of several pathways of catabolism, for example glycolysis, the cycle of pentoses, the 0-oxidation of lipids and the catabolism of proteins.
  • the degradation of these substances can therefore be indirectly modified by the inhibition of the expression of aconitase.
  • the nucleic acid fragment is a fragment of the genomic sequence of the plant aconitase gene, for example that illustrated in FIG. 1 or that illustrated in FIG. 18.
  • the fragment genomics contains at least 25 nucleotides and preferably at least 30, for example between 50 and 500 or more, unless it is a part of a non-coding region or an intron of the genomic sequence, to which case, the fragment can be at least 10 nucleotides in length.
  • the introns of the plant aconitase gene constitute preferred fragments of the invention. It has been found that 1 • genomic organization of the 1 • aconitase gene is identical in Arabidopsis (dicotyledonous) and in corn (monocotyledonous), the introns being positioned in exactly the same way.
  • the aconitase gene contains a particularly high number of introns: around 19 to 20. Aconitase therefore represents a very rich source of introns. In addition, splicing of introns must be particularly effective insofar as the gene is expressed in a constitutive manner.
  • the invention therefore encompasses the introns of the plant aconitase genes, including the signals splicing, and fragments of introns comprising at least 10, and preferably at least 30 bases.
  • the length of the introns varies between 70 and 500 bases approximately.
  • the sequences comprising the intron (s) can also include the sequences which, in the genome, immediately adjoin the intron.
  • the fragment may then comprise on either side of the intron, a sequence corresponding to a part of the exon which naturally adjoins the intron, this sequence preferably having a length of between 1 and 100 bases, for example 5 at 50.
  • introns of the invention there may be mentioned those of Arabidopsis and corn (see Table III, Example 12). Mention may also be made of the introns of other species, the genomic sequences being able to be identified in the manner indicated in Example 12.
  • the introns of the plant aconitase gene can be used as elements capable of increasing the efficiency of expression of a heterologous sequence in a plant. Indeed, it has been demonstrated, particularly in monocotyledons, that the insertion of an intron into the 5 ′ untranslated part of a gene, that is to say between the site of initiation of transcription and the site of translation initiation, leads to an improvement in the stability of the messenger, and therefore, to a better expression.
  • the intron (s) used in this way preferably come from a monocotyledon such as corn. It is preferably, but not necessarily, the first intron of the gene.
  • non-coding nucleic acid fragment mention may be made of the fragment -85 to +1, for example -85 to -52, of the sequence of FIG. 1. It has been observed that this region has a structure secondary typical of IRE (Iron Responsive Element). It could be that this part of the sequence is specific for the mitochondrial aconitase messenger, in which case a ribozyme directed specifically against this region, or a part, for example the region -49 to +1, would specifically inhibit the mitochondrial activity.
  • Another particularly preferred fragment is the HindIII - BglII fragment (-1293 to +45 of the genomic sequence of FIG. 1), or the corresponding fragment in sequences coding for homologous proteins.
  • the promoter of the aconitase gene is found within this fragment. This fragment can be used as such as a promoter to obtain the expression of heterologous coding sequences in plants.
  • Smaller fragments can also be used provided that the promoter activity is retained. These "subfragments" can be identified by the fusion of the subfragment in question with the coding sequence of a reporter gene such as that of beta glucuronidase, and the detection of the expression of the reporter gene in plant cells.
  • the deletion, within the Hind III - Bgl II fragment, of 100 to 300 nucleotides on the 5 ′ side normally gives rise to sub-fragments having a promotional activity. It is preferable to preserve the reading phase to test the chosen fragment.
  • the promoter leads to a constitutive expression and is strongly expressed both during the germination of the seeds and during the maturation of the seed and of the pollen grains. It is therefore particularly advantageous to use the promoter region of the invention to obtain strong expression during this period of the plant's life.
  • the tissues of the seed, where the expression directed by the promoter is particularly strong, are the cotyledons, the endosperm or the endo-sperm, and the embryo.
  • the promoter fragment is preferably used to direct constitutive expression, either in the cytoplasm, in the mitochondria, or in both.
  • sequence coding for the mitochondrial signal peptide of aconitase is fused to the 5 ′ end of the coding sequence.
  • promoter fragments extending further upstream of the HindIII site (-1293).
  • the inventors identified a clone by the RACE technique, the 5 ′ end of the genomic sequence of which is in position -52 upstream of the first TATA box. This suggests that initiation of transcription may take place further upstream.
  • This results indicate the possible existence of a second promoter which could be responsible for the transcription of one of the two forms of aconitase from the gene. This second promoter is also part of the invention.
  • the promoter of the maize aconitase gene also forms part of the invention. It is included in the upstream part of the genomic sequence of FIG. 18, in particular within the SalI-HindIII fragment cited in example 12.
  • the promoter regions of the invention are normally used as the chimeric gene. These chimeric genes comprise: i) a promoter region according to the invention, and ii) a transcribed heterologous sequence, coding or not, placed under the control of said promoter.
  • transcribed heterolocal sequence, coding or not means any transcribed sequence other than those normally associated with the aconitase promoter in the plant.
  • This expression encompasses non-coding sequences such as ribozymes or antisense sequences, directed against a transcript of interest, as well as coding sequences.
  • - all coding sequences conferring traits of interest from an agronomic point of view, for example sequences involved in male sterility, for example unedited mitochondrial genes, sequences conferring resistance to a virus or to herbicides, etc. ; - mammalian gene coding sequences, for example interferon, growth hormone, insulin and any other product which may be useful as a medicament.
  • the invention also relates to chimeric genes capable of being expressed in plants characterized in that they comprise: i) a functional promoter in plants other than that naturally associated with the aconitase gene, and ii) a sequence encoding the protein of the invention, as defined above, or for a protein fragment, as defined above.
  • promoter in this type of chimeric gene mention may be made of the 35S promoter, the NOS promoter, plant-specific seed promoters.
  • promoters of the napin gene As specific seed promoters, mention may be made of the promoter of the napin gene (EP-A-0255378), as well as the promoters of the AT2S genes of Arabidopsis thaliana, that is to say the promoters PAT2S1, PAT2S2, PAT2S3 and PAT2S4 (Krebbers et al., 1988, Plant Physiol., 87: 859-866.
  • the coding sequence corresponds to that coding for the protein of the invention exhibiting aconitase activity or for a protein fragment exhibiting either an immunological homology with aconitase or an aconitase activity.
  • the invention further relates to chimeric genes capable of being expressed in plants characterized in that they comprise: i) a functional promoter in plants, ii) a transcribed sequence, coding or not, placed under the control of said promoter, iii) one or more introns of the plant aconitase gene, as defined above.
  • the presence of one or more introns stabilizes the transcribed mRNA.
  • the intron (s) can be positioned within the transcribed sequence, or can be placed between the promoter and the start of the transcribed sequence, as indicated above.
  • the invention also relates to plasmids or vectors characterized in that they contain at least one of the nucleic acid sequences according to the invention.
  • the plasmids and vectors allow the stable transformation of the plant, for example the Ti plasmids of Aqrobacterium, viral vectors such as Geminiviruses or CaMV.
  • the invention also relates to plant cells and transgenic plants transformed stably by a nucleic acid sequence according to the invention.
  • transgenic plants mention may be made of species belonging to botanical families such as legumes (for example beans, peas, etc.), crucifers (for example, cabbage, radishes, etc.), nightshade (for example tomatoes, potatoes, etc.) cucurbits (for example melon), chenopodiaceae (for example vegetable beet), and umbelliferae (for example, carrots, celery, etc.).
  • Cucurbits and Brassicae are particularly preferred. Mention may also be made of cereals such as wheat, corn, barley, triticale and rice, and oilseeds such as sunflower, soya and rapeseed.
  • All known means for introducing foreign DNA into plants can be used, for example example A robacteriu, electroporation, protoplast fusion, bombardment with a particle gun, or penetration of DNA into cells such as pollen, microspore, seed and immature embryo, viral vectors such as Geminiviruses or satellite viruses.
  • Agrobacterium tumefaciens and rhizogenes are the preferred means.
  • the sequence of the invention is introduced into an appropriate vector with all the necessary regulatory sequences such as promoters, terminators, etc. as well as any sequence necessary for selecting the transformants.
  • the invention also relates to monoclonal or polyclonal antibodies capable of recognizing, preferably specifically, the protein and protein fragments of the invention.
  • These antibodies are produced according to the usual techniques in the art using, as immunogen, the protein purified according to the techniques described in the examples below or the recombinant protein.
  • the purification technique of Example 1 below leads to the production of two forms of aconitase (called Acol and AcoII).
  • Acol and AcoII aconitase
  • By using one of these two proteins as an immunogen it is possible, according to the invention, to produce monoclonal antibodies capable of distinguishing between the two forms.
  • These specific monoclonal antibodies constitute immunological probes useful for studying the subcellular localization of the two enzymatic forms, or for purification.
  • the antibodies of the invention can be used for the screening of cDNA libraries or for other uses such as the study of the relationship between the aconitases of different species.
  • the proteins and nucleic acids of the invention find numerous applications.
  • the nucleic acid sequences and the chimeric genes of the invention are used in a method for modifying the metabolism of a plant. This method is characterized by the introduction into the plant of a genetic insert comprising a nucleic acid sequence of the invention.
  • the modification of the plant's metabolism can consist, for example:
  • the modification consists in a modification of the quantity of aconitase produced by the plant. It may be an increase or inhibition of aconitase production.
  • An increase is obtained by the introduction into the plant of a genetic insert comprising a promoter functional in plants, and under the control of this promoter, a sequence coding for the protein of the invention.
  • the promoter can be that naturally associated with the plant aconitase gene or a promoter heterologous to the aconitase gene.
  • the insertion of the coding sequence with its own promoter leads to an overproduction of aconitase, the expression of the additional copies of the aconitase gene being spatially and temporally identical to the endogenous gene.
  • the promoter is heterologous to the gene for aconitase, it can be a constitutive promoter or a promoter specific for certain tissues or for certain stages of development. This will allow a temporal and spatial expression different from that produced by the endogenous gene.
  • the coding sequence used to obtain an overproduction of aconitase may be the entire coding sequence exemplified by that illustrated in FIG. 1 or may correspond to one of the two forms (mitochondrial or cytosolic) making it possible to obtain overproduction in a subcellular localization defined.
  • the sequences coding for the proteins having at least 75% homology with that of FIG. 1 can also be used.
  • the overproduction of aconitase leads to an overproduction of at least one of the organic acids of the Krebs cycle or of the glyoxylate cycle, in particular citrate, isocitrate, succinate, glyoxylate, malate, oxaloacetate, ⁇ -cetoglutarate, fumarate.
  • This variant of the invention therefore constitutes a process for obtaining an overproduction of organic acids in plants.
  • the acids thus obtained can then be extracted from the plant, using methods known per se, for use in the food industry, for example as an additive, antioxidants etc.
  • the production of citrate is particularly preferred, for example as an additive for fruit juices.
  • the amount of aconitase produced by the plant can also be reduced by the use of a ribozyme or an antisense sequence directed against at least part of the transcript of the aconitase gene.
  • Ribozymes and antisense sequences have the structure described above. These sequences inhibitors can be used in a chimeric gene according to the invention, the promoter being chosen in order to allow an appropriate expression. For example, an inducible promoter would allow production of the ribozyme and therefore inactivation of the aconitase transcript only when the induction conditions were met.
  • the ribozyme or the antisense sequence may also be under the control of the promoter of the invention.
  • Acetyl coenzyme-A being the product of lipid, protein and polysaccharide catabolism, it follows a modification of the catabolism of these substances or of some of these substances.
  • This aspect of the invention can therefore be applied for example to the reorientation of the metabolism or catabolism of starch, oils, proteins, etc., for the food, chemical, pharmaceutical and cosmetological industries.
  • the tissue distribution of aconitase can be modified.
  • the insertion of additional copies of one of the two forms of aconitase, for example the mitochondrial form rather than the other form, leads to overproduction of this form.
  • aconitase produced by a plant can also be envisaged to modify the nature of the aconitase produced by a plant by inserting, in a plant belonging to a first species, a sequence coding for the aconitase of a second species.
  • This can be interesting when the second species has particularly advantageous characteristics, for example when the aconitase of a particular species is less sensitive to certain substances, or when its expression is regulated differently from that of the host plant.
  • aconitase can also affect the metabolism of metal ions, such as iron, cadmium and copper. These effects are probably exerted thanks to the role of IRE-BP which the vegetable aconitase can play.
  • FIG. 1 nucleotide sequence of the gene coding for a protein with aconitase activity in Arabidopsis thaliana.
  • ARABACO Arabidopsis thaliana aconitase
  • MELONACO Melon aconitase (Cucumis melo)
  • IREB Iron Responsive Element Binding Protein
  • ACON Aconitase
  • V cysteines constituting the Iron-Sulfur center
  • i amino acids forming the active site
  • * identical amino acids
  • . similar amino acids.
  • FIG. 3 nucleotide and protein sequence of cDNA clone No. 1 of Arabidopsis thaliana coding for a protein with aconitase activity.
  • Figure 8 compartmentalization of enzymes involved in the Glyoxylate cycle.
  • FIG 10 restriction map deduced from the cDNA clone n '1 of Arabidopsis thaliana coding for a protein with aconitase activity.
  • Figure 11 A nucleotide and protein sequence of the 5 'end of cDNA No. 1 of Arabidopsis thaliana coding for an aconitase.
  • Bold protein sequence showing homology with the NH 2 terminal ends of the potato and melon aconitases.
  • FIG. 11B comparison of the NH 2 terminal sequences of the aconitase deduced from the cDNA of Arabidopsis thaliana, of the melon aconitase (Cucumis melo), and of the mitochondrial potato aconitase (Solanu tuberosum).
  • ARABACO Aconitase of Arabidopsis thaliana
  • MELONACO Aconitase of melon (Cucumis melon)
  • IREB Iron Responsive Element Binding Protein
  • ACON Aconitase
  • the bold figure percentage of identical residues
  • the figure in brackets percentage of similar residues .
  • ARABACO Aconitase from Arabidopsis thaliana
  • MELONACO Melon aconitase (Cucumis melo)
  • IREB Iron Responsive Element Binding Protein
  • ACON Aconitase.
  • FIG. 14 physical mapping of the aconitase gene from Arabidopsis thaliana.
  • A restriction map of part 5 • of the genomic fragment isolated from the DASH library
  • B restriction map of the 3 * part of the genomic fragment isolated from the EMBL library
  • B BamHI
  • Ps PstI
  • Pv PvuII
  • H HindIII
  • E EcoRI
  • X Xbal
  • DASH phage vector DASH
  • EMBL phage vector EMBL3.
  • Figure 15 putative IRE-like structure (position -85 to -52 on the genomic sequence).
  • FIG. 16 detail of the translational fusion of the promoter of 1 • aconitase with the reporter gene for ⁇ -glucuronidase carried by the binary vector pBIOS 170.
  • c) Sequence of the fusion of the aconitase promoter with the / 3-glucuronidase gene (tataa Tata box).
  • Standard characters aconitase sequence, italic characters: pBI 101.1 sequence.
  • FIG. 17 alignment of protein and nucleotide sequences of A. thaliana (amino acids 240 to 269) with the corresponding part of the corn.
  • the corn sequence was obtained by P.C.R., using as primers, oligo D III and oligo D IV. A nucleic homology of 77.5% and a protein homology of 87.5% was detected. The sequence of a hundred bases was then used as a probe on corn genomic DNA and allowed the identification of the gene.
  • Aconitase was purified from melon seeds by traditional chromatographic techniques.
  • the crude extract is prepared by grinding 100 g of seeds with a waring blendor (3 min, 4 ° C, maximum speed), then stirred in 100 ml of 20 mM Imidazole buffer; pH 7.5 (1 h, 4 ° C).
  • the soluble fraction containing the activity is recovered after centrifugation (13,000 g, 30 min, 4 ° C), then filtered on a miracloth sheet to remove cellular debris and a large part of lipids.
  • the first chromatographic step consists of ion exchange chromatography on a Q sepharose fast flow resin (PHARMACIA).
  • the crude protein suspension (1360 mg) is deposited at the top of the column equilibrated with a 20 mM Imidazole buffer, pH 7.5.
  • the proteins are eluted under isocratic conditions in a 20 mM Imidazole buffer, ph7.5 added with 200 mM sodium acetate.
  • the active fractions (260 mg of protein) are desalted on EconoPac 10 DG columns (BIORAD) with 20 mM Imidazole buffer, pH 7.5.
  • the proteins are then deposited on a column containing an affinity resin on a Yellow 86 dye (SIGMA).
  • SIGMA Yellow 86 dye
  • the elution is then carried out by a linear gradient of sodium acetate ranging from 0 to 0.5 M in a 20 mM Imidazole buffer, pH 7.5.
  • the active fractions are again recovered (14.4 mg of protein) and then adjusted to an ammonium sulfate concentration of 1.2 M.
  • the protein extracts are then deposited on a column of hydrophobic interaction Protein Pack HIC Phenyl 5 PW (WATERS).
  • the elution of the proteins is then carried out by a linear gradient of ammonium sulphate ranging from 1.2 to 0 M in a 20 mM Imidazole buffer, pH 7.5.
  • the first activity peak (Aco I) is eluted for an ammonium sulphate concentration close to 0.9 M.
  • the second activity peak (Aco II) is eluted for a lower concentration of 0.7 M.
  • the active fractions are again desalted (Aco I fraction: 0.76 mg; Aco II fraction: 0.44 mg) in 20 mM Imidazole buffer, pH 7.5. Finally, the active fractions of each of the activity peaks are deposited on a Mono Q MR 5/5 ion exchange column (PHARMACIA).
  • This last chromatography makes it possible to obtain two proteins with relatively pure aconitase activity after elution with a linear gradient of sodium acetate from 0 to 0.3 M in a 20 mM Imidazole buffer, pH 7.5.
  • the proteins Aco I and Aco II were eluted for a concentration of sodium acetate close to 200 mM.
  • the Aco I and Aco II proteins at the end of the purification were purified by a factor of 878 times and 763 times, respectively. These two proteins show specific activities close to 1,518.42 mmol / min / mg for Aco I and 1,321.15 mmol / min / mg for Aco II.
  • a polyacrylamide gel (10% separation gel; 5% concentration gel) is poured 24 h before its use (Mini Protean II BIORAD system).
  • a pre-electrophoresis of 1 h 30 to 20 mA makes it possible to homogenize the gel.
  • the samples must not be denatured, they are placed 15 min at 37 ° C. The separation is done for 45 min at 190 V.
  • the proteins are transferred to a PVDF (Poly Vinyl DiFluoride) membrane.
  • the membrane is immersed for 10 s in a 100% methanol solution then incubated in the transfer buffer CAPS (3 [cyclohexylamino] t-propane sulfonic acid) 10 mM, pH 11, supplemented with 10% methanol until equilibrium.
  • CAPS [cyclohexylamino] t-propane sulfonic acid
  • Protein electrotransfer is done in semi-dry condition with the 2117 LKB multiphor system for 1 h at 60 mA (0.8 mA / cm2 of membrane).
  • the proteins transferred to the PVDF membrane are visualized after staining with Coomassie blue R250 (0.1% solution in 50% methanol) for 5 min, then discoloration 5 to 10 min in the following solution methanol, acetic acid, water ( 5: 10: 40 vol).
  • the membrane part corresponding to the protein of interest is cut out, and the protein sequenced.
  • the NH2 terminal part of the protein is sequenced according to the reaction of HEWICK et al (1981) with the automatic sequencer Applied-Biosystem.
  • the NH2 terminal sequence of melon seed aconitases which the inventors have determined, has could be compared ( Figure 11) with the terminal NH2 sequence of mitochondrial potato aconitase (COURTOIS-VERNIQUET and DOUCE, personal communication). A strong homology between these sequences is noted: out of 14 sequence residues, 9 are common with the mitochondrial potato aconitase. This may mean that the melon mitochondrial aconitase has been purified or that the terminal NH2 sequences of the mitochondrial and cytosolic aconitases are highly homologous. The absence of methionine as the first amino acid could indicate a maturation of the protein during import into the mitochondria (cleavage of the signal peptide).
  • EXAMPLE 3 MANUFACTURE OF POLYCLONAL ANTIBODIES DIRECTED AGAINST ACONITASES:
  • Rabbits female hybrids of 2 to 3 months are immunized intradermally with 10 ⁇ q of purified aconitase, emulsified to an equal volume of complete Freund's adjuvant during the first immunization, incomplete for the immunizations which follow (40 and 70 days after the first injection).
  • Blood samples taken from the central ear vein, are taken regularly (weekly).
  • the blood collected on heparin is rapidly centrifuged (3000 g, 4 ° C, 5 min).
  • the plasmas containing the antibodies are divided into aliquots and stored at -20 ⁇ C.
  • the characterization of polyclonal antibodies is done by the Western Blot technique according to the protocol detailed below.
  • the electrophoresis of the purified proteins or fractions is carried out in a 10% SDS-PAGE denaturing gel (separation gel), 3% concentration gel.
  • the samples are prepared in the following buffer: Tris / HCl 10 mM; pH 8.0; 1 mM EDTA; SDS 2.5%; ? -mercaptoethanol 5.0%; 0.01% bromophenol blue. Proteins are denatured by heating (100 ° C, 5 min).
  • the colored protein markers of molecular weight are the following: myosin (200,000) phosphorylase b (97,400), trypsin inhibitor (21,500), lysozymes (14,300).
  • the electrophoresis is carried out under a current of 20 mA by gel for 1 h.
  • the proteins separated on SDS-PAGE gel are transferred onto a nitrocellulose membrane.
  • the electrotransfer is done with the BIORAD mini trans blot device or the PHARMACIA Phast System (semi-dry transfer according to the manufacturer's recommendations), depending on the type of gel that has allowed the protein to be separated beforehand.
  • the membrane is incubated in a saturated TBST solution (20 mM Tris-HCl; 500 mM NaCl; 0.05% Tween 20) supplemented with Regilait (5%) for a minimum 3 hrs.
  • the membrane is placed for 2 h in a TBST incubation solution containing the first antibody (polyclonal antibody diluted to 1/8000 or monoclonal antibody: culture supernatant). - the excess antibody is eliminated by three successive washes of 3 min in a TBST solution. The membrane is then incubated for 2 h in a TBST solution, in the presence of a second antibody conjugated to alkaline phosphatase (rabbit anti-immunoglobulins diluted to 1/9000 or mouse anti-immunoglobulins diluted to 1/4000, SIGMA ). After this step, 3 new washes are carried out.
  • a second antibody conjugated to alkaline phosphatase rabbit anti-immunoglobulins diluted to 1/9000 or mouse anti-immunoglobulins diluted to 1/4000, SIGMA .
  • the antigen-antibody complex is revealed in the following development solution: 5 ml of alkaline phosphatase buffer (100 mM Tris / HCl; pH 9.5; 100 mM NaCl; 5 mM NaCl), 33 ⁇ l of nitro blue tetrazolium ( NBT) at 50 mg / ml prepared in 70% dimethylformami e, 16.5 ⁇ l of 5 Bromo-4-chloro-3 indolylphosphate (BCIP) at 50 mg / ml prepared in dimethylformamide.
  • alkaline phosphatase buffer 100 mM Tris / HCl; pH 9.5; 100 mM NaCl; 5 mM NaCl
  • NBT nitro blue tetrazolium
  • BCIP Bromo-4-chloro-3 indolylphosphate
  • Polyclonal antibodies were produced after immunization of two rabbits with the Aco I protein (10 ⁇ g / injection) and two other rabbits with the Aco II protein (10 ⁇ g / injection).
  • the reactivity and the specificity of the antibodies are tested on crude or purified extracts of melon seed proteins separated by electrophoresis and transferred onto a nitrocellulose membrane.
  • the antibodies give a strong response for a dilution up to 1 / 8,000.
  • the two plasmas give the same type of response.
  • the inventors had a cDNA bank of ripe melon fruit (Cantaloupe Charentais).
  • the cDNAs are cloned at the start of the ⁇ -galactosidase gene in the phages UNI-ZAP. Oriented cloning cuts halves of clones that are not in the correct reading phase.
  • the lad q repressor which blocks the transcription of the lac Z gene is provided by the bacteria XL1 Blue. This repressor is important because it allows to control the expression of fusion proteins which can be toxic for E. coli.
  • IPTG isopropylthio / 3-D galactoside
  • Positive clones are identified by superimposing the filters revealed with the corresponding box.
  • the piece of agar containing the positive zone is removed using a pasteur pipette, then placed in 1 ml of SM buffer containing a drop of chloroform (inhibiting bacterial development) for 1 h at room temperature to allow the diffusion of phages in the solution.
  • the tubes are stored at 4 ° C.
  • the positive lysis plaques which are sampled are not pure (confluent plaques). To isolate a positive clone with certainty, it is necessary to carry out several successive screens by re-spreading the lysis ranges recovered so as to obtain isolated lysis ranges.
  • the 21 clones of the first category are related: they give a signal during hybridization.
  • the first class (I) consists of 11 clones of which the EcoRI insert has a size of 1.7 Kb.
  • the second class (II) of clones (9 clones) comprises an EcoRI insert of 1.8 Kb.
  • the third class (III) consists of the largest clone with an EcoRI insert of 2.2 Kb (n ° 16).
  • EXAMPLE 5 SEQUENCING OF MELON cDNAs - HOMOLOGIES WITH IRE-BP:
  • the 5 ′ sequence of the longest clone did not allow the protein sequence corresponding to the NH2 terminal end to be found. This is not surprising since a protein of around 100 kDa should be encoded by an mRNA of at least 3 Kb. They then used this 900 bp sequence to interrogate the databases (SWISSPROT - ISIC 2) and ensure that they had correctly isolated the cDNA clone corresponding to the purified protein. Significant homologies have been found with all of the aconitase or IRE-BP sequences, in particular with human IRE-BP and E aconitase. coli (about 60%).
  • the difficulty in this choice of strategy is to find the right hybridization conditions because the inventors have a cDNA clone serving as a probe of a given species (melon) to screen a bank of another species (Arabidopsis thaliana). They do not know the degree of conservation of aconitase in plants. Also, several hybridization conditions in which the concentration of formamide varied (0, 10, 20, 30, 40, 50%) were tested. Likewise, progressive washing conditions were used.
  • the probe used is the 2.2 Kb DNA fragment obtained after digestion with the EcoRI restriction enzyme of the melon cDNA clone No. 16.
  • the other 4 clones are identical, their size is 2.3 Kb.
  • the restriction map shows that they belong to the same class as the longest clones, only the EcoRI fragment of 0.8 Kb at the 5 'end is absent (these clones probably come from an incomplete methylation of the EcoRI sites. cDNA interns).
  • the 3 3.2 kb clones (nos. 1, 2, 3) were sequenced at each end (universal primers T3 and M13). At the 3 'end, a poly A tail was observed consisting of 40, 15 and 16 residues respectively.
  • the sequence of the 5 ′ end (FIG. 11) showed a strong homology with the NH2 terminal protein sequence of melon aconitase (9 identical amino acids out of 14) and potato mitochondrial aconitase (8 acids identical amines in 14) ( Figures 10 and 3).
  • the EcoRI-EcoRV fragments of 0.7 and 0.9 Kb were subcloned into the vector pBSII SK + and then sequenced at the ends with the universal primers T3 and M13.
  • the entire cDNA clone was subsequently sequenced (FIG. 3) by the oligonucleotide progression strategy.
  • This clone has a total length of 3,210 bp.
  • the open reading frame has a length of 2769 bp.
  • the termination codon is a TAA codon (ocher codon), the untranslated part in 3 * has a length of 441 bp.
  • sequence of the 5 ′ and 3 ′ ends of cDNAs 2, 3, 4 and 5 allow their positioning on the sequence of the cDNA n ⁇ 1 clone.
  • the 5 'end of clones 2 and 3 is in position 66.
  • the 5' end is in position 134.
  • clones 2, 3, 4 and 5 are located respectively in position 2964, 2964, 2926, 2976.
  • Clones 2 and 3 are strictly identical; same departure and same stop.
  • Analysis of the 3 ′ non-coding part of cDNA clone n ° 1 reveals three possible polyadenylation sites according to the AATAAA consensus at position 2848, 2940 and 3026. These three sites must be functional because 3 compatible stop positions have been obtained for the cDNA clones studied.
  • Figure 12 showing the percentages of homology between the different aconitases shows a very significant homology of about 90% between the plant aconitases studied. These proteins appear closer to IRE-BP (approximately 70% homology) and E. coli aconitase (approximately 65% homology) than mitochondrial aconitases (approximately 45% homology).
  • LAMBDA DASH bank of Arabidopsis thaliana (ecotype C24) (genomic DNA partially digested by the restriction enzyme Hind III, then cloned into the vector DASH at the Hind III site) is screened with the cDNA n ⁇ l 3.2 Kb isolated from Arabidopsis thaliana.
  • the EMBL 3 genomic library of Arabidopsis thaliana (Columbia ecotype) constructed after partial digestion of the DNA by the restriction enzyme Mbo I then cloning of these fragments at the BamHI site of the EMBL 3 vector. After spreading of 2.10 5 phages then hybridization with the 0.6 Kb fragment, a positively responding clone was isolated. A 3.5 Kb Hind III restriction fragment weakly hybridizing with the 1.6 Kb probe and strongly with the 0.6 Kb probe was cloned into the pBS II SK + vector then sequenced until the 3 'end of the cDNA is found.
  • the hybridizations made it possible to complete the restriction map of the gene coding for an aconitase and to verify the Hind III junction between the two physical clones (FIG. 14).
  • the genomic DNA of two Arabidopsis thaliana ecotypes (Columbia and C24) was digested with several restriction enzymes. The fragments obtained were separated on a 0.8% agarose gel and then transferred to a Hybond N + nylon membrane. This membrane was hybridized with the EcoRI fragments of the cDNA clone No. 1 (0.8; 1.6; 0.6 Kb). The mapping of the locus of this gene by Southern shows that it exactly follows the restriction map obtained with the phage clones.
  • genomic DNA fragments were cloned into the pBS II SK + vector before sequencing: - BamHI - BamHI: about 7.7 Kb;
  • the Arabidopsis thaliana aconitase gene was sequenced over 6,762 bp ( Figure 1). Comparison of the sequence of the aconitase gene with the corresponding cDNA shows that the gene consists of 20 exons and 19 introns.
  • genes also show a large number of exons: the gene for human transferrin consists of 17 exons, that of the transferrin receptor for 19 exons.
  • the 5 'end of the cDNA coding for aconitase has been found in the genomic sequence. However, the site of initiation of transcription was not known (the upstream region of the promoter is rich in AT, so there are several putative TATA boxes). The Northern results indicate that the cDNA clone was practically complete (a hybridization signal was visualized at approximately 3.2 Kb, identical to the size of the cDNA). The presence of an intron in the 5 'region of the gene cannot however be excluded.
  • the transcription initiation site was mapped by the RACE technique with the RACE CLONTECH amplifinder kit ( Figure 9).
  • polyadenylated RNAs were isolated from total RNA extracted from leaves. The integrity of messenger RNAs is checked in Northern using as probes the DNA fragments obtained by EcoRI digestion of the cDNA clone No. 1.
  • an oligonucleotide (anchor) from the 3'NH3 GGAGACTTCCAAGGTCTTAGCTATCACTTAAGCAC 5' kit is hooked with the T4 RNA ligase.
  • the amplification of the 5 ′ end of the cDNA is done by PCR using an oligonucleotide complementary to the oligonucleotide "anchor" of the kit and the oligonucleotide n ° 16:
  • the PCR reaction is carried out under the following conditions:
  • primers 9 and 14 are as follows:
  • the amplification conditions are those described above.
  • the reaction solution of the first amplification is precipitated and then taken up in 10 ⁇ l of sterile water. 2 ⁇ l of this solution will serve as a target for the second amplification reaction by PCR.
  • the positive control of the kit expected at around 490 bp is visible lane 4.
  • a re-amplification with the oligonucleotide n "16 gives aspecificity (lane 2).
  • the oligonucleotide n ° 9 seems to allow the amplification of a band d DNA at about 200 bp (lane 3).
  • Another clone was sequenced and placed in position -49 on the genomic sequence. This clone does not carry an additional G which indicates that it is not complete. The distance to the first initiation site is 50 bp. This clone must belong to a second class of clone amplified during PCR and forming the DNA band on a larger agarose gel. This type of result could lead to think that there is a second promoter further upstream.
  • a transcription initiation site In the 5 'part of the gene, a transcription initiation site has been precisely mapped. In reality, 5 sites allow the start of transcription in the region -9 to +9, the most usual site would be at +1.
  • a putative TATA box is located in position -32 (TATAA). This position is in agreement with the described TATA boxes which are located at 32 ⁇ 7 bp upstream from the transcription initiation site. Multiple transcription initiation sites would be present more particularly for housekeeping genes.
  • yeast genes coding for the synthetic enzymes of histidine and valine transfer RNAs (NATSOULIS et al, (1986, The HTS1 Gene encoded both the Cytoplasmic and Mitochondrial Histidine tRNA synthetases of S. cerevisiae, Cell 46; 235-243) CHATTON et al, (1988, The yeast VAS1 Gene encodes both Mitochondrial and Cytoplasmic Valyl-tRNA Synthetase, The Journal of Biological Chemistry 263; 52-57). These enzymes exist both in the cytoplasm and in the mitochondrial matrix space.
  • the first translation initiation site allows the translation of a protein with the import signal peptide into the mitochondria.
  • the second translation initiation site located further downstream will give a protein without mitochondrial import peptide and will therefore remain cytoplasmic localization.
  • For the Arabidopsis thaliana aconitase gene there apparently does not exist a second site for initiating translation between methionine at position +91 and the site for initiating transcription (open reading phase). However, the presence of an unconventional initiation codon cannot be excluded. Indeed, it seems that the ACG and AUA codons can play the role of translation initiation codon.
  • a more or less intense signal is observed in all parts of the plant, indicating a constitutive expression of the aconitase gene.
  • a signal is also obtained for the total RNA of rapeseed (Brassica napus) indicating a high conservation of the aconitase between these two plant species of the cruciferous family.
  • a strong expression of this gene is detected on young germinating seedlings.
  • the glyoxylate cycle must be very high at this time of development allowing the transformation of lipids into sugars essential for the growth of the plant.
  • aconitase being an enzyme of the glyoxylate cycle, a strong expression of this at this stage of development is in accordance with the metabolic needs of the plant.
  • rapeseed Arabidopsis thaliana being a small plant, the removal of the different floral organs is relatively delicate. A high expression of the aconitase gene was then observed in the anthers compared to a low expression in the pistils. This strong activity in the anthers could reflect a very active metabolism for the maturation of the pollen grains.
  • the observed expression of the aconitase gene in the leaves and stems could be due to the cytosolic aconitase activity making it possible to produce carbon skeletons for different biosynthetic pathways.
  • cytosolic and mitochondrial aconitases are encoded by the same gene, it could also be the messenger of the mitochondrial form that is expressed.
  • citrate synthase in castor seeds is due to the mitochondrial isoenzyme and that only messenger RNA coding for the mitochondrial form would be present in the seeds (ZEHLER and SCHNARRENBERGER, (1984, Citrate Synthases from Germinating Castor Bean Seeds, I - Purification and properties, Physioloqia Plantarum 60: 1-8)).
  • ZHLER and SCHNARRENBERGER (1984, Citrate Synthases from Germinating Castor Bean Seeds, I - Purification and properties, Physioloqia Plantarum 60: 1-8).
  • the two isoenzymatic forms also show different isoelectric points of 5.9 and 9.1 respectively for the mitochondrial and cytosolic forms.
  • the restriction site Bgl II (position +46), appears ideally placed to carry out a transcriptional fusion with the reporter gene GUS. Indeed, it is located upstream of the potential starting codon of cytoplasmic aconitase.
  • Hind III-Bgl II fragment with a size of 1339 bp was inserted by oriented cloning into the binary vector pBi 101.1, Hind III - Bam HI sites (JEFFERSON et al, (1987, GUS Fusions: ft-glucuronidase as a sensitive and versatile Gene Marker in Higher Plants, EMBO Journal 6; 3901-3907)) to obtain the vector pBios 170.
  • the inventors have been able to show that the promoter leads to a fairly strong ⁇ -glucuronidase activity in 1 • albumen compared to the maternal parts (integuments, placenta, ovarian tissue).
  • This activity in the albumen is not surprising because it is a very useful reserve tissue during germination. Although the inventors are in the presence of an exalbuminated species, they have been able to precisely visualize the expression of this aconitase promoter in this tissue being development.
  • the immature embryo at the heart stage also exhibits 9-glucuronidase activity; at more advanced stages, a constitutive expression is observed in the embryo.
  • this activity is restricted to the embryo and possibly to the residual albumen.
  • the activity of the aconitase promoter is very strong in the embryo and more particularly in the cotyledons, the latter being the reserve organs where the glycosylate cycle is active.
  • CONSTRUCTED PLANTS ACTIVITY name of the primary (transformant ⁇ -GLUCURONIDASE vector)) (nmol 4-MU / mg protein / minute)
  • EXAMPLE 11 OBTAINING A COMPLEMENTARY DNA FRAGMENT OF A MAIZE ACONITASE GENE:
  • the degenerate oligonucleotide DI was designed by preferring, for the amino acid in position 32, an Alanine with Serine found in Arabidopsis. Indeed, the sequence of the potato and the melon presented this amino acid.
  • Oligonucleotides DU, DIII and DVI were used separately to initiate reverse transcription reactions on poly A + RNA isolated and purified from maize seedlings, etiolated and 6 days old. These reactions were carried out with the Reverse Transcription System kit from the company Promega and led to the production of three complementary DNAs. On these, several PCR reactions were carried out with different combinations of DI / DII oligonucleotides; DI / DIII; DI / DIV; DV / DVI and this under the following conditions: 1 microliter of complementary DNA is added to 50 microliters of PCR mixture composed of 0.25 mM dNTP, 1.5 mM MgCl 2,
  • the clone T1 On one of the clones, the clone T1, a 6.2 Kb SalI fragment hybridizing with the cDNA fragment was cloned into the pBS II SK + vector. This fragment was initially sequenced at the ends as well as from 2 oligonucleotides specific for the complementary DNA fragment and then, by the oligonucleotide progression strategy. The first comparisons with the complementary DNA of Arabidopsis showed that this clone did not contain the 5 'end of the maize aconitase gene. In order to try to obtain the sequence of 1 • end 5 • , the inventors undertook to sequence by the technique of progression by oligonucleotides the upstream zone on the other genomic clones. Only 2 of them, RI and Jl, presented a more extended 5 'region of the gene than the Tl clone; with however Jl which contained only 1060 bp more than the clone Tl.
  • RI contains an insertion of approximately 15 kb of corn genomic DNA, comprising in particular a SalI-HindIII fragment of approximately 6800 bp covering the 5 'end of the aconitase gene, and extending from the -4000 position to the position 2841 ( Figure 18).
  • This fragment is purifiable by double digestion HindIII, Sali; Sali being a unique restriction site present on the vector and contiguous to the site of insertion of the genomic fragment, namely BamHI, compatible with the enzyme Mbol.
  • a total of 6036 base pairs of the sequence of a maize aconitase gene could be determined from the clone RI (FIG. 18) with a single uncertainty of a few bases at position 4635; this region corresponds to an intron. Since the inventors did not have a complementary DNA clone synthesized from the polyA + end of this maize aconitase gene, the coding regions were defined by searching for homologies with the coding sequences of Arabidopsis and that of the incomplete complementary DNA of the melon.
  • n ° 17 has a size different from that of Arabidopsis (+ 3 base pairs) and it is also the one which codes for the protein zone presenting the more divergence despite a fairly conserved nucleic sequence. This is explained by the addition of a T at position 5021 corn sequence (or the deletion of a base after position 3047 on the Arabidopsis sequence).
  • Table III presents the size of the exons and introns of the two Aconitase genes studied.
  • FIG. 19 shows the alignment of the Arabidopsis and maize aconitases attesting to the very high conservation of these enzymes.

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Abstract

L'invention concerne une protéine ayant une activité enzymatique d'aconitase, caractérisée en ce qu'elle comporte, soit (i) la séquence en acides aminés illustrée dans la figure (1) ou une séquence présentant au moins 75% d'homologie avec celle-ci, soit (ii) une variante de la séquence (i) comportant une délétion de jusqu'à 40 acides aminés environ au niveau de l'extrémité NH2. L'invention concerne également le gène de l'aconitase végétale et des fragments dérivés du gène, par exemple les introns, les séquences codantes, les régions promotrices du gène de l'aconitase et des gènes chimériques comprenant ces régions.

Description

ACONITASES VEGETALES ET ACIDES NUCLEIQUES CODANT POUR
CES ACONITASES
L'invention concerne l'aconitase végétale, des séquences d'acides nucléiques codant pour l'aconitase, ainsi que le gène de l'aconitase et des fragments dérivés de ce gène. L'invention concerne aussi les régions promotrices du gène de 1'aconitase et des gènes chimériques comprenant cette région promotrice. En outre, l'invention vise un procédé pour modifier le métabolisme d'une plante par l'introduction, dans la plante, d'une séquence d'acide nucléique capable de modifier l'expression naturelle du gène de 1'aconitase.
L'aconitase, (E.C.4.2.I.3.), également connu sous le nom d'aconitate hydratase ou citrate (isocitrate) hydro-lyase, est une protéine à centre fer-soufre catalysant la réaction d'interconversion réversible du citrate en isocitrate via le cis-aconitate comme intermédiaire. Depuis plusieurs années, les recherches ont conduit à la mise en évidence non seulement d'une aconitase mitochondriale (intervenant dans le cycle de Krebs) mais également d'une aconitase cytosolique, qui, chez les animaux, possède une double fonctionnalité : une activité d'aconitase, dont le rôle physiologique n'est pas connu, et une activité "Iron Responsive Elément - Binding Protein" (IRE-BP) permettant une régulation post-transcriptionnelle dans le métabolisme du fer. Chez l'homme, l'IRE-BP existe dans deux états conformationnels, appelés des "isoformes", et correspondant à un état de réduction.
Chez les animaux et chez certains micro¬ organismes, les aconitases mitochondriales et cytosoliques ont pu être purifiées et clonées. Par exemple, l'aconitase mitochondriale de porc (Zheng et al. 1990, J. Biol. Che ., 265 : 2814-2821) et de levure (Gangloff, 1990, PNAS, 85 : 8998-9002) a été clonée, ainsi que l'aconitase cytosolique humaine (Rouault et al., 1990, PNAS, 87 : 7958-7962) et bactérienne (Promodrou et al., 1991, J. Gen. Microbiol., 137 : 2505-2515).
Chez les animaux, l'aconitase cytosolique et l'aconitase mitochondriale sont codées par deux gènes différents et sont facilement separables, par exemple par chromatographie sur DEAE - cellulose.
En ce qui concerne l'aconitase végétale, très peu d'informations sont disponibles à l'heure actuelle. Chez les plantes, il existe aussi une activité aconitase mitochondriale, intervenant dans le cycle de Krebs, et une activité aconitase cytosolique, intervenant dans le cycle du glyoxylate. Le fait qu'aucune activité aconitase ne soit détectée dans les glyoxysomes suggère que le cycle du glyoxylate est détournée via le cytosol (Courtois - Verniquet et Douce, 1993, Biochem. Journal, 294 : 103-107).
Un certain nombre de différences dans les propriétés structurales des aconitases mitochondriales d'origine animale et végétale, en particulier dans la structure Fer-Soufre, ont pu être mises en évidence (Brouquisse et al., 1986, Plant Physiol., 81 : 247-252) . De plus, contrairement aux travaux réalisés dans le domaine animal, les formes mitochondriale et cytosolique de l'aconitase végétale n'ont pu, jusqu'à présent, être séparées par chromatographie d'échange d'ions sur DEAE (Brouquisse et al., 1987, Plant Physiol., 84 : 1402-1407), les deux formes présentant les mêmes pics d'élution. Ces résultats suggèrent que la forme mitochondriale et la forme cytosolique de l'aconitase végétale ont des structures très voisines.
A ce jour, les aconitases de deux espèces végétales ont été purifiées. L'aconitase mitochondriale de pomme de terre a pu être purifiée à partir de mitochondries de tubercules (Verniquet et al., 1991, Bioche . J., 276 : 643-948). Il s'agit d'une protéine monomérique d'un poids moléculaire d'environ 90KDa, de nature acide, se rapprochant des aconitases bactériennes et de levure.
De Bellis et al., 1993, Physiologia Plantarum, 88 : 485-492, ont purifié deux isoformes de 1'aconitase . à partir de cotylédons étiolés de citrouille. Ces deux isoformes ont un poids moléculaire voisin de lOOKDa et 98KDa avec des pi respectivement de 5.0 et 4.8. Selon ces auteurs, une troisième forme a également été détectée en gel non dénaturant mais n'a pas été purifiée. La localisation subcellulaire de ces isoformes n'a pas été clairement déterminée mais les auteurs supposent qu•il s'agit d1isoformes cytosoliques. La signification biologique de ces "isoformes" n'est pas élucidée.
Les informations disponibles aujourd'hui sur les aconitases végétales ne permettent donc pas de définir la relation entre la forme mitochondriale et la forme cytosolique. Il n'est pas connu si les deux formes sont codées par deux gènes différents, comme chez l'animal, ou s'il s'agit d'un seul gène. L'existence de différentes isoformes d'une même forme d*aconitase a été suggérée mais n'a pas été confirmée. De plus, l'aconitase de citrouille et celle de pomme de terre purifiées par De Bellis et par Verniquet, respectivement (supra) , présentent des carac¬ téristiques différentes, l'une de l'autre, suggérant une spécificité d'espèce. A ce jour, le degré d'homologie entre les différentes espèces végétales n'est pas connu
Jusqu'à présent, le clonage du gène de l'aconitase végétale n'a jamais été rapporté.
La présente invention concerne le clonage de l'ADNc de l'aconitase végétale et la caractérisation du gène, y compris la région promotrice.
Le clonage du gène a présenté un certain nombre de difficultés pratiques. Par exemple, la spécificité d'espèce de 1'aconitase suggérée dans 1'art antérieur empêche la transposition fiable d'information concernant une première espèce, sur une deuxième. Pour cloner l'ADNc de l'aconitase de melon, les inventeurs ont donc dû purifier l'aconitase à partir de graines de melon afin d'obtenir la séquence en acides aminés de l'extrémité NH2. Ceci a permis d'élaborer une série de sondes nucléiques dégénérées, mais aucune de ces sondes n'a permis d'identifier, parmi une banque d'ADNc, de clone positif. Une séquence partielle d'ADNc d'aconitase de melon a pu être identifiée en criblant une banque d'expression d'ADNc avec des anticorps polyclonaux, mais un clone complet de l'ADNc de l'aconitase n'a pas été identifié.
Une hybridation inter-spécifique, c'est-à-dire le criblage d'une banque d'ADNc d'Arabidopsis thaliana avec une sonde provenant de 1'ADNc de 1'aconitase de melon, a donc _ été ' effectuée. Les conditions d'hybridation inter-spécifique ont été spécialement conçues pour cette étape du clonage parce que l'homologie entre les séquences n'était pas connue. Un clone entier d'ADNc d'Arabidopsis thaliana a pu ainsi être identifié. Cet ADNc a ensuite servi de sonde pour cribler une banque génomique d'Arabidopsis thaliana et a permis l'identification du gène, y compris la région promotrice. A partir de ce gène, les inventeurs ont identifié un couple d'amorces qui a pu être utilisé chez d'autres espèces notamment chez le maïs, dans une réaction d'amplification, permettant l'identification du gène de 1*aconitase d•autres espèces.
Les résultats de ces travaux ont permis aux inventeurs : d'effectuer des recherches d'homologies de séquence entre les aconitases de différentes espèces. Il a été démontré que l'aconitase d'Arabidopsis thaliana présente, au niveau de la protéine, une forte homologie (70 %) avec l'IRE-BP humaine, et avec l'aconitase d'autres espèces végétales (90 % environ). Les protéines végétales sont plus proches des aconitases cytosoliques animales que des aconitases mitochondriales animales. Ces résultats suggèrent que l'aconitase végétale, en particulier l'aconitase cytosolique, joue le rôle d'une IRE-BP et permet une régulation post-transcriptionelle dans le métabolisme d'ions métalliques tels que le fer, ou bien qu'elle joue le rôle d'une RNA-BP, se fixant à une structure proche ou similaire des IRE animales, qui interviendrait dans une régulation post- transcriptionnelle du métabolisme de la plante ou de la graine ;
- de caractériser le gène de l'aconitase chez Arabidopsis thaliana. Sa structure est très complexe, comportant 20 expns et' 19 introns. Cinq départs de transcription ont été cartographiés, dont un est utilisé préférentiellement. Un fragment présentant une activité promotrice a été identifié. Ce promoteur permet une expression constitutive particulièrement forte lors de la germination des graines et de la maturation des grains de pollen ;
- de mettre en évidence l'existence d'un clone putatif dont l'initiation de transcription se situerait en amont de la TATA box identifiée. Ce gène pourrait donc coder pour les deux formes protéiques, son expression étant éventuellement dirigée par deux promoteurs ; d'émettre l'hypothèse que la forme mitochondriale de l'aconitase se différencie de la forme cytosolique essentiellement par la présence, à l'extrémité NH2, d'un peptide signal mitochondriale.
- de caractériser le gène de l'aconitase chez le maïs et ainsi, de faire une comparaison entre l'aconitase de plantes dicotylédones et celle de plantes monocotyledones. La protéine est extrêmement conservée (90% d'homologie) entre les deux types de plantes, et présente des régions spécifiques aux plantes, et d'autres conservées, parmi toutes les espèces étudiées, y compris les animaux et les micro¬ organismes. Au niveau du gène, l'organisation génomique est identique chez les monocotyledones et chez les dicotylédones.
L'objet de la présente invention est une protéine ayant une activité enzymatique d'aconitase. Plus particulièrement l'invention concerne une protéine ayant une activité enzymatique d'aconitase caractérisée en ce qu'elle comporte, soit i) la séquence en acides aminés illustrée dans la figure 1 ou une séquence présentant au moins 75 % d'homologie avec celle-ci, soit : ii) une variante de la séquence i) comportant une délétion jusqu'à 40 acides aminés environ au niveau de 1'extrémité NH2.
Dans le contexte de la présente invention, une activité enzymatique d'aconitase est définie comme étant la capacité de catalyser la réaction d'isomérisation du citrate en iso-citrate via le cis- aconitate. Cette activité peut être dosée par la méthode décrite par Rose et O'Connel (J. Biol. Chem. ,
242 : 1870-1879, 1967). Cette méthode fait appel au couplage de plusieurs réactions enzymatiques décrites ci-dessous :
Aconitase
Citrate > Isocitrate
<
Isocitrate déshydrogénase Isocitrate > α-cétoglutarate
NADP NADPH2
La réduction du NADP est suivie par spectrophotométrie à 340nm.
Une autre méthode de dosage d'activité enzymatique de l'aconitase est celle décrite par Kennedy et al. (J. Biol. Chem., 258 : 11098-11105, 1983) qui permet de suivre à 240 nm l'apparition du cis-aconitate à partir de 1'isocitrate. La réaction enzymatique se déroule à 25° C dans un tampon phosphate 50mM à pH 6 avec isocitrate 50mM comme substrat. Le coefficient d'extinction molaire du cis- aconitate est donné comme étant égal à 3,6mM"1, une unité enzymatique (U) correspondant à la formation d'une micro-mole de cis-aconitate par minute. Ce dosage, facile à mettre en oeuvre, est utilisé pour déterminer les constantes enzymatiques de 1'aconitase et pour suivre sa purification.
La protéine de l'invention, outre son activité d*aconitase, peut également présenter une activité d'IRE-BP, c'est-à-dire, est capable de se fixer à des ARNm ayant une structure secondaire voisine de celle de 1»iron-responsive élément (IRE) animal.
La protéine de l'invention, ayant une activité enzymatique d'aconitase, peut être celle dont la séquence en acides aminés est illustrée dans la figure 1, et qui représente l'aconitase d'Arabidopsis thaliana.
L'invention englobe également des protéines présentant au moins 75 % d'homologie avec la séquence illustrée dans la figure 1 et ayant une activité d'aconitase. Dans le contexte de la présente invention, le pourcentage d'homologie entre deux séquences d'acides aminés est calculé comme étant le nombre d'acides aminés identiques plus le nombre d'acides aminés similaires dans l'alignement des deux séquences, divisé par la longueur des séquences entre deux positions données. Si, entre les deux positions données, les deux séquences n'ont pas la même longueur, le pourcentage d'homologie est le nombre d'acides aminés identiques et similaires, divisé par la longueur de la séquence la plus longue. Les acides aminés "similaires" sont connus dans l'art, voir par exemple R.F. Feng, M.S. Jobson and R.F. Doolittle, 1985, J. Mol. Evol., 21 : 112-115. Ils sont normalement considérés comme étant ceux qui, au sein d'une matrice de permutation, ont un coefficient de substitution positif.
De préférence, les protéines homologues de l'invention présentent au moins 80, et plus particulièrement au moins 85, par exemple 90 ou 95 % d'homologie, et de préférence au moins 80% par exemple 85% ou 90% d'identité, avec celle illustrée dans la figure 1.
Comme protéines préférées de l'invention, on peut aussi citer les deux aconitases de melon purifiées par les inventeurs à partir de graines de melon. Les deux formes semblent avoir en commun une même séquence en acides aminés. La séquence partielle en acides aminés est illustrée dans la figure 2. Elle présente 86,5 % d'identité avec celle d'Arabidopsis thaliana (91,8 % d'homologie). Les deux formes d'aconitase de melon purifiées par les inventeurs, selon la méthode décrite dans les exemples plus loin, ont un poids moléculaire apparent estimé en gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes voisin de 97KDa. Les points isoélectriques de ces deux protéines (appelées "Acol" et "AcoII") sont estimés respectivement à 5,2 et 5.0.
Comme autre exemple de protéine préférée de l'invention, on peut citer l'aconitase de maïs (figures 18 et 20)
Les protéines présentant au moins 75 % d'homologie avec celle de la figure 1 comprennent aussi l'aconitase d'autres espèces végétales, en particulier les Angiospermes. On peut citer en particulier l'aconitase des dicotylédones comprenant les légumineuses, les crucifères, les solanacées, les cucurbitacées, les chénopodiacées, les ombellifères, le tournesol, le soja. Les cucurbitacées et les espèces du genre Brassica, par exemple B. napus, B. oleracea etc.. sont particulièrement préférées. On peut aussi citer l'aconitase des monocotyledones comprenant les céréales telles que le blé, le maïs, l'orge, le triticale et le riz.
Les protéines de 1•invention peuvent également être définies comme étant des protéines ou des enchaînements protéiques comportant au moins l'une des séquences protéiques suivantes, ou une séquence présentant au moins 60%, et de préférence au moins 70% ou 80% d'homologie avec l'une de ces séquences, ces séquences étant spécifiques aux aconitases végétales :
I : DTVSMIEAYLRANKMFVDYSEPESKTVYSSCLELNLEDVE
II : PLKEMKADWHSCLDNRV III : AVPKEAQSKAVEFNFNGTTAQLR
IV : KGMTMSPPG
V : AWMMRL REHFANIRIVNKHLKGEVG
VI : NVSEIKPGQDVTWTNN
VII : les acides aminés 1 à 40 de l'extrémité NH2 de la protéine illustrée dans la figure 1.
Ces séquences se trouvent aux positions suivantes de l'aconitase d'Arabidopsis thaliana illustrée dans la figure 2 :
I : 361-400
II : 414-430
III : 436-458
IV : 683-691
V : 745-771
VI : 875-891
Outre les régions spécifiques aux plantes, les protéines de 1'invention renferment également plusieurs zones hautement conservés au sein de toutes les espèces étudiées. Ces zones seront appelées dans ce qui suit "régions conservées du point de vue phylogénétique". Il s'agit de séquences d'acides aminés ayant une longueur d'au moins 7 acides aminés et étant conservées avec au moins 75% d'homologie (environ 60% d'identité), et souvent au moins 80% d'homologie, chez les plantes, les animaux et les micro-organismes. Comme exemple de ce type de région, on peut citer les séquences suivantes (les numéros entre parenthèses étant les acides aminés d'A. thaliana, numérotés selon la figure 2) :
VIII : PGSGIVHQVNLE (acides aminés 204 à 216) ,
IX : GTDSHTTMIDGLG (acides aminés 236 à 248) X : DSITTDHISPAG (acides aminés 406 à 417)
XI : GSGSSRD (acides aminés 808 à 814) L'invention englobe également des variantes de la séquence illustrée dans la figure 1 et de celles présentant au moins 75 % d'homologie avec celle-ci, les variantes comportant une délétion de jusqu'à 40 acides aminés environ au niveau de l'extrémité NH2. Cette délétion n'affecte pas l'activité enzymatique d'aconitase de la protéine. Du point de vue physiologique, cette délétion correspond soit à l'élimination du peptide signal mitochondrial soit à l'élimination de la partie de la séquence qui différencie la forme mitochondriale de la forme cytosolique. De préférence, la délétion s'étend de l'acide aminé 1 à l'acide aminé 30 environ.
Pour Arabidopsis thaliana, la délétion au niveau de l'extrémité NH2 s'étend de préférence de l'acide aminé 1 à l'acide aminé 27 (numérotation selon la figure 1) ou encore de l'acide aminé 1 à l'acide aminé 29. En effet, les inventeurs démontrent que la forme mitochondriale de 1•aconitase d'Arabidopsis thaliana démarre à l'acide aminé 28 (Ser Ser Met...). Ceci signifie que les acides aminés 1 à 27 correspondent vraisemblablement au peptide signal mitochondrial. La forme cytosolique de l'aconitase d'Arabidopsis thaliana démarre vraisemblablement à l'acide aminé 30 (Met) .
Dans ce qui suit, les protéines ayant une activité d'aconitase et comportant la séquence de la figure 1, ou une séquence présentant au moins 70 % ou 75% d'homologie avec celle-ci, ou encore les variantes comportant une délétion NH2-terminale, seront appelées "les protéines de l'invention". L'invention concerne également des fragments protéiques, ou des "enchaînements d'acides aminés", comprenant au moins 6 acides aminés de la protéine de l'invention, et de préférence au moins 8 ou au moins 10 acides aminés. La longueur maximale des fragments de 1•invention correspond à la longueur de la protéine entière moins un acide aminé. Typiquement, les fragments de 1•invention ont une longueur comprise entre 10 et 900 acides aminés, par exemple entre 20 et 800, ou entre 30 et 500 acides aminés, notamment 50, 200, 300, 400, etc.. acides aminés. Les fragments protéiques de longueur importante, par exemple au-delà de 500 acides aminés, peuvent éventuellement présenter une activité enzymatique d'aconitase. Les fragments peuvent donc être des peptides, des polypeptides ou des protéines. Ces fragments protéiques peuvent être reconnus par des anticorps capables de reconnaître la protéine entière, les fragments présentant donc une homologie immunologique avec la protéine "mère".
Selon une variante de l'invention, les fragments ont une longueur comprise entre 6 et 40 acides aminés et présentent, sur toute leur longueur, une homologie d'au moins 90%, et de préférence au moins 90% d'identité, avec la partie correspondante de la protéine de la figure 1. L'expression "la partie correspondante" signifie la partie de la protéine illustrée dans la figure 1 avec laquelle l'alignement est fait pour calculer 1'homologie. Ces fragments ont typiquement une longueur comprise ente 8 et 30 acides aminés.
Exceptionnellement, les fragments de l'invention peuvent avoir une longueur inférieure à 40 acides aminés et ne présenter que 60% d'homologie avec la partie correspondante de la protéine de la figure l. Ceci est le cas lorsqu'il s'agit de fragments correspondant aux régions de la protéine spécifiques aux plantes. Dans le contexte de l'invention, "spécifique aux plantes" signifie une séquence d'acides aminés ayant une longueur d'au moins 6 et de préférence au moins 8 acides aminés, présentant moins de 40%, et souvent moins de 30% d'homologie avec les séquences correspondantes chez les mammifères et chez les organismes unicellulaires. Au sein du règne végétal, ces régions sont conservées avec une homologie d'au moins 60%, typiquement au moins 80%. Les régions spécifiques aux aconitases végétales comprennent les séquences suivantes :
I : DTVSMIEAYLRANKMFVDYSEPESKTVYSSCLELNLEDVE
II : PLKEMKAD HSCLDNRV
III : AVPKEAQSKAVEFNFNGTTAQLR
IV : KGMTMSPPG
V : AWMMRL REHFANIRIVNKHLKGEVG
VI : NVSEIKPGQDVTWTNN dont les emplacements ont été indiqués plus haut.
Selon ce dernier mode de réalisation, le fragment peut être constitué d'un fragment de l'extrémité NH2 de la protéine illustrée dans la figure 1, l'expression "extrémité NH2", signifiant la partie de la protéine s'étendant de l'acide aminé 1 à l'acide aminé 40, par exemple entre 1 et 30. Le fragment peut également être constitué d'un sous-fragment d'une séquence ayant une longueur de 40 acides aminés environ et présentant au moins 60 % d'homologie avec l'extrémité NH2 de la protéine illustrée dans la figure 1. Le fragment NH2-terminal a normalement une longueur comprise entre 6 et 40 acides aminés, par exemple 30. De préférence, ces fragments présentent au moins 70 %, et plus particulièrement au moins 80 % d'homologie, avec les acides aminés 1 à 40 de celle illustrée dans la figure 1. L'extrémité NH2 correspond vraisemblablement au peptide signal mitochondrial responsable du transport de 1*aconitase dans les mitochondries. Les fragments selon cet aspect de 1'invention constituent donc des peptides signaux et peuvent être utilisés, par exemple dans la production de protéines de fusion pour assurer le transport dans les mitochondries.
Selon une autre variante de l'invention, les fragments protéiques ont une longueur supérieure à 40 acides aminés, par exemple 40 à 100, et présentent sur toute leur longueur au moins 75%, et de préférence au moins 80 ou 90% d'homologie avec la partie correspondante de la protéine de la figure 1. Comme exemples de ce type de fragment, on peut citer la moitié NH2 terminale de la protéine, la moitié COOH terminale ou encore la partie centrale.
Les enchaînements d'acides nucléiques de l'invention peuvent comprendre, outre le fragment dérivé de l'aconitase végétale décrite ci-dessus, d'autres régions ne présentant aucune relation avec l'aconitase. Cette variante englobe des protéines de fusion et d'autres protéines "hybrides".
Les protéines et fragments protéiques de 1*invention peuvent être obtenus par purification à partir de la plante, en mettant en oeuvre le protocole expérimental décrit dans les exemples ci-dessous, suivi éventuellement par un clivage de la protéine pour obtenir des fragments. Ils peuvent également être produits par voie recombinante après 1'insertion dans un hôte cellullaire compétent d'une séquence d'acide nucléique appropriée suivie de la purification de la protéine ainsi produite. Ils peuvent également être obtenus par synthèse chimique.
Outre les protéines et fragments protéiques, 1•invention concerne également les gènes de l'aconitase végétale, et toutes les séquences d'acide nucléique dérivées de la séquence génomique, toutes les séquences codantes y compris les séquences dégénérées, les séquences régulatrices, les introns, les séquences susceptibles de s'hybrider avec le gène de l'aconitase végétale et des fragments de ces séquences.
Plus particulièrement, l'invention concerne une séquence d'acide nucléique caractérisée en ce qu'elle comporte soit : i) une séquence qui, le cas échéant après transcription, épissage et traduction, donne lieu à la protéine de l'invention, soit ii) le transcrit de la séquence i) ou son équivalent ADNc, soit iii) une séquence complémentaire de la séquence i) ou ii) , soit iv) une séquence ayant une longueur d'au moins 25 bases et capable de s'hybrider, sur toute sa longueur, avec les séquences i) , ii) ou iii) dans des conditions stringentes ou moyennement stringentes, soit v) un fragment consistant en au moins 6, et de préférence au moins 25 ou 30, nucléotides consécutives de l'une quelconque des séquences i) , ii) , ou iii).
Le terme acide nucléique signifie dans le cadre de la présente invention de l'ADN ou de l'ARN, ou éventuellement un mélange des deux.
Selon cet aspect de l'invention, une séquence d'acides nucléiques du type i) est la séquence génomique d'Arabidopsis thaliana illustrée dans la figure 1 ou celle du maïs illustrée dans la figure 18. On peut aussi citer les séquences génomiques végétales du gène de l'aconitase chez d'autres espèces, par exemple les monocotyledones, telles que les céréales etc..., et dicotylédones, par exemple de nombreux légumes. Ces séquences peuvent être identifiées par l'utilisation d'une réaction d'amplification d'acide nucléique, de préférence Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) , les amorces et les conditions étant, par exemple, celles utilisées dans l'exemple 11 plus loin, le substrat étant de l'ARN poly A+. On peut également utiliser d'autres amorces dérivées du gène de l'aconitase végétale, par exemple les séquences codant pour tout ou partie des enchaînements d'acides aminés I à XI cités ci-dessus.
Les séquences génomiques peuvent également être identifiées chez des espèces autres que celles spécifiquement exemplifiées dans cette demande par l'utilisation d'une sonde spécifique au gène de l'aconitase végétale, par exemple une sonde contenant les séquences I à VI citées ci-dessus. Les conditions d'hybridisation sont celles citées dans l'exemple 6.
Comme exemple de séquences d'acide nucléique du type ii) , on peut citer les transcrits (mRNA) du gène de l'aconitase végétale, ou son équivalent en ADNc, par exemple les ADNc illustrés dans les figures 3 et 4, ainsi que toutes les séquences dégénérées capables de coder pour la protéine de la revendication 1. Les séquences du type ii) englobent également le transcrit primaire (pré-mRNA) c'est-à-dire le transcrit de l'ADN génomique avant épissage. Le pré-mRNA contient notamment les introns.
L'invention englobe également les séquences du type iii), c'est-à-dire les séquences complémentaires des séquences i) et ii) . L'expression "complémentaire" signifie normalement une complémentarité de 100 %, mais peut également signifier un degré de complémentarité suffisamment élevé pour permettre l'hybridation stable entre la séquence et sa séquence complémentaire dans des conditions stringentes. La présence d'un certain nombre de mesapariements, par exemple jusqu'à 10 %, ou éventuellement jusqu'à 20 %, peut être tolérée.
L'invention concerne également des séquences du type iv) , c'est-à-dire des séquences d'acides nucléiques ayant au moins 25 bases et étant capables de s'hybrider avec les séquences i) , ii) et iii) telles que définies ci-dessus, dans des conditions stringentes ou moyennement stringentes. De préférence, ces séquences ont une longueur entre 25 et 1000 bases, par exemple 30 à 900 ou 50 à 500.
Les conditions stringentes sont les suivantes :
- l'hybridation s'effectue sur les filtres de nitro-cellulose dans 20ml de solution d'hybridation (SSC 6X, SDS 5%, DENHARDT 5X, ADN de spermes de saumon 50mg/ml) .
- une pré-hybridation de 4 heures est suivie d'une hybridation de 12 heures (solution contenant la sonde marquée) à la température de 68°C.
Les filtres subissent les lavages suivants :
- 2 lavages de 30 n dans une solution SSC 2X à 68°C ;
- un lavage de 30 mn dans une solution SSC 2X, SDS 0.1% à 68°C ;
- un lavage de 30 mn dans une solution SSC 0.1X, SDS 0.1% à 68°C.
Les conditions de moyenne stringence (à appliquer par exemple lors du criblage d'une banque provenant d'une espèce végétale avec une sonde provenant d'une autre espèce végétale) sont les suivantes : - les conditions d'hybridation se font en faisant varier la concentration de formamide 10, 20, 30, 40, 50 % à une température fixe de 40°C dans un tampon d'hybridation SSC 6X, SDS 0.1%, DENHARDT 5X, ADN de spermes de saumon 50mg/ml.
- une pré-hybridation de 4 heures est suivie d'une hybridation de 12 heures.
Les conditions de lavage sont les suivantes :
- un lavage de 30 mn dans une solution SSC 2X à
42°C
- un lavage de 30 mn dans une solution SSC IX à
42°C
- un lavage de 30 mn dans une solution SSC 0.1X à
42°C
- un lavage de 30 mn dans une solution SSC 0.1X, SDS 0.1% à 68°C.
Ces conditions de stringence permettent d'identifier les séquences codant pour l'aconitase chez une espèce végétale par le criblage d'une banque d'ADNc de cette espèce avec une sonde provenant d'une autre espèce végétale.
En général, les conditions stringentes permettent l'hybridation de deux séquences d'acide nucléique présentant au moins 85%-90% d'homologie. Les conditions moyennement stringentes permettent l'hybridation de séquences présentant au moins 60% ou au moins 65% d'homologie. Dans le contexte de l'invention, "homologie" au niveau de l'acide nucléique signifie identité.
L'invention vise également des séquences du type (v) , c'est-à-dire des fragments d'acide nucléique consistant en au moins 6, et de préférence au moins 20, 25 ou 30, par exemple 40, 50, 60 ou plus nucléotides consécutives de l'une quelconque des séquences (i) , (ii) , ou (iii) précédemment décrites. Avantageusement, le fragment comporte entre 10 et 500 nucléotides, par exemple entre 30 et 300.
Le fragment peut être capable de jouer le rôle d'amorce dans une réaction d'amplification d'acide nucléique. Dans ce cas, un couple de fragments est utilisé, chaque séquence ayant une longueur de 15 à 300 bases environ, de préférence entre 18 et 50 bases. Les fragments choisis comme amorces doivent avantageusement correspondre à des zones de la protéine séparées les unes des autres par moins de 900 acides aminés, de préférence moins de 500, par exemple une cinquantaine d'acides aminés.
Le fragment dérivé du gène de 1'aconitase peut faire partie d'une séquence "hybride" plus grande, comportant d'une part au moins un fragment selon l'invention et d'autre part, une ou plusieurs séquences ne présentant pas d'apparenté avec le gène de l'aconitase, par exemple une séquence dérivée d'un deuxième gène.
Le fragment peut être marqué par des moyens connus en soi, par exemple des moyens radioactifs, fluorescents, enzymatiques, ou par un marquage à l'avidine ou à la biotine. Selon cet aspect de l'invention, le fragment marqué sert de sonde nucléotidique. Dans ce cas, la longueur du fragment est de préférence comprise entre 6 et 900 bases, par exemple entre 50 et 350 bases.
Selon une variante préférée de l'invention, la séquence d'acide nucléique est une séquence dite "complémentaire" qui comporte un ou plusieurs fragments ayant une longueur d'au moins 6 nucléotides, par exemple au moins 10 nucléotides, le(s)dit(s) fragment(s) étant complémentaire(s) d'une partie, au moins, du transcrit du gène de l'aconitase. Ce genre de structure, capable d'inhiber l'expression du gène 20 de l'aconitase, englobe plus particulièrement des séquences antisens et des ribozymes dirigés contre le transcrit du gène de l'aconitase.
Dans le cas de l'antisens, la séquence comporte normalement un seul fragment, complémentaire d'une partie au moins, du transcrit, ce fragment ayant une longueur d'au moins une vingtaine de nucléotides. Plusieurs séquences antisens peuvent être reliées les unes aux autres soit de manière contigùe, soit en alternance avec d'autres séquences.
De préférence, la séquence inhibitrice est un ribozyme dirigé contre le transcrit du gène de l'aconitase, le ribozyme comprenant une séquence complémentaire d'une partie au moins du transcrit du gène de l'aconitase et, incluse au sein de cette séquence complémentaire, une région catalytique provenant d'un ribozyme, de préférence un ribozyme du type tête de marteau (voir par exemple EP-A-321 201) . Le ribozyme peut être un mono-ribozyme ou un poly- ribozyme.
Selon l'invention, les séquences antisens et les ribozymes sont normalement produits in-vivo par la transcription de la séquence d'ADN correspondante, insérée de manière stable dans le génome de la plante. La traduction du transcrit du gène de l'aconitase est alors empêchée, soit par l'hybridation de la séquence antisens, soit par le clivage du transcrit par le ribozyme, affectant ainsi le fonctionnement du cycle de Krebs et du cycle glyoxylate, ainsi que la ou les voie(s) métabolique(s) régulée(s) post- transcriptionnellement par l'aconitase cytosolique grâce à son activité RNA-binding. L'inhibition de la production d'aconitase conduit à une réduction du taux de production des acides organiques de ces deux cycles, mais à une augmentation de la production de l'acétyl coenzyme-A. Ce dernier est le produit de la dégradation des squelettes carbonés de plusieurs voies du catabolisme, par exemple la glycolyse, le cycle des pentoses, la 0-oxydation des lipides et le catabolisme des protéines. La dégradation de ces substances peut être donc indirectement modifiée par l'inhibition de l'expression de l'aconitase.
La mise en oeuvre et les applications de la séquence inhibitrice est décrite en détail plus loin.
Selon un mode de réalisation préférée de l'invention, le fragment d'acide nucléique est un fragment de la séquence génomique du gène de l'aconitase végétale, par exemple celle illustrée dans la figure 1 ou celle illustrée dans la figure 18. Le fragment génomique comporte au moins 25 nucléotides et de préférence au moins 30, par exemple entre 50 et 500 ou plus, sauf s'il s'agit d'une partie d'une région non codante ou d'un intron de la séquence génomique, auquel cas, le fragment peut avoir une longueur d'au moins 10 nucléotides.
Les introns du gène de 1•aconitase végétale constituent des fragments préférés de l'invention. Il a été constaté que 1•organisation génomique du gène de 1•aconitase est identique chez Arabidopsis (dicotylédone) et chez le maïs (monocotylédone) , les introns se positionnant exactement de la même manière.
Chez les monocotyledones et chez les dicotylédones, le gène de l'aconitase contient un nombre d'introns particulièrement élevé : environ 19 à 20. L'aconitase représente donc une source d'introns très riche. Par ailleurs, l'épissage des introns doit être particulièrement efficace dans la mesure où le gène est exprimé de manière constitutive.
L'invention englobe donc les introns des gènes d'aconitase végétale, y compris les signaux d'épissage, et des fragments des introns comprenant au moins 10, et de préférence au moins 30 bases. En général, la longueur des introns varie entre 70 et 500 bases environ. Selon cette variante, les séquences comprenant le ou les introns peuvent également comprendre les séquences qui, dans le génome, jouxtent immédiatement l'intron. Le fragment peut alors comprendre de part et d'autre de 1•intron, une séquence correspondant à une partie de 1'exon qui naturellement jouxte l'intron, cette séquence ayant de préférence une longueur comprise entre 1 et 100 bases, par exemple 5 à 50.
Comme exemple d'introns de l'invention, on peut citer ceux d'Arabidopsis et de maïs (voir tableau III, exemple 12) . On peut également citer les introns d'autres espèces, les séquences génomiques pouvant être identifiées de la manière indiquée dans l'exemple 12.
Les introns du gène de 1'aconitase végétale peuvent être utilisés comme éléments susceptibles d'augmenter l'efficacité d'expression d'une séquence hétérologue chez une plante. En effet, il a été démontré, particulièrement chez les monocotyledones que l'insertion d'un intron dans la partie 5'non traduite d'un gène, c'est-à-dire entre le site d'initiation de transcription et le site d'initiation de traduction, conduit à une amélioration de la stabilité du messager, et par conséquent, à une meilleure expression. Le ou les introns utilisés de cette manière proviennent de préférence d'une monocotylédone telle que le maïs. Il s'agit de préférence, mais pas obligatoirement, du premier intron du gène. Le premier intron du gène de 1'aconitase de maïs peut être obtenu par séquençage de la partie du gène qui se trouve en amont de la séquence génomique partielle de la figure 18 contenue dans le clone RI (voir exemple 12) . Le séquençage complet du fragment SalI-HindIII de 6800 pb (HindIII = position 2841) devrait permettre l'obtention du premier intron et du promoteur (voir exemple 12) .
Comme autre exemple de fragment d'acide nucléique non-codant, on peut citer le fragment -85 à +1, par exemple -85 à -52, de la séquence de la figure 1. Il a été constaté que cette région présente une structure secondaire typique des IRE (Iron Responsive Elément) . Il se pourrait que cette partie de la séquence soit spécifique du messager de l'aconitase mitochondriale, auquel cas un ribozyme dirigé spécifiquement contre cette région, ou une partie, par exemple la région -49 à +1, permettrait d'inhiber spécifiquement l'activité mitochondriale.
Un autre fragment particulièrement préféré est le fragment HindIII - BglII (-1293 à +45 de la séquence génomique de la figure 1) , ou le fragment correspondant dans des séquences codant pour des protéines homologues. Le promoteur du gène de l'aconitase se trouve au sein de ce fragment. Ce fragment peut être utilisé en tant que tel comme promoteur pour obtenir l'expression de séquences codantes hétérologues chez les plantes.
Des fragments de plus petite taille peuvent également être utilisés à condition que l'activité promotrice soit conservée. Ces "sous-fragments" peuvent être identifiés par la fusion du sous-fragment en question avec la séquence codante d'un gène rapporteur tel que celui du beta glucuronidase, et la détection de l'expression du gène rapporteur dans des cellules végétales. La délétion, au sein du fragment Hind III - Bgl II, de 100 à 300 nucléotides du coté 5' donne lieu normalement à des sous-fragments ayant une activité promotrice. Il est préférable de préserver la phase de lecture pour tester le fragment choisi.
Il est également possible, selon l'invention, d'utiliser deux régions promotrices en tandem pour augmenter le niveau d'expression.
Le promoteur conduit à une expression constitutive et est fortement exprimé à la fois lors de la germination des graines et lors de la maturation de la graine et des grains de pollen. Il est donc particulièrement avantageux d'utiliser la région promotrice de 1•invention pour obtenir une forte expression pendant cette période de la vie de la plante. Les tissus de la graine, où l'expression dirigée par le promoteur est particulièrement forte, sont les cotylédons, l'albumen ou 1'endo-sperme, et 1•embryon.
Le fragment promoteur est de préférence utilisé pour diriger une expression constitutive, soit dans le cytoplasme, soit dans les mitochondries, soit dans les deux à la fois. Pour obtenir l'expression d'une protéine hétérologue dans les mitochondries, la séquence codant pour le peptide signal mitochondrial de l'aconitase est fusionnée à l'extrémité 5' de la séquence codante.
Il peut également être envisagé d'utiliser des fragments promoteurs s'étendant plus en amont du site HindIII (-1293) . Les inventeurs ont identifié un clone par la technique RACE dont 1'extrémité 5' sur la séquence génomique se situe en position -52 en amont de la première TATA box. Ceci laisse suggérer qu'une initiation de la transcription peut avoir lieu plus en amont. Ces résultats indiquent l'existence éventuelle d'un deuxième promoteur qui pourrait être responsable de la transcription de 1'une des deux formes de l'aconitase à partir du gène. Ce deuxième promoteur fait également partie de l'invention.
Le promoteur du gène de l'aconitase de maïs fait également partie de l'invention. Il est compris dans la partie amont de la séquence génomique de la figure 18, notamment au sein du fragment SalI-HindIII cité dans 1'exemple 12.
Les régions promotrices de 1'invention sont normalement utilisées sous forme de gène chimérique. Ces gènes chimériques comportent : i) une région promotrice selon l'invention, et ii) une séquence hétérologue transcrite, codante ou non, placée sous le contrôle dudit promoteur.
L'expression "séquence hétéroloque transcrite, codante ou non" signifie dans le contexte de la présente invention toute séquence transcrite autre que celles normalement associées avec le promoteur de l'aconitase dans la plante. Cette expression englobe des séquences non-codantes telles que des ribozymes ou des séquences antisens, dirigées contre un transcrit d'intérêt, ainsi que des séquences codantes.
Comme exemples de séquences codantes, on peut citer :
- des gènes rapporteurs tel que Gus codant pour le Beta glucuronidase ;
- des séquences conférant une résistance à un antibiotique, par exemple la résistance à la anamycine, la gentamycine, le G418, etc.. ;
- toutes séquences codantes conférant des traits intéressants du point de vue agronomique, par exemple des séquences impliquées dans la stérilité mâle, par exemple des gènes mitochondriaux non-édités, des séquences conférant une résistance à un virus ou aux herbicides etc. ; - des séquences codantes de gène de mammifères, par exemple l'interféron, l'hormone de croissance, l'insuline et tout autre produit susceptible d'être utile en tant que médicament.
Ces gènes chimériques permettent d'obtenir une forte expression dans les graines sèches.
L'invention concerne également des gènes chimériques capable d'être exprimés chez les plantes caractérisés en ce qu'ils comportent : i) un promoteur fonctionnel chez les plantes autre que celui naturellement associé avec le gène de l'aconitase, et ii) une séquence codant pour la protéine de l'invention, telle que définie ci-dessus, ou pour un fragment protéique, tel que défini ci-dessus.
Comme exemples de promoteur dans ce type de gène chimérique, on peut citer le promoteur du 35S, le promoteur NOS, des promoteurs semences spécifiques de la plante.
Comme promoteurs spécifiques de graines, on peut citer le promoteur du gène de la napin (EP-A-0255378) , ainsi que les promoteurs des gènes AT2S d'Arabidopsis thaliana, c'est-à-dire les promoteurs PAT2S1, PAT2S2, PAT2S3 et PAT2S4 (Krebbers et al., 1988, Plant Physiol., 87 : 859-866.
La séquence codante correspond à celle codant pour la protéine de 1'invention présentant une activité d'aconitase ou pour un fragment protéique présentant soit une homologie immunologique avec l'aconitase ou une activité d'aconitase.
L'invention concerne en outre des gènes chimériques capable d'être exprimés chez les plantes caractérisés en ce qu'ils comportent : i) un promoteur fonctionnel chez les plantes, ii) une séquence transcrite, codante ou non, placée sous le contrôle dudit promoteur, iii) un ou plusieurs introns du gène de l'aconitase végétale, tel(s) que défini(s) ci-dessus.
La présence d'un ou plusieurs introns stabilise 1'ARNm transcrit. Le ou les intron(s) peuvent être positionné(s) au sein de la séquence transcrite, ou peuvent être placé(s) entre le promoteur et le début de la séquence transcrite, comme indiqué ci-dessus.
L'invention vise également des plasmides ou vecteurs caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins l'une des séquences d'acide nucléique selon l'invention. De préférence, les plasmides et vecteurs permettent la transformation stable de la plante, par exemple les plasmides Ti d'Aqrobacterium, des vecteurs viraux tels que les Geminivirus ou le CaMV.
L'invention concerne également des cellules végétales et des plantes transgéniques transformées de manière stable par une séquence d'acide nucléique selon l'invention. Comme exemple de plantes transgéniques, on peut citer les espèces appartenant aux familles botaniques telles que les légumineuses (par exemple les haricots, pois, etc..), les crucifères (par exemple, les choux, radis, etc..), les solanacées (par exemple les tomates, pommes de terre, etc..) les cucurbitacées (par exemple le melon) , les chénopodiacées (par exemple la betterave potagère) , et les ombellifères (par exemple, les carottes, céleris, etc..). Les cucurbitacées et les Brassicae sont particulièrement préférés. On peut également citer les céréales telles que le blé, le maïs, l'orge, le triticale et le riz, et les oléagineux tels que le tournesol, le soja et le colza.
Tous les moyens connus pour introduire de l'ADN étranger dans des plantes peuvent être utilisés, par exemple A robacteriu , électroporation, fusion de protoplastes, bombardement avec canon à particules, ou pénétration d'ADN dans des cellules comme le pollen, la microspore, la graine et l'embryon immature, vecteurs viraux tels que les Geminivirus ou les virus satellites. Agrobacterium tumefaciens et rhizogenes constituent le moyen préféré. Dans ce cas, la séquence de 1*invention est introduite dans un vecteur approprié avec toutes les séquences régulatrices nécessaires telles que promoteurs, terminateurs, etc.. ainsi que toute séquence nécessaire pour sélectionner les transformants.
L'invention vise également des anticorps monoclonaux ou polyclonaux capable de reconnaître, de préférence de manière spécifique, la protéine et les fragments protéiques de l'invention. Ces anticorps sont produits selon les techniques habituelles dans l'art en utilisant, comme immunogène, la protéine purifiée selon les techniques décrites dans les exemples ci-dessous ou la protéine recombinante. La technique de purification de 1'exemple 1 ci-dessous conduit à la production de deux formes de 1'aconitase (appelées Acol et AcoII) . En utilisant l'une de ces deux protéines comme immunogène, il est possible, selon l'invention, de produire des anticorps monoclonaux capable de faire la distinction entre les deux formes. Ces anticorps monoclonaux spécifiques constituent des sondes immunologiques utiles pour étudier la localisation subcellulaire des deux formes enzymatiques, ou pour la purification.
De manière générale, les anticorps de l'invention peuvent être utilisés pour le crible de banques d'ADNc ou pour d'autres utilisations telles que l'étude de la parenté entre les aconitases de différentes espèces. Les protéines et acides nucléiques de 1'invention trouvent de nombreuses applications. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, les séquences d'acide nucléique et les gènes chimériques de l'invention sont utilisés dans un procédé pour la modification du métabolisme d'une plante. Ce procédé est caractérisé par l'introduction, dans la plante, d'un insert génétique comportant une séquence d'acide nucléique de l'invention.
La modification du métabolisme de la plante peut consister, par exemple :
- en la modification de la quantité d'aconitase produite par la plante ;
- en une modification de l'expression temporelle ou spatiale de 1'acitonase ;
- en une modification de la nature de l'aconitase produite.
De préférence, la modification consiste en une modification de la quantité d'aconitase produite par la plante. Il peut s'agir d'une augmentation ou d'une inhibition de la production d'aconitase.
Une augmentation est obtenue par 1'introduction dans la plante d'un insert génétique comprenant un promoteur fonctionnel chez les plantes, et sous le contrôle de ce promoteur, une séquence codant pour la protéine de l'invention. Le promoteur peut être celui naturellement associé avec le gène de l'aconitase végétale ou un promoteur hétérologue au gène de l'aconitase. Lorsque le promoteur est le prpmoteur naturel, 1'insertion de la séquence codante avec son propre promoteur conduit à une surproduction d'aconitase, l'expression des copies supplémentaires du gène de 1'aconitase étant spatialement et temporellement identique au gène endogène. En revanche, si le promoteur est hétérologue au gène de l'aconitase, il peut s'agir d'un promoteur constitutif ou encore d'un promoteur spécifique de certains tissus ou de certains stades de développement. Ceci permettra d'obtenir une expression temporelle et spatiale différente de celle produite par le gène endogène.
La séquence codante utilisée pour obtenir une surproduction d'aconitase peut être la séquence codante entière exemplifiée par celle illustrée dans la figure 1 ou peut correspondre à l'une des deux formes (mitochondriale ou cytosolique) permettant d'obtenir la surproduction dans une localisation subcellulaire définie. Les séquences codant pour les protéines présentant au moins 75 % d'homologie avec celle de la figure 1 peuvent également être utilisées.
Selon cet aspect de l'invention, la surproduction d'aconitase conduit à une surproduction d'au moins l'un des acides organiques du cycle de Krebs ou du cycle glyoxylate, notamment le citrate, 1'isocitrate, le succinate, le glyoxylate, le malate, 1'oxaloacétate, 1'α-cetoglutarate, le fumarate.
Cette variante de 1•invention constitue donc un procédé pour obtenir une surproduction d'acides organiques chez les plantes. Les acides ainsi obtenus peuvent ensuite être extraits de la plante, en faisant appel à des méthodes connues en soi, pour l'utilisation dans l'industrie agroalimentaire, par exemple en tant qu'addifif, antioxydants etc. La production de citrate est particulièrement préférée, par exemple en tant qu'additif pour des jus de fruits.
La quantité d'aconitase produite par la plante peut également être diminuée par l'utilisation d'un ribozyme ou d'une séquence antisens dirigé contre au moins une partie du transcrit du gène de l'aconitase. Les ribozymes et les séquences antisens ont la structure décrite plus haut. Ces séquences inhibitrices peuvent être utilisées dans un gène chimérique selon l'invention, le promoteur étant choisi afin de permettre une expression appropriée. Par exemple, un promoteur inductible permettrait la production du ribozyme et par conséquent 1'inactivation du transcrit de l'aconitase uniquement lorsque les conditions d'induction étaient remplies. Le ribozyme ou la séquence antisens peut également être sous le contrôle du promoteur de l'invention.
Selon cette variante de l'invention, l'inhibition de la production d1aconitase conduit à une diminution de la production des acides organiques du cycle de Krebs et du cycle glyoxylate. Par conséquent, il y a augmentation de la quantitié d'Acétyl coenzyme-A et d'acide citrique disponibles. L'Acetyl coenzyme-A étant le produit du catabolisme lipidique, protéique et polysaccharidique, il s'ensuit une modification du catabolisme de ces substances ou de certaines de ces substances. Cet aspect de l'invention peut donc être appliqué par exemple à la réorientation du métabolisme ou du catabolisme d'amidon, d'huiles, de protéines, etc, pour les industries agro-alimentaires, chimiques, pharmaceutiques et cosmétologiques.
Selon une autre variante de l'invention, la distribution tissulaire de 1'aconitase peut être modifiée. Par exemple, l'insertion de copies supplémentaires de l'une des deux formes d'aconitase, par exemple la forme mitochondriale plutôt que 1'autre forme, conduit à la surproduction de cette forme.
En outre, le clivage systématique du peptide signal mitochondrial, par l'utilisation d'un ribozyme telle que définie ci-dessus, conduit à la production de la forme cytosolique seulement de l'enzyme.
Bien entendu, l'utilisation d'un promoteur spécifique de certains tissus permettra l'obtention d'aconitase dans les tissus où l'expression n'est pas normalement très forte.
Il peut également être envisagé de modifier la nature de l'aconitase produite par une plante par l'insertion, dans une plante appartenent à une première espèce, d'une séquence codant pour l'aconitase d'une deuxième espèce. Ceci peut être intéressant lorsque la deuxième espèce présente des caractéristiques particulièrement avantageuses, par exemple lorsque l'aconitase d'une espèce particulière est moins sensible à certaines substances, ou lorsque son expression est réglée différemment de celle de la plante hôte.
La modification du métabolisme de la plante par une augmentation ou une diminution de la production d'aconitase peut également influer sur le métabolisme des ions métalliques, tels que le fer, le cadmium et le cuivre. Ces effets sont vraisemblablement exercés grâce au rôle d'IRE-BP que peut jouer l'aconitase végétale.
Différents aspects de 1'invention sont illustrés dans les figures :
- Figure 1 : séquence nucléotidique du gène codant pour une protéine à activité aconitase chez Arabidopsis thaliana.
Légende : lettres minuscules = séquence non codante, lettres majuscules = séquence codante, acides aminés en caractères gras = séquence montrant une homologie avec les séquences protéiques NH2 terminales de 1*aconitase mitochondriale de pomme de terre et des aconitases (Acol et AcoII) de graines de melon.
- Figure 2 : comparaison des séquences protéiques des aconitases de différentes espèces. Les séquences protéiques des IRE-BP et des aconitases de E. coli, de porc et des levures ont été extraites de la banque "Swiss Prot 26" (version Août 93) . L'alignement a été réalisé avec le programme PC Gène Clustal (Intelli Genêtics) .
Légende : ARABACO = Aconitase d'Arabidopsis thaliana, MELONACO = Aconitase de melon (Cucumis melo) , IREB = Iron Responsive Elément Binding Protein, ACON = Aconitase, V = cystéines constituant le centre Fer-Soufre, i = acides aminés formant le site actif, * = acides aminés identiques, . = acides aminés similaires.
- Figure 3 : séquence nucléotidique et protéique du clone d'ADNc n° 1 d'Arabidopsis thaliana codant pour une protéine à activité aconitase.
Légende : lettres minuscules = séquence non codante, lettres majuscules = séquence codante, acides aminés en caractères gras = séquence montrant une homologie avec les séquences protéiques NH2 terminales de 1'aconitase mitochondriale de pomme de terre et des aconitases (Acol et AcoII) des graines de melon.
- Figure 4 : séquence nucléotidique et protéique du clone d'ADNc n° 16 de melon codant pour une protéine à activité aconitase.
Légende : lettres minuscules = séquence non codante, lettres majuscules = séquence codante
- Figure 5 : cycle de Krebs
- Figure 6 : cycle du Glyoxylate
Figure 7 : cycle de Krebs = source de squelettes carbonés utilisés dans plusieurs voies de biosynthèse.
Figure 8 : compartimentation des enzymes impliquées dans le cycle du Glyoxylate.
1 : citrate synthase, 2 : isocitrate lyase, 3 : malate synthase, 4 : malate déshydrogénase.
- Figure 9 : schéma du principe de la RACE-PCR. Légende : am et am' = amorces complémentaires. - Figure 10 : carte de restriction déduite du clone ADNc n' 1 d'Arabidopsis thaliana codant pour une protéine à activité aconitase.
B : bamHI, E : EcoRI, H : HindIII, RV : Eco RV, Pv : PvuII.
Figure 11 A : séquence nucléotidique et protéique de l'extrémité 5' du cDNA n° 1 d'Arabidopsis thaliana codant pour une aconitase.
Caractères gras : séquence protéique montrant de 1'homologie avec les extrémités NH2 terminales des aconitases de pomme de terre et de melon.
- Figure 11 B : comparaison des séquences NH2 terminales de 1'aconitase déduite du cDNA d'Arabidopsis thaliana, de l'aconitase de melon (Cucumis melo) , et de l'aconitase mitochondriale de pomme de terre (Solanu tuberosum) .
- Figure 12 : pourcentages d'homologies entre les aconitases de différentes espèces.
Légende : ARABACO = Aconitase d'Arabidopsis thaliana, MELONACO = Aconitase de melon (Cucumis melon) , IREB = Iron Responsive Elément Binding Protein, ACON = Aconitase, le chiffre gras = pourcentage de résidus identiques, le chiffre entre parenthèses = pourcentage de résidus similaires.
- Figure 13 : arbre phylogénique des aconitases de différentes espèces.
Légende : ARABACO ≈ Aconitase d'Arabidopsis thaliana, MELONACO = Aconitase de melon (Cucumis melo) , IREB = Iron Responsive Elément Binding Protein, ACON = Aconitase.
- Figure 14 : cartographie physique du gène de l'aconitase d'Arabidopsis thaliana.
A : carte de restriction de la partie 5• du fragment génomique isolé à partir de la banque DASH, B : carte de restriction de la partie 3 * du fragment génomique isolé à partir de la banque EMBL,
C : cartographie du gène de 1 •aconitase déduite des deux cartes précédentes.
B = BamHI, Ps = PstI, Pv = PvuII, H = HindIII, E = EcoRI, X = Xbal, DASH = vecteur phagique DASH, EMBL = vecteur phagique EMBL3.
Figure 15 : structure IRE-like putative (position -85 à -52 sur la séquence génomique) .
- Figure 16 : détail de la fusion traductionnelle du promoteur de 1•aconitase avec le gène rapporteur de la ^-glucuronidase portée par le vecteur binaire pBIOS 170. a) Séquence de la région en amont du codon d'initiation putatif (Met) de l'aconitase. b) Séquence de la région en amont du codon d'initiation de la β-glucuronidase (vecteur pBI 101.1) . c) Séquence de la fusion du promoteur de l'aconitase avec le gène de la /3-glucuronidase (tataa = Tata box) .
Caractères standards : séquence de l'aconitase, caractères en italique : séquence de pBI 101.1.
- Figure 17 : alignement des séquences protéiques et nucléotidiques d'A. thaliana (acides aminés 240 à 269) avec la partie correspondante du maïs. La séquence de maïs a été obtenue par P.C.R., utilisant comme amorces, oligo D III et oligo D IV. Une homologie nucléique de 77.5%, et protéique de 87.5% était détectée. La séquence d'une centaine de bases a ensuite servie de sonde sur de l'ADN génomique de maïs et a permis l'identification du gène.
- Figure 18 : 6036 paires de bases de la séquence génomique d'un gène aconitase de maïs obtenues par séquençage du clone RI. La séquence protéique à partir d'exon 2 est également indiquée, bien que l'extrémité 5' de l'exon 2 n'a pu être déterminé avec certitude. L'exon 1 et l'intron 1 n'ont pas été identifiés, mais ils se situent dans les quatre mille premières bases d'un fragment d'une taille de 6800 paires de bases SalI-HindIII du clone génomique RI ; HindIII étant à la position 2841 de la séquence présentée.
Figure 19 : alignement des aconitases Arabidopsis et maïs attestant la très grande conservation de ces enzymes. (* = acides aminés identiques, . = acides aminés similaires) .
Figure 20 : alignement entre 3 aconitases végétales identifiées dans le cadre de la présente invention (ZMACO = Aconitase maïs, ATACO = aconitase Arabidopsis, CMACO = aconitase melon, * = acides aminés identiques, . ≈ acides aminés similaires) .
- Figure 21 : amorces D I à D VI utilisées dans l'exemple 11.
EXEMPLES
EXEMPLE I : PURIFICATION DE 2 POLYPEPTIDES AYANT UNE ACTIVITE ACONITASE A PARTIR DE GRAINES DE MELON :
L'aconitase a été purifiée à partir de graines de melon par des techniques chromatographiques traditionnelles.
L'extrait brut est préparé par broyage de 100 g de graines au waring blendor (3 mn, 4°C, vitesse maximale) , puis agité dans 100 ml de tampon Imidazole 20 mM ; pH 7,5 (1 h, 4°C). La fraction soluble contenant l'activité est récupérée après centrifugation (13 000 g, 30 mn, 4°C), puis filtrée sur une feuille de miracloth permettant d'éliminer les débris cellulaires et une grande partie des lipides.
La première étape chromatographique consiste en une chromatographie d'échange d'ions sur une résine Q sépharose fast flow (PHARMACIA) . La suspension protéique brute (1 360 mg) est déposée au sommet de la colonne équilibrée avec un tampon d'Imidazole 20 mM, pH 7,5. Les protéines sont éluées en conditions isocratiques dans un tampon Imidazole 20 mM, ph7,5 additionné d'acétate de sodium 200 mM.
Les fractions actives (260 mg de protéines) sont dessalées sur des colonnes EconoPac 10 DG (BIORAD) avec un tampon Imidazole 20 mM, pH 7,5. Les protéines sont alors déposées sur une colonne contenant une résine d'affinité sur colorant Yellow 86 (SIGMA). L'élution est ensuite réalisée par un gradient linéaire d'acétate de sodium allant de 0 à 0,5 M dans un tampon Imidazole 20 mM, pH 7,5.
Les fractions actives sont de nouveau récupérées (14,4 mg de protéines) puis ajustées à une concentration en sulfate d'ammonium de 1,2 M.
Les extraits protéiques sont alors déposés sur une colonne d'interactions hydrophobes Protein Pack HIC Phényl 5 PW (WATERS). L'élution des protéines est ensuite effectuée par un gradient linéaire de sulfate d'ammonium allant de 1,2 à 0 M dans un tampon Imidazole 20 mM, pH 7,5.
Deux pics d'activité sont alors détectés. Le premier pic d'activité (Aco I) est élue pour une concentration en sulfate d'ammonium voisin de 0,9 M. Le deuxième pic d'activité (Aco II) est élue pour une concentration plus faible de 0,7 M.
Les fractions actives sont de nouveau dessalées (fraction Aco I : 0,76 mg ; fraction Aco II : 0,44 mg) dans un tampon Imidazole 20 mM, pH 7,5. Enfin, les fractions actives de chacun des pics d'activité sont déposées sur une colonne d'échange d'ions Mono Q MR 5/5 (PHARMACIA) .
Cette dernière chromatographie permet d'obtenir deux protéines à activité aconitase relativement pures après une élution avec un gradient linéaire d'acétate de sodium de 0 à 0.3 M dans un tampon d'Imidazole 20 mM, pH 7,5. Les protéines Aco I et Aco II étaient éluées pour une concentration en acétate de sodium voisine de 200 mM. Les protéines Aco I et Aco II en fin de purification ont été purifiées d'un facteur respectivement de 878 fois et 763 fois. Ces deux protéines montrent des activités spécifiques voisines de 1 518,42 mmol/mn/mg pour Aco I et de 1 321,15 mmol/mn/mg pour Aco II.
90 mg de protéine pure Aco I et 60 μg d'Aco I sont obtenus en fin de purification.
Tableau I :
Activité Activité Activité Facteur
Etapes de Protéines totale spécifique restante de purification (mg) (nmol/min) (nmol/min/ (X) Purifi¬ mg) cation
Extrait brut 1360 2360 1.73 100 -
Sépharose QFF 266 1565 5.88 66.3 3.4
Yellow 86 14.4 725 50.34 30.7 29.2
Phényl HIC
- fraction Aco I 0.76 229 781.78 9.7 451.9
- fraction Aco II 0.44 54 122.48 2.3 70.8
Mono Q
- fraction Aco I 0.09 137 1518.42 5.8 877.7
- fraction Aco II 0.06 79 1321.15 3.3 763.7 EXEMPLE 2 : DETERMINATION DE LA SEQUENCE NH2 TERMINALE DES 2 ACONITASES :
Un gel de polyacrylamide (gel de séparation 10 % ; gel de concentration 5 %) est coulé 24 h avant son utilisation (système Mini Protean II BIORAD) . Une pré-électrophorèse de 1 h 30 à 20 mA permet d'homogénéiser le gel.
Les échantillons ne doivent pas être dénaturés, ils sont placés 15 mn à 3 7°C. La séparation se fait pendant 45 mn à 190 V.
Après la séparation, les protéines sont transférées sur une membrane PVDF (Poly Vinyl DiFluoride) . La membrane est plongée 10 s dans une solution de méthanol 100 % puis incubée dans le tampon de transfert CAPS (3[cyclohexylamino]t-propane sulfonic acid) 10 mM, pH 11, additionné de méthanol 10 % jusqu'à l'équilibre.
L'électrotransfert des protéines se fait en condition semi-sèche avec le système multiphor 2117 LKB pendant 1 h à 60 mA (0,8 mA/cm2 de membrane).
Les protéines transférées sur la membrane PVDF sont visualisées après coloration au bleu de Coomassie R250 (solution à 0,1 % dans du méthanol 50 %) pendant 5 mn, puis décoloration 5 à 10 mn dans la solution suivante méthanol, acide acétique, eau (5 : 10 : 40 vol) .
La partie de membrane correspondant à la protéine intéressante est découpée, et la protéine séquencée.
La partie NH2 terminale de la protéine est séquencée selon la réaction de HEWICK et al (1981) avec le séquenceur automatique Applied-Biosystem.
La séquence NH2 terminale des aconitases de graines de melon, que les inventeurs ont déterminée, a pu être comparée (Figure 11) avec la séquence NH2 terminale de l'aconitase mitochondriale de pomme de terre (COURTOIS-VERNIQUET et DOUCE, communication personnelle) . Une forte homologie entre ces séquences est constatée : sur 14 résidus séquences, 9 sont communs avec 1'aconitase mitochondriale de pomme de terre. Cela peut signifier que l'aconitase mitochondriale de melon a été purifiée ou bien alors que les séquences NH2 terminales des aconitases mitochondriales et cytosoliques sont très homologues. L'absence de méthionine comme premier acide aminé pourrait indiquer une maturation de la protéine lors de l'importation dans les mitochondries (clivage du peptide signal) .
EXEMPLE 3 : FABRICATION D'ANTICORPS POLYCLONAUX DIRIGES CONTRE LES ACONITASES :
Les lapins (hybrides femelles de 2 à 3 mois) sont immunisés par voie intradermique avec 10 μq d'aconitase purifiée, émulsionnée à un volume égal d'adjuvant de Freund complet lors de la première immunisation, incomplet pour les immunisations qui suivront (40 et 70 jours après la première injection) .
Les prélèvements de sang, pratiqués dans la veine centrale de l'oreille sont effectués régulièrement (toutes les semaines) . Le sang recueilli sur héparine est rapidement centrifugé (3000 g, 4°C, 5 mn) . Les plasmas contenant les anticorps sont répartis en aliquots et conservés à -20βC.
La caractérisation des anticorps polyclonaux se fait par la technique de Western Blot selon le protocole détaillé ci-dessous. L'électrophorèse des protéines ou des fractions purifiées est effectuée en gel dénaturant SDS-PAGE 10 % (gel de séparation), gel de concentration 3 %.
Les échantillons sont préparés dans le tampon suivant : Tris/HCl 10 mM ; pH 8,0 ; EDTA 1 mM ; SDS 2,5 % ; ?-mercaptoéthanol 5,0 % ; bleu de bromophénol 0,01 %. Les protéines sont dénaturées par chauffage (100°C, 5 mn) .
Un dépôt de 100 μl d'extrait brut (préparation : voir exemple I) traité dans les conditions décrites ci-dessus en présence de 10 % de sucrose, est réalisé dans un puits unique.
Les marqueurs protéiques colorés de poids moléculaire (Rainbow-AMERSHAM) sont les suivants : myosine (200 000) phosphorylase b (97 400) , inhibiteur de trypsine (21 500) , lysozymes (14 300) . L'électrophorèse s'effectue sous un courant de 20 mA par gel pendant 1 h.
Les protéines séparées sur gel SDS-PAGE sont transférées sur membrane de nitrocellulose. L'électrotransfert se fait avec l'appareil mini trans blot BIORAD ou le Phast System PHARMACIA (transfert semi-sec selon les recommandations du fabricant) , en fonction du type de gel qui a permis la séparation préalable des protéines.
La révélation de la membrane par les anticorps se fait comme suit : la membrane est incubée dans une solution saturante TBST (Tris-HCl 20 mM ; NaCl 500 mM ; Tween 20 0,05 %) additionnée de Régilait (5 %) pendant un minimum de 3 h.
- puis la membrane est placée 2 h dans une solution d'incubation TBST contenant le premier anticorps (anticorps polyclonal dilué au 1/8000 ou anticorps monoclonal : surnageant de culture) . - l'élimination de l'excès d'anticorps se fait par trois lavages successifs de 3 mn dans une solution TBST. La membrane est ensuite incubée 2 h dans une solution TBST, en présence d'un second anticorps conjugué à la phosphatase alcaline (anti- immunoglobulines de lapin diluées au 1/9 000 ou anti- immunoglobulines de souris diluées au 1/4 000, SIGMA) . Après cette étape, 3 nouveaux lavages sont effectués. enfin, le complexe antigène-anticorps est révélé dans la solution de développement suivante : 5 ml de tampon phosphatase alcaline (Tris/HCl 100 mM ; pH 9,5 ; NaCl 100 mM ; MgCl2 5 mM) , 33 μl de nitro blue tetrazolium (NBT) à 50 mg/ml préparé dans du diméthylformami e 70 %, 16,5 μl de 5 Bromo-4-chloro-3 indolylphosphate (BCIP) à 50 mg/ml préparé dans de la diméthylformamide.
Des anticorps polyclonaux ont été produits après immunisation de deux lapins avec la protéine Aco I (10 μg/injection) et de deux autres lapins avec la protéine Aco II (10 μg/injection) .
La réactivité et la spécificité des anticorps sont testées sur des extraits bruts ou purifiés de protéines de graines de melon séparées par électrophorèse et transférées sur une membrane de nitrocellulose. Les anticorps donnent une réponse forte pour une dilution jusqu'au 1/8 000. Les deux plasmas donnent le même type de réponse.
Dans l'extrait brut, une seule bande est reconnue à environ 97 Da, démontrant la spécificité des anticorps polyclonaux. De même, dans les extraits protéiques des autres étapes chromatographiques, une seule bande est reconnue. Notons que les plasmas reconnaissent aussi bien Aco I que Aco II et ce, quel que soit le matériel ayant servi à 1'immunisation (Aco I ou Aco II) . La forte spécificité de ces anticorps permettra leur utilisation principalement pour le crible de banques ADNc ou pour d'autres utilisations éventuelles (localisation cytologique de l'aconitase, parenté entre les aconitases de différentes espèces) .
EXEMPLE 4 : ISOLEMENT D'ADNc ACONITASE PAR IMMUNOSCREENING D'UNE BANQUE D'EXPRESSION DE FRUIT MATURE DE MELON :
Les inventeurs disposaient d'une banque ADNc de fruit de melon mûr (Cantaloup charentais) .
Les ADNc sont clones au début du gène de la β- galactosidase dans les phages UNI-ZAP. Un clonage orienté permet de réduire de moitié les clones qui ne sont pas dans la bonne phase de lecture.
Le represseur lad q qui bloque la transcription du gène lac Z est apporté par la bactérie XLl Blue. Ce represseur est important car il permet de contrôler l'expression des protéines de fusion qui peuvent être toxiques pour E.coli.
Ainsi, la production de protéines de fusion se fait au moment choisi grâce à l'addition de l'IPTG (isopropylthio/3-D galactoside) qui est un inducteur du promoteur du gène lac Z.
Les étalements de la banque se font comme décrit dans Sambrook et al (1989, Molecular Cloninq : a Laboratory Manual, Cold Sprinq Harbor Laboratory Press, New-York) . Au bout d'environ 8 h, lorsque les plages de lyse apparaissent, les filtres préalablement imbibés dans une solution d'IPTG 10 mM puis séchés, sont déposés à la surface des boîtes. Les boîtes sont de nouveau incubées pendant 3 h à 37"C permettant à l'IPTG d'induire la protéine de fusion qui se fixera sur le filtre après que les bactéries aient été lysées. Ce sont les bactéries infectées formant le contour de la plage de lyse qui produiront la protéine de fusion. Ainsi, lors de la révélation par les anticorps, les plages de lyse apparaîtront sous forme de halo. Les filtres sont percés en trois positions asymétriques pour pouvoir repérer facilement les plages positives.
La révélation de la protéine de fusion se fait comme décrit dans l'exemple 3 à l'aide des anticorps polyclonaux produits.
Les clones positifs sont repérés en superposant les filtres révélés avec la boîte correspondante. Le morceau de gélose contenant la zone positive est prélevé à l'aide d'une pipette pasteur, puis placé dans 1 ml de tampon SM contenant une goutte de chloroforme (inhibant le développement bactérien) pendant 1 h à température ambiante pour permettre la diffusion des phages dans la solution. Les tubes sont conservés à 4°C.
Après le premier crible, les plages de lyse positives qui sont prélevées ne sont pas pures (plages confluentes) . Il convient, pour isoler avec certitude un clone positif, d'effectuer plusieurs cribles successifs en réétalant les plages de lyse récupérées de façon à obtenir des plages de lyse isolées.
Sur les 4.105 phages qui ont été étalés, 28 clones purs reconnus par les anticorps polyclonaux ont alors pu être isolés.
Ces clones ont été analysés par digestion enzymatique, hybridation et séquençage.
La digestion de ces clones par EcoRI et Xho I montre deux catégories de clones :
- Les clones dont 1•insertion contient un site de restriction EcoRI mais pas de site de restriction Xho I (21 clones) . - Les clones dont l'insertion contient un site de restriction Xho I mais pas de site de restriction EcoRI (7 clones) .
Pour étudier la parenté de ces clones les inventeurs ont réalisé des hybridations en dot-blot (ceci permet d'effectuer un tri préliminaire sans avoir à effectuer de digestion et de transfert sur membrane) .
Le fragment obtenu, après digestion par l'enzyme de restriction EcoRI, du clone le plus grand (2,6 Kb) et du clone le plus court (2,3 Kb) de la première catégorie ont servi de sonde. Les 21 clones de la première catégorie sont apparentés : ils donnent un signal lors de l'hybridation.
Après digestion par EcoRI et transfert sur membrane, les clones sont hybrides avec le fragment EcoRI de 2,2 Kb du 10 donnent un signal, les inventeurs ont pu déterminé 3 classes de clones. La première classe (I) est constituée de 11 clones dont l'insert EcoRI a une taille de 1,7 Kb. La deuxième classe (II) de clones (9 clones) comporte un insert EcoRI de 1,8 Kb. La 3ème classe (III) est constituée du clone le plus grand avec un insert EcoRI de 2,2 Kb (n°16) .
EXEMPLE 5 : SEQUENÇAGE DES ADNc DE MELON - HOMOLOGIES AVEC LES IRE-BP :
La séquence complète du clone le plus long (n* 16) a été déterminée par la technique classique de Sanqer et al. Elle est présentée dans la figure 4.
En 3 ' , la séquence fait apparaître une queue poly A de 80 résidus. Un clone de chacune des classes I et II a été séquence en 3' et en 5• montrant une homologie parfaite avec le clone 16 mais avec des queues poly A d'une longueur moins importante (respectivement 21 et 27 résidus) . D'après toutes nos données d'analyses de restriction (simple et double digestion) , d'hybridation et de séquençage, tous ces clones semblent provenir d'un même messager.
La séquence 5' du clone le plus long (n°16) n'a pas permis de retrouver la séquence protéique correspondant à l'extrémité NH2 terminale. Ceci n'est pas étonnant car une protéine d'environ 100 kDa devrait être codée par un ARNm d'au moins 3 Kb. Ils se sont alors servis de cette séquence de 900 pb pour interroger les banques de données (SWISSPROT - CITI 2) et s'assurer qu'ils avaient bien isolé le clone ADNc correspondant à la protéine purifiée. Des homologies importantes ont été retrouvées avec l'ensemble des séquences d'aconitase ou d'IRE-BP, en particulier avec 1'IRE-BP humaine et l'aconitase d'E. coli (environ 60 %) .
Ces résultats suggéraient que l'ADNc correspondant à la protéine purifiée avait bien été isolé. Cependant, l'extrémité 5' de cet ADNc n'était pas présente.
Avec des fragments 5' terminaux, les inventeurs ont essayé d'isoler des clones complets dans cette banque, mais sans succès. Aussi ont-ils pris la décision de cribler une nouvelle banque d'ADNc qui provenait d'une autre espèce végétale.
EXEMPLE 6 : ISOLEMENT DE L'ADNc DE L'ACONITASE D'ARABIDOPSIS THALIANA ET COMPARAISON DES SEQUENCES PROTEIQUES DES ACONITASES DE DIFFERENTES ESPECES (ANIMALES, VEGETALES, BACTERIENNES) :
Comme Arabidopsis thaliana est aujourd'hui l'espèce modèle par excellence (petit génome, cycle de vie court, cartes génétiques et RFLP disponibles, etc...), il a été choisi de cribler une banque ADNc de siliques immatures (écotype Columbia) , construite par GIRAUDAT et al (1992, Isolation of the Arabidopsis ABI3 gène by Positional cloninq, The Plant Cell 4 ; 1251-1261) . Cette banque a été réalisée avec le vecteur Lambda ZAP II de STRATAGENE. Le clonage des ADNc n'est pas orienté (clonage EcoRI).
La difficulté dans ce choix de stratégie est de trouver les bonnes conditions d'hybridation car les inventeurs disposent d'un clone ADNc servant de sonde d'une espèce donnée (melon) pour cribler une banque d'une autre espèce (Arabidopsis thaliana) . Ils ne connaissent pas le degré de conservation de l'aconitase chez les plantes. Aussi, plusieurs conditions d'hybridation dans lesquelles la concentration en formamide variait (0, 10, 20, 30, 40, 50 %) ont été testées. De même, des conditions de lavages progressifs ont été utilisées.
Pour chaque condition d'hybridation, environ 1,5.105 phages ont été étalés. La sonde utilisée est le fragment d'ADN de 2,2 Kb obtenu après digestion par 1'enzyme de restriction EcoRI du clone ADNc de melon n°16.
7 clones hybridant avec la sonde dans les conditions suivantes ont été isolés : hybridation effectuée en présence de 30 % de formamide à 42"C et 2 lavages dans une solution SSC 2X pendant 30 mn à 42°C. Ces clones ont été analysés après digestion par 1'enzyme de restriction EcoRI. La carte de restriction sommaire des clones les plus longs, 3 clones de 3,2 Kb, est décrite dans la figure 10.
Les 4 autres clones sont identiques, leur taille est de 2,3 Kb. La carte de restriction montre qu'ils appartiennent à la même classe que les clones les plus longs, seul le fragment EcoRI de 0,8 Kb à 1'extrémité 5' est absent (ces clones proviennent vraisemblablement d'une méthylation incomplète des sites EcoRI internes des ADNc) .
Les 3 clones de 3,2 Kb (n° 1, 2, 3) ont été séquences à chaque extrémité (amorces universelles T3 et M13) . A l'extrémité 3', il a été observé une queue poly A constituée respectivement de 40, 15 et 16 résidus. La séquence de l'extrémité 5' (Figure 11) a montré une forte homologie avec la séquence NH2 terminale protéique de l'aconitase de melon (9 acides aminés identiques sur 14) et de l'aconitase mitochondriale de pomme de terre (8 acides aminés identiques sur 14) (figures 10 et 3) .
Un clone ADNc correspondant à 1'aconitase d'Arabidopsis thaliana avait donc vraisemblablement été isolé.
Les fragments EcoRI-EcoRV de 0,7 et 0,9 Kb (voir carte de restriction, Figure 10) ont été sous clones dans le vecteur pBSII SK+ puis séquences aux extrémités avec les amorces universelles T3 et M13. Le clone ADNc en totalité a par la suite été séquence (Figure 3) par la stratégie de progression par oligonucléotides. Ce clone a une longueur totale de 3 210 pb. Le cadre de lecture ouvert a une longueur de 2769 pb. Le codon de terminaison est un codon TAA (codon ochre) , la partie non traduite en 3* a une longueur de 441 pb. A l'extrémité 5', il n'y a pas de codon stop (cadre de lecture ouvert) ce qui pourrait laisser supposer la présence d'un peptide signal. A l'exception de la éthionine présente dans la séquence NH2 terminale protéique, il n'a pas été observé d'autre méthionine plus en amont, ce qui indiquerait que ce clone ne soit pas totalement complet. Le poids moléculaire de la protéine à activité aconitase codé par cet ADNc déduit à partir de la séquence nucléotidique est de 98 490 Da. Le pi calculé est de 6,0. Ces valeurs sont en accord avec les résultats obtenus lors de la purification (PM : 97 kDa ; pi : 5,2).
Les essais d'obtention d'un clone plus long ont été infructueux et la séquence totale du clone le plus long est présentée dans la figure 3 (ADNc n° 1) .
La séquence des extrémités 5' et 3 ' des ADNc n° 2, 3, 4 et 5 permettent leur positionnement sur la séquence du clone ADNc nβ 1.
L'extrémité 5' des clones n° 2 et 3 se situe en position 66. Pour les clones 4 et 5 l'extrémité 5' est en position 134.
A 1'extrémité 3• , les clones 2, 3, 4 et 5 se situent respectivement en position 2964, 2964, 2926, 2976. Les clones 2 et 3 sont strictement identiques ; même départ et même arrêt. L'analyse de la partie 3' non codante du clone ADNc n° 1 fait apparaître trois sites de polyadénylation possibles suivant le consensus AATAAA en position 2848, 2940 et 3026. Ces trois sites doivent être fonctionnels car 3 positions d'arrêt compatibles ont été obtenues pour les clones ADNc étudiés.
Les comparaisons de séquences de 1'IRE-BP humaine et de 1'aconitase mitochondriale de porc (ROUAULT et al, 1991 (supra) ; HENTZE et ARGOS, (1991, Homolocrv between IRE-BP, a regulatory RNA-binding Protein, Aconitase, and isopropylmalae isomerase, Nucleic Acids Research 19 ; 1739-1740) avaient montré la parenté entre ces deux protéines (30 à 33 % d'identité).
L'isolement des ADNc chez Cucumis melo et Arabidopsis thaliana codant pour une aconitase a permis de rechercher les homologies existant avec d'autres aconitases de différentes espèces (Figure 2) .
Les alignements des séquences protéiques montrent des régions fortement conservées. Les études cristal- lographiques de LAUBLE et al (Crystal Structures of Aconitase with Isocitrate and Nitroisocitrate bound, Biochemistry 31 ; 2735-2748) en 1992 avaient permis d'identifier 23 résidus formant le site actif. Ces résidus sont conservés dans toutes les aconitases étudiées. Ces alignements font également apparaître que les protéines à activité aconitase étudiées chez Arabidopsis thaliana et Cucumis melo ont une homologie plus importante avec les IRE-BP.
La Figure 12 indiquant les pourcentages d'homologie entre les différentes aconitases montre une homologie très impor'tante d'environ 90 % entre les aconitases végétales étudiées. Ces protéines apparaissent plus proches des IRE-BP (homologie d'environ 70 %) et de l'aconitase de E. coli (homologie d'environ 65 %) que des aconitases mitochondriales (homologie d'environ 45 %) .
L'arbre de distarîce (Figure 13) permet de visualiser rapidement les parentés entre ces différentes aconitases.
Il a été montré qu'il existe vraisemblablement chez les plantes une protéine à activité aconitase très conservée. Ces protéines montrent une forte homologie avec les IRE-BP et devraient avoir un rôle dans des mécanismes de régulation traductionnelle. EXEMPLE 7 : ISOLEMENT, SEQUENÇAGE ET DETERMINATION DU DEPART DE TRANSCRIPTION DU GENE ACONITASE D'ARABIDOPSIS THALIANA :
Juscju'à présent-, aucun gène codant pour 1•aconitase mitochondriale ou pour 1'aconitase cytosolique n'a été étudié dans le domaine végétal ou dans le domaine animal.
Deux banques génomiques ont dû être criblées pour pouvoir isoler le gène complet de l'aconitase étudiée.
Dans un premier temps une banque LAMBDA DASH d'Arabidopsis thaliana (écotype C24) (ADN génomique digéré partiellement par l'enzyme de restriction Hind III, puis clone dans le vecteur DASH au site Hind III) est criblée avec l'ADNc nβl de 3,2 Kb isolé d'Arabidopsis thaliana.
Parmi les 2.105 phages étalés, 6 clones positifs ont été isolés. Ces clones apparaissent identiques après analyse par restriction.
Les analyses par hybridation sur différentes digestions (simples ou doubles) par des enzymes de restriction a permis de montrer que ce clone recouvrait 1'extrémité 5• du gène aconitase et était incomplet en 3' ;
Pour obtenir la partie manquante du gène en 3• , les inventeurs ont dû cribler une autre banque génomique.
La banque génomique EMBL 3 d'Arabidopsis thaliana (écotype Columbia) construite après digestion partielle de l'ADN par l'enzyme de restriction Mbo I puis clonage de ces fragments au site BamHI du vecteur EMBL 3. Après étalement de 2.105 phages puis hybridation avec le fragment de 0,6 Kb, un clone répondant positivement a été isolé. Un fragment de restriction Hind III de 3,5 Kb hybridant faiblement avec la sonde de 1,6 Kb et fortement avec la sonde de 0,6 Kb a été clone dans le vecteur pBS II SK+ puis séquence jusqu'à ce que l'on retrouve l'extrémité 3' de l'ADNc.
Les hybridations ont permis de compléter la carte de restriction du gène codant pour une aconitase et de vérifier la jonction Hind III entre les deux clones physiques (Figure 14) .
Dans le même temps, un Southern a été réalisé pour tenter de voir s•il existe un ou plusieurs gènes codant pour l'aconitase, chez Arabidopsis thaliana, et pour vérifier que la carte de restriction du gène établie à partir des clones phagiques suit bien la carte génomique.
L'ADN génomique de deux écotypes d'Arabidopsis thaliana (Columbia et C24) a été digéré par plusieurs enzymes de restriction. Les fragments obtenus ont été séparés sur un gel d'agarose 0,8 % puis -transférés sur une membrane de nylon Hybond N+. Cette membrane a été hybridée avec les fragments EcoRI du clone ADNc n°l (0,8 ; 1,6 ; 0,6 Kb) . La cartographie du locus de ce gène par Southern montre qu'elle suit exactement la carte de restriction obtenue avec les clones phagiques.
Lors des cribles des banques génomiques, il a été utilisé deux écotypes d'Arabidopsis thaliana (Columbia et C24) . Sur le Southern, il peut être constaté qu'il n'existe pas de polymorphisme entre C24 et Columbia, au locus étudié, pour les couples enzyme-sonde testés.
L'analyse de ces résultats semble donc indiquer qu'il n'existerait qu'un gène chez Arabidopsis thaliana codant pour l'ADNc isolé.
Les fragments d'ADN génomique suivants ont été clones dans le vecteur pBS II SK+ avant séquençage : - BamHI - BamHI : environ 7,7 Kb ;
- EcoRI - BamHI : environ 0,6 Kb ;
- EcoRI - EcoRI : environ 2,8 Kb (dont un site EcoRI provenant du site de clonage du vecteur) ;
- BamHI - BamHI : environ 2,0 Kb (dont un site BamHI provenant du site de clonage du vecteur) ;
- BamHI - BamHI : environ 1,3 Kb ;
- Hind III - Hind III : environ 5,5 Kb.
La totalité du fragment Hind III - Hind III de 5,5 Kb a été séquencée. Chaque fragment clone a été séquence aux deux extrémités avec les amorces universelles T3 et M13. La stratégie de progression par oligonucleotides a été adoptée pour compléter la séquence.
Il est à noter qu'il existe un site Hind III distant de 0,1 Kb du site Hind III de clonage. La présence de ce site a pu être montrée grâce aux hybridations avec la sonde de 1,6 Kb (la double digestion BamHI-Hind III donne deux fragments de 1,8 Kb et 1,3 Kb alors que la simple digestion BamHI donne un fragment de 2 Kb) . La présence de ce site a été confirmée lors du séquençage des extrémités des fragments EcoRI-EcoRI de 2,8 Kb et BamHI-BamHI de 2,0 Kb.
De plus, le fragment de restriction Hind III de 3,5 kb de Lambda 3 • EMBL a été clone dans le vecteur pBS II SK+ puis séquence jusqu'à ce que l'extrémité 34 de l'ADNc soit retrouvée.
Le gène de l'aconitase d'Arabidopsis thaliana a été séquence sur une longueur de 6 762 pb (Figure 1) . La comparaison de la séquence du gène de l'aconitase avec l'ADNc correspondant montre que le gène est constitué de 20 exons et de 19 introns.
D'autres gènes montrent également un grand nombre d'exons : le gène de la transferrine humaine est constitué de 17 exons, celui du récepteur de la transferrine de 19 exons.
Il est intéressant de noter la présence du premier intron juste après le codon d'initiation méthionine putatif (position +91) . Ceci renforce 1'idée que cette enzyme doit être très conservée : 1'épissage devant être parfait pour obtenir une protéine fonctionnelle.
L'analyse de la partie 3' non codante montre trois sites de polyadénylation possibles suivant le consensus AATAAA. Ces trois sites sont situés en position 5068, 5199, 5285. Il a été constaté lors de la caractérisation des ADNc (Exemple 5) que ces sites doivent être fonctionnels.
L'extrémité 5' de l'ADNc codant pour l'aconitase a été retrouvée sur la séquence génomique. Cependant, le site d'initiation de la transcription n'était pas connu (la région amont du promoteur est riche en AT, il existe donc plusieurs TATA box putatives) . Les résultats de Northern indiquent que le clone ADNc était pratiquement complet (un signal d'hybridation était visualisé à environ 3,2 Kb, identique à la taille de l'ADNc). La présence d'un intron dans la région 5' du gène ne peut cependant pas être exclue.
Aussi, le site d'initiation de transcription a- t-il été cartographie par la technique RACE avec le kit amplifinder RACE CLONTECH (Figure 9) . Pour cela, des ARN polyadénylés ont été isolés à partir d'ARN totaux extraits de feuilles. L'intégrité des ARN messagers est contrôlée en Northern en utilisant comme sonde les fragments d'ADN obtenus par digestion EcoRI du clone ADNc n°l.
L'oligonucléotide n° 19 :
GCTGGAACTCAAGCTCCATGTTTGCCTGCA
positionné en +524 sur la séquence de l'ADNc a servi à synthétiser le premier brin d'ADNc à partir des ARN polyadénylés purifiés.
A l'extrémité 3' du brin d'ADNc nouvellement synthétisé, un oligonucléotide (anchor) du kit 3'NH3 GGAGACTTCCAAGGTCTTAGCTATCACTTAAGCAC 5' est accroché avec la T4 RNA ligase. L'amplification de l'extrémité 5' de l'ADNc se fait par PCR en utilisant un oligonucléotide complémentaire de l'oligonucléotide "anchor" du kit et l'oligonucléotide n° 16 :
CAAGCAAGATCAACAACAGCAGGAACACCA
déterminé à partir de la séquence de l'ADNc positionné en +375. La réaction PCR est effectuée dans les conditions suivantes :
- Dénaturation de l'ADN 5 mn à 94°C ;
- 35 cycles d'amplification :
- dénaturation 1 mn à 94"C,
- hybridation 1 mn à 50°C,
- élongation 2 mn à 72°C ;
- Réaction finale d'élongation 7 mn à 72°C.
Après amplification, aucune bande n'est visualisée sur gel d'agarose coloré au bromure d'éthidium.
Il a alors été réalisé une seconde amplification par PCR à partir de la réaction précédente en prenant plusieurs couples d'amorces (l'oligonucléotide complémentaire de l'oligonucléotide "anchor" accroché au brin d'ADNc associé avec les oligonucleotides n°16, 9 et 14 respectivement en position +375, +52, +230 désignés à partir de la séquence ADNc) . Les séquences des amorces 9 et 14 sont les suivantes :
- n° 14 : CACAGTTACGTATGGCCGA - n* 9 : GTCGAGTGAAGAAGCAAA
Les conditions d'amplification sont celles décrites précédemment. La solution de réaction de la première amplification est précipitée puis reprise dans 10 μl d'eau stérile. 2 μl de cette solution serviront de cible pour la deuxième réaction d'amplification par PCR. Le témoin positif du kit attendu à environ 490 pb est visible piste 4. Une réamplification avec l'oligonucléotide n"16 donne de l'aspécificité (piste 2). L'oligonucléotide n°9 semble permettre l'amplification d'une bande d'ADN à environ 200 pb (piste 3). Avec l'oligonucléotide n°14, deux bandes ont été amplifiées (piste 5) d'une taille d'environ 300 et 350 pb. Ces deux bandes ont été clonées dans un vecteur pGEM T sans avoir été préalablement séparées. 35 clones portant une insertion ont été séquences. La sélection des clones a été réalisée par digestion avec l'enzyme de restriction Bgl II (site de coupure en position +48) . Le +1 a été positionné sur la séquence au site comptant le plus grand nombre de clones "cappés" (en l'occurrence 14 sur 35 clones séquences). Parmi ces 35 clones, 14 s'arrêtent en position +1, 7 en position -2, 4 en position -4, 5 en position -9 et 1 en position +9. Tous ces clones, lors de la séquence montrent un G supplémentaire en 5' qui n'est pas présent sur la séquence génomique. Il s'agit du capping (coiffe) du messager (indiquant ainsi avec certitude le site d'initiation de la transcription).
Ainsi, ces résultats suggèrent que le site d'initiation de transcription de ce gène est en fait constitué de plusieurs sites d'initiation (5 ont été déterminés) s'étendant sur une zone de 19 pb (-9 à +9).
Il a été également observé un clone s'arrêtant en position +14, 3 en position +20 et 1 en position +29. Ces clones doivent provenir de l'arrêt prématuré de la réverse transcriptase (aucun G supplémentaire en 5* de ces clones) .
Un autre clone a été séquence et placé en position -49 sur la séquence génomique. Ce clone ne porte pas de G supplémentaire ce qui indique qu'il n'est pas complet. La distance avec le premier site d'initiation est de 50 pb. Ce clone doit appartenir à une deuxième classe de clone amplifiée lors de la PCR et formant la bande d'ADN sur gel d'agarose de plus grande taille. Ce type de résultat pourrait amener à penser qu'il existe un deuxième promoteur plus en amont.
Il est à remarquer que les clones correspondant à la bande haute de l'amplification ne sont pas clones avec la même efficacité que ceux correspondant à la bande basse.
Bien qu'il ne soit pas possible de conclure quant à la position d'une deuxième site d'initiation de la transcription putatif, il est surprenant de trouver une struture secondaire ressemblant aux IRE (Iron Responsive Elément) aux positions -85 et -52 (figure 15) .
Dans la partie 5' du gène, un site d'initiation de la transcription a été cartographie avec précision. En réalité, 5 sites permettent le départ de la transcription dans la région -9 à +9, le site le plus usuel se situerait en +1. Une TATA box putative est située en position -32 (TATAA) . Cette position est en accord avec les TATA box décrites qui se situent à 32 ± 7 pb en amont du site d'initiation de la transcription. De multiples sites d'initiation de la transcription seraient présents plus particulièrement pour les gènes de ménage.
De ce site d'initiation de la transcription jusqu'au premier ATG (sans doute le codon d'initiation) en position +91, la séquence est codante, ce qui pourrait faire penser à la présence d'un peptide signal mitochondrial (le cadre de lecture reste ouvert jusqu'au codon TAA en position -30). Mais, dans cette séquence se trouvent un résidu aspartique (en position 25) et un résidu glutamique (en position 14) , les résidus acides étant généralement absents dans les peptides signaux mitochondriaux. Il n'existe cependant pas de séquence consensus stricte pour les peptides signaux de mitochondries. Aussi, il est possible que cette séquence constitue bien un signal d'importation dans les mitochondries.
Une telle situation pourrait impliquer la présence d'un autre site d'initiation de la transcription plus en amont et donc également la présence d'un deuxième promoteur.
Une autre situation permettant à un gène de coder pour deux protéines à localisations différentes est possible lorsque 1'ARNm porte deux sites d'initiation de la traduction. De tels exemples ont été décrits pour les gènes de levure codant pour les enzymes de synthèse des ARN de transfert de l'histidine et de la valine (NATSOULIS et al, (1986, The HTS1 Gène encodes both the Cytoplasmic and Mitochondrial Histidine tRNA synthetases of S. cerevisiae, Cell 46 ; 235-243) CHATTON et al, (1988, The yeast VAS1 Gène encodes both Mitochondrial and Cytoplasmic Valyl-tRNA Synthetase, The Journal of Biological Chemistry 263 ; 52-57) . Ces enzymes existent à la fois dans le cytoplasme et dans l'espace matriciel mitochondrial. Le premier site d'initiation de la traduction permet la traduction d'une protéine avec le peptide signal d'importation dans les mitochondries. Le deuxième site d'initiation de la traduction situé plus en aval donnera une protéine sans peptide d'importation mitochondriale et restera donc à localisation cytoplasmique. Pour le gène de l'aconitase d'Arabidopsis thaliana, il n'existe apparemment pas un deuxième site d'initiation de la traduction entre la méthionine en position +91 et le site d'initiation de la transcription (phase de lecture ouverte) . Cependant, la présence d'un codon d'initiation non conventionnel ne peut être exclue. En effet, il semble que les codons ACG et AUA puissent jouer le rôle de codon d'initiation de la traduction.
EXEMPLE 8 : EXPRESSION SPATIO-TEMPORELLE DE L'ARN MESSAGER DE L'ACONITASE CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA ET BRASSICA NAPUS :
Les ARN totaux ont été extraits de différentes parties des plantes étudiées. Après séparation sur un gel d'agarose dénaturant 1,2 %, les ARN sont transférés sur une membrane de nylon puis hybrides avec les fragments EcoRI du clone ADNc n°l.
Un signal plus ou moins intense est observé dans toutes les parties de la plante, indiquant une expression constitutive du gène de l'aconitase. Un signal est également obtenu pour les ARN totaux du colza (Brassica napus) indiquant une forte conservation de 1'aconitase entre ces deux espèces végétales de la famille des crucifères. Une forte expression de ce gène est détectée sur des jeunes plantules en germination. Or, il apparaît que le cycle du glyoxylate doit être très élevé à ce moment du développement permettant la transformation des lipides en sucres indispensables à la croissance de la plante. Ainsi, l'aconitase étant une enzyme du cycle du glyoxylate, une forte expression de celle-ci à ce stade du développement est en accord avec les besoins métaboliques de la plante. Il est également possible que cette forte expression permette la production de squelettes carbonés nécessaires à plusieurs voies de biosynthèse notamment lors de la synthèse des acides aminés. BROUQUISSE et al, 1987 (supra), avaient mis en évidence une forte activité aconitase cytosolique pouvant jouer cette fonction en association avec une activité isocitrate déshydrogénase NADP+ cytosolique, la formation d'équivalents réducteurs NADPH pouvant également être utilisée dans des réactions de biosynthèse. Une forte expression du gène de 1•aconitase est également observée dans les fleurs ouvertes alors que les bourgeons en cours de développement ne présentent qu'une faible expression. Pour préciser quel organe floral exprime fortement le gène de l'aconitase, les inventeurs ont travaillé sur le colza (Arabidopsis thaliana étant une plante de petite taille, le prélèvement des différents organes floraux est relativement délicat) . Il a alors été observé une forte expression du gène de l'aconitase dans les anthères comparativement à une faible expression dans les pistils. Cette forte activité dans les anthères pourrait refléter un métabolisme très actif pour la maturation des grains de pollen.
De même, une expression relativement importante est observée dans les siliques immatures. Cette expression pourrait permettre un stockage de l'ARN messager ou de la protéine à activité aconitase dans les graines qui seront utilisés lors de la germination au moment de la reprise des métabolismes. Malgré le bruit de fond important (difficulté d'extraction des ARN de graines du fait d'une présence importante de lipides) un signal est également visible dans les graines sèches. Enfin, une expression relativement faible dans les feuilles et dans les tiges est montrée.
L'ensemble de ces résultats semble indiquer une expression constitutive du gène codant pour une protéine à activité aconitase. Une forte expression lors de la germination peut faire penser à l'activité aconitase cytosolique intervenant dans le cycle du glyoxylate. Il apparaît toutefois que, lors de la mise en place de l'appareil photosynthétique, le cycle du glyoxylate est stoppé, les ARNm ne devant plus être détectés dans les différents tissus de la plante.
Cependant, l'expression observée du gène de l'aconitase dans les feuilles et les tiges pourrait être due à l'activité aconitase cytosolique permettant de produire des squelettes carbonés pour différentes voies de biosynthèse.
Toutefois, si les aconitases cytosoliques et mitochondriales sont codées par le même gène, il pourrait également s'agir du messager de la forme mitochondriale qui est exprimé.
Il est intéressant de noter que toute l'activité de la citrate synthase des graines de ricin est due à 1'isoenzyme mitochondriale et que seul l'ARN messager codant pour la forme mitochondriale serait présente dans les graines (ZEHLER et SCHNARRENBERGER, (1984, Citrate Synthases from Germinating Castor Bean Seeds, I - Purification and properties, Physioloqia Plantarum 60 : 1-8) ) . Ces travaux ont été possibles car les isoenzymes de la citrate synthase mitochondriale et glyoxysomale peuvent être distinguées l'une de l'autre (la citrate synthase glyoxysomale est inhibée par le 5,5' dithiobis (2 nitrobenzoic acide) : DTNB) . Les deux formes isoenzymatiques montrent également des points isoélectriques différents respectivement de 5,9 et 9,1 pour les formes mitochondriales et cytosoliques.
Dans le cas de l'aconitase, la situation est plus complexe car non seulement les deux formes isoenzymatiques (cytosolique et mitochondriale) n'ont pas pu être distinguées l'une de l'autre, mais de plus, la forme cytosolique intervient dans le cycle du glyoxylate. Celle-ci permet également de fournir des intermédiaires du métabolisme acide, ces besoins pouvant être permanents et non pas ponctuels comme le cycle du glyoxylate.
Dans cette situation, il est difficile d'étudier l'expression de l'une ou l'autre des formes de l'aconitase car il est également possible, ainsi que les inventeurs en ont émis l'hypothèse, qu'un seul gène code pour ces deux formes.
Pour confirmer les données moléculaires obtenues sur 1'organisation de 1'extrémité 5* du gène et sur l'expression spatio-temporelle de son ARNm, les inventeurs ont fait appel aux expériences de transgénèse à 1'aide du gène rapporteur codant pour la .-glucuronidase (GUS) . Seule la partie 5' flanquante du gène a été étudiée. EXEMPLE 9 : CARACTERISATION D'UN FRAGMENT PROMOTEUR DU GENE ACONITASE
Au vu de la position du site d'initiation de la transcription (déterminée par la technique 5' RACE) , le site de restriction Bgl II (position +46) , apparaît idéalement placé pour réaliser une fusion transcriptionnelle avec le gène rapporteur GUS. En effet, il est situé en amont du codon de départ potentiel de l'aconitase cytoplasmique. Le fragment Hind III-Bgl II, d'une taille de 1339 pb a été inséré par un clonage orienté dans le vecteur binaire pBi 101.1, sites Hind III - Bam HI (JEFFERSON et al, (1987, GUS Fusions : ft-glucuronidase as a sensitive and versatile Gène Marker in Higher Plants, EMBO Journal 6 ; 3901-3907) ) pour obtenir le vecteur pBios 170.
Ce dérivé particulier du vecteur binaire pBi 101 a été choisi pour obtenir dans le même temps une fusion traductionnelle entre la région amont, potentiellement codante du gène aconitase et la région codante du gène β-glucuronidase (Figure 16) .
Ce vecteur binaire a été introduit dans la souche désarmée d'Agrobacterium tumefaciens C58'3 et un clone recombinant a servi à transformer des racines d'Arabidopsis thaliana (VALVEKENS et al, (1988, Agrobacterium Tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis Root Explants usinq Kanamycin Sélection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 85 : 5536-5540) ) . Des cals transformés et des plantules régénérées ont été testées pour la présence d'activité 3-glucuronidase par le test histochimique. Une coloration bleue a été détectée à la fois sur cals et plantules, indiquant la fonctionnalité du fragment promoteur clone. EXEMPLE 10 : CARACTERISATION QUALITATIVE ET QUANTITATIVE DU PROMOTEUR ACONITASE D'ARABIDOPSIS THALIANA :
L'expression dans les feuilles est détectée à la fois dans le mésophylle et dans les tissus conducteurs, l'activité semblant plus forte dans ces derniers.
Dans les racines, l'observation microscopiçue révèle une activité 0-glucuronidase se limitant essentiellement à la zone d*élongation des pointes racinaires.
Lors de 1'analyse par hybridation sur des ARN de différents organes et à différents stades, les chercheurs avaient détecté une activité forte dans des fleurs matures d'Arabidopsis. Les résultats sur les organes de reproduction mâle et femelle de colza en développement montraient que cette augmentation intervenait dans la partie mâle. Les observations d'activité 3-glucuronidase sur les fleurs transgéniques confirment ces résultats et suggèrent fortement qu'il s'agit d'une augmentation de l'activité transcriptionnelle du promoteur aconitase dans les grains de pollen.
D'autre part, les inventeurs ont pu montrer que le promoteur conduisait à une assez forte activité β- glucuronidase dans 1•albumen comparativement aux parties maternelles (téguments, placenta, tissu ovarien) .
Cette activité dans l'albumen n'est pas surprenante car il s'agit d'un tissu de réserve fort utile lors de la germination. Bien que les inventeurs soient en présence d'une espèce exalbuminée, ils ont pu visualiser précisément l'expression de ce promoteur aconitase dans ce tissu en cours de développement. L'embryon immature au stade coeur présente lui aussi une activité 9-glucuronidase ; à des stades plus avancés, une expression constitutive est observée dans l'embryon.
Sur une graine mature, cette activité est restreinte à 1•embryon et éventuellement à 1'albumen résiduel.
Lors de la germination de la graine, l'activité du promoteur aconitase est très forte dans 1'embryon et plus particulièrement dans les cotylédons, ces derniers étant les organes de réserve où le cycle de glycosylate est actif.
Des analyses comparatives avec le promoteur CaMV 35S montrent que le promoteur aconitase est environ 20 fois plus faible dans les feuilles âgées (voir tableau II, ci-dessous) :
TABLEAU II:
CONSTRUITS PLANTES ACTIVITE (nom du (transformant β-GLUCURONIDASE vecteur) primaire) (nmol 4-MU/mg protéine/minute)
35S - GUS 40 - 2 10.99 (pBi 121) 40 - 4 14.69
Aco-GUS 40 - 6 0.27 (pBiOS 170) 40 - 9 0.69
(dosages effectués selon le protocole de Jefferson et al, 1987, supra) EXEMPLES DECRIVANT L'ISOLEMENT ET LA CARACTERISATION
DU GENE ACONITASE MAIS
EXEMPLE 11 : OBTENTION D'UN FRAGMENT D'ADN COMPLEMENTAIRE D'UN GENE ACONITASE DU MAIS :
Compte tenu des alignements de séquences protéiques des différentes Aconitases et IRE-BP (cf Figure n° 2) , les inventeurs se sont attachés à définir des zones conservées entre toutes ces protéines et si possible identiques entre les 2 aconitases végétales qui avaient préalablement été caractérisées. Ces zones protéiques d'une longueur de 6 à 7 acides aminés devaient à la fois être distantes d'une taille compatible avec la technologie PCR, être dispersées sur toute la longueur de la protéine et surtout être composées d'acides aminés pour lesquels très peu de codons existent, ce dernier point étant impératif afin de concevoir des oligonucleotides dégénérés engendrant un nombre de combinaisons limitées. Aussi, des zones contenant au moins une méthionine ou un tryptophane ont été preferentiellement retenues. Ainsi 6 zones ont été choisies et 6 oligonucléodides dégénérés, 3 sens ou brins codants et 3 antisens ou brins complémentaires ont été synthétisés. Afin de faciliter les étapes de clonage, des bases supplémentaires définissant des sites de restriction ont été rajoutées à l'extrémité 5' de chaque oligonucléotide : site EcoRI pour les oligonucleotides sens (DI, DIV, DV) ; site HindIII pour les oligonucleotides complémentaires (DU, DIII, DVI) . Les différents oligonucleotides sont présentés ci-dessous avec la position des acides aminés de la séquence protéique d'Arabidopsis et avec le nombre de combinaisons correspondantes (chiffres entre parathèses) . Voir figure 21.
Conformément aux données obtenues dans 1'exemple
2 et précisées dans la figure 11(b), l'oligonucléotide dégénéré DI a été conçu en préférant, pour l'acide aminé en position 32, une Alanine à la Serine trouvée chez Arabidopsis. En effet, la séquence de la pomme de terre et du melon présentaient cet amino-acid.
Les oligonucleotides DU, DIII et DVI ont séparément servi à amorcer des réactions de transcription réverse sur des ARN poly A+ isolés et purifiés à partir de plantules de maïs, étiolées et âgées de 6 jours. Ces réactions ont été réalisées avec le kit Reverse Transcription System de la société Promega et ont conduit à 1*obtention de trois ADN complémentaires. Sur ces derniers, plusieurs réactions PCR ont été réalisées avec différentes combinaisons d'oligonucleotides DI/DII ; DI/DIII ; DI/DIV ; DV/DVI et cela dans les conditions suivantes : 1 microlitre d'ADN complémentaire est ajouté à 50 microlitres de mélange PCR composé de dNTP 0,25 mM, 1,5 mM de MgC12,
3 unités de Taq Polymérase (Promega), 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl, 0,2 microM de chaque oligonucléotide. La réaction est réalisée dans un DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus Version 2.2) selon les étapes suivantes : 3 min de dénaturation à 95°C suivies de 40 cycles composés de 30 secondes de dénaturation à 95°C, 45 secondes d'hybridation à 55"C et d'une minute et 30 secondes d'extension à 72"C.
Seulement une réaction d'amplification (amorces DIII et DIV) a donné un produit qui, de plus, présentait, après électrophorèse en gel d'agarose, une taille compatible avec le fragment théorique attendu (100 pb environ) . Ce produit a été introduit par ligation dans le vecteur pGEM-T de Promega selon les recommandations du fournisseur (pGEM-T Vector System I) et transformé dans la souche d'Escherichia coli XLl Blue obtenue auprès de la société Stratagène.
Divers clones ont été obtenus et le fragment inséré de l'un d'entre eux a été séquence selon le protocole du Kit de Promega, fmol DNA Sequencing System. La séquence qui a été déterminée démontrait que ce fragment était hautement homologue avec la séquence d'Arabidopsis thaliana. Une homologie nucléique de 77,5 % et protéique de 87,5 % était détectée (figure n° 17) .
EXEMPLE 12 : ISOLEMENT ET DETERMINATION DE LA SEQUENCE D'UN GENE ACONITASE DU MAIS
Une banque génomique EMBL 3 de maïs construite après digestion partielle par l'enzyme Mbol de l'ADN isolé de plantules (stade 2 feuilles) de la lignée B73 a été obtenue (Clontech référencée FL 1032 D) . Après étalement de 2.106 phages puis hybridation avec le fragment d'ADN complémentaire de maïs de 100 bp identifié dans l'exemple 11 (figure 17), 9 clones génomiques ont été isolés. Quatre d'entre eux se sont révélés identiques après analyse par restriction.
Sur un des clones, le clone Tl, un fragment Sali de 6,2 Kb hybridant avec le fragment d'ADNc a été sous clone dans le vecteur pBS II SK+. Ce fragment a été séquence initialemment aux extrémités ainsi qu'à partir de 2 oligonucleotides spécifiques du fragment d'ADN complémentaire puis, ensuite, par la stratégie de progression par oligonucleotides. Les premières comparaisons avec l'ADN complémentaire d'Arabidopsis ont montré que ce clone ne contenait pas l'extrémité 5' du gène aconitase de maïs. Afin d'essayer d'obtenir la séquence de 1•extrémité 5• , les inventeurs ont entrepris de sequencer par la technique de progression par oligonucleotides la zone amont sur les autres clones génomiques. Seulement 2 d'entre eux, RI et Jl présentaient une zone 5' du gène plus étendue que le clone Tl ; avec toutefois Jl qui ne contenait que 1060 pb de plus que le clone Tl.
RI contient une insertion d'environ 15 kb d'ADN génomique de maïs, comprenant notamment un fragment SalI-HindIII d'environ 6800 pb recouvrant l'extrémité 5' du gène aconitase, et s'étendant de la position -4000 à la position 2841 (figure 18) . Ce fragment est purifiable par double digestion HindIII, Sali ; Sali étant un site de restriction unique présent sur le vecteur et contigu au site d'insertion du fragment génomique, à savoir BamHI, compatible avec l'enzyme Mbol.
C'est au total 6036 paires de bases de la séquence d'un gène aconitase de maïs qui ont pu être déterminées du clone RI (Figure 18) avec une seule incertitude de quelques bases à la position 4635 ; cette réqion correspond à un intron. Etant donné que les inventeurs ne disposaient pas de clone d'ADN complémentaire synthétisé à partir de 1*extrémité polyA+ de ce gène aconitase de maïs, les régions codantes ont été définies par recherche d'homologies avec les séquences codantes d'Arabidopsis et celle de l'ADN complémentaire incomplet du melon. Ceci a permis de démontrer qu'à partir des positions 530-540, la zone codante est très homologue avec l'exon 2 d'Arabidopsis et que, par la suite, absolument tous les exons d'Arabidopsis ont été retrouvés, attestant ainsi que l'organisation génétique du gène aconitase est très conservée entre ces 2 espèces. Comme les inventeurs n•ont pas pu déterminer 1'extrémité 5' de 1•exon 2 et qu•aucune homologie nette avec 1•exon 1 n'est définissable dans les 500 premières bases de cette séquence, les exons ont été numérotés en fonction des homologues Arabidopsis ils s'étendent donc des positions :
position exacte à définir à 623 pour l'exon
-1122 à 1282 pour l'exon 3 -1360 à 1452 pour l'exon 4 -1664 à 1839 pour 1•exon 5 -1932 à 2093 pour 1'exon 6 -2335 à 2479 pour l'exon 7 -2572 à 2714 pour l'exon 8 -3074 à 3130 pour l'exon 9 -3229 à 3308 pour l'exon 10 -3407 à 3482 pour 1'exon 11 -3569 à 3754 pour 1'exon 12 -3842 à 3909 pour 1'exon 13 -4030 à 4148 pour l'exon 14 -4241 à 4362 pour l'exon 15 -4474 à 4572 pour 1*exon 16 -4686 à 5165 pour l'exon 17 -5239 à 5337 pour 1•exon 18 -5423 à 5665 pour 1'exon 19 -5764 à 5835 pour l'exon 20 (Partie codante uniquement) .
Des signaux potentiels de polyadénylation sont présents aux positions 5069 et 5081. Seul l'exon n* 17 a une taille différente de celui d'Arabidopsis (+ 3 paires de bases) et c'est aussi celui qui code pour la zone protéique présentant le plus de divergence malgré une séquence nucléique assez conservée. Ceci s'explique par l'addition d'un T à la position 5021 séquence du maïs (ou la délétion d'une base après la position 3047 sur la séquence d'Arabidopsis) .
Il est assez remarquable de retrouver tous les introns situés à des positions identiques sur ces 2 gènes. Le tableau III présente la taille des exons et introns des deux gènes Aconitase étudiés. La taille des introns qui est en moyenne supérieure chez le gène du maïs diffère grandement d'un intron à l'autre entre ces 2 gènes : un intron relativement long chez Arabidopsis (intron 17 = 340 pb) peut être court chez le maïs (= 73) et réciproquement (intron 8 d'Arabidopsis =91 et =359 chez le maïs) .
La figure n° 19 montre l'alignement des aconitases Arabidopsis et maïs attestant de la très grande conservation de ces enzymes. Sur la figure n' 20, c'est un alignement entre les 3 aconitases végétales décrites dans cette invention (ZMACO = Aconitase maïs ; ATACO = Aconitase Arabidopsis ; CMACO = Aconitase melon) présentant les homologies sur la partie commune aux trois séquences.
N° EXON INTRON
ARABIDOPSIS MAIS ARABIDOPSIS MAIS
1 92 ? 152 ?
2 105 ? 107 498
3 161 161 104 77
4 93 93 91 201
5 186 186 84 92
6 162 162 122 241
7 145 145 114 92
8 143 143 91 359
9 57 57 100 96
10 80 80 79 98
11 76 76 241 87
12 186 186 82 87
13 68 68 85 120
14 119 119 86 92
15 122 122 89 109
16 99 99 89 ?
17 477 480 340 73
18 99 99 68 84
19 243 243 107 98
20 67 72
Tableau ïH ailles des exons et introns des gènes Aconitase d'Arabidopsis thaliana et de Maïs

Claims

REVENDICATIONS
1. Protéine ayant une activité enzymatique d1aconitase, caractérisée en ce qu'elle comporte, soit i) la séquence en acides aminés illustrée dans la figure 1 ou une séquence présentant au moins 75 % d'homologie avec celle-ci, soit ii) une variante de la séquence i) comportant une délétion de jusqu'à 40 acides aminés environ au niveau de 1 'extrémité NH2.
2. Enchaînement d'acides aminés comprenant au moins un fragment de la protéine selon la revendication 1, ledit fragment consistant en : a) une séquence ayant une longueur comprise entre 6 et 40 acides aminés, ladite séquence présentant, sur toute sa longueur, au moins 90% d'homologie avec la partie correspondante de la séquence en acides aminés de la figure 1, ou présentant au moins 60% d'homologie avec 1'une des séquences suivantes :
I : DTVSMIEAYLRANKMFVDYSEPESKTVYSSCLELNLEDVE
II : PLKEMKAD HSCLDNRV
III : AVPKEAQSKAVEFNFNGTTAQLR
IV : KGMTMSPPG
V : AWMMRL REHFANIRIVNKHLKGEVG
VI : NVSEIKPGQDVTWTNN
VII : les acides aminés 1 à 40 de l'extrémité NH2 de la protéine illustrée dans la figure 1. ou b) une séquence ayant une longueur supérieure à 40 acides aminés, ladite séquence présentant, sur toute sa longueur, au moins 75% d'homologie avec la partie correspondante de la séquence en acides aminés de la figure 1.
3. Enchaînement d'acides aminés selon la revendication 2 caractérisé en ce qu•il comprend une séquence ayant une longueur comprise entre 40 et 100 acides aminés et présente, sur toute sa longueur, au moins 80% d'homologie avec la partie correspondante de la séquence en acides aminés de la figure 1.
4. Séquence d'acide nucléique caractérisée en ce qu'elle comporte soit : i) une séquence comprenant à la fois une partie 5' non-transcrite, une partie transcrite, éventuellement avec des introns, et une partie 3' non transcrite, ladite séquence donnant lieu, après transcription, épissage et traduction à la protéine selon la revendication 1, soit ii) le transcrit de la séquence i) ou son équivalent ADNc, soit iii) une séquence complémentaire de la séquence i) ou ii) , soit iv) une séquence ayant une longueur d'au moins 25 bases et étant capable de s'hybrider, sur toute sa longueur, avec les séquences i) , ii) ou iii) dans des conditions strinqentes ou moyennement stringentes, soit v) un fragment consistant en au moins 25 nucléotides consécutives de l'une quelconque des séquences i) , ii) , ou iii) , ou en au moins 10 nucléotides consécutives lorsqu'il s'agit d'un fragment d'un intron de la séquence i) .
5. Séquence d'acide nucléique selon la revendication 4 caractérisée en ce qu'elle comporte la séquence génomique illustrée dans la figure 1 ou celle illustrée dans la figure 18, ou un fragment de .l'une de ces séquences.
6. Séquence d'acide nucléique selon la revendication 5 caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une partie d'une région non-codante ou d'un intron de la séquence génomique.
7. Séquence d'acide nucléique caractérisée en ce qu'elle comporte au moins un intron du gène d'aconitase végétale, ou une partie d'un tel intron, ladite partie ayant au moins 10 nucléotides et de préférence au moins 30 nucléotides.
8. Séquence d'acide nucléique selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'elle présente une activité promotrice et se trouve au sein du fragment HindIII(-1293)-BglII(+45) de la séquence génomique de la figure 1.
9. Séquence d'acide nucléique selon la revendication 4, capable d'inhiber le gène de l'aconitase caractérisée en ce qu'elle comporte un ou plusieurs fragments ayant une longueur d'au moins 6 nucléotides, le(s)dit(s) fragment(s) étant complémentaire(s) d'au moins une partie du transcrit du gène de l'aconitase.
10. Couple de séquences d'acide nucléique selon la revendication 4 caractérisée en ce que chaque séquence a une longueur comprise entre 15 et 300 nucléotides et est capable de jouer le rôle d'amorce dans une réaction d'amplification d'acide nucléique.
11. Plasmide caractérisé en ce qu'il contient au moins l'une des séquence d'acide nucléique selon les revendications 5 à 10.
12. Gène chimérique capable d*être exprimé chez les plantes caractérisé en ce qu'il comporte : i) une région promotrice selon la revendication 8, et ii) une séquence hétérologue transcrite, codante ou non, placée sous le contrôle dudit promoteur.
13. Gène chimérique capable d'être exprimé chez les plantes caractérisé en ce qu'il comporte : i) un promoteur fonctionnel chez les plantes autre que celui naturellement associé avec le gène de 1'aconitase, et ii) une séquence codant pour la protéine selon la revendication 1 ou pour un fragment protéique selon la revendication 2.
14. Cellules végétales transformées de manière stable par une séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 4 à 13.
15. Plantes transgéniques transformées de manière stable par une séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 4 à 13.
16. Anticorps monoclonaux ou polyclonaux capables de reconnaître, de préférence de manière spécifique, la protéine selon la revendication 1 ou le fragment protéique selon la revendication 2.
17. Procédé pour la modification du métabolisme d'une plante, caractérisé par l'introduction dans la plante d'un insert génétique comportant une séquence d'acide nucléique selon la revendication 4.
18. Procédé selon la revendication 17 caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique comprend un promoteur fonctionnel chez les plantes, et sous le contrôle de ce promoteur, une séquence codant pour la protéine selon la revendication 1, ou pour un fragment protéique selon la revendication 2, l'expression de cette séquence conduisant à une surproduction d*aconitase.
19. Procédé selon la revendication 18 caractérisé en ce que la surproduction d'aconitase conduit à une surproduction d'au moins llun des acides organiques du cycle de Krebs ou du cycle glyoxylate, notamment le citrate, 1'isocitrate, le succinate, le glyoxylate, le malate, 1'oxaloacétate, l'α-cetoglutarate, le fumarate.
20. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que le promoteur est soit celui naturellement associé, dans la plante, avec le gène de l'aconitase, soit un promoteur hétérologue au gène de l'aconitase.
21. Procédé selon la revendication 17 caractérisé en ce que 1'insert génétique comprend un promoteur fonctionnel, et sous le contrôle de ce promoteur, une séquence inhibitrice selon la revendication 9, l'expression de la séquence conduisant à une inhibition de l'expression du gène de l'aconitase.
22. Procédé selon la revendication 20 caractérisé en ce que l'inhibition de l'expression du gène de l'aconitase conduit à une surproduction de l'Acétyl coenzyme-A et par conséquent, à une réorientation du métabolisme ou du catabolisme polysaccharidique, lipidique et azoté.
23. Procédé pour obtenir l'expression constitutive, dans une plante, d'une séquence codante, l'expression étant particulièrement forte lors de la germination des graines et lors de la maturation de la graine et du pollen, caractérisé par l'introduction dans le génome de la plante, d'un gène chimérique selon la revendication 12.
24. Gène chimérique capable d'être exprimé chez les plantes caractérisé en ce qu'il comporte : i) un promoteur fonctionnel chez les plantes, ii) une séquence transcrite, codante ou non, placée sous le contrôle dudit promoteur, iii) un ou plusieurs introns du gène de l'aconitase végétale, selon la revendication 6 ou 7.
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998006831A1 (fr) * 1996-08-08 1998-02-19 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Cellules vegetales et plantes transgeniques a formation acetyle-coa modifiee
WO1998021336A2 (fr) * 1996-11-08 1998-05-22 Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung Procede de controle genetique de la maturation de semences dans des plantes
WO2004056967A2 (fr) * 2002-12-18 2004-07-08 Agrinomics Llc Generation de vegetaux a teneur en huile modifiee
FR2915397A1 (fr) * 2007-04-27 2008-10-31 Vincience Sa Composition pharmaceutique et/ou cosmetique contenant des principes actifs activateurs de l'aconitase
FR2915396A1 (fr) * 2007-04-27 2008-10-31 Vincience Sa Composition pharmaceutique et/ou cosmetique contenant des peptides

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993021223A1 (fr) * 1992-04-13 1993-10-28 Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Procedes et reactifs pour le diagnostic d'autoanticorps
WO1994001451A2 (fr) * 1992-07-13 1994-01-20 Bionebraska, Inc. Procede pour la modification de polypeptides recombines
WO1994020622A1 (fr) * 1993-03-11 1994-09-15 Akzo Nobel N.V. Fragment polypeptidique pouvant induire des anticorps neutralisants diriges contre le virus de l'immuno-decience feline

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993021223A1 (fr) * 1992-04-13 1993-10-28 Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Procedes et reactifs pour le diagnostic d'autoanticorps
WO1994001451A2 (fr) * 1992-07-13 1994-01-20 Bionebraska, Inc. Procede pour la modification de polypeptides recombines
WO1994020622A1 (fr) * 1993-03-11 1994-09-15 Akzo Nobel N.V. Fragment polypeptidique pouvant induire des anticorps neutralisants diriges contre le virus de l'immuno-decience feline

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAUW, G., ET AL.: "Two-dimensional gel electrophoresis, protein electroblotting and microsequencing: a direct link between proteins and genes.", ELECTROPHORESIS 11, 528-536, 1990 *
COURTOIS-VERNIQUET, F., ET AL.: "Lack of aconitase in glyoxysomes and peroxisomes", THE BIOCHEMICAL JOURNAL, vol. 294, pages 103 - 107 *
DE BELLIS, L., ET AL.: "Purification and characterization of aconitase isoforms from etiolated pumpkin cotyledons", PHYSIOLOGIA PLANTARUM, vol. 88, pages 485 - 492 *
EMBL SEQUENCE DATABASE ACCESSION NO.X82839 RELEASE 41,28-11-1994;PEYRET, P., ET AL. 'A.THALIANA MRNA FOR ACONITASE (ZAPII)' *
EMBL SEQUENCE DATABASE ACCESSION NO.X82840 RELEASE 41, 28-11-1994,PEYRET, P., ET AL. 'C.MELO MRNA FOR ACONITASE (UNI-ZAPXR)' *
EMBL SEQUENCE DATABASE ACCESSION NO.X82841 RELEASE 41; 28-11-1994. PEYRET, P., ET AL. 'A.THALINA ACO GENE' *
HIRLING, H., ET AL.: "Expression of active iron regulatory factor from a full-length human cDNA by in vitro transcription/translation", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 20, no. 1, OXFORD GB, pages 33 - 39 *
KAPTAIN, S., ET AL.: "A regulated RNA binding protein also possesses aconitase activity", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, vol. 88, WASHINGTON US, pages 10109 - 10113 *
KENNEDY, M.C., ET AL.: "Purification and characterization of cytosolic aconitase from beef liver and its relationship to the iron-responsive element binding protein", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, vol. 89, WASHINGTON US, pages 11730 - 11734 *
ROUAULT, T.R., ET AL.: "Cloning of the cDNA encoding an RNA regulatory protein - the human iron-responsive element binding-protein", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, vol. 87, WASHINGTON US, pages 7958 - 7962 *
VERNIQUET, F., ET AL.: "Rapid inactivation of plant aconitase by hydrogen peroxide", THE BIOCHEMICAL JOURNAL, vol. 276, pages 643 - 648 *
YAMANASHI, Y., ET AL.: "Identification of HS1 protein as a major substrate of protein-tyrosine kinase(s) upon B-cell antigen receptor-mediated signaling", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, vol. 90, WASHINGTON US, pages 3631 - 3635 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998006831A1 (fr) * 1996-08-08 1998-02-19 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Cellules vegetales et plantes transgeniques a formation acetyle-coa modifiee
WO1998021336A2 (fr) * 1996-11-08 1998-05-22 Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung Procede de controle genetique de la maturation de semences dans des plantes
WO1998021336A3 (fr) * 1996-11-08 1998-07-16 Inst Pflanzengenetik & Kultur Procede de controle genetique de la maturation de semences dans des plantes
WO2004056967A2 (fr) * 2002-12-18 2004-07-08 Agrinomics Llc Generation de vegetaux a teneur en huile modifiee
WO2004056967A3 (fr) * 2002-12-18 2004-08-12 Agrinomics Llc Generation de vegetaux a teneur en huile modifiee
FR2915397A1 (fr) * 2007-04-27 2008-10-31 Vincience Sa Composition pharmaceutique et/ou cosmetique contenant des principes actifs activateurs de l'aconitase
FR2915396A1 (fr) * 2007-04-27 2008-10-31 Vincience Sa Composition pharmaceutique et/ou cosmetique contenant des peptides
WO2008145848A2 (fr) * 2007-04-27 2008-12-04 Societe D'extraction Des Principes Actifs S.A. (Vincience) Composition pharmaceutique et/ou cosmetique contenant des peptides derives de l ' aconitase
WO2008145849A2 (fr) * 2007-04-27 2008-12-04 Societe D'extraction Des Principes Actifs S.A. (Vincience) Composition pharmaceutique et/ou cosmetique contenant des peptides derives de l'aconitase
WO2008145849A3 (fr) * 2007-04-27 2009-06-18 Soc Extraction Principes Actif Composition pharmaceutique et/ou cosmetique contenant des peptides derives de l'aconitase
WO2008145848A3 (fr) * 2007-04-27 2009-06-18 Soc Extraction Principes Actif Composition pharmaceutique et/ou cosmetique contenant des peptides derives de l ' aconitase

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