FR2715404A1 - Aconitases végétales et acides nucléiques codant pour ces aconitases. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une protéine ayant une activité enzymatique d'aconitase, caractérisée en ce qu'elle comporte, soit i) la séquence en acides aminés illustrée dans la figure 1 ou une séquence présentant au moins 75 % d'homologie avec celle-ci, soit: ii) une variante de la séquence i) comportant une délétion de jusqu'à 40 acides aminés environ au niveau de l'extrémité NH2 . L'invention concerne également les régions promotrices du gène de l'aconitase et des gènes chimériques comprenant ces régions.

Description

conitase.s Végétales et acides Nuol&iques codant pour ces Aconitases

L'invention concerne l'aconitase végétale, des séquences d'acides nucléiques codant pour l'aconitase, et un procédé pour modifier le aétabolisme d'une plante par l'introduction, dans la plante, d'une séquence d'acide nucléique capable de modifier

l'expression naturelle du gène de l'aconitase.

L'invention concerne également les régions promotrices du gène de l'aconitase et des gènes chimériques

comprenant cette région promotrice.

L'aconitase, (E.C,4.2.1.3.), également connu mous le nom d'aconitate hydratase ou citrate (isocitrate) hydro-lyase, est une protéine & centre fer-soufre catalysant la réaction d'interoonversion réversible du citrate en isocitrate via le cis-aconitate comme intermédiaire. Depuis plusieurs années, les recherches ont conduit & la mise en évidence non seulement d'une aconitase mitochondriale (intervenant dans le cycle de Krebs) mais également d'une aconitase cytosolique, qui, chez les animaux, possède une double fonctionnalité: une activité d'aconitase, dont le r8le physiologique n'est pas connu, et une activité "Iron Responsive Element Binding Protein" (IRE-BP) permettant une régulation post-transcriptionnelle dans le métabolisme du fer. Chez l'homme, 1'IRE-BP existe dans deux états conformationnels, appelés des

wisoformes", et correspondant & un état de réduction.

Chez les animaux et chez certains micro-

organismes, les aconitases mitochondriales et cytosoliques ont pu útre purifiées et clonées. Par exemple, l'aconitase mitochondriale de porc (Zheng et al. 1990, J. Biol. Chem., 265: 2814-2821) et de levure (Gangloff, 1990, PNAS, 85: 8998-9002) a été clonée, ainsi que l'aconitase cytosolique humaine (Rouault et ai., 1990, PNAS, 87: 7958- 7962) et

bactérienne (Promodrou et al., 1991, J. Gen.

MNicrobiol., 137: 2505-2515).

Chez les animaux, l'aconitase cytosolique et l'aconitase mitochondriale sont codées par deux gènes différents et sont facilement séparables, par exemple

par chromatographie sur DEAE - cellulose.

En ce qui concerne l'aconitase végétale, très peu

d'informations sont disponibles & l'heure actuelle.

Chez les plantes, il existe aussi une activité aconitase mitochondriale, intervenant dans le cycle de Krebs, et une activité aconitase cytosolique, intervenant dans la cycle du glyoxylate. Le fait qu'aucune activité aconitase ne soit détectée dans les glyoxysomes suggère que le cycle du glyoxylate est détournée via le cytosol (Courtois - Verniquet et

Douce, 1993, Biochem. Journal, 294: 103-107).

Un certain nombre de différences dans les propriétés structurales des aconitases mitochondriales d'origine animale et végétale, en particulier dans la structure Fer-Soufre, ont pu être mises en évidence (Brouquisse et ai., 1986, Plant Physiol., 81: 247-252). De plus, contrairement aux travaux réalisés dans le domaine animal, les formes mitochondriale et cytosolique de l'aconitase végétale n'ont pu, jusque&'à présent, être séparées par chromatographie d'échange d'ions sur DEAE (Brouquisse et al. , 1987, Plant Physiol., 84: 1402-1407), les deux formes présentant les mêmes pics d'élution. Ces résultats suggèrent que la forme aitochondriale et la forme cytosolique de

l'aconitase végétale ont des structures très voisines.

A ce jour, les aconitases de deux espèces végétales ont été purifiées. L'aconitase mitochondriale de pomme de terre a pu être purifiée à partir de mitochondries de tubercules (Verniquet et al., 1991, Biochem. J., 276: 643-948). Il s'agit d'une protéine monomérique d'un poids moléculaire d'envirion 9OKDa, de nature acide, se rapprochant des

aconitases bactériennes et de levure.

De Bellis et al., 1993, Physiologia Plantarum, 88: 485-492, ont purifié deux isoformes de 1'aconitase & partir de cotylédons étiolés de citrouille. Ces deux isoformes ont. un poids moléculaire voisin de lOOKDa et 98KDa avec des pI respectivement de 5.0 et 4.8. Selon ces auteurs, une troisième forme a également été détectée en gel non dénaturant mais n'a pas été purifiée. La localisation subcellulalre de ces isoformes n'a pas été clairement déterminée mais les auteurs supposent qu'il s'agit d'isoformes cytosoliques. La signification biologique

de ces "isoformes" n'est pas élucidée.

Les informations disponibles aujourd'hui sur les aconitases végétales ne permettent donc pas de définir la relation entre la forme mitochondriale et la forme cytosolique. Il n'est pas connu si les deux formes sont codées par deux gènes differents, comme chez l'animal, ou s'il s'agit d'un seul gène. L'existence de différentes isoformes d'une même forme d'aconitase a été suggérée mais n'a pas été confirmée. De plus, l'aconitase de citrouille et celle de pomme de terre purifiées par De Bellis et par Verniquet,

respectivement (supra), présentent des carac-

téristiques différentes, l'une de l'autre, suggérant une spécificité d'espèce. A ce jour, le degré d'homologie entre les différentes espèces végétales n'est pas connu% Jusqu'à présent, le clonage du gène de

l'aconitase végétale n'a jamais été rapporté.

La présente invention concerne le clonage de ltADNc de l'aconitase végétale et la caractérisation

du gène, y compris la région promotrice.

Le clonage du gène a présenté un certain nombre de difficultés pratiques. Par exemple, la spécificité d'espèce de l'aconitase suggérée dans l'art antérieur empêche la transposition fiable d'information concernant une première espèce, sur une deuxième. Pour cloner l'ADNc de l'aconitase de melon, les inventeurs ont donc d purifier 1'aconitase & partir de graines de melon afin d'obtenir la séquence en acides aminés de l'extrémité NH2. Ceci a permis d'élaborer une série de sondes nucléiques degénér4es, mais aucune de ces sondes n'a permis d'identifier, parmi une banque d'ADNc, de clone positif. Une séquence partielle d'ADNc d'aconitase de melon a pu être identifiée en criblant une banque d'expression d'ADNc avec des anticorps polyclonaux, mais un clone complet de l'ADNc

de l'aconitase n'a pas été identifié.

Une hybridation inter-spécifique, c'est-à-dire le criblage d'une banque d'ADNc d'Arabidopsis thaliana avec une sonde provenant de l'ADNc de l'aconitase de melon, a donc été effectuée. Les conditions d'hybridation inter-spécifique ont été spécialement concues pour cette étape du clonage parce que l'homologie entre les séquences n'était pas connue. Un clone entier d'ADNc d'Arabidopsis thaliana a pu ainsi être identifié. Cet ADNc a ensuite servi de sonde pour cribler une banque génomique d'Arabidopsis thaliana et a permis l'identification du gène, y compris la région promotrice. Les résultats de ces travaux ont permis aux inventeurs: d'effectuer des recherches d'homologies de

séquence entre les aconitases de différentes espèces.

Il a été démontré que l'aconitase d'Arabidopsis thaliana présente une forte homologie (70 %) avec l'IRE-BP humaine, et avec l'aconitase d'autres espèces végétales (90 % environ). Les protéines végétales sont plus proches des aconitases cytosoliques animales que des aconitases mitochondriales animales. Ces résultats suggèrent que l'aconitase végétale, en particulier l'aconitase cytosolique, joue le rôle d'une IREBP et permet une régulation post-transcriptionelle dans le métabolisme d'ions métalliques tels que le fer, ou bien qu'elle joue le rôle d'une RNA-bp, se fixant à une structure proche des IRE animales, qui

interviendrait dans une régulation post-

transcriptionnelle du métabolisme de la plante ou de la graine; - de caractériser le gène de l'aconitase chez Arabidopsis thaliana. Sa structure est très complexe, comportant 20 exons et 19 introns. Cinq départs de transcription ont été cartographiés, dont un est utilisé préférentiellement. Un fragment présentant une activité promotrice a été identifié. Ce promoteur permet une expression constitutive particulièrement forte lors de la germination des graines et de la maturation des grains de pollen; - de mettre en évidence l'existence d'un clone putatif dont l'initiation de transcription se situerait en amont de la TATA box identifiée. Ce gène pourrait donc coder pour les deux formes protéiques, son expression étant éventuellement dirigée par deux promoteurs; - d'émettre l'hypothèse que la forme mitochondriale de l'aconitase se différencie de la forme cytosolique essentiellement par la présence, &

l'extrémité NH2, d'une peptide signal aitochondriale.

L'objet de la présente invention est une protéine ayant une activité enzymatique d'aconitase. Plus particulièrement l'invention concerne une protéine ayant une activité enzymatique d'aconitase caractérisée en ce qu'elle comporte, soit i) la séquence en acides aminés illustrée dans la figure 1 ou une séquence présentant au moins 75 % d'homologie avec celle-ci, soit: ii) une variante de la séquence i) comportant une délétion de jusqu'& 40 acides aminés environ au niveau

de l'extrémité NHa.

Dans le contexte de la présente invention, une activité enzymatique d'aconitase est définie comme étant la capacité de catalyser la réaction

d'isomérisation du citrate en iso-citrate via le cais-

aconitate. Cette activité peut être dosée par la méthode décrite par Rose et O'Connel (J. Biol. Chem., 242: 1870-1879, 1967). Cette méthode fait appel au couplage de plusieurs réactions enzymatiques décrites cidessous: Aconitase Citrate -------------------------> Isocitrate Isocitrate déshydrogénase Isocitrate - -------------> a- cétoglutarate

NADP NADPH2

La réduction du NADP est suivie par apectrophotométrie

à 340nm.

Une autre méthode de dosage d'activité enzymatique de l'aconitase est celle décrite par Kennedy et al, CJ. Biol. Chem., 258: 11098-11105, 1983) qui permet de suivre & 240 na l'apparition du cis- aconitate & partir de l'isocitrate. La réaction enzymatique se déroule & 25 C dans un tampon phosphate SOmM à pH 6 avec isocitrate 50K comme

substrat. Le coefficient d'extinction molaire du cis-

aconitate est donné comme étant égal à 3,6mM'l, une unité enzymatique (U) correspondant à la formation d'une micro-mole de cis-aconitate par minute. Ce dosage, facile à mettre en oeuvre, est utilisé pour déterminer les constantes enzymatiques de l'aconitase

et pour suivre sa purification.

La protéine de l'invention, outre son activité d'aconitase, peut également présenter une activité d'IRE-BP, c'est-à-dire, est capable de se fixer & des ARNm ayant une BtruCture d'iron-responsive element

(IRE).

La protéine de l'invention, ayant une activité enzymatique d'aconitase, peut être celle dont la séquence en acides aminés est illustrée dans la figure 1, et qui représente l'aconitase d'Arabidopsis thaliana. L'invention englobe également des protéines présentant au moins 75 % d'homologie avec la séquence illustrée dans la figure 1 et ayant une activité d'aconitase. De préférence, ces protéines homologues présentent au moins 80, et plus particulièrement au moins 85, par exemple 90 ou 95 % d'homologie avec

celle illustrée dans la figure 1.

Comme protéines préférées de l'invention, on peut aussi citer les aconitases de melon purifiées par les inventeurs & partir de graines de melon. Les deux formes semblent partager une même séquence en acides aminés. La séquence partielle en acides aminés est illustrée dans la figure 2. Elle présente 86,5 % d'identité avec celle d'ArabidoDsis thaliana (91,8 % d'homologie). Les deux formes d'aconitase de melon purifiées par les inventeurs, selon la méthode décrite dans les exemples plus loin, ont un poids moléculaire apparent estimé en gel de polyacrilamide en conditions dénaturantes voisin de 97KDa. Les points isoélectriques de ces deux protéines (appelées wAcoI"

et #AcolI") sont estimés respectivement & 5,2 et 5.0.

Les protéines présentant au moins 75 % d'homologie avec celle de la figure 1 comprennent aussi l'aconitase d'autres espèces végétales telles

que Brassica napus.

L'invention englobe également des variantes de la séquence illustrée dans la figure 1 et de celles présentant au moins 75 % d'homologie avec celle-ci, les variantes comportant une délétion de jusqu'& 40

acides aminés environ au niveau de l'extrémité NH2.

Cette délétion n'affecte pas l'activité enzymatique d'aconitase de la protéine. Du point de vue physiologique, cette délétion correspond soit à l'élimination du peptide signal mitochondrial soit & l'élimination de la partie de la séquence qui différencie la forme mitochondriale de la forme cytosolique. De préférence, la délétion s'étend de

l'acide aminé 1 à l'acide aminé 30 environ.

Pour Arabidopsis thaliana, la délétion au niveau de l'extrémité NH2 s'étend de préférence de l'acide aminé 1 à l'acide aminé 27 (numérotation selon la figure 1) ou encore de l'acide aminé 1 à l'acide aminé 29. En effet, les inventeurs démontrent que la forme mitochondriale de l'aconitase d'ArabidoDsis thaliana démarre à l'acide aminé 28 (Ser Ser Met...). Ceci signifie que les acides aminés 1 à 27 correspondent vraisemblablement au peptide signal mitochondrial. La forme cytosolique de l'aconitase d'Arabidopsis thaliana démarre vraisemblablement à l'acide aminé 30 (Met). Dans ce qui suit, les protéines ayant une activité d'aconitase et comportant la séquence de la figure 1, ou une séquence présentant au moins 70 % d'homologie avec celle-ci, ou encore les variantes comportant une délation NH2-terminale, seront appelées

"les protéines de l'invention".

L'invention concerne également des fragments protéiques comprenant au moins 6 acides aminés de la protéine de l'invention. De préférence, ces fragments protéiques sont reconnus par des anticorps capables de reconnaltre la protéine entière, les fragments présentant donc une homologie immunologique avec la protéine "mère". Les fragments de l'invention ont une longueur d'au moins 6 acides aminés, de préférence comprise entre 10 et 900 acides aminés, par exemple , 200, 300, 400, etc.

acides aminés. Les fragments protéiques de longueur importante, par exemple au-delà de 500 acides aminés, peuvent éventuellement présenter.. DTD: une activité enzymatique d'aconitase.

Selon un mode de réalisation préféré de cet aspect de l'invention, le fragment protéique est constitué d'un fragment de l'extrémité NH2 de la protéine illustrée dans la figure 1, l'expression "extrémité NH2W, signifiant la partie de la protéine s'étendant de l'acide aminé 1 à l'acide aminé 40, par exemple entre 1 et 30. Le fragment NH2-terminale peut également être constitué d'un sous-fragment d'une séquence ayant une longueur de 40 acides aminés environ et présentant au moins 60 % d'homologie avec l'extrémité NH2 de la protéine illustrée dans la figure 1. Le fragment NH2-terminal a normalement une longueur comprise entre 6 et 40 acides aminés, par exemple 30. De préférence, ces fragments présentent au moins 70 %, et plus particulièrement au moins 80 % d'homologie, avec les acides aminées 1 & 40 de celle illustrée dans la figure 1. L'extrémité NH2 correspond au peptide signal aitochondrial responsable du transport de l'aconitase dans les mitochondries. Les fragments selon cet aspect de l'invention constituent donc des peptides signals et peuvent étre utilisés, par exemple dans la production de protéines de fusion

pour assurer le transport dans les mitochondries.

Les protéines et fragments protéiques de 1l'invention peuvent *tre obtenus par purification à partir de la plante, en mettant en oeuvre le protocole expérimental décrit dans les exemples ci-dessous, suivi éventuellement par un clivage de la protéine pour obtenir des fragments. Ils peuvent également être produits par voie recombinante après l'insertion dans un hôte cellullaire compétent d'une séquence d'acide nucléique appropriée suivie de la purification de la protéine ainsi produite. Ils peuvent également étre

obtenus par synthèse chimique.

Outre les protéines et fragments protéiques, l'invention concerne également une séquence d'acide nucléique caractérisée en ce qu'elle comporte soit: i) une séquence qui, le cas échéant après transcription, épissage et traduction, donne lieu & la protéine de l'invention, soit ii) le transcrit de la séquence i) ou son équivalent ADNc, soit iii) une séquence complémentaire de la séquence i) ou il), soit iv) une séquence capable de s'hybrider avec les séquences i), ii) ou iii) dans des conditions stringentes ou moyennement stringentes, soit Il v) un fragment comportant au moins 6, et de préférence au moins 30, nucléotides consécutives de

l'une quelconque des séquences 1i), ii), iii) ou iv).

Le terme acide nucléique signifie dans le cadre de la présente invention de l'ADN ou de lARN, ou

éventuellement un mélange des deux.

Selon cet aspect de l'invention, une séquence d'acides nucléiques préférée est la séquence génomique illustrée dans la figure 1 ou encore les séquences d'ADNc illustrées dans les figures 3 et 4, ou les

séquences dégénérées, dérivées de celles-ci.

L'invention englobe également les séquences complémentaires de ces séquences, l'expression "complémentaire" signifiant normalement une complémentarité de 100 %, mais peut également signifier un degré de complémentarité suffisamment élevé pour permettre l'hybridation stable entre la séquence et sa séquence complémentaire. La présence d'un certain nombre de mésapariements, par exemple jusqu'à 10 %, ou éventuellement jusqu'à 20 %, peut

être tolérée.

L'invention concerne également des séquences d'acides nucléiques capables de s'hybrider avec les séquences i) et ii) telles que définies ci-dessus, dans des conditions stringentes ou moyennement stringentes. Les conditions stringentes sont les suivantes: - l'hybridation s'effectue sur les filtres de nitro-cellulose dans 20ml de solution d'hybridation (SSC 6X, SDS 5%, DENHARDT 5X, ADN de spermes de saumon Omg/ml). - une pré-hybridation de 4 heures est suivie d'une hybridation de 12 heures (solution contenant la

sonde marquée) à la température de 68'C.

Les filtres subissent les lavages suivants: - 2 lavages de 30 mn dans une solution SSC 2X & 68C: - un lavage de 30 un dans une solution Ssc 2X, SDS 0.1% à 68*C t - un lavage de 30 mn dans une solution SSC 0.1X,

SDS 0.1% à 68'C.

Les conditions de moyenne stringence (& appliquer par exemple lors du criblage d' une banque provenant d'une espèce avec une sonde provenant d'une autre espèce) sont les suivantes: - les conditions d'hybridation se font en faisant varier la concentration de formamide 10, 20, 30, 40, % à une température fixe de 40'C dans un tampon d'hybridation SSC 6X, SDS 0.1%, DENHARDT 5X, ADN de

spermes de saumon 50Og/ml.

- une pré-hybridation de 4 heures est suivie

d'une hybridation de 12 heures.

Les conditions de lavage sont les suivantes: - un lavage de 30 un dans une solution SSC 2X à 42'C -un lavage de 30 un dans une solution SSC lX & 42C; - un lavage de 30 mn dans une solution SSC 0.1X & 42C; - un lavage de 30 un dans une solution SSC 0.1X,

SDS 0.1% à 68*C.

Ces conditions de stringence permettent d'identifier les séquences codant pour 1'aconitase chez une espèce végétale par le criblage d'une banque d'ADNc de cette espèce avec une sonde provenant deune

autre espèce.

L'invention vise également des fragments d'acide nucléique comportant au moins 6, et de préférence au moins 30, nucléotides consécutives de l'une quelconque des séquences (i), (ii), ou (iii) précédemment décrites, Avantageusement, le fragment comporte entre et 300 nucléotides et est capable de jouer le rôle d'amorçe dans une réaction d'amplification d'acide nucléique. Le fragment peut également tre marqué par des moyens connus en soi, par exemple des moyens radioactifs, fluorescents, enzymatiques, ou par un marquage & l'avidine ou & la biotine. Selon cet aspect de l'invention, le fragment marqué sert de sonde nucléotidique. Dans ce cas, la longueur du fragment est de préférence comprise entre 6 et 900 bases, par

exemple entre 50 et 350 paires de bases.

Selon une variante préférée de l'invention, la séquence d'acide nucléique comporte un ou plusieurs fragments ayant une longueur d'au moins 6 nucléotides, le(s)dit(s) fragment(s) étant complémentaires d'une

partie, au moins, du transcrit du gène de l'aconitase.

Ce genre de structure, capable d'inhiber l'expression du gène de l'aconitase, englobe plus particulièrement des séquences antisens et des ribozymes dirigés contre

le transcrit du gène de l'aconitase.

Dans le cas de l'antisens, la séquence comporte normalement un seul fragment, complémentaire d'une partie au moins, du transcrit, ce fragment ayant une

longueur d'au moins une vingtaine de nucléotides.

Plusieurs séquences antisens peuvent être reliées les unes aux autres soit de manière contigûe, soit en

alternance avec d'autres séquences.

De préference, la séquence inhibitrice est un ribozyme dirigé contre le transcrit du gène de l'aconitase, le ribozyme comprenant une séquence complémentaire d'une partie au moins du transcrit du gène de l'aconitace et, incluse au sein de cette séquence complémentaire, une région catalytique provenant d'un ribozyme, de préférence un ribozyme du

type tête de marteau (voir par exemple EP-A-321 201).

Le ribozyme peut àtre un mono-ribozyme ou un poly-

ribozyme. Selon l'invention, les séquences antisens et les ribozymes sont normalement produits ln-vivo par la transcription de la séquence d'ADN correspondante,

insérée de manière stable dans le génome de la plante.

La traduction du transcrit du gène de l'aconitase est alors empêchée, soit par l'hybridation de la séquence antisens, soit par le clivage du transcrit par le ribozyme, affectant ainsi le fonctionnement du cycle de Krebs et du cycle glyoxylate, ainsi que la ou les

voie(s) métabolique(s) régulée(s) post-

transcriptionnellement par l'aconitase cytosolique grâce & son activité RNA-binding. L'inhibition de la production d'aconitase conduit & une réduction du taux de production des acides organiques de ces deux cycles, mais & une augmentation de la production de l'acétyl coenzyme-A. Ce dernier est le produit de la dégradation des squelettes carbonés de plusieurs voles du catabolisme, par exemple la glycolyse, le cycle des pentoses, la D-oxydation des lipides et le catabolisme des protéines. La dégradation de ces substances peut *tre donc indirectement modifiée par l'inhibition de

l'expression de laconitase.

La mise en oeuvre et les applications de la

séquence inhibitrice est décrite en détail plus loin.

Selon un mode de réalisation préférée de l'invention, le fragment d'acide nucléique est un fragment de la séquence génomique illustrée dans la figure 1 comportant au moins 10 nucléotides. Ce fragment peut correspondre à au moins une partie d'une région non codante ou d'un intron de la séquence

génomique illustrée.

Comme exemple de fragment d'acide nucléique non-

codant, on peut citer le fragment -85 & +1, par exemple -85 & -52, de la séquence de la figure 1. Il a été constaté que cette région présente une structure

secondaire typique des IRE (Iron Responsive Element).

il se pourrait que cette partie de la séquence soit spécifique du messager de 1'aconitase mitochondriale, auquel cas un ribozyme dirigé spécifiquement contre cette région, ou une partie, par exemple la région -49 & +1, permettrait d'inhiber spécifiquement l'activité mitochondriale. Un fragment particulièrement préféré est le fragment HindIII - BglII (1293 à +45 de la séquence génomique de la figure 1), ou le fragment correspondant dans des séquences codant pour des protéines homologues. Le promoteur du gène de l'aconitase se trouve au sein de ce fragment. Ce fragment peut étre utilisé en tant que tel comme promoteur pour obtenir l'expression de séquences

codantes hétérologues chez les plantes.

Des fragments de plus petite taille peuvent également être utilisés à condition que l'activité promotrice soit conservée. Ces "sous- fragments" peuvent tre identifiés par la fusion du sous-fragment en question avec la séquence codante d'un gène rapporteur tel que le le beta glucuronidase, et la détection de l'expression du gène rapporteur dans des cellules végétales. La délétion, au sein du fragment Hind II - Bgl II, de 100 à 300 nucléotides du coté ' donne lieu normalement & des sous-fragments ayant une activité promotrice. Il est préférable de préserver la phase de lecture pour tester le fragment choisi. Il est également possible, selon l'invention, d'utiliser deux régions promotrices en tandem pour

augmenter le niveau d'expression.

Le promoteur conduit a une expression constitutive et est fortement exprimé & la fois lors de la germination des graines et lors de la maturation de la graine et des grains de pollen. Il est donc particulièrement avantageux d'utiliser la région promotrice de l'invention pour obtenir une forte expression pendant cette période de la vie de la plante. Les tissus de la graine, ot l'expression dirigée par le promoteur est particulièrement forte, sont les cotylédons, l'albumen ou l'endo-sperme, et l'embryon. Le fragment promoteur est de préference utilisé pour diriger uns expression constitutive, soit dans le cytoplasme, soit dans les mitochondries, soit dans les deux & la fois. Pour obtenir l'expression d'une protéine héterologue dans les mitochondries, la séquence codant pour le peptide signal mitochondrial de l'aconitase est fusionnée à l'extremité 5' de la

séquence codante.

Il peut également être envisagé d'utiliser des fragments promoteurs s'étendant plus en amont du site BindIII (-1293). Les inventeurs ont identifié un clone par la technique RACE dont l'extrémité 5' sur la séquence génomique se situe en position -52 en mont de la première TATA box. Ceci laisse suggérer qu'une initiation de la transcription peut avoir lieu plus en amont. Ces résultats indiquent l'existence éventuelle d'un deuxième promoteur qui pourrait être responsable de la transcription de l'une des deux formes de l'aconitase & partir du gène. Ce deuxième promoteur

fait également partie de l'invention.

Les réglons promotrices de l'invention sont

normalement utilisées sous forme de gène chimérique.

Ces gènes chimériques comportent: i) une région promotrice selon l'invention, et il) une séquence hétérologue transcrite, codante

ou non, placée sous le contrôle dudit promoteur.

L'expression "séquence hétéroloque transcrite, codant* ou non" signifie dans le contexte de la présente invention toute séquence transcrite autre que celles normalement associées avec le promoteur de 1,aconitase dans la plante. Cette expression englobe des séquences non-codantes telles que des ribozymes ou des séquences antisens, dirigées contre un transcrit

d'intérêt, ainsi que des séquences codantes.

Comme exemples de séquences codantes, on peut citer: - des gènes rapporteurs tel que Gus codant pour le Beta glucuronidase; - des séquences conférant une résistance & un antibiotique, par exemple la résistance & la kanamycine, la gentamycine, le G418, etc...; - toutes séquences codantes conférant des traits intéressants du point de vue agronomique, par exemple des séquences impliquées dans la stérilité male, par exemple des gènes mitochondriaux non-édités, des séquences conférant une résistance & unvirus ou aux herbicides etc.: - des séquences codantes de gène de mammifères, par exemple l'interféron, l'hormone de croissance, l'insuline et tout autre produit susceptible d'être

utile en tant que médicament.

Ces gènes chimériques permettent d'obtenir une

forte expression dans les graines sèches.

L'invention concerne également des gènes chimériques capable d'être exprimés chez les plantes caractérisés en ce qu'ils comportent: i) un promoteur fonctionnel chez les plantes autre que celui naturellement associé avec le gène de l'aconitase, et ii) une séquence codant pour la protéine de l'invention, telle que définie ci-dessus, ou pour un

fragment protéique, tel que défini ci-dessus.

Comme exemples de promoteur dans ce type de gène chimérique, on peut citer le promoteur du 35S, le promoteur NOS, des promoteurs semences spécifiques de

la plante.

Comme promoteurs spécifiques de graines, on peut citer le promoteur du gène de la napin (EP-A-0255378), ainsi que les promoteurs des gènes AT2S d'Arabidopsis thaliana, c'est-à-dire les promoteurs PAT2S1, PAT2S2, PAT2S3 et PAT2S4 (Krebbers et al., 1988, Plant

Physiol., 87: 859-866.

La séquence codante correspond à celle codant pour la protéine de l'invention présentant une activité d'aconitase ou pour un fragment protéique présentant soit une homologie immunologique avec

l'aconitase ou une activité d'aconitase.

L'invention concerne en outre des gènes chimériques capable d'être exprimés chez les plantes caractérisés en ce qu'ils comportent: i) un promoteur fonctionnel chez les plantes, ii) une séquence transcrite, codante ou non, placée sous le contrôle dudit promoteur, iii) un ou plusieurs introns du gène de

l'aconitase végétale, tel(s) que défini(s) ci-dessus.

La présence d'un ou plusieurs introns stabilise l'ARNm transcrit. Le ou les intron(s) peuvent être positionné(s) au sein de la séquence transcrite, ou peuvent être placé(s) entre le promoteur et le début

de la séquence transcrite.

L'invention vise également des plasmides ou vecteurs caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins l'une des séquence d'acide nucléique selon l'invention. De préférence, les plasmides et vecteurs permettent la transformation stable de la plante, par exemple les plasmides Ti d'Agrobacterium, des vecteurs

viraux tels que 1es Geminivirus ou le CaMV.

L'invention concerne également des cellules végétales et des plantes transgéniques transformées de manière stable par une séquence d'acide nucléique selon l'invention. Comme exemple de plantes transgéniques, on peut citer les espèces appartenant aux familles botaniques telles que les légumineuses (par exemple les haricots, pois, etc....), 1es crucifères (par exemple, les choux, radis, etc...), les solanacées (par exemple les tomates, pommes de terre, etc...) les cucurbitacées (par exemple le melon), les chénopodiacées (par exemple la betterave potagère), et 1es ombellifères (par exemple, les carottes, céleris, etc...). Les cucurbitacées et les Brassicae sont particulièrement préférés. On peut également citer les céréales telles que le blé, le mais, l'orge, le triticale et le riz, et les

oléagineux tels que le tournesol, le soja et le colza.

Tous les moyens connus pour introduire de l'ADN étranger dans des plantes peuvent étre utilisés, par exemple Agrobacterium, électroporation, fusion de protoplastes, bombardement avec canon & particules, ou pénétration d'ADN dans des cellules comme le pollen, le microspore, la graine et l'embryon immature, vecteurs viraux tels que les Geminivirus ou les virus satellites. Aqrobacterium tumefaciens et rhizoqenes constituent le moyen préféré. Dans ce cas, la séquence de l'invention est introduite dans un vecteur approprié avec toutes les séquences régulatrices nécessaires telles que promoteurs, terminateurs, etc... ainsi que toute séquence nécessaire pour

sélectionner les transformants.

L'invention vise également des anticorps monoclonaux ou polyclonaux capable de reconnaître, de préférence de manière spécifique, la protéine et les fragments protéiques de l'invention. Ces anticorps sont produits selon les techniques habituelles dans l'art en utilisant, comme immunogène, la protéine purifiée selon les techniques décrites dans les exemples ci-dessous ou la protéine recombinante. La technique de purification de l'exemple 1 cl-dessous conduit à la production de deux formes de l'aconitase (appelées AcoI et AcoII). En utilisant l'une de ces deux protéines comme immunogène, il est possible, selon l'invention, de produire des anticorps monoclonaux capable de faire la distinction entre les deux formes. Ces anticorps monoclonaux spécifiques constituent des sondes immunologiqes utiles pour étudier la localisation subcellulaire des deux formes

enzymatiques, ou pour la purification.

De manière générale, les anticorps de l'invention peuvent étre utilisés pour le crible de banques dOADNc ou pour d'autres utilisations telles que l'étude de la

parenté entre les aconitases de différentes espèces.

Les protéines et acides nucléiques de l'invention trouvent de nombreuses applications. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, les séquences d'acide nucléique et les gènes chimériques de l'invention sont utilisés dans un procédé pour la modification du métabolisme d'une plante. Ce procédé est caractérisé par l'introduction, dans la plante, d'un insert génétique comportant une séquence d'acide

nucléique de l'invention.

La modification du métabolisme de la plante peut consister, par exemple: en la modification de la quantité d'aconitase produite par la plante; - en une modification de l'expression temporale ou spatiale de l'acitonase: en une modification de la nature de l'aconitase produite. De préférence, la modification consiste en une modification de la quantité d'aconitase produite par la plante. Il peut s'agir d'une augmentation ou d'une

inhibition de la production d'aconitase.

Une augmentation est obtenue par l'introduction dans la plante d'un insert génétique comprenant un promoteur fonctionnel chez les plantes, et sous le contrôle de ce promoteur, une séquence codant pour la protéine de l'invention. Le promoteur peut étre celui naturellement associé avec le gène de l'aconitase végétale ou un promoteur hétérologue au gène de l'aconitase. Lorsque le promoteur est le promoteur naturel, l'insertion de la séquence codante avec son propre promoteur conduit à une surproduction d'aconitase, l'expression des copies supplémentaires du gène de l'aconitase étant spatialement et temporalement identique au gène endogène. En revanche, si le promoteur est hétérologue au gène de l'aconitase, il peut s'agir d'un promoteur constitutif ou encore d'un promoteur spécifique de certains tissus ou de certains stades de développement. Ceci permettra d'obtenir -une expression temporale et spatiale

différente de celle produite par le gène endogène.

La séquence codante utilisée pour obtenir une surproduction d'aconitase peut être la séquence codante entière exemplifiée par celle illustrée dans la figure 1 ou peut correspondre & l'une des deux formes (mitochondriale ou cytosolique) permettant d'obtenir la surproduction dans une localisation subcellulaire définie. Les séquences codant pour les protéines présentant au moins 75 % d'homologie avec

celle de la figure 1 peuvent également être utilisées.

Selon cet aspect de l'invention, la surproduction d'aconitase conduit & une surproduction d'au moins l'un des acides organiques du cycle de Krebs ou du cycle glyoxylate, notamment le citrate, l'isocitrate, le succinate, le glyoxylate, le malate,

l'oxaloacétate, lia-cetoglutarate, le fumarate.

Cette variante de l'invention constitue donc un procédé pour obtenir une surproduction d'acides organiques chez les plantes. Les acides ainsi obtenus peuvent ensuite être extraits de la plante, en faisant appel à des méthodes connues en soi, pour l'utilisation dans l'industrie agroalimentaire, par exemple en tant qu'addifif, antioxydants etc. La production de citrate est particulièrement préférée,

par exemple en tant qu'additif pour des jus de fruits.

La quantité d'aconitase produite par la plante peut également être diminuée par l'utilisation d'un ribozyme ou d'une séquence antisens dirigé contre au

moins une partie du transcrit du gène de l'aconitase.

Les ribozymes et les séquences antisens ont la structure décrite plus haut. Ces séquences inhibitrices peuvent être utilisées dans un gène chimérique selon l'invention, le promoteur étant

choisi afin de permettre une expression appropriée.

Par exemple, un promoteur inductible permettrait la production du ribozyme et par conséquent l'inactivation du transcrit de l'aconitase uniquement

lorsque les conditions d'induction étaient remplies.

Le ribozyme ou la séquence antisens peut également

&tre sous le contrôle du promoteur de l'invention.

Selon cette variante de l'invention, l'inhibition de la production d'aconitase conduit & une diminution de la production des acides organiques du cycle de Krebs et du cycle qlyoxylate. Par conséquent, il y a augmentation de la quantitié d'Acétyl coenzyme-A et d'acide citrique disponibles. L'Acetyl coenzyme-A étant le produit du catabolisme lipidique, protéique et polysaccharidique, il s'ensuit une modification du catabolisme de ces substances ou de certaines de ces substances. Cet aspect de l'invention peut donc être appliqué par exemple & la réorientation du métabolisme ou du catabolisme d'amidon, d'huiles, de protéines, etc, pour les industries agro-alimentaires, chimiques,

pharmaceutiques et cosmétologiques.

Selon une autre variante de l'invention, la distribution tissulaire de l'aconitase peut être modifiée. Par exemple, l'insertion de copies supplémentaires de l'une des deux formes d'aconitase, par exemple la forme mitochondriale plutôt que l'autre

forme, conduit & la surproduction de cette forme.

En outre, le clivage systématique du peptide signal mitochondrial, par l'utilisation d'un ribozyme telle que définie ci-dessus, conduit & la production

de la forme cytosolique seulement de l'enzyme.

Bien entendu, l'utilisation d'un promoteur spécifique de certains tissus permettra l'obtention d'aconitase dans les tissus o l'expression n'est pas

normalement très forte.

Il peut également être envisagé de modifier la nature de l'aconitase produite par une plante par l'insertion, dans une plante appartenent & une première espèce, d'une séquence codant pour l'aconitase d'une deuxième espèce. Ceci peut être intéressant lorsque la deuxième espèce présente des caractéristiques particulièrement avantageuses, par exemple lorsque l'aconitase d'une espèce particulière est moins sensible & certaines substances, ou lorsque son expression est réglée différemment de celle de la

plante hôte.

La modification du métabolisme de la plante par une augmentation ou une diminution de la production d'aconitase peut également influer sur le métabolisme des ions métalliques, tels que le fer, le cadmium et le cuivre. Ces effets sont vraisemblablement exercés grâce au rôle d'IRE-BP que peut jouer l'aconitase végétale. Différents aspects de l'invention sont illustrés dans les figures - Figure 1 séquence nucléotidique du gène codant pour une protéine à activité aconitase chez

Arabidopsis thaliana.

Légende: lettres minuscules - séquence non codante, lettres majuscules séquence codante, acides aminés en caractères gras = séquence montrant une homologie avec les séquences protéiques NH2 terminales de l'aconitase mitochondriale de pomme de terre et des

aconitases (AcoI et AcoII) de graines de melon.

- Figure 2 = comparaison des séquences protéiques des aconitases de différentes espèces. Les séquences protéiques des IRE-BP et des aconitases de E. coli, de porc et des levures ont été extraites de la banque *Swiss Prot 260 (version Aout 93). L'alignement a été réalisé avec le programme PC Gene Clustal (Intelli Genetics). Légende: ARABACO - Aconitase d4Arabidopsis thaliana, MELONACO - Aconitase de melon (Cucumis melo), IREB - Iron Responsive Element Binding Protein, ACON - Aconitase, Y = cystéines constituant le centre Fer-Soufre, 4 - acides aminés formant le site actif - Figure 3: séquence nucléotidique et protéique du clone d'ADNc n' 1 d'Arabidopsis thaliana codant

pour une protéine & activité aconitase.

Légende: lettres minuscules - séquence non codante, lettres majuscules séquence codante, acides aminés en caractères gras - séquence montrant une homologie avec les séquences protéiques NHa terminales de 1'aconitase mitochondriale de pomme de terre et des

aconitases (AcoI et AcoII) des graines de melon.

- Figure 4: séquence nucléotidique et protéique du clone d'ADNc n' 16 de melon codant pour une

protéine & activité aconitase.

Légende: lettres minuscules - séquence non codante, lettres majuscules séquence codante - Figure 5: cycle de Krebs - Figure 6: cycle du Glyoxylate - Figure 7: cycle de Krebs - source de squelettes carbonés utilisés dans plusieurs voies de biosynthèse. - Figure 8: compartimentation des enzymes

impliquées dans le cycle du Glyoxylate.

1: citrate synthase, 2: isocitrate lyase, 3:

malate synthase, 4: malate deshydrogénase.

- Figure 9: schéma du principe de la RACE-PCR.

Légende: am et am' - amorces complémentaires.

- Figure 10: carte de restriction déduite du clone ADNc n 1 d'Arabldopsis thaliana codant pour une

protéine & activité aconitase.

B: bamHI, E: EcoRI, H: HindIII, RV: Eco RV,

Pv: PvuII.

- Figure 11 A: séquence nucléotidique et protéique de l'extrémité 5' du cDNA n* 1 d'Arabidopsis

thaliana codant pour une aconitase.

Caractères gras: saéquence protéique montrant de l'homologie avec les xtrémités INHa terminales des

aconitases de pomme de terre et de melon.

- Figure 11 B: comparaison des séquences NHu terainales de l'aconitase déduite du cDNA d'Arabidopsie thaliaa, de l'aconitase de melon (Cucumis melo), et de l'aconitase aitochondriale de

pomme de terre (Solanum tuberosum).

- Figure 12: pourcentages d'homologies entre les

aconitases de différentes espèces.

Légende: ARABACO - Aconitase d!Arabidoysis thaliana, MELONACO - Aconitase de melon (Cucmis melon), IREB - Iron Responsive Element Binding

Protein, ACON - Aconitase, le chiffre gras -

pourcentage de résidus identiques, le chiffre entre

parenthèses - pourcentage de r4ésidus similaires.

- Figure 13: arbre phylogénique des

aconitases de différentes espèces.

Légende: ARABACO - Aconitase d'ArabidoDpsis thaliana, MELONACO - Aconitase de melon (Cucumis melo), IREB = Iron Responsive Element Binding Protein,

ACON - Aconitase.

- Figure 14: cartographie physique du gène de

l'aconitase d'Arabidoysis thaliana.

A: carte de restriction de la partie 5' du fragment génomique isolé & partir de la banque DASH, B: carte de restriction de la partie 3' du fragment génomique isolé & partir de la banque EMBL, C: cartographie du gène de l'aconitase déduite

des deux cartes précédentes.

B - BamnI, PS - PstI, Pv = PvuII, H - lindIII, E - EcoRI, X - Xbal, DASH vecteur phagique DASH, EMBL

* vecteur phagique EPBL3.

- Figure 15: structure IRE-like putative

(position -85 à -52 sur la séquence génomique).

- Figure 16: détail de la fusion traductionnelle du promoteur de ltaconitase avec le gène rapporteur de la p-glucuronidase portée par le vecteur binaire pBIOS 170. a) Séquence de la région en amont du codon

d'initiation putatif (Met) de l'aconitase.

b) Séquence de la région en amont du codon d'initiation de la pglucuronidase (vecteur pBI

101.1).

c) Séquence de la fusion du promoteur de l'aconitase avec le gène de la A-glucuronidase (tataa

- Tata box).

Caractères standards: séquence de l'aconitase,

caractères en italique: séquence de pBI 101.1.

EXEMPLES

EXEMPLE I g PURIFICATION DE a POLYPEPTIDES AYANT UNE

ACTIVITE ACONITASE A PARTIR DE GRAIXNES DE MBLON:

L'aconitase a été purifiée & partir de graines de melon par des techniques chromatographiques traditionnelles. L'extrait brut est préparé par broyage de o100 g de graines au waring blendor (3 mn, 4C, vitesse maximale), pui8 agité dans 100 ml de tampon Iuidazole MM t pH 7,5 (1 h, 4'C). La fraction soluble contenant l'activité est récupérée après centrifugation (13 oo000 g, 30 Mn, 4C), puis filtrée sur une feuille de miracloth permettant d'éliminer les

débris cellulaires et une grande partie des lipides.

La première étape chromatographique consiste en une chromatographie d'échange d'ions sur une résine Q sépharose fast flow (PHARMACIA). La suspension protéique brute (1 360 mg) est déposée au sommet de la colonne équilibrée avec un tampon d'Imidazole 20 uM, pH 7,5. Les protéines sont éludes en conditions isocratiques dans un tampon Imidazole 20 mm, ph7,5

* additionné d'acétate de sodium 200 MN.

Les fractions actives (260 mg de protéines) sont dessalées sur des colonnes EconoPac 10 DG (BIORAD) avec un tampon Imidazole 20 mMi, pH 7,5. Les protéines sont alors déposées sur une colonne contenant une

résine d'affinité sur colorant Yellow 86 (SIGMA).

L'*lution est ensuite réalisée par un gradient linéaire d'acétate de sodium allant de O & 0,5 N dans

un tampon Imidazole 20 SM, pH 7,5.

Les fractions actives sont de nouveau récupérées (14,4 mg de protéines) puis ajustées & une concentration en sulfate d'ammonium de 1,2 M. Les extraits protéiques sont alors déposés sur une colonne d'interactions hydrophobes Protein Pack HIC Phényl 5 PW (WATERS). L'élution des protéines est ensuite effectuée par un gradient linéaire de sulfate d'aîmonium allant de 1,2 & O M dans un tampon

Imidazole 20 mM, pH 7,5.

Deux pics d'activité sont alors détectés. Le premier pic d'activité (Aco I) est élué pour une concentration en sulfate d'ammonium voisin de 0,9 M. Le deuxième pic d'activité (Aco II) est élué pour une concentration plus faible de 0,7 M. Les fractions actives sont de nouveau dessalées (fraction Aco I: 0,76 mg i fraction Aco II: 0444 mg) dans un tampon Imidazole 20 mm, pH 7,5. Enfin, les tractions actives de chacun des pics d'activité sont déposées sur une colonne d'échange d'ions Mono Q MR

/5 (PHARMACIA).

Cette dernière chromatographie permet d'obtenir deux protéines & activité aconitase relativement pures après une élution avec un gradient linéaire d'acétate de sodium de 0 à 0.3 M dans un tampon d'Imidazole mM, pH 7,5. Les protéines Aco I et Aco II étaient éluées pour une concentration en acétate de sodium voisine de 200 mM. Les protéines Aco I et Aco II en fin de purification ont été purifiées d'un facteur respectivement de 878 fois et 763 fois. Ces deux protéines montrent des activités spécifiques voisines de i 518,42 mmol/mn/mg pour Aco I et de i 321,15

mmol/mn/mg pour Aco II.

mg de protéine pure Aco I et 60 pg d'Aco I

sont obtenus en fin de purification.

Tableau Z:

Activité Activité Activité Fecteur itapes de Protéines totate pécifit Ique restante de

purification (mrg) (rmolt/min) (rtl/mi ni () Pr wfff-

s) fetiton

Extrait brut 1360 2360 1.73 100 -

Sipharose OFF 266 1565 5.88 66.3 3.4 Yettlow 86 14.4 725 50.34 30.7 29.2 Plqt HIC - fraction Aco I 0.76 229 781.78 9.7 451.9 - frection Aco Il 0.44 54 122.48 2.3 70.8 Nonom À fraction Aco I 0.09 137 1S18.42 S.8 77.7 fraction Aco II 0.06 79 1321.15 3.3 763.7

EXEMPLE 2 I DETERXMIN&TION DE LA SEQUEBNCE YK2 TERMIMALB

DES 2 ACONITASE8:

Un gel de polyacrylamide (gel de séparation 10 %; gel de concentration 5 %) est coulé 24 h avant son utilisation (système Mini Protean Il BIORAD). Une pré-électrophorèse de 1 h 30 à 20 mA permet

d'homogénéiser le gel.

Les échantillons ne doivent pas *tre dénaturés, ils sont placés 15 mn & 3 7'C. La séparation se tait pendant 45 mn & 190 V. Après la séparation, les protéines sont transférées sur une membrane PVDF (Poly Vinyl DiFluoride). La membrane est plongée 10 s dans une solution de méthanol 100 % puis incubée dans le tampon de transfert CAPS (3[oyclohexylamino]t-propane sulfonic acid) 10 xM, pH 11, additionné de méthanol 10

% jusqu'à l'équilibre.

L'électrotransfert des protéines se fait en condition semi-sèche avec le système multiphor 2117

LKB pendant 1 h & 60 mA (0,8 mA/cm2 de membrane).

Les protéines transférées sur la membrane PVDF sont visualisées après coloration au bleu de Coomassie R250 (solution & 0,1 % dans du méthanol 50 %) pendant mn, puis décoloration 5 à 10 mn dans la solution suivante méthanol, acide acétique, eau (5: 10: 40 vol). La partie de membrane correspondant à la protéine intéressante est découpée, et la protéine séquencée. La partie NH2 terminale de la proteine est séquencée selon la réaction de HEWICK et al (1981)

avec le séquenceur automatique Applied-Biosystem.

La séquence NH2 terminale des aconitases de graines de melon, que les inventeurs ont déterminée, a pu 8tre comparée (Figure 11) avec la séquence NH2 terminale de l'aconitase mitochondriale de pomme de terre (COURTOIS-VERNIQUET et DOUCE, communication personnelle). Une forte homologie entre ces séquences est constatée: sur 14 résidus séquencés, 9 sont communs avec 1'aconitase mitochondriale de pomme de terre. Cela peut signifier que l'aconitase mitochondriale de melon a été purifiée ou bien alors que les séquences NH2 terminales des aconitases

mitochondriales et cytosoliques sont très homologues.

L'absence de méthionine comme premier acide aminé pourrait indiquer une maturation de la protéine lors de l'importation dans les mitochondries (clivage du

peptide signal).

ZNEXPLE 3 I FABRICATION D'MT!CORPB POLYCLOIUX

DIRIGES CONTRE LES ACONITABSE8:

Les lapins (hybrides femelles de 2 & 3 mois) sont immunisés par voie intradermique avec 10 sg d'aconitase purifiée, émulsionnée à un volume égal d'adjuvant de Freund complet lors de la première immunisation, incomplet pour les immunisations qui

suivront (40 et 70 jours après la première injection).

Les prélèvements de sang, pratiqués dans la veine centrale de l'oreille sont effectués régulièrement (toutes les semaines). Le sang recueilli sur héparine est rapidement centrifugé (3000 g, 4'C, 5 mn). Les plasmas contenant les anticorps sont répartis en

aliquote et conservés à -20C.

La caractérisation des anticorps polyclonaux se fait par la technique de Western Blot selon le

protocole détaillé ci-dessous.

L'électrophorèse des protéines ou des fractions purifiées est effectuée en gel dénaturant SDS-PAGE

% (gel de séparation), gel de concentration 3 %.

Les échantillons sont préparés dans le tampon suivant: Trls/HC1 10 NM I pH 8,0; EDTA 1 M: SDS 2,5 %; -mercaptoéthanol 5,0 %; bleu de bromophénol 0,01 %. Les protéines sont dénaturées par chauffage

(100lC, 5 mn).

Un dépôt de 100 pl d'extrait brut (préparation: voir exemple I) traité dans les conditions décrites ci-dessus en présence de 10 % de sucrose, est réalisé

dans un puits unique.

Les marqueurs protéiques colorés de poids moléculaire (Rainbow- AMERSHAM) sont les suivants: myosine (200 000) phosphorylase b (97 400), inhibiteur

de trypsine (21 500), lysozymes (14 300).

L'électrophorèse s'effectue sous un courant de 20 mA par gel pendant 1 h. Les protéines séparées sur gel SDS-PAGE sont

transférées sur membrane de nitrocellulose.

L'électrotransfert se fait avec l'appareil mini trans blot BIORAD ou le Phast System PHARMACIA (transfert semi-sec selon 1es recommandations du fabricant), en fonction du type do gel qui a permis la séparation

préalable des protéines.

La révélation de la membrane par les anticorps se fait comme suit: - la membrane est incubée dans une solution saturante TBST (Tris-HCl 20 mM; NaCl 500 mM; Tween 20 0,05 %) additionnée de Régilait (5 %) pendant un minimum de 3 h. - puis la membrane est placée 2 h dans une solution d'incubation TBST contenant le premier anticorps (anticorps polyclonal dilué au 1/8000 ou

anticorps monoclonal: surnageant de culture).

- l'élimination de l'excès d'anticorps se fait par trois lavages successifs de 3 mn dans une solution TBST. La membrane est ensuite incubée 2 h dans une solution TBST, en présence d'un second anticorps

conjugué & la phosphatage alcaline (anti-

immunoglobulines de lapin diluées au 1/9 000 ou anti-

immunoglobulines de souris diluées au 1/4 000, SIGMA).

Apres cette étape, 3 nouveaux lavages sont effectués.

- enfin, le complexe antigène-anticorps est révélé dans la solution de développement suivante: 5 mi1 de tampon phosphatase alcaline (Tris/HCl 100 uMN pH 9,5 t NaCl 100 MM! XgC12 5 mN), 33 p1 de nitro blue tetrazolium (NBT) à 50 mg/ml préparé dans du diméthylformamide 70 %, 16, 5 M1 de 5 Bromo-4-chloro-3 indolylphosphate (BCIP) & 50 mg/ml préparé dans de la diméthylformamide. Des anticorps polyclonaux ont été produits après immunisation de deux lapins avec la protéine Aco I (10 pg/injection) et de deux autres lapins avec la

protéine Aco II (10 mg/injection).

La réactivité et la spécificité des anticorps sont testées sur des extraits bruts ou purifiés de protéines de graines de melon séparées par électrophorèse et transférées sur une membrane de nitrocellulose. Les anticorps donnent une réponse forte pour une dilution jusqu'au 1/8 000. Les deux

plasmas donnent le même type de réponse.

Dans l'extrait brut, une seule bande est reconnue & environ 97 kDa, démontrant la spécificité des anticorps polyclonaux. De méme, dans les extraits protéiques des autres étapes chromatographiques, une seule bande est reconnue. Notons que les plasmas reconnaissent aussi bien Aco I que Aco II et ce, quel que soit le matériel ayant servi à l'immunisation (Aco

I ou Aco II).

La forte spécificité de ces anticorps permettra leur utilisation principalement pour le crible de banques ADNc ou pour d'autres utilisations éventuelles (localisation cytologique de l'aconitase, parenté

entre les aconitases de différentes espèces).

BXEXPLE 4 à ISOLEMENT D*ADNO ACOMZTA8B PAR

IXNTOBCREEN!NG D'UNE NAQUER DEZPR11SB!ON Du FRUIT

MATURE D MELON:

Les inventeurs disposaient d'une banque ADNc de

fruit de melon mOr (Cantaloup charentais).

Les ADNc sont clonés au début du gène de la p-

galactosidase dans les phages UNI-ZAP. Un clonage orienté permet de réduire de moitié les clones qui ne

sont pas dans la bonne phase de lecture.

Le répresseur lacl q qui bloque la transcription du gène lac Z est apporté par la bactérie XL1 Blue. Ce répresseur est important car il permet de contrôler ltexpression des protéines de fusion qui peuvent être

toxiques pour E.coli.

Ainsi, la production de protéines de fusion se fait au moment choisi grAce & l'addition de i*IPTG (isopropylthiop-D galactoside) qui est un inducteur du promoteur du gène lac Z. Les étalements de la banque Be font comme décrit dans Sambrook et al (1989, Nolecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New-York). Au bout d'environ 8 h, lorsque les plages de lyse apparaissent, les filtres préalablement imbibés dans une solution d'IPTG 10 mM puis séchés, sont déposés & la surface des boites. Les bottes sont de nouveau incubées pendant 3 h & 37'C permettantà i'IPTG d'induire la protéine de fusion qui se fixera sur le filtre après que les bactéries aient été lysées. Ce sont les bactéries infectées formant le contour de la plage de lyse qui produiront la protéine de fusion. Ainsi, lors de la révélation par les anticorps, les plages de lyse apparaîtront sous forme de halo. Les filtres sont percés en trois positions asymétriques pour pouvoir repérer facilement les

plages positives.

La révélation de la protéine de fusion se fait comme décrit dans l'exemple 3 & l'aide des anticorps

polyclonaux produits.

Les clones positifs sont repérés en superposant les f iltres révélées avec la botte correspondante. Le morceau de gélose contenant la zone positive est prélevé & l'aide d'une pipette pasteur, puis placé dans 1 al de tampon SM contenant une goutte de chloroforme (inhibant le développement bactérien) pendant 1 h & température ambiante pour permettre la diffusion des phages dans la solution. Les tubes sont

conservés & 4*C.

Apres le premier crible, les plages de lyse positives qui sont prélevées ne sont pas pures (plages confluentes). Il convient, pour isoler avec certitude un clone positif, d'effectuer plusieurs cribles successifs en réétalant les plages de lyse récupérées

de façon à obtenir des plages de lyse isolées.

Sur les 4.105 phages qui ont été étalés, 28 clones purs reconnus par les anticorps polyclonaux ont

alors pu être isolés.

Ces clones ont été analysés par digestion

enzymatique, hybridation et séquençage.

La digestion de ces clones par EcoRI et Xho I montre deux catégories de clones: - Les clones dont l'insertion contient un site de restriction EcoRI mais pas de site de restriction Xho

I (21 clones).

- Les clones dont l'insertion contient un site de restriction Xho I mais pas de site de restriction

EcoRI (7 clones).

Pour étudier la parenté de ces clones les inventeurs ont réalisé des hybridations en dot-blot (ceci permet d'effectuer un tri préliminaire sans avoir & effectuer de digestion et de transfert sur membrane). Le fragment obtenu, après digestion par l'enzyme de restriction EcoRI, du clone le plus grand (2,6 Kb) et du clone le plus court (2,3 Kb) de la première catégorie ont servi de sonde. Les 21 clones de la première catégorie sont apparentés: ils donnent un

signal lors de l'hybridation.

Après digestion par EcoRI et transfert sur membrane, les clones sont hybridés avec le fragment EcoRI de 2,2 Kb du 10 donnent un signal, 1es inventeurs ont pu déterminé 3 classes de clones. La première classe (I) est constituée de 11 clones dont l'insert EcoRI a une taille de 1,7 Kb. La deuxième classe (II) de clones (9 clones) comporte un insert EcoRI de 1,8 Kb. La 3ème classe (III) est constituée du clone le plus grand avec un insert EcoRI de 2,2 Kb (n'16). EXEMPLE I $ 83QUENCAGE DES ADNoa DE "XLON HOKOLOGIES AVEC LEs IR-BP: La séquence complète du clone le plus long (n' 16) a été déterminée par la technique classique de

Sanqer et al. Elle est présentée dans la figure 4.

En 3', la séquence fait apparaître une queue poly A de 80 résidus. Un clone de chacune des classes I et II a été séquencé en 3' et en 5' montrant une homologie parfaite avec le clone 16 mais avec des queues poly A d'une longueur moins importante (respectivement 21 et 27 résidus). D'après toutes nos données d'analyses de restriction (simple et double digestion), d'hybridation et de séquençage, tous ces

clones semblent provenir d'un mémne messager.

La séquence 5' du clone le plus long (n'16) n'a pas permis de retrouver la séquence protéique correspondant & l'extrémtté NH2 terminale. Ceci n'est pas étonnant car une protéine d'environ 100o kDa devrait àtre codée par un ARNm d'au moins 3 Xb. Ils se sont alors servis de cette séquence de 900 pb pour interroger les banques de données (SWISSPROT - CITI 2) et s'assurer qu'ils avaient bien isolé le clone ADNc correspondant & la protéine purifiée. Des homologies importantes ont été retrouvées avec l'ensemble des séquences d'aconitase ou d'IRE-BP, en particulier avec l'IRE-BP humaine et l'aconitase d'E. coli (environ %). Ces résultats suggéraient que l'ADNc correspondant & la protéine purifiée avait bien été iso1é. Cependant, l'extrémité 5' de cet ADNc n'était

pas présente.

Avec des fragments 5' terminaux, les inventeurs ont essayé d'isoler des clones complets dans cette banque, mais sans succès. Aussi ont-ils pris la décision de cribler une nouvelle banque d'ADNc qui

provenait d'une autre espèce végétale.

EXEMPLE 6 8 ISOLRMENT DB L'ADNo DB L'&CONITA8B

D'ARABIDOPSIS TRALIANU MT COXMPARAIBON DBS SEQUNCBS

PROTEIQUES DeB8 ACONITMES Du DvIFERENTB8 B8PBCIS

(ANIMALES, VEGITALE8, BACTERIENN8E):

Comme Arabidopsis thaliana est aujourd'hui l'espèce modèle par excellence (petit génome, cycle de vie court, cartes génétiques et RFLP disponibles, etc...), il a été choisi de cribler une banque ADNc de siliques immatures (écotype Columbia), construite par GIRAUDAT et al (1992, Isolation ot the Arabidopsis ABI3 gene by Positional cloninq, The Plant Cell 4: 1251-1261). Cette banque a été réalisée avec le vecteur Lambda ZAP II de STRATAGENE. Le clonage des

ADNc n'est pas orienté (clonage EcoRI).

La difficulté dans ce choix de stratégie est de trouver les bonnes conditions d'hybridation car les inventeurs disposent d'un clone ADNc servant de sonde d'une espèce donnée (lelon) pour cribler une banque d'une autre espèce (ArabidoDsis thaliana). Ils ne connaissent pas le degré de conservation de l'aconitase chez les plantes. Aussi, plusieurs conditions d'hybridation dans lesquelles la concentration en formamide variait (0, 10, 20, 30, 40, %) ont été testées. De mime, des conditions de

lavages progressifs ont été utilisées.

Pour chaque condition d'hybridation, environ 1,5.105 phages ont été étalés. La sonde utilisée est le fragment d'ADN de 2,2 Kb obtenu après digestion par l'enzyme de restriction EcoRI du clone ADNc de melon n16. 7 clones hybridant avec la sonde dans les conditions suivantes ont été isolées: hybridation effectuée en présence de 30 % de formamide à 42'C et 2

lavages dans une solution SSC 2X pendant 30 mn & 42'C.

Ces clones ont été analysés après digestion par l'enzyme de restriction EcoRI. La carte de restriction

sommaire des clones les plus longs, 3 clones de

3,2 Kb, est décrite dans la figure 10.

Les 4 autres clones sont identiques, leur taille est de 2,3 Kb. La carte de restriction montre qu'ils appartiennent à la même classe que les clones les plus longs, seul le fragment EcoRI de 0,8 Kb & lextrémité ' est absent (ces clones proviennent vraisemblablement d'une méthylation incomplète des

sites EcoRI internes des ADNc).

Les 3 clones de 3,2 Xb (ne 1, 2, 3) ont été séquencés à chaque extrémité (amorces universelles T3 et M13). A l'extrémité 3', il a été observé une queue poly A constituée respectivement de 40, 15 et 16 résidus. La séquence de l'extrémité 5' (Figure 11) a montré une forte homologie avec la séquence NH2 terminale protéique de l'aconitase de melon (9 acides aminés identiques sur 14) et de l'aconitase mitochondriale de pomme de terre (8 acides aminés

identiques sur 14) (figures 10 et 3).

Un clone ADNc correspondant à l'aconitase d'Arabidopsis thaliana avait donc vraisemblablement

été isolé.

Les fragments EcoRI-ScoRV de 0,7 et 0,9 Kb (voir carte de restriction, Figure 10) ont été sous clones dans le vecteur pBSII SK+ puis séquences aux extrémités avec les amorces universelles T3 et M13. Le clone ADNc en totalité a par la suite été séquencé (Figure 3) par la stratégie de progression par oligonucléotides. Ce clone a une longueur totale de 3 210 pb. Le cadre de lecture ouvert a une longueur de 2769 pb. Le codon de terminaison est un codon TAA (codon ochre), la partie non traduite en 3' a une longueur de 441 pb. A l'extrémité 5', il n'y a pas de codon stop (cadre de lecture ouvert) ce qui pourrait laisser supposer la présence d'un peptide signal. A l'exception de la méthionine présente dans la séquence NH2 terminale protéique, il n'a pas été observé d'autre méthionine plus en amont, ce qui indiquerait que ce clone ne soit pas totalement complet. Le poids moléculaire de la protéine & activité aconitase codé par cet ADNc déduit à partir de la séquence nucléotidique est de 98 490 Da. Le pI calculé est de 6,0. Ces valeurs sont en accord avec les résultats obtenus lors de la purification (PM: 97 kDa; pI: ,2). Les essais d'obtention d'un clone plus long ont été infructueux et la séquence totale du clone le plus

long est présentée dans la figure 3 (ADNc ne 1).

La séquence des extrémités 5' et 3' des ADNc n' 2, 3, 4 et 5 permettent leur positionnement sur la

séquence du clone ADNc n' 1.

L'extrémité 5' des clones né 2 et 3 se situe en position 66. Pour les clones 4 et 5 l'extrémité 5' est

en position 134.

A l'extrémité 3', les clones 2, 3, 4 et 5 se situent respectivement en position 2964, 2964, 2926, 2976. Les clones 2 et 3 sont strictement identiques: méme départ et même arrêt. L'analyse de la partie 3' non codante du clone ADNc n' 1 fait apparaître trois sites de polyadénylation possibles suivant le consensus AATAAA en position 2848, 2940 et 3026. Ces trois sites doivent étre fonctionnels car 3 positions d'arrêt compatibles ont été obtenues pour les clones

ADNc étudiés.

Les comparaisons de séquences de 1'IRE-BP humaine et de l'aconitase mitochondriale de porc (ROUAULT et ai, 1991 (supra) I HENTZE et ARGOS, (1991, Homoloqy between IRE-BP, a regulatory RNA-bindinq Protein, Aconitase, and isopropylmalae isomerase, Nucleic Acide Research 19: 17391740) avaient montré la parenté

entre ces deux protéines (30 & 33 % d'identité).

L'isolement des ADNc chez Cucumis melo et Arabidopsis thaliana codant pour une aconitase a permis de rechercher les homologies existant avec

d'autres aconitases de différentes espèces (Figure 2).

Les alignements des séquences protéiques montrent

des régions fortement conservées. Les études cristal-

lographiques de LAUBLE et al (Crystal Structures of Aconitase with Isocitrate and Nitroisocitrate bound, Biochemistry 31 t 2735-2748) On 1992 avaient permis d'identifier 23 résidus formant le site actif. Ces résidus sont conservés dans toutes les aconitases étudiées. Ces alignements font également apparaître que 1es protéines & activité aconitase étudiées chez Arabidopsis thaliana et Cucumis nelo ont

une homologie plus importante avec les IRE-BP.

La Figure 12 indiquant les pourcentages d'homologie entre les différentes aconitases montre une homologie très importante d'environ 90 % entre les aconitases végétales étudiées. Ces protéines apparaissent plus proches des IRE-BP (homologie d'environ 70 %) et de l'aconitase de E. colt (homologie d'environ 65 %) que des aconitases

mitochondriales (homologie d'environ 45 %).

L'arbre de distance (Figure 13) permet de visualiser rapidement les parentés entre ces

différentes aconitases.

I1 a été montré qu'il existe vraisemblablement chez les plantes une protéine à activité aconitase très conservée. Ces protéines montrent une forte homologie avec les IRE-BP et devraient avoir un rôle

dans des mécanismes de régulation traductionnelle.

BXEMPLE 7 IS OLE ENT, DQUENCAGEB ET D"TEEXINMTION DU

DEPART DE TANSCRIPTION DU GENE ACONITSE

D',RABIDOPSIS THAL!N:

Jusqu'& présent, aucun gène codant pour l'aconitase mitochondriale ou pour l'aconitase cytosolique n'a été étudié dans le domaine végétal ou

dans le domaine animal.

Deux banques génomiques ont dû être criblées pour

pouvoir isoler le gène complet de l'aconitase étudiée.

Dans un premier temps une banque LAMBDA DASH d'Arabidopsis thaliana (écotype C24) (ADN génomique digéré partiellement par l'enzyme de restriction Hind III, puis cloné dans le vecteur DASH au site Hind III) est criblée avec l'ADNc n1l de 3,2 Kb isoé14

d'Alrabidopss thaliana.

Parmi les 2.105o phages étalés, 6 clones positifs ont été isol4s. Ces clones apparaissent identiques

après analyse par restriction.

Les analyses par hybridation sur différentes digestions (simples ou doubles) par des enzymes de restriction a permis de montrer que ce clone recouvrait l'extrémité 5' du gène aconitase et était incomplet en 3'; Pour obtenir la partie manquante du gène en 3', les inventeurs ont dû cribler une autre banque génomique. La banque génomique EMBL 3 d'Arabidopsis thaliana (écotype Columbia) construite après digestion partielle de l'ADN par l'enzyme de restriction Mbo t puis clonage de ces fragments au site BamHI du vecteur EMBL 3. Après étalement de 2.105 phages puis hybridation avec le fragment de 0,6 Kb, un clone répondant positivement a été isolé. Un fragment de restriction Hind III de 3,5 Kb hybridant faiblement avec la sonde de 1,6 Kb et fortement avec la sonde de 0,6 Kb a été cloné dans le vecteur pBS II SK+ puis séquencé jusqu'à ce que l'on retrouve l'extrémité 3'

de l'ADNc.

Les hybridations ont permis de compléter la carte de restriction du gène codant pour une aconitase et de vérifier la jonction Hind III entre les deux clones

physiques (Figure 14).

Dans le même temps, un Southern a été réalisé pour tenter de voir s'il existe un ou plusieurs gènes codant pour l'aconitase, chez Arabidopsis thaliana, et pour vérifier que la carte de restriction du gène établie à partir des clones phagiques suit

bien la carte génomique.

L'ADN génomique de deux écotypes d'Arabidopsis thaliana (Columbia et C24) a été digéré par plusieurs enzymes de restriction. Les fragments obtenus ont été séparés sur un gel d'agarose 0,8 % puis transférés sur une membrane de nylon Hybond N+. Cette membrane a été hybridée avec les fragments EcoRI du clone ADNc n*l (0,8 s 1,6: 0,6 Kb). La cartographie du locus de ce gène par Southern montre qu'elle suit exactement la carte de restriction obtenue avec les clones phagiques. Lors des cribles des banques génomiques, il a été utilisé deux écotypes d'Arabidopsis thaliana (Columbia et C24). Sur le Southern, il peut être constaté qu'il n'existe pas de polymorphisme entre C24 et Columbia,

au locus étudi4, pour les couples enzyme-sonde testés.

L'analyse de ces résultats semble donc indiquer qu'il n'existerait qu'un gène chez ArabidoDsis

thaliana codant pour 1'ADNc isolé.

Les fragments d'ADN génomique suivants ont été clonés dans le vecteur pBS Il SK+ avant séquençage: - BamHI - BamHI: environ 7,7 Kb y - EcoRI BamHI: environ 0,6 Xb; - EcoRI - EcoRI: environ 2,8 Kb (dont un site EcoRI provenant du site de clonage du vecteur) s - BamHI - BamHI: environ 2,0 Kb (dont un site BamHI provenant du site de clonage du vecteur); - BamiI BamHI: environ 1,3 Kb S

- Hind III - Hind III: environ 5,5 Kb.

La totalité du fragment Hind III - Rind III de ,5 Kb a été séquencée. Chaque fragment cloné a été séquencé aux deux extrémités avec les amorces universelles T3 et M13. La stratégie de progression par oligonuoléotides a été adoptée pour compléter la séquence. Il est & noter qu'il existe un site Hind III distant de 0,1 Kb du site Hind III de clonage. La présence de ce site a pu être montrée gr&ce aux hybridations avec la sonde de 1,6 Kb (la double digestion BamHI-Hind III donne deux fragments de 1,8 Kb et 1,3 Kb alors que la simple digestion BamHI donne un fragment de 2 Kb). La présence de ce site a été confirmée lors du séquençage des extrémités des fragments EcoRI-EcoRI de 2,8 Kb et BamHI-BamHI do

2,0 Kb.

De plus, le fragment de restriction Hind III de 3,5 kb de Lambda 3' EMBL a été cloné dans le vecteur pBS II SK+ puis séquencé jusqu'& ce que l'extrémité 34

de l'ADNc soit retrouvée.

Le gène de l'aconitase d'Arabidopsis thaliana a

été séquencé sur une longueur de 6 762 pb (Figure 1).

La comparaison de la séquence du gène de l'aconitase avec 1'ADNc correspondant montre que le

gène est constitué de 20 exons et de 19 introns.

D'autres gènes montrent également un grand nombre d'exons: le gène de la transferrine humaine est constitué de 17 exons, celui du récepteur de la

transferrine de 19 exons.

Il est intéressant de noter la présence du premier intron juste après le codon d'initiation méthionine putatif (position +91). Ceci renforce l'idée que cette enzyme doit itre très conservée: 1'épissage devant être parfait pour obtenir une

protéine fonctionnelle.

L'analyse de la parti. 3' non codante montre trois sites de polyadénylation possibles suivant le consensus AATAAA. Ces trois sites sont située en position 5068, 5199, 5285. Il a été constaté lors de la caractérisation des ADNc (Exemple 5) que ces sites

doivent étre fonctionnels.

L'extrémité 5' de l'ADNc codant pour l'aconitase a été retrouvée sur la séquence génomique. Cependant, le site d'initiation de la transcription n'était pas connu (la région amont du promoteur est riche en AT, il existe donc plusieurs TATA box putatives). Les résultats de Northern indiquent que le clone ADNc était pratiquement complet (un signal d'hybridation était visualisé & environ 3,2 Kb, identique & la taille de l'ADNc). La présence d'un intron dans la

région 5' du gène ne peut cependant pas être exclue.

Aussi, le site d'initiation de transcription a-

t-il été cartographié par la technique RACE avec le kit amplifinder RACE CLONTECH (Figure 9). Pour cela, des ARN polyadénylés ont été isolés à partir d'ARN totaux extraits de feuilles. L'intégrité des ARN messagers est contrôlée en Northern en utilisant comme sonde les fragments d'ADN obtenus par digestion EcoRI

du clone ADNc nel.

L'oligonucléotide ne 19:

GCTGGAACTCAAGCTCCATGTTTGCCTGCA

positionné en +524 sur la séquence de l'ADNc a servi & synthétiser le premier brin d'ADNc & partir des ARN

polyadénylés purifiées.

A l'extrémité 3' du brin d'ADNc nouvellement synthétisé, un oligonucléotide (anchor) du kit 3'NH3 GGAGACTTCCAAGGTCTTAGCTATCACTTAAGCAC 5' est accroché avec la T4 RNA ligase. L'amplification de l'extrémité ' de l'ADNc se fait par PCR en utilisant un oligonucléotide complémentaire de l'oligonucléotide wanchorf du kit et l'oligonucléotide n' 16:

CAAGCAAGATCAACAACAGCAGGAACACCA

déterminé & partir de la séquence de l'ADNC positionné en +375. La réaction PCR est effectuée dans les conditions suivantes: - Dénaturation de l'ADN 5 mn à 94C; - 35 cycles deamplification: - dénaturation 1 mn à 94C, - hybridation 1 mn à 50'C, - élongation 2 mn à 72'C

- R6action finale d'élongation 7 mn & 72'C.

Après amplification, aucune bande n'est visualisée sur gel d'agarose coloré au bromure d'éthidium. I1 a alors été réalisé une seconde amplification par PCR à partir de la réaction précédente en prenant plusieurs couples d'amorces (l'oligonucléotide complémentaire de l'oligonucléotide wanchor" accroché au brin d'ADNc associé avec les oligonucléotides n'16, 9 et 14 respectivement en position +375, +52, +230 désignés & partir de la séquence ADNe). Les séquences des amorces 9 et 14 sont les suivantes: - n 14: CACAGTTACGTATGGCCGA - n 9: GTCGAGTGAAGAAGCAAA Les conditions d'amplification sont celles décrites précédemment. La solution de réaction de la première amplification est précipitée puis reprise dans 10 m1 d'eau stérile. 2 pi1 de cette solution serviront de cible pour la deuxième réaction d'amplification par PCR. Le témoin positif du kit attendu & environ 490 pb est visible piste 4. Une réamplification avec l'oligonucléotide n'l6 donne de l'aspécificité (piste 2). L'oligonucléotide n'9 semble permettre l'amplification d'une bande d'ADN & environ pb (piste 3). Avec l'oligonucléotide n14, deux bandes ont été amplifiées (piste 5) d'une taille d'environ 300 et 350 pb. Ces deux bandes ont été clonées dans un vecteur pGEM T sans avoir été préalablement séparées. 35 clones portant une insertion ont été séquences. La sélection des clones a été réalisée par digestion avec l'enzyme de

restriction Bgl II (site de coupure en position +48).

Le +1 a été positionné sur la séquence au site comptant le plus grand nombre de clones "cappés" (en l'occurrence 14 sur 35 clones séquences). Parmi ces clones, 14 s'arrêtent en position +1, 7 en position -2, 4 en position -4, 5 en position -9 et 1 en position +9. Tous ces clones, lors de la séquence montrent un G supplémentaire en 5' qui n'est pas présent sur la séquence génomique. I1 s'agit du capping (coiffe) du messager (indiquant ainsi avec

certitude le site d'initiation de la transcription).

Ainsi, ces résultats suggèrent que le site d'initiation de transcription de ce gène est en fait constitué de plusieurs sites d'initiation (5 ont été déterminés) s'étendant sur une zone de 19 pb (-9 à +9). Il a été également observé un clone s'arrêtant en

position +14, 3 en position +20 et 1 en position +29.

Ces clones doivent provenir de l'arrêt prématuré de la réverse transcriptase (aucun G supplémentaire en 5' de

ces clones).

Un autre clone a été séquencé et placé en position -49 sur la séquence génouique. Ce clone ne porte pas de G supplémentaire ce qui indique qu'il n'est pas complet. La distance avec le premier site d'initiation est de 50 pb. Ce clone doit appartenir & une deuxième classe de clone amplifiée lors de la PCR et formant la bande d'ADN sur gel d'agarose de plus grande taille. Ce type de résultat pourrait amener & penser qu'il existe un deuxième promoteur plus en amont. Il est à remarquer que les clones correspondant à la bande haute de l'amplification ne sont pas clones avec la même efficacité que ceux correspondant à la

bande basse.

Bien qu'il ne soit pas possible de conclure quant à la position d'une deuxième site d'initiation de la transcription putatif, il est surprenant de trouver une struture secondaire ressemblant aux IRE (Iron Responsive Element) aux positions -85 et -52 (figure ). Dans la partie 5' du gène, un site d'initiation

de la transcription a été cartographie avec précision.

En réalité, 5 sites permettent le départ de la transcription dans la région -9 à +9, le site le plus usuel se situerait en +1. Une TATA box putative est située en position -32 (TATAA). Cette position est en accord avec les TATA box décrites qui se situent à 32 7 pb en amont du site d'initiation de la transcription. De multiples sites d'initiation de la transcription seraient présents plus particulièrement

pour les gènes de ménage.

De ce site d'initiation de la transcription jusqu'au premier ATG (sans doute le codon d'initiation) en position +91, la séquence est codante, ce qui pourrait faire penser & la présence d'un peptide signal mitochondrial (le cadre de lecture

reste ouvert jusqu'au codon TAA en position -30).

Mais, dans cette séquence ne trouvent un résidu aspartique (en position 25) et un résidu glutamique (en position 14), les résidus acides étant généralement absents dans les peptides signaux mitochondriaux. Il n'existe cependant pas de séquence consensus stricte pour les peptides signaux de mitochondries. Aussi, il est possible que cette séquence constitue bien un signal d'importation dans

les mitochondries.

Une telle situation pourrait impliquer la présence d'un autre site d'initiation de la transcription plus en amont et donc également la

présence d'un deuxième promoteur.

Une autre situation permettant à un gène de coder pour deux protéines & localisations différentes est possible lorsque l'ARNm porte deux sites d'initiation de la traduction. De tels exemples ont été décrits pour les gènes de levure codant pour les enzymes de synthèse des ARN de transfert de l'histidine et de la valine (NATSOULIS et al, (1986t The HTS1 Gene encodes both the Cytoplasmic and Mitochondrial Histidine tRNA synthetases of S. cerevisiae, Cell 46: 235-243): CHATTON et al, (1988, The yeast VASI Gene encodes both Iitochondrial and Cytoplasmic Valyl- tRNA Synthetasea The Journal of Biological Chemistry 263: 52-57). Ces enzymes existent à la fois dans le cytoplasme et dans l'espace matriciel mitochondrial. Le premier site d'initiation de la traduction permet la traduction d'une protéine avec le peptide signal d'importation dans les mitochondries. Le deuxième site d'initiation de la traduction situé plus en aval donnera une protéine sans peptide d'importation mitochondriale et restera donc & localisation cytoplasmique. Pour le gène de l'aconitase dArabtdoDsis thaliana, il n'existe apparemment pas un deuxième site d'initiation de la traduction entre la méthionine en position +91 et le site d'initiation de la transcription (phase de lecture ouverte). Cependant, la présence d'un codon d'initiation non conventionnel ne peut être exclue. En effet, il semble que les codons ACG et AUA puissent jouer le rôle de codon d'initiation de la traduction.

EXEMPLE S I EXPREBSION BPATIO-TEMPOIRELLN DB L'A"E

MESSAGER DZ LIACONITASB CHRZ ARABIDOPSIB TALIaNA ET

DBRASSICA NAPUS:

Les ARN totaux ont été extraits de différentes parties des plantes étudiées. Après séparation sur un gel d'agarose dénaturant 1,2 %, les ARN sont transférés sur une membrane de nylon puis hybridés

avec les fragments EcoRI du clone ADNc n'l.

Un signal plus ou moins intense est observé dans toutes les parties de la plante, indiquant une

expression constitutive du gène de l'aconitase.

Un signal est également obtenu pour les ARN totaux du colza (Brasstca napus) indiquant une forte conservation de l'aconitase entre ces deux espèces végétales de la famille des crucifères. Une forte expression de ce gène est détectée sur des jeunes plantules en germination. Or, il apparaît que le cycle du glyoxylate doit être très élevé & ce moment du développement permettant la transformation des lipides

en sucres indispensables & la croissance de la plante.

Ainsi, l'aconitase étant une enzyme du cycle du glyoxylate, une forte expression de celle-ci & ce stade du développement est en accord avec les besoins métaboliques de la plante. Il est également possible que cette forte expression permette la production de squelettes carbonés nécessaires & plusieurs voles de biosynthèse notamment lors de la synthèse des acides aminés. BROUOUISSE et al, 1987 (supra), avalent mis en évidence une forte activité aconitase cytosolique pouvant jouer cette fonction en association avec une activité isocitrate déshydrogénase NADP+ cytosolique, la formation d'équivalents réducteurs NADPH pouvant également être utilisée dans des réactions de biosynthèse. Une forte expression du gène de l'aconitase est également observée dans les fleurs ouvertes alors que les bourgeons en cours de

développement ne présentent qu'une faible expression.

Pour préciser quel organe floral exprime fortement le gène de l'aconitase, les inventeurs ont travaillé sur le colza (Arabidopsis thaliana étant une plante de petite taille, le prélèvement des différents organes floraux est relativement délicat). Il a alors été observé une forte expression du gène de l'aconitase dans les anthères comparativement & une faible expression dans les pistils. Cette forte activité dans les anthères pourrait refléter un métabolisme très

actif pour la maturation des grains de pollen.

De même, une expression relativement importante est observée dans les siliques immatures. Cette expression pourrait permettre un stockage de l'ARN messager ou de la protéine & activité aconitase dans les graines qui seront utilisés lors de la germination au moment de la reprise desmétabolismes. Malgré le bruit de fond important (difficulté d'extraction des ARN de graines du fait d'une présence importante de lipides) un signal est également visible dans les graines sèches. Enfin, une expression relativement faible dans les feuilles et dans les tiges est montrée. L'ensemble de ces résultats semble indiquer une expression constitutive du gène codant pour une protéine & activité aconitase. Une forte expression lors de la germination peut faire penser & l'activité aconitase cytosolique intervenant dans le cycle du glyoxylate. Il apparaît toutefois que, lors de la mise en place de l'appareil photosynthétique, le cycle du glyoxylate est stoppé, les ARNm ne devant plus tre

détectés dans les différents tissus de la plante.

Cependant, l'expression observée du gène de l'aconitase dans les feuilles et les tiges pourrait être due à l'activité aconitase cytosolique permettant de produire des squelettes carbonés pour différentes

voies de biosynthèse.

Toutefois, si les aconitases cytosoliques et mitochondriales sont codées par le même gène, il pourrait également s'agir du messager de la forme

mitochondriale qui est exprimé.

I1 est intéressant de noter que toute l'activité de la citrate synthase des graines de ricin est due & l'isoenzyme mitochondriale et que seul lt'ARN messager codant pour la forme mitochondriale serait présente dans les graines (ZEHLER et SCHNARRENBERGER, (1984, Citrate Synthases from Germinating Castor Bean Seeds, I - Purification and properties, Physioloqia Plantarum : 1-8)). Ces travaux ont été possibles car les isoenzymes de la citrate synthase mitochondriale et glyoxysomale peuvent ètre distinguées l'une de l'autre (la citrate synthase glyoxysomale est inhibée par le ,5' dithiobis (2 nitrobenzoic acide): DTNB). Les deux formes isoenzymatiques montrent également des points iscolectriques différents respectivement de 5,9 et 9,1 pour les formes mitochondriales et cytosoliques. Dans le cas de l'aconitase, la situation est plus complexe car non seulement les deux formes isoenzymatiques (cytosolique et mitochondriale) n'ont pas pu être distinguées l'une de l'autre, mais de plus, la forme cytosolique intervient dans le cycle du glyoxylate. Celle-ci permet également de fournir des intermédiaires du métabolisme acide, ces besoins pouvant être permanents et non pas ponctuels comme le

cycle du glyoxylate.

Dans cette situation, il est difficile d'étudier l'expression de l'une ou l'autre des formes de l'aconitase car il est également possible, ainsi que les inventeurs en ont émis l'hypothèse, qu'un seul

gène code pour ces deux formes.

* Pour confirmer les données moléculaires obtenues sur l'organisation de l'extrémité 5' du gène et sur l'expression spatio-temporelle de son ARNm, les inventeurs ont fait appel aux expériences de transgénèse & l'aide du gène rapporteur codant pour la 0-glucuronidase (GUS). Seule la partie 5' flanquante

du gène a été étudiée.

EXEXPLE 9 I CARACTERISATION D'UN RAGMENT PROKOTEUR DU

GENB ACONITASB

Au vu de la position du site d'initiation de la transcription (déterminée par la technique 5' RACE), le site de restriction Bgl Il (position +46), apparatt idéalement placé pour réaliser une fusion transcriptionnelle avec le gène rapporteur GUS. En effet, il est situé en amont du codon de départ potentiel de l'aconitase cytoplasmique. Le fragment Hind III-Bgl II, d'une taille de 1339 pb a été inséré par un clonage orienté dans le vecteur binaire pBi 101.1, sites Hind III - Bam HI (JEFFERSON et al, (1987, GUS Fusions: O-glucuronidase as a sensitive and versatile Gene Marker in Higher Plants, EMBO Journal 6: 3901-3907)) pour obtenir le vecteur pBios 170. Ce dérivé particulier du vecteur binaire pBi 101 a été choisi pour obtenir dans le m&me temps une fusion traductionnelle entre la région amont, potentiellement codante du gène aconitase et la région

codante du gène p-glucuronidase (Figure 16).

Ce vecteur binaire a été introduit dans la souche désarmée d'Aqrobacterium tumefaciens C58'3 et un clone recombinant a servi & transformer des racines d'Arabidopsis thaliana (VALVEKENS et al, (1988f Agrobacterium Tumefaciens-mediated transformation of

Arabidopsis Root Explants usine Kanamycin Selection.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ot America 85: 5536-5540)). Des cals transformés et des plantules régénérées ont été testées pour la présence d'activité p-glucuronidase par le test histochimique. Une coloration bleue a été détectée & la fois sur cals et plantules, lndiquant la

fonctionnalité du fragment promoteur cloné.

BEXPLE 10 t CARACTERI8ATION QUALITATIVE ET

QUANTITATIVI DU PROMOTUBVR ACONIT&B D'IRMBIDOPS1

TKXHALIANA

L'expression dans les feuilles est détectée & la fois dans le uésophylle et dans les tissus conducteurs, l'activité semblant plus forte dans ces derniers. Dans les racines, l'observation microscopique révèle une activité P-glucuronidase se limitant essentiellement à la zone d'élongation des pointes racinaires. Lors de l'analyse par hybridation sur des ARN de différents organes et à différents stades, les chercheurs avaient détecté une activité forte dans des fleurs matures d'Arabidopsis. Les résultats sur les organes de reproduction malle et femelle de colza en développement montraient que cette augmentation intervenait dans la partie m&le. Les observations d'activité P-glucuronidase sur les fleurs transgéniques confirment ces résultats et suggèrent fortement qu'il s'agit d'une augmentation de l'activité transcriptionnelle du promoteur aconitase

dans les grains de pollen.

D'autre part, les inventeurs ont pu montrer que

le promoteur conduisait & une assez forte activité p-

glucuronidase dans l'albumen comparativement aux parties maternelles (téguments, placenta, tissu ovarien). Cette activité dans l'albumen n'est pas surprenante car il s'agit d'un tissu de réserve fort utile lors de la germination. Bien que les inventeurs soient en présence d'une espèce exalbuminée, ils ont pu visualiser précisément l'expression de ce promoteur aconitase dans ce tissu en cours de développement. L'embryon immature au stade coeur présente lui aussi une activité j-glucuronidase; à des stades plus avancés, une expression constitutive

est observée dans l'embryon.

Sur une graine mature, cette activité est restreinte à l'embryon et éventuellement à l'albumen résiduel. Lors de la germination de la graine, l'activité du promoteur aconitase est très forte dans l'embryon et plus particulièrement dans les cotyléadons, ces derniers étant les organes de réserve ot le cycle de

glycosylate est actif.

Des an&lyses comparatives avec le promoteur CaMV S montrent que le promoteur aconitase est environ 20 fois plus faible dans les feuilles igées (voir tableau II, ci-dessous):

TABLEAU M:

CONSTRUITS PLANTES ACTIVITE

(nom du (transformant p-GLUCURONIDASE vecteur) primaire) (nmol 4-NU/mg protéine/minute)

S - GUS 40 - 2 10.99

(pBi 121) 40 - 4 14.69 Aco-GUS 40 - 6 0.27 (pBiOS 170) 40 - 9 0.69 (dosages effectués selon la protocole de Jefferson et ali 1987, supra)

EVENDICATZONXS

1. Proteine ayant une activité enzymatique d'aconitase, caractérisée en ce qu'elle comporte, soit i) la séquence en acides aminée illustrée dans la figure 1 ou une séquence présentant au moins 75 % d'homologie avec celle-ci, soit: il) une variante de la séquence 1) comportant une délétion de jusqu'à 40 acides aminés environ au niveau

de l'extrémité NH2.

2. Fragment protéique caractérisé en ce qu'il comprend au moins 6 acides aminés de la protéine selon la revendication 1, et de préférence est reconnu par des anticorps capable de reconnaître la protéine de la

revendication 1.

3. Fragment selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il a une longueur comprise entre 6 et 40 acides aminés, et est renfermé par les acides aminés 1 à 40 de l'extrémité NHZ de la protéine illustrée dans la figure 1, ou présente au moins 60 % d'homologie avec les acides aminés 1 & 40 de l'extrémité NH2 de la

protéine illustrée dans la figure 1.

4. Séquence d'acide nucléique caractérisée en ce qu'elle comporte soit: i) une séquence comprenant à la fois une partie ' non-transcrite, une partie transcrite, éventuellement avec des introns, et une partie 3' non transcrite, ladite séquence donnant lieu, après transcription, épissage et traduction à la protéine selon la revendication 1, soit ii) le transcrit de la séquence i) ou son équivalent ADNc, soit iii) une séquence complémentaire de la séquence i) ou ii), soit iv) une séquence capable de *'hybrider avec les séquences i), 1i) ou iii) dans des conditions stringentes ou moyennement stringentes, soit v) un fragment comportant au moins 6, et de préférence au moins 30, nucléotides consécutives de

l'une quelconque des séquences 1), ii), iii) ou iv).

5. Séquence d'acide nucléique selon la revendication 4 caractérisée en ce qu'elle comporte la séquence génomique illustrée dans la figure 1, ou un fragment de celle-ci comportant au moins 10 nucléotides. 6. Séquence d'acide nucléique selon la revendication 5 caractérise on ce qu'elle comporte au moins une partie d'une région non-codante ou d'un

intron de la séquence génomique.

7. Séquence d'acide nucléique selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'elle présente une activité promotrice et se trouve au sein du fragment HindIII(-1293)-BglII(+45) de la séquence

génomique de la figure 1.

8. Séquence d'acide nucléique selon la revendication 4, capable d'inhiber le gène de l'aconitase caractérisée en ce qu'elle comporte un ou plusieurs fragments ayant une longueur d'au moins 6 nucléotides: le(s)dit(s) fragment(s) étant complémentaire(s) d'au moins une partie du transcrit

du gène de laconitase.

9. Séquence d'acide nucléique selon la revendication 4 caractérisée on ce qu'elle a une longueur comprise entre 10 et 300 nucléotides et est capable de jouer le rôle d'amorce dans une réaction

d'amplification d'acide nucléique.

10. Plasmide caractérisé on ce qu'il contient au moins l'une des séquence d'acide nucléique selon les

revendications 5 & 9.

11. Gène chimérique capable d'être exprimé chez les plantes caractérisé en ce qu'il comporte: i) une région promotrice selon la revendication 7, et ii) une séquence hétérologue transcrite, codante

ou non, placée sous le contrôle dudit promoteur.

12. Gène chimérique capable d'être exprimé chez les plantes caractérisé en ce qu'il comporte: i) un promoteur fonctionnel chez les plantes autre que celui naturellement associé avec le gène de l'aconitase, et il) une séquence codant pour la protéine selon la revendication i ou pour un fragment protéique selon la

revendication 2.

13. Cellules végétales transformées de manière stable par une séquence d'acide nucléique selon l'une

quelconque des revendications 4 à 10.

14. Plantes transgéniques transformées de manière stable par une séquence d'acide nucléique selon l'une

quelconque des revendications 4 & 10.

15. Anticorps monoclonaux ou polyclonaux capables de reconnaître, de préférence de manière spécifique, la protéine selon la revendication 1 ou le fragment

protéique selon la revendication 2.

16. Procédé pour la modification du métabolisme d'une plante, caractérisé par l'introduction dans la plante d'un insert génétique comportant une séquence

d'acide nucléique selon la revendication 4.

17. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique comprend un promoteur fonctionnel chez les plantes, et sous le contrôle de ce promoteur, une séquence codant pour la protéine selon la revendication 1, ou pour un fragment protéique selon la revendication 2, l'expression de cette séquence conduisant à une surproduction d'aconitase. 18. Procédé selon la revendication 17 caractérisé en ce que la surproduction d'aconitase conduit à une surproduction d'au moins l'un des acides organiques du cycle de Krebs ou du cycle glyoxylate, notamment le citrate, l'isocitrate, le succinate, le glyoxylate, le malate, loxaloacétate, l'a-cetoglutarate, le fumarate. 19. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que le promoteur est soit celui naturellement associé, dans la plante, avec le gène de l9aconitase,

soit un promoteur hétérologue au gène de l'aconitase.

20. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que l'insert génétique comprend un promoteur fonctionnel, et sous le contrôle de ce promoteur, une séquence inhibitrice selon la revendication 8, l'expression de la séquence conduisant à une

inhibition de l'expression du gène de l'aconitase.

21. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que l'inhibition de l'expression du gène de l'aconitase conduit & une surproduction de l'Acétyl coenzyme-A et par conséquent, & une réorientation du métabolisme ou au catabolisme polysaccharidique,

lipidique et azoté.

22. Procédé pour obtenir l'expression constitutive, dans une plante, d'une séquence codante, l'expression étant particulièrement forte lors de la germination des graines et lors de la maturation de la graine et du pollen, caractérisé par l'introduction dans le génome de la plante, d'un gène chimérique

selon la revendication 11.

23. Gène chimérique capable d'être exprimé chez les plantes caractérisé en ce qu'il comporte: i) un promoteur fonctionnel chez les plantes, ii) une séquence transcrite, codante ou non, placée sous le contrôle dudit promoteur, iii) un ou plusieurs introns du gène de

l'aconltase végétale, selon la revendication 6.