MOLECULE D'ACIDE NUCLEIQUE CODANT UNE PREPROPROTEINE D'ALLERGENE D'UN ACARIEN DU GENRE DERMATOPHAGOIDES OU EUROGLYPHUS ET SON UTILISATION POUR LA PRODUCTION DUDIT ALLERGENE DANS LES PLANTES.
La présente invention concerne la production d' llergènes d'acariens de la poussière domestique du genre Dermatophagoides ou Euroglyphus dans des cellules végétales. L'invention concerne aussi des plantes transgéniques ou partie de ces plantes et plus particulièrement des cellules végétales transformées exprimant un tel allergène recombinant. L'invention se rapporte tout particulièrement à des méthodes de diagnostic et de traitement des allergies provoquées par de tels allergènes et aux compositions pour leur mise en œuvre.
Les allergènes sont des protéines provenant de matière diverse, par exemple du pollen ou d'acariens, qui constituent la cause majeure d'allergies dans les climats tempérés. Certains individus prédisposés génétiquement deviennent hypersensibles (allergiques) à des antigènes provenant de sources environnementales très variées. Les antigènes capables d'induire une réaction d' hypersensibilisation immédiate ou retardée sont appelés allergènes. Les allergènes peuvent notamment avoir pour origine des arbres, des plantes herbacées, des insectes, des mammifères, de la nourriture, des médicaments ou des produits chimiques. Les allergènes sont classés en groupes de I à V selon leurs propriétés im unochimiques . La présente invention s'intéresse aux allergènes de
Dermatophagoides farinae, de Dermatophagoides pteronyssinus ou de Euroglyphus maynei, respectivement aussi désigné Der p, Der f ou Eur m, et plus particulièrement aux allergènes d'acariens choisis dans le groupe I. L'allergène Der pi est l'un des allergènes majeurs accumulés dans les excréments
d'acariens ( Dermatophagoides sp) . La protéine Der pi a une masse moléculaire de 28 kDa et présente une activité cystéine protéase.
Les anticorps impliqués dans l'allergie appartiennent à la classe des im unoglobulines de type IgE. En présence d'un allergène, les IgE se lient aux mastocytes et aux basophiles, ce qui conduit au relargage par ces cellules de différents médiateurs chimiques et à la manifestation de l'allergie. Celle-ci peut prendre différentes formes, comme par exemple un choc anaphylactique, de l'asthme, une rhinite ou une dermatite atopique.
Lorsque le diagnostic de l'allergie à un composé particulier a été établi, la désensibilisation du patient vis-à-vis de l' allergène en cause est l'approche thérapeutique la plus fréquente, notamment lorsque la présence de l' allergène ne peut être évitée comme dans le cas du pollen et des acariens. Ce type de traitement a prouvé son efficacité, mais il nécessite de disposer d'un produit efficace et sûr. En effet, le traitement présente un risque de choc anaphylactique, de plus le produit administré doit être dépourvu de toute impureté qui pourrait constituer un autre allergène potentiel. Or, aujourd'hui, on ne sait utiliser que des mélanges complexes d' allergènes et pas de produit pur. Il est donc nécessaire de pouvoir disposer d' allergènes sous une forme structurale la plus proche possible de 1 ' allergène natif et présentant le plus grand degré de pureté possible.
L'un des moyens possibles pour atteindre ce but est la production d' llergènes recombinants dans un organisme hôte (Laffer, S. et al., J. Allergy Clin. Immunol., Septembre 1996, volume 98, no. 3, pages 652-658).
Ainsi, il a été proposé dans l'art antérieur d'exprimer des gènes codant ces protéines d' allergènes dans E. coli . Ce système d'expression présente l'inconvénient de
ne pas assurer les modifications post-traductionnelles des protéines qui peuvent être réalisées dans les cellules eucaryotes. Par exemple, les protéines produites ne sont pas glycosylées, or la glycosylation de certaines protéines allergènes peut être importante pour leur capacité de fixation aux IgE (Petersen, A. et al., Clinical and Expérimental Allergy, 1998, volume 28, pages 315-321 ; Van Ree et al., J. Biol. Chem. , 2000, volume 275, pages 11451- 11458). II a également été proposé d'exprimer des protéines actives dans les plantes. A cet égard on peut citer la demande de brevet internationale PCT publiée sous le No. WO 00/20612 qui décrit de façon générale des plantes transgéniques exprimant des protéines actives et envisage parmi celles-ci des allergènes.
Or, les travaux de recherche réalisés par les inventeurs dans le cadre de l'invention ont mis en évidence que les protéines d' allergènes du groupe I des acariens genre Dermatophagoides sont des protéines complexes dont le clonage et l'expression dans les plantes nécessitent des travaux de mise au point et de sélection importants pour obtenir un polypeptide présentant effectivement 1 ' antigénicité de l' allergène natif.
On a décrit dans l'art antérieur, par exemple dans les demandes de brevet internationales PCT publiées sous les No. WO 88/10297 et WO 92/04445, le clonage et l'expression d'ADN recombinants codant pour un polypeptide d' allergène des acariens du genre Dermatophagoides .
L'ADNc codant Der pi n'étant pas disponible, son clonage a été réalisé pour obtenir l'ADNc codant pour la protéine mature. Une première expérience d'expression a échoué. En effet, il n'y a pas eu expression de l' allergène sous forme recombinante à partir de cellules de tabac transformées avec l'ADNc codant la protéine mature. Une
nouvelle expérience de clonage a permis d'obtenir un ADNc de 960 bp codant la préproprotéine .
L'utilisation de l'ADNc codant la préproprotéine pour la transformation de cellules de tabac a permis la production de l'allergène Der pi sous forme recombinante.
Les ADNc codant les allergènes ont été sous-clonés dans des vecteurs d'expression compatibles avec le système végétal. Ces vecteurs ont été utilisés pour la transformation de cellules de tabac cultivées en suspension et pour une production dans des plantes de tabac.
Les vecteurs d'expression construits au cours de ces travaux contiennent le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur et la séquence de terminaison de la nopaline synthase ( nos ) encadrant la séquence d'ADNc codant chaque allergène natif. Leur transfert dans des cellules de tabac BY2 a été réalisé à l'aide de la bactérie Agrobacterium tumefaciens . A l'issue de cette transformation des cals transgéniques exprimant l' allergène recombinant ont été sélectionnés par résistance sur un milieu nutritif contenant l'antibiotique kanamycine. Les cals résistants exprimant 1' allergène recombinant ont été criblés par western blot à l'aide d'anticorps spécifiques de la protéine Der pi. Enfin, trois cals exprimant fortement Der pi recombinant ont été sélectionnés pour initier une culture en suspension de cellules transgéniques de tabac.
La localisation de l' allergène recombinant a été ensuite étudiée par fractionnement cellulaire. La localisation extracellulaire deDer pi, a été mise en évidence. Cet allergène est accumulé dans les fractions correspondant au milieu de culture des suspensions cellulaires mais également dans la fraction correspondant aux protéines ioniquement liées à la paroi des cellules végétales .
Ces travaux ont permis de montrer que la protéine Der pi d'acarien est une protéine synthétisée sous forme de
préproprotéine. La protéine mature Der pi a une masse moléculaire de 28 kDa et présente un site de N-glycosylation potentiel ; toutefois les données de la littérature concernant la glycosylation de cette protéine chez les acariens sont contradictoires (Chua et al., 1988, J. Exp. Med, volume 167, pages 175-182 ; - Thomas et al., 1988, Int. Archs. Allergy Appl. Immun. , volume 85, pages 127-129).
L'analyse de l' allergène recombinant par SDS-PAGE et immunodétection après transfert sur membrane de nitrocellulose a révélé 4 polypeptides immunoréactifs avec des anticorps spécifiques de Der pi d'acarien. L'un de ces polypeptides immunodétectés présente une migration électrophorétique proche de la protéine d'acarien et correspond à la protéine Der pi mature et glycosylée. Les 3 autres polypeptides présentent une migration électrophorétique plus faible et correspondent à des étapes intermédiaires de maturation de la protéine.
L' allergène est synthétisé sous forme d'une préproprotéine présentant à son extrémité N-terminale un peptide signal de 18 a. a. et un propeptide de 80 a. a. Le peptide signal et le propeptide sont clivés au cours de la maturation co- et post-traductionnelle de la protéine dans la cellule d'acarien pour donner une protéine mature de 222 a. a. Ainsi, le peptide signal permet d'introduire la protéine en cours de synthèse dans la lumière du reticulum endoplas ique. Le rôle du propeptide N-terminal n'a pas encore été identifié, mais la présente invention a mis en évidence son rôle décisif pour l'expression et la stabilité de l' allergène. Ces travaux montrent la complexité des protéines d'acariens qui sont synthétisées sous forme de préproprotéines et subissent une glycosylation. Ainsi, le propeptide N-terminal constitué de 80 a.a. est indispensable pour exprimer la protéine Der pi dans un système eucaryote tel que la cellule végétale ou la levure.
En outre, les cellules végétales transformées par l'ADNc codant pour la préproprotéine constituent à ce jour le seul système d'expression hétérologue permettant la production de l'allergène sous sa forme mature.
En conséquence, l'invention a pour objet une molécule d'acide nucléique purifiée comprenant ou constituée par une séquence polynucléotidique codant pour (i) la forme mature d'un allergène protéique d'un acarien du genre Dermatophagoides ou Euroglyphus et (ii) un propeptide placé à l'extrémité N-terminale dudit allergène protéique
Avantageusement, ladite séquence nucléotidique code aussi pour (iii) un peptide signal placé à l'extrémité N- terminale dudit propeptide.
L' acarien est choisi dans le groupe comprenant : Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae et Euroglyphus maynei.
L'invention se rapporte tout particulièrement à la mise en œuvre d'un allergène protéique mature d'acariens du genre Dermatophagoides choisi dans le groupe comprenant : Der pi ( Dermatophagoides pteronyssin us ) , Der fl ( Dermatophagoides farinae) et Eur ml (Euroglyphus maynei) . L'invention a tout spécialement pour objet la forme mature des allergènes protéiques suivants :
- Der pi, dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le SEQ ID NO.2 qui est codée par la séquence nucléotidique représentée dans la liste de séquence en annexe sous le SEQ ID NO.l,
- Der fl, dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le SEQ ID NO.4 qui est codée par la séquence nucléotidique
représentée dans la liste de séquence en annexe sous le SEQ ID NO.3,
- Eur ml, dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le SEQ ID NO.6 qui est codée par la séquence nucléotidique représentée dans la liste de séquence en annexe sous le SEQ ID NO.5,
Le propeptide placé à 1 'extrémité N-terminale dudit allergène protéique est choisi dans le groupe comprenant les propres propeptides des allergènes ci-dessus :
- pour Der pi : la séquence en acides aminés du propeptide est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le SEQ ID NO.8 qui est codée par la séquence nucléotidique représentée dans la liste de séquence en annexe sous le SEQ ID NO.7.
- pour Der fl : la séquence en acides aminés du propeptide est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le SEQ ID NO.10 qui est codée par la séquence nucléotidique représentée dans la liste de séquence en annexe sous le SEQ ID NO.9.
- pour Eur ml : la séquence en acides aminés du propeptide est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le SEQ ID NO.12 qui est codée par la séquence nucléotidique représentée dans la liste de séquence en annexe sous le SEQ ID NO.11.
Selon une forme de réalisation préférée, on préfère associer à chaque allergène mature son propre propeptide.
Le peptide signal placé à l'extrémité N-terminale dudit propeptide peut être tout peptide signal responsable de l'introduction de proforme dans la lumière du reticulum endoplasmique des cellules. Plus particulièrement, ledit peptide signal est choisi dans le groupe comprenant les propres peptides signaux des allergènes ci-dessus :
- pour Der pi : la séquence en acides aminés du peptide signal est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le SEQ ID NO.14 qui est codée par la séquence nucléotidique représentée dans la liste de séquence en annexe sous le SEQ ID NO.13.
- pour Der fl : la séquence en acides aminés du peptide signal est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le SEQ ID NO.16 qui est codée par la séquence nucléotidique représentée dans la liste de séquence en annexe sous le SEQ ID NO.15
- pour Eur ml : la séquence en acides aminés du peptide signal est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le SEQ ID NO.18 qui est codée par la séquence nucléotidique représentée dans la liste de séquence en annexe sous le SEQ ID NO.17.
Selon une forme de réalisation préférée, on préfère associée à chaque allergène mature son propre peptide signal.
Un exemple spécifique de séquence polynucléotidique selon l'invention codant pour (i) la forme mature d'un allergène protéique d'un acarien du genre Dermatophagoides, (ii) un propeptide placé à l'extrémité N-terminale dudit allergène protéique, et (iii) un peptide signal placé à l'extrémité N-terminale dudit propeptide, est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO.19 (Figure 2). La séquence en acides aminés correspondant codée par cette séquence polynucléotidique est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO.20.
L ' invention a aussi pour objet une molécule d ' acide nucléique recombinant comprenant une molécule d ' acide nucléique définie précédemment, un promoteur lié de manière fonctionnelle à ladite molécule d ' acide nucléique ,
éventuellement un gène de sélection placé sous le contrôle de son propre promoteur ou du même promoteur que ladite molécule d'acide nucléique, et avantageusement une séquence de terminaison placée en aval de ladite molécule d'acide nucléique.
A titre d'exemple de promoteurs, on peut citer ceux choisis dans le groupe comprenant :
-les promoteurs compatibles du système d'expression,
-les promoteurs constitutifs, -les promoteurs spécifiques pour diriger l'expression dans un organe,
-les promoteurs spécifiques du développement de la plante,
-les promoteurs inductibles par le stress, par exemple mécanique, thermique, sucre, chimique.
A titre d'exemple de gènes de sélection, on peut citer ceux choisis dans le groupe comprenant ceux conférant une résistance à un antibiotique comme la kanamycine, la ripamycine, etc.
A titre d'exemple de séquences de terminaison, on peut citer toutes celles compatibles avec le système d'expression.
Une molécule d'acide nucléique recombinant selon l'invention peut être un vecteur. L'invention se rapporte donc à un vecteur d'expression comprenant une origine de réplication eucaryote, une séquence promotrice adaptée, un marqueur de sélection et une molécule d'acide nucléique comme définie précédemment placée sous le contrôle desdites séquences de régulation.
L'invention concerne encore un hôte eucaryote d'origine végétale transformé par une molécule d'acide nucléique définie ci-dessus. A titre d'exemple d'un tel hôte eucaryote selon l'invention, on peut citer une cellule ou
une suspension de cellules de plante dans le génome de laquelle est incorporée, avantageusement de façon stable, une molécule d'acide nucléique définie précédemment sous le contrôle de séquence de régulation de manière à exprimer 1' allergène dans la cellule ou suspension de cellules.
A titre d'exemple d'un tel hôte eucaryote selon l'invention, on peut aussi citer une plante ayant incorporé, avantageusement de façon stable, dans son génome une molécule d'acide nucléique définie précédemment sous le contrôle de séquence de régulation de manière à exprimer 1 ' allergène dans une partie déterminée de ladite plante .
Par conséquent, l'hôte eucaryote objet de la présente invention est avantageusement choisi parmi une plante, une cellule ou une suspension de cellules de plantes.
L'invention envisage comme plantes tant les dicotylédones que les monocotylédones . L'invention envisage tout particulièrement comme monocotylédones, le maïs, les céréales graminés et le riz. L'invention envisage tout particulièrement comme dicotylédones, le tabac, la tomate, le colza, la pomme de terre, les légumineuses, comme le soja et la luzerne.
L'invention se rapporte donc aussi à un procédé d'obtention d'un allergène protéique d'un acarien du genre Dermatophagoides ou Euroglyphus recombinant, comprenant la culture d'un organisme eucaryote, transformé par une molécule d'acide nucléique définie précédemment dans des conditions et pendant un temps suffisant pour permettre l'expression de ladite protéine, puis l'isolement des protéines produites à partir de la culture des organismes transformés. L'organisme eucaryote avantageusement utilisé dans le cadre du procédé d'obtention d'un allergène protéique d'un acarien du genre Dermatophagoides ou Euroglyphus recombinant objet de la présente invention est
choisi parmi une plante, une cellule ou une suspension de cellules de plante.
Plus particulièrement, le procédé de l'invention comprend les étapes suivantes : (i) la transformation de cellules végétales avec une molécule d'acide nucléique définie précédemment liée de manière opérationelle à un promoteur,
(ii) la culture desdites cellules transformées, (iii) l'isolement de l' allergène exprimé dans lesdites cellules.
Le procédé de l'invention est remarquable en ce qu'il permet d'utiliser des cellules végétales qui ont la capacité de synthétiser et de maturer correctement des allergènes biologiquement actifs et parfaitement conformes pour leurs caractéristiques physicochimiques.
Le procédé de l'invention admet plusieurs modes de réalisation comprenant ou non à l'étape (ii) la régénération de plantes ou partie de plantes génétiquement transformées pour exprimer un allergène. Un mode préféré de production d' allergènes recombinants selon l'invention consiste à l'étape (i) à transformer des cellules végétales issues de suspensions cellulaires, et à l'étape (ii) à sélectionner les cals transformés, puis à initier des suspensions cellulaires à partir desdits cals transformés et cultiver ces suspensions, et à l'étape (iii) à purifier l' allergène à partir d'extraits protéiques issus des suspensions cellulaires transgéniques, en particulier du milieu de culture.
Dans ce mode de réalisation, l' allergène recombinant est isolé à l'étape (iii) par purification à partir d'extraits protéiques issus de suspensions cellulaires transgéniques dans des conditions non dénaturantes via un procédé de purification pouvant être une chromatographie d'affinité sur une colonne de métal chélaté et/ou une chromatographie de tamisage moléculaire.
Plus particulièrement, ce procédé permet d'obtenir à partir de cellules de plantes cultivées en suspension, donc dans un environnement confiné, des allergènes recombinants utiles dans des applications de diagnostic ou thérapeutiques .
Un autre mode de production d' allergènes recombinants selon l'invention consiste à l'étape (i) à régénérer sur un milieu de sélection, à partir desdites cellules, des plantes ou parties de plantes génétiquement transformées pour exprimer un allergène, puis éventuellement à obtenir de semences par autofécondation de la plante régénérée, et enfin facultativement, à produire des plantes à partir des semences. L' allergène recombinant est alors obtenu à l'étape (iii) à partir de cellules végétales cultivées en suspension ou partie de plantes par extraction puis purification.
La sélection des cellules, tissus ou parties de plantes transformées par la molécule d'ADN comprenant une séquence codant un allergène hetérologue est avantageusement réalisée, à l'étape (ii) grâce à la présence dans ladite molécule d'ADN d'un gène exprimant une résistance à un agent de sélection présent dans le milieu de culture. De tels gènes sont bien connus de l'homme du métier, il s'agit notamment de ceux conférant une résistance à un antibiotique comme la kanamycine, la ripamycine, etc....
La transformation des cellules à l'étape (i) du procédé de 1 ' invention peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier : - directement par électroporation ou bombardement de microparticules avec la molécule d'ADN formant un vecteur d'expression, ou
- indirectement à l'aide d'un micro-organisme apte à transformer les cellules de plantes, lui-même préalablement
transformé par ledit vecteur d'expression, comme, par exemple, Agrobacterium tumefaciens.
L'invention a pour objet un allergène protéique d'un acarien du genre Dermatophagoides ou Euroglyphus recombinant obtenu par le procédé ci-dessus. Un tel allergène protéique est une molécule active dont la maturation est proche de 1' allergène natif. Il présente une glycosylation avec un glycanne de petite taille, le poids moléculaire observé est donc très proche de l' allergène natif.
L'invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique pour le traitement ou le diagnostic d'une allergie aux acariens du genre Dermatophagoides, comprenant comme principe actif une quantité efficace d'une protéine ci-dessus ou d'un anticorps dirigé contre cette protéine.
L'invention se rapporte à un procédé de détection de la sensibilité manifestée par un individu aux acariens du genre Dermatophagoides comprenant la mise en contact, avantageusement in vitro, d * un échantillon provenant d'un individu avec une protéine définie ci-dessus ou un anticorps dirigé contre cette protéine, dans des conditions permettant la formation d'un complexe antigène/anticorps, puis la détection dudit complexe. L'invention a enfin pour objet un réactif de diagnostic d'une allergie aux acariens du genre Dermatophagoides ou Europglyphus comprenant une protéine définie ci-dessus ou un anticorps dirigé contre cette protéine .
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant le clonage et l'expression dans des plantes ou cellules de plantes d'une molécule d'acide nucléique selon l'invention codant une préproprotéine de l' allergène Der pi. Il sera
fait référence dans ce qui suit aux dessins en annexe dans lesquels :
- La figure 1 est une représentation schématique de l'ADNc selon l'invention codant une préproprotéine de 1'allergène Der pi.
- La figure 2 est la séquence de l'ADNc et de la préproprotéine Der pi clonée au cours de l'invention.
- La figure 3 représente les alignements des ADNc codant pour la préproprotéine et pour la protéine mature. - La figure 4 représente la recherche de similitude avec l' allergène Der pi dans les banques de données (http: //www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/ ) .
- La figure 5 est une représentation schématique des ADNc codant la préproprotéine (A) ou l'ADNC mature de Der pi (B).
- La figure 6 représente 1 ' immunodétection de la protéine Der pi recombinante. Les protéines extraites des cals (piste 1), du milieu intracellulaire des cellules en suspension (piste 2), du milieu de culture des cellules en suspension (piste 3), des feuilles de tabac (piste 4) transformées par la préproprotéine, les protéines d'acariens (piste 5) et les protéines transformées par l'ADNc codant la protéine mature fusionnée au peptide signal de la sporamine ont été séparées par électrophorèse SDS-PAGE puis transférées sur membrane de nitrocellulose et immunodétectée avec l'anticorps spécifique de Der pi . Une charge plus faible de l'extrait issus du milieu extracellulaire permet de visualiser les différentes formes accumulées dans les cellules en suspension. - La figure 7 représente l'analyse électrophorétique de la protéine Der pi recombinante. Les polypeptides présentant une réaction croisée avec la protéine Der pi ont été extraits et purifiés sur colonne d'immunoaffinité à partir des acariens (piste 1), des cellules de tabac (piste 2 ) ou des levures (piste 3). Ces polypeptides ont été
séparés par électrophorèse SDS-PAGE et les protéines ont été colorées par coloration au nitrate d'argent.
- La figure 8 représente la séquence N-terminale de la forme majoritaire produite par les acariens, par les cellules BY2 et par les levures.
- La figure 9 représente l'analyse de l'activité de Der pi recombinant produit dans les cellules BY2.
La figure 10 représente l'analyse de la glycosylation de l' allergène Der pi recombinant. Les protéines purifiées d'acariens (piste 1), de tabac (piste 2) et de levure (piste 3) ont été séparées par électrophorèse SDS-PAGE, colorées au nitrate d'argent (panneau A) ou transférées sur membrane de nitrocellulose et immunodétectées avec un anticorps spécifique de l' allergène Der pi (panneau B), des résidus xylose (panneau C), des résidus fucose (panneau D), des épitopes Lewis a (panneau E) ou affinodétectées avec la concanavaline A (panneau F).
La figure 11 représente l'analyse de la glycosylation de Der pi recombinant produit dans les cellules BY2 par spectrométrie de masse.
La figure 12 représente l'analyse électrophorétique (A) de la forme précurseur et de la forme mature de Der pi produite dans des cellules végétales de tabac en suspension après séparation par chromatographie. L'identité des protéines a été vérifiée par immunodétection sur membrane après transfert à l'aide d'un anticorps anti- Der pi (B) ainsi que la glycosylation par affinodétection sur membrane à l'aide de la concanavaline A (C). Les pistes sont chargées à quantités de protéines égales . - La figure 13 représente l'analyse de la protéine
Der pi recombinante produite dans les suspensions cellulaires de tabac par Elisa. La protéine recombinante réagit avec les IgE spécifiques de la protéine d'acarien.
- La figure 14 représente l'analyse de la protéine recombinante Der pi produite dans les suspensions
cellulaires et les feuilles de tabac par des expériences d' « histamine release ». La protéine recombinante produite dans les feuilles de tabac ou dans les cellules en suspension mobilise des cellules sensibilisées par différents sérums ( 1 — 2 — 4 et 5 ) et déclenche une sécrétion d' histamine de façon identique à la molécule native.
I) Expression de l' allergène Der pi recombinant. Au cours de cette étude, l'ADNc codant la protéine
Der pi a été clone par RT-PCR en utilisant les amorces suivantes (VanOortetal ; 2002, Eur.J.Biochem. , volume 269, pages 1-9) :
- pPICZalphaA5 ' cloning primer pro-Der pi: GGGCTCGAGAAAAGACGTCCATCATCGATCAAAACTTTTG (SEQ ID
NO.21) ;
- pPICZalphaA5 ' cloning primer mature et pro-Der pi: GGGGAGCTCTTAGAGAATGACAACATATGG (SEQ ID NO.22) ;
- pPICZalphaA5 ' cloning primer mature Der pi: GGGCTCGAGAAAAGAACTAACGCCTGCAGTATCAAT (SEQ ID NO.23).
Les ARNms utilisés pour cette expérience ont été obtenus à partir d 'ARN d'acariens de l'espèce Derma topha goi des pteronyssin us . Deux ADNcs ont été successivement clones, l'ADNc codant pour la protéine mature correspondant aux 666 nucléotides en position 3' ainsi que l'ADNc codant la préproprotéine, soit un ADNc de 1089 bp (Figure 2) .
L'analyse des séquences a mis en évidence que les ADNc clones codent pour une isoforme de l' allergène Der pi précédemment décrite par Chua et al. (1988 ; J. Exp. Med., volume 167, pages 175-182). Ainsi le codon (GTA) codant une valine en position 765-767 a été remplacé par le codon GCA codant une alanine. La recherche de similitude présentée figure 4 met en évidence que cette séquence présente de
fortes homologies avec les allergènes Eur ml (84,4%) et Der fl (82,6%) isolés respectivement de Euroglyphus maynei et Dermatophagoides farinae.
II) Clonage et expression dans la cellule végétale.
Les deux ADNc codant la protéine mature et la préproprotéine ont ensuite été clones dans des vecteurs d'expression compatibles avec le système levure ou le système plante. Deux constructions ont été utilisées pour exprimer la protéine Der pi dans la cellule végétale. Dans un premier temps, afin d'exprimer la protéine sous sa forme mature, un peptide signal d'origine végétale a été fusionné à l'extrémité N-terminale de l'ADNc codant pour la forme mature (Figure 5). Ce peptide signal provient d'une protéine végétale vacuolaire de pomme de terre, la sporamine. Ce peptide signal a été montré efficace dans le système BY2 et plante de tabac lors d'études antérieures réalisées dans notre laboratoire . Ce peptide signal a été amplifié par PCR à l'aide des amorces suivantes SP035S5' (SEQ ID NO.24) et PPSP03 ' (SEQ ID NO.25) :
SP035S5' : GCCCGAAGCTTGCATGCCTTCAG
P P S P 03 ' : C AT T GATAC T G C A GGCGTTAGTGGCTGGATTGGGCAGGAGATAGAGGG puis clone à l'extrémité 5' de l'ADNc codant la protéine mature à l'aide l'enzyme de restriction Sph I. Puis cet ADNc modifié ainsi que l'ADNc codant la préproprotéine ont été clones sous dépendance du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur et en amont de la séquence de terminaison de la nopaline synthase (Figure 5).
Ces deux cassettes d'expression ont été introduites dans le génome des cellules BY2 ( Nicotianae tabacum) via Agrobacterium tumefaciens. Puis l'analyse de l'expression a été réalisée par immunodétection avec un anticorps dirigé
contre la protéine Der pi d'acariens. Comme dans le cas de la levure, aucun polypeptide n'a pu être immunodétecté dans les cellules transformées avec l'ADNc codant la protéine mature fusionnée au peptide signal de la sporamine (Figure 6, piste 2) alors que 70% des cellules transgéniques transformées avec l'ADNc codant la préproprotéine accumule 4 polypeptides immunodétectés par l'anticorps spécifique de Der pi (Figure 6, piste 3).
Il a été observé que l'un des polypeptides, immunodétecté dans la cellule de tabac (Figure 6, piste 3 et encadré), présente une migration électrophorétique proche de la protéine issue d'acariens (Figure 6, piste 5). Les trois autres polypeptides présentent une migration électrophorétique plus faible et correspondent probablement à des intermédiaires de synthèse de la protéine mature. Ces résultats d'expression ont été confirmés chez la levure. La comparaison de la protéine Der pi produite dans les cellules en suspension (figure 6, piste 1 et 3 ) ou dans le feuilles de tabac (figure 6, piste 4) met en évidence que les feuilles de tabac accumulent principalement la forme mature mais en plus faible quantité. Aucun polypeptide n'est observé lorsque les cellules sont transformées par l'ADNc codant la protéine mature fusionnée au peptide signal de la sporamine. Ces expériences mettent en évidence que le propeptide N-terminal constitué de 80 a. a. (Figure 3) est indispensable pour exprimer la protéine Der pi dans un système eucaryote tel que la cellule végétale ou la levure.
III) Analyse de l'allergène Der pi recombinant. 1 ) Purification de la protéine recombinante.
La protéine Der pi recombinante produite dans la cellule végétale ou chez la levure a été purifiée par chromatographie d'immunoaffinité sur une colonne d'anticorps dirigé contre la protéine Der pi d'acariens. Les protéines purifiées sont présentées figure 7. Nous avons également pu
mettre en évidence que l'on pouvait dissocier la forme la plus mature des formes précurseurs (Figure 12)
2) Caractérisation de l' allergène Der pi. L'analyse de la séquence N-terminale de l' allergène
Der pi produit dans les cellules BY2 a mis en évidence que la forme majoritairement accumulée dans le milieu extracellulaire présentent 5 acides aminés (DLNAE) supplémentaires par rapport à la forme mature de Der pi produite par les acariens (Figure 8). Toutefois nous avons également pu mettre en évidence dans les cellules BY2 la présence d'une forme minoritaire dont la maturation correspond à la maturation N-terminale de l' allergène d'acariens. Afin d'étudier le repliement de la protéine recombinant produite par les cellules BY2, l'activité enzymatique de l' allergène recombinant Der pi a été analysée. En effet, il a été montré chez les acariens que cette protéine présentait une activité cystéine protéase. Comme l'illustre la figure 9, la molécule Der pi produite par les cellules BY2 hydrolyse un mélange de substrats composé de Cbz-Phe-Arg-AMC et de Boc-Gln-Ala-AMC. L'activité protéasique est mesurée par la fluorescence émise par le composé AMC clivé au cours de la réaction. L'activité mesurée pour Der pi recombinant semble moindre que dans le cas de la papaïne, cystéine protéase utilisée comme contrôle lors de cette étude.
3 ) Etude de la glycosylation de l' allergène recombinant.
Cette étude structurale a été complétée en analysant la glycosylation de la molécule produite par les cellules végétales. L'analyse a été réalisée dans un premier temps par " Western blot " à l'aide d'anticorps spécifiques des résidus sucres présents chez les plantes. Ainsi, comme il
est illustré Figure 10, la molécule Der pi produite par la cellule végétale (piste 2) réagit avec l'ensemble des sondes utilisées signifiant que la molécule est glycosylée et que le glycanne présente des résidus αl,3-fucose, βl,2-xylose spécifiques des plantes et l'épitope Lewis a. L' allergène produit par les acariens (piste 1) ne répond avec aucune des sondes utilisées et ne semble pas glycosylé dans notre étude. A l'inverse, l' allergène Der pi produit par les levures (piste 3) réagit avec la concanavaline A, l'importante glycosylation de cet allergène pourrait expliquer en partie le haut poids moléculaire observée pour cet allergène. L'analyse structurale des glycannes de Der pi produit par les cellules végétales a été ensuite réalisée par spectrométrie de masse. Cette étude a permis de confirmer la présence de résidus xylose et fucose sur le glycanne, les formes prédominantes rencontrées sont de type [GlcNAcMAn3GlcNAc2XylFuc ] et [ GlcNAc2MAn3GlcNAc2XylFuc] (Figure 11). Cette analyse structurale de l' allergène recombinant met en évidence que le système végétal est l'un des systèmes permettant de produire une molécule active dont la maturation est proche de la protéine native. Dans tous les autres système de production (cellules CHO, cellules d'insectes SF9, cellules de drosophiles, levures), aucun clivage du propeptide N-terminal n'est observé, ce clivage est indispensable à l'activité de la protéine. L'analyse de la glycosylation nous a permis de montrer que la molécule Der pi était glycosylée comme cela est observée dans tous les systèmes d'expression utilisés pour produire cet allergène. Toutefois contrairement au système animaux et levures, la molécule produite présente un glycanne de petite taille et par conséquent le poids moléculaire observé est très proche de la molécule d'acariens. L'ensemble de ces données mettent en évidence que le système végétal est le seul système d'expression à ce jour capable de produire une
molécule Der pi active et dont le repliement est similaire à la molécule native.
4 ) Analyse de 1 ' allergénicité des allergènes recombinant. a) Test de liaison aux IgE.
La capacité de liaisons aux IgE de l' allergènes Der pi a été comparée par une analyse Elisa. La comparaison des deux molécules native et recombinante n'a permis de mettre en évidence que de faibles différences. Toutefois, il apparaît que la molécule recombinante est deux fois plus compétente pour lier les anticorps monoclonaux que la protéine native (figure 13).
b) Essai de libération d'histamine.
Les basophiles d'un donneur non-allergique ont été partiellement purifiés par centrifugation sur Percoll. Les cellules ont été dépouillées de leur IgE par un traitement à l'acide lactique puis re-sensibilisées par addition de quatre sérums positifs pour Der pi. Les cellules ont ensuite été incubées avec Der pi natif ou recombinant à 37°C pendant 45 min. Les cellules ont été centrifugées et la libération d'histamine dans le surnageant a été mesurée par une méthode fluorométrique. Les résultats sont exprimés en % de libération du contenu total en histamine des cellules . Les tests de libération présentés figure 14 démontrent que les protéines native et recombinantes produites dans les cellules ou dans les feuilles de tabac déclenchent une libération d'histamine identique.