FR2777571A1 - Procede de valorisation des residus de distillation de produits de fermentation - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de valorisation de résidus de distillation de produits de fermentation issus de l'industrie agro-alimentaire, en particulier de résidus de distillation du vin. Ce procédé permet la préparation de composés d'intérêt économique tels que des arômes, et comprend les étapes de :a) culture dans des conditions de fermentation, d'au moins un microorganisme choisi pour sa capacité à synthétiser lesdits composés, en présence d'un substrat comprenant un résidu issu de la distillation de produits de fermentation,b) récupération des composés produits.

Description

PROCEDE DE VALORISATION DES RESIDUS DE DISTILLATION DE
PRODUITS DE FERMENTATION.

La présente invention a pour objet des moyens de valorisation de résidus de distillation de produits de fermentation et en particulier un procédé pour la production de composés d'intérêt économique à partir de ces résidus de distillation de produits de fermentation.

L'invention concerne en particulier la valorisation des résidus de distillation de produits de fermentation issus de l'industrie agro-alimentaire.

Dans le cadre de l'invention, ces résidus ou sous-produits sont utilisés comme substrats pour la culture de microorganismes capables de se développer et de produire des molécules d'intérêt économique ; ces composés sont en particulier des molécules à haute valeur ajoutée telles que des arômes, des colorants, des enzymes, des acides aminés, des lipides, des glucides, des produits biologiquement actifs dans le domaine thérapeutique, agro-alimentaire ou pour l'agriculture, etc.

Les inventeurs ont, dans le cadre de cette invention, observé que des produits résiduels de la distillation du vin, et en particulier du vin de Cognac (ces produits résiduels étant désignés dans ce cas spécifique par l'expression "vinasse"), sont susceptibles de constituer des substrats appropriés pour la culture de microorganismes, dans le but de produire des molécules d'intérêt économique.

La présente demande de brevet a donc pour objet un procédé de préparation de composés d'intérêt économique à partir de substrats constitués par ou comprenant des résidus de distillation de produits de fermentation et l'utilisation de microorganismes pour la mise en oeuvre ce de procédé.

Ainsi la demande concerne un procédé de préparation de composés d'intérêt économique (appelés "composés"), comprenant les étapes de:
a) culture dans des conditions de fermentation aérobie, d'au moins un microorganisme choisi pour sa capacité à synthétiser lesdits composés, en présence d'un substrat comprenant un résidu issu de la distillation de produits de fermentation,
b) récupération des composés produits.

En particulier, les produits obtenus peuvent être isolés et purifiés par extraction par un solvant, par distillation, par extraction solide-liquide, par extraction gaz-liquide couplée à une cryocondensation, par fluides supercritiques, par des procédés membrannaires, en particulier la perstraction et la pervaporation ou par séparation chromatographique, en particulier HPLC, ainsi que par des combinaisons de ces techniques séparatives.

La fermentation peut être réalisée en milieu aérobie, anaérobie ou mixte.

Selon un premier mode de réalisation du procédé, le substrat mis en oeuvre comprend un résidu de la distillation du vin et, à titre d'exemple, un résidu de la distillation du vin de Cognac ou d'Armagnac. Ce résidu est appelé "vinasse".

Les vinasses sont le sous-produit liquide obtenu en sortie d'alambic après distillation du vin. L'élaboration du Cognac est réalisée sur lies et génère de gros volumes de vinasse : environ deux tiers du volume de vin distillé. Les vinasses ne contiennent plus d'alcool, et quasiment plus de composés aromatiques, ceux-ci étant passés dans le distillat. Elles contiennent cependant un certain nombre de substances, et notamment des quantités non négligeables d'acides organiques (7,55 à 10,05 g/l).

La composition moyenne des vinasses de distillerie de Cognac est la suivante: pH 3,5
Matières solubles 1 g/l
Matières dissoutes 30 g/l
Cendres 3 g/I
DCO 30 g/I
DBO5 20 g/I
Azote total 0,5 g/l
P205 0,6-0,5 g/l K2O 2-3 g/l
Cl 0,03 g/I
Acide tartrique 5-6 g/l
Acide succinique 0,5-1 g/l
Acide lactique 2-3 g/l
Acide citrique et malique 0,05 g/l
Total 7,55-10,05 gll
La DCO est la Demande Chimique en Oxygène, c'est-à-dire la quantité d'oxygène nécessaire pour oxyder les matières organiques contenues dans les effluents.

La DBO5 est la Demande Biologique en Oxygène nécessaire, pendant 5 jours, aux micro-organismes contenus dans l'eau pour oxyder une partie des matières carbonées.

L'acide tartrique des vinasses de distillerie de Cognac est sous forme de bitartrate de potassium (KHC4H406).

Alternativement, selon un autre mode de réalisation de l'invention, le substrat est choisi parmi les résidus de distillation de produits de fermentation de fruits, de betteraves, de canne à sucre, de céréales, notamment de malt, d'orge, de blé.

A titre d'exemple, les résidus de distillation de produits de fermentation du jus de pomme sont les résidus de distillation du calvados, les résidus de distillation de produits de fermentation de la canne à sucre sont les résidus de distillation du rhum, etc.

Les substrats ainsi définis, pris isolément ou en mélange, peuvent être utilisés pour produire différents composés tels que des composés odorants volatils (ou arômes), et de façon générale des protéines, des acides aminés, des lipides, des glucides, des nucléosides, des alcools ou des dérivés de ces composés. Les substrats décrits peuvent ainsi, en fonction du microorganisme choisi pour la mise en oeuvre du procédé, permettre la production de composés biologiquement actifs, entrant dans la composition d'insecticides, de pesticides, d'herbicides, de substances contrôlant la croissance végétale ou des principes actifs de médicaments.

Les substrats définis dans le cadre de l'invention peuvent être adaptés pour la culture de microorganismes variés et en particulier de bactéries, de levures, ou de champignons.

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé défini est caractérisé en ce que l'étape de culture met en oeuvre au moins une levure du genre Sporobolomyces odorus capable de produire des arômes, dans des conditions de culture permettant la croissance de ladite souche S. odorus et la production d'arômes à partir d'un substrat comprenant de la vinasse.

Sporobolomyces odorus est une souche de levure connue pour sa capacité à produire des arômes tels que la lactone, en particulier la ydécalactone.

L'invention a donc pour objet un procédé pour la préparation d'arômes comprenant les étapes de
a) culture dans des conditions de fermentation aérobie de
Sporobolomyces odorus en présence d'un substrat comprenant de la vinasse, le pH du milieu étant compris entre 4 et 7, de préférence égal à environ 6, la température de la réaction étant compatible avec la croissance de S. odorus,
b) récupération des arômes produits.

Le procédé ainsi défini est avantageusement réalisé sous agitation entre 50 et 1000 rpm, de préférence entre 100 et 700 rpm et avec une aération de 0,10 à 10 wm, de préférence de 0,10 à 5 wm.

La température de l'étape de culture peut varier selon la(les) souches de microorganismes utilisées. Pour Sporobolomyces odorus, la culture est effectuée à une température comprise entre 10 et 50OC, de préférence entre 20 et 40"C, avantageusement voisine de 24"C ; cette température est régulée pour être maintenue essentiellement constante.

La récupération peut être réalisée en continu des arômes produits par extraction solide-liquide. Les arômes produits se trouvent essentiellement dissous dans le milieu de culture qui est une phase aqueuse. Leurs coefficients de partage étant plus favorables pour une phase lipidique, la séparation des arômes du milieu de fermentation peut être réalisée par extraction solide-liquide utilisant une huile solide à température ambiante. Les arômes produits sont ainsi récupérés et concentrés dans l'huile solide. II est aussi possible d'obtenir les arômes dans un alcoolat, c'est à dire, en solution dans de l'éthanol. Pour ce faire, L'huile solide contenant les composés odorants est fondue et mélangée avec de l'éthanol. Le mélange est ensuite refroidi dans de la glace fondante pour séparer l'huile solide d'alcoolat qui contient les arômes en solution. Ce dernier peut être ensuite distillé pour purifier les composés odorants.

Le substrat utilisé peut être le cas échéant enrichi pour favoriser la croissance des souches de microorganismes et/ou pour favoriser la production des composés recherchés. Par exemple, on aura recours à un enrichissement en composés glucidiques et notamment en glucose.

Le procédé peut également comprendre la mise en oeuvre, lors de l'étape de culture, d'un précurseur susceptible de favoriser la production des composés recherchés, en particulier d'un précurseur utilisé pour la bioconversion, par le(les) microorganisme(s) utilisé(s).

Ainsi, selon le mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé est caractérisé en ce que l'étape de culture de Sporobolomyces odorus est réalisée en présence de substrats choisis et d'acide ricinoléique ou de dérivés d'acide ricinoléique, par exemple d'un ester, assimilables par le(les) microorganisme(s).

De façon particulièrement intéressante, lorsque le substrat est la vinasse, le microorganisme choisi est S. odorus et le précurseur est un ester d'acide ricinoléique tel que le ricinoléate de méthyle.

Les inventeurs ont observé que la mise en oeuvre du procédé conduit à un niveau de production des composés recherchés particulièrement élevé, lorsque l'incorporation du précurseur et en particulier du ricinoléate de méthyle dans le milieu de culture est réalisée sous forme fractionnée tout au long de l'étape de culture.

Ce fractionnement permet d'augmenter la production de composés recherchés présents dans la phase aqueuse.

Par ailleurs, les inventeurs ont constaté qu'un apport de précurseur et en particulier en ricinoléate de méthyle, dans le cadre de la réalisation du procédé, est avantageusement effectué précocément lors de l'étape de culture et de préférence dès la mise en culture, cet apport étant avantageusement reconduit en quantités, égales ou différentes, à différents moments ultérieurement au cours de l'étape de culture.

Par exemple, L'apport en précurseur et en particulier en ricinoléate de méthyle peut être fractionné en quatre apports, lorsque la durée de la culture est par exemple voisine de 3 jours.

Le procédé de l'invention est caractérisé dans un mode de réalisation particulier, en ce que la quantité de ricinoléate de méthyle introduite au cours de chaque apport est comprise entre 0,008 % (v/v) et 5 % (v/v), de préférence comprise entre 0,008 % (v/v) et 0,2 % (v/v), avantageusement entre 0,03 % et 0,10 % (v/v), de préférence voisine de 0,03 % (v/v).

La quantité de ricinoléate de méthyle introduite dans la culture peut être aménagée en fonction du résultat recherché.

Avantageusement, la quantité de ricinoléate de méthyle introduite au cours de chaque apport est voisine de 0,07 % (v/v) jusqu'à l'obtention d'une quantité totale ajoutée comprise entre 0,1 % (v/v) et 5 % (v/v), avantageusement entre 0,03 et 0,7 % (v/v) en fin de culture.

Dans le cas de la production d'arômes à partir de vinasse mise en culture avec Sporobolomyces odorus, on optimisera les différents paramètres pour la réalisation du procédé en fonction de la quantité de composés que l'on cherche à produire et lorsque ces composés sont des arômes tels que la ydécalactone, ces paramètres peuvent être choisis de façon à produire entre 50 mg/l et 700 mg/l de y-décalactone en phase aqueuse.

De façon générale, la quantité totale et la quantité de chaque fraction de précurseur ajouté est déterminée en fonction de son influence sur la réaction de bioconversion, de la toxicité éventuelle des composés produits sur le développement des souches de micro-organismes et en fonction de la durée de l'étape de culture.

Le procédé de l'invention est ainsi caractérisé en ce que l'étape de culture peut être réalisée pendant une durée variable et en particulier peut être conduite pendant une durée comprise entre quelques heures et plusieurs jours, par exemple jusqu'à 10 jours, notamment une durée minimum de 24 h, en particulier une durée comprise entre 24 et 72 heures.

Avantageusement, pour optimiser les paramètres de la réalisation du procédé, on utilise une densité cellulaire (DO à 620 nm) initiale des microorganismes apportés pour la réalisation de l'étape de culture est comprise entre 0,1 et 20, de préférence entre 0,2 et 15 avantageusement entre 1 et 15.

Avantageusement, la densité optique initiale des microorganismes apportés pour la réalisation de l'étape de culture est comprise entre 5 et 15 ou entre 5 et 10.

D'autres composés peuvent encore être ajoutés au milieu de culture et en particulier on utilisera avantageusement des tensioactifs tels que le Tween 209 ou des antimoussants.

Les microorganismes susceptibles d'être cultivés en présence des substrats de l'invention peuvent être variés et peuvent notamment être choisis parmi les souches suivantes, le cas échéant après recombinaison, capables de donner lieu à la production des composés identifiés ci-après:
Souches Produits
Sporobolomyces odorus arômes, colorants, biomasse
Yarrowia lipolytica arômes, biomasse, polyols
Saccharomyces cerevisiae biomasse, ergostérol (- > vitamine D)
Candida guillermondii lipides
Candida utilis acides aminés (ex.: lysine, méthionine...)
Candida utilis propanediol
Lenzites betulina arômes
Penicillium chrysogenum antibiotiques
Penicillium sp. analgésiques
Penicillium citdnum anticholestérolémiques
Aureobasidium pullulans polysaccharides (pullulane, etc.)
Fusarium sp. antihypertenseurs
Tolypocladium inflatum immunosurpresseurs
Coriolus versicolor immu nostimu lants
Beauveria bassiana insecticides et pesticides biologiques
Puccinia chondrillinna herbicides biologiques
Fusarium moniliforme substance de croissance végétale
Cylindrocarpon ra dicicola stéroïdes
Lactococcus lactis arômes
Aspergillus enzymes
Bacillus enzymes
Pseudomonas putida vitamines
Bacillus ammoniagenes nucléosides
Bacillus pumilus antiinflamatoires
Bacililus cereus antifongiques
Bacillus thuringiensis insecticides et pesticides biologiques
Claviceps purpurea alcaloïdes
Streptomyces diastaticus antidiabétiques
Streptomyces platensis antitu moraux
Streptomyces dimorphogenes inhibiteurs d'enzymes
Streptomyces hygroscopicus antihelminthes, herbicides, antiviraux
(agriculture)
Streptomyces cinnamonensis a nticoccid iens (agriculture) Arthrobotrys irregularis nématicides biologiques
De façon avantageuse, pour la réalisation de l'invention, le substrat utilisé pour la culture des microorganismes est stérilisé par tout moyen approprié et par exemple en autoclave, préalablement à la mise en culture.

Par ailleurs, I'étape de récupération des produits formés peut être conduite de toute manière appropriée et en particulier les produits obtenus peuvent être isolés et purifiés par extraction par un solvant, par distillation, par extraction solide-liquide, par extraction gaz-liquide couplée à une cryocondensation, par fluides supercritiques, par des procédés membranaires, en particulier la perstraction et la pervaporation ou par séparation chromatographique, en particulier HPLC, ainsi que par des combinaisons de ces techniques séparatives.

La récupération des composés peut être effectuée à l'issue de l'étape de culture ou le cas échéant insitu, notamment lorsque les composés produits peuvent présenter un certain niveau de toxicité par rapport aux microorganismes utilisés.

Les caractéristiques de l'invention sont également illustrées dans les exemples et les figures qui suivent: Légende des figures
Figure 1A. Relation entre la biomasse (exprimée en g/l de matière sèche) et la densité cellulaire (DO à 620 nm).

Figure 1B. Relation entre la biomasse (exprimée en g/l de matière sèche) et le volume de mycélium.

Figure 2A. Etat de cultures de S. odorus âgées de 77 heures sur différents milieux à base de vinasse.

Figure 2B. Cinétique de croissance et de développement de S. odorus sur
MT2-malt.

Figure 2C. Cinétique de croissance et de développement de S. odorus sur
MV2-malt.

Figure 3. Evolution de la production de biomasse dans les conditions standards et sur vinasse non complémentée.

Figure 4. Evolution de la production de lactone dans les conditions standards et sur vinasse non complémentée.

Figure 5. Influence d'un ajout de 1,66 % d'huile de ricin sur l'évolution de la production de biomasse.

Figure 6. Influence d'un ajout de 1,66 % d'huile de ricin sur la production de lactone.

Figure 7. Evolution de la production de biomasse en fonction de la nature du composé lipidique ajouté.

Figure 8. Evolution de la production de lactone en fonction de la nature du composé lipidique ajouté.

Figure 9. Cinétiques de croissance et de production de y-décalactone chez
S. odorus après additions fractionnées de ricinoléate de méthyle. Le précurseur est ajouté à t = 0, 24, 48 et 72 h à raison de 0,06 % (v/v).

La flèche indique le moment où le précurseur a été ajouté.

Figure 10. Croissance, production de g-décalactone et rendement de bioconversion par S. odorus cultivé après additions fractionnées de ricinoléate de méthyle.

Le précurseur est ajouté à t = 0, 24, 48 et 72 h à raison de 0,008 % (v/v).

La flèche indique le moment où le précurseur a été ajouté.

Figure 11. Croissance de Sporobolomyces odorus en fonction de la quantité de y-décalactone présente initialement dans le milieu.

Figure 12. Impact d'un apport simultané de tween 20 et de RM sur la croissance de S. doms.

La flèche indique le moment où le précurseur a été ajouté.

Figure 13. Impact d'un apport simultané de tween 20 et de RM sur la production de y-décalactone.

La flèche indique le moment où le précurseur a été ajouté.

A. Matériel et Méthodes
I. LES SOUCHES 1.1 LA SOUCHE DE SPOROBOLOMYCES ODORUS
La souche de Sporobolomyces odorus utilisée est la souche déposée sous la référence CBS 2636.

1.2 LA SOUCHE DE LENZITES BETULINA
La souche utilisée est la souche déposée sous la référence MIC 38.

II LES MILIEUX DE CULTURE ET DE CONSERVATION DE DIFFERENTS
MICROORGANISMES
II.1 SPOROBOLOMYCES ODORUS
II.1.1- COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE DES
SPOROBOLOMYCES ODORUS
Deux milieux de culture ont été testés, afin de déterminer lequel permet la meilleure production de y-décalactone. Ces milieux peuvent être utilisés comme milieux témoins pour le test des substrats.

Le premier de ces milieux a la composition suivante (JOURDAIN, 1985):
- 30 g/l de glucose
- 3,5 g/l de peptone
- 1 g/I d'extrait de malt
- 2g/l de KH2PO4
- 0,13g/l de CaCI2, 2H2O
- 0,01 g/l de FeSO4, 7H2O
- 3 g/l de MgSO4, 7H2O
- H2O (milieu MT1) ou vinasse concentrée trois fois et centrifugée 5 minutes à 1 000 g (milieu MV1) qsp il.

Le second milieu utilisé (FERON, 1996) est formulé comme suit:
- 1 g/l de glucose
- 0,5 g/l de bacto tryptone
- 1 g/l d'extrait de levure
- 1 g/l d'extrait de malt
- 2 g/l de casamino acides
- 2 g/l de KH2PO4
- 0,13 g/l de CaCI2, 2H2O
- 0,01 g/l de FeSO4, 7H2O
- 3 g/l de MgS04, 7H2O
- H2O (milieu MT2) ou vinasse concentrée trois fois et centrifugée 5 minutes à 1 000 g (milieu MV2) qsp 1 1.

Dans les deux cas, le pH a été ajusté à 6 à l'aide de soude 5 N, puis le milieu a été réparti à raison de 60 ml dans des erlenmeyers de 250 ml et autoclavé 20 minutes à 120 "C.

Au cours des cultures, réalisées en milieu liquide, la température a été maintenue à 24 "C et l'agitation à 250 rpm (tours par minute).

II.1.2 - COMPOSITION DU MILIEU DE CONSERVATION DE
SPOROBOLOMYCES ODORUS
La souche de Sporobolomyces odorus a été conservée sur boite de pétri à 4"C. Dans ce cas, un milieu de type MT2 a été utilisé. 15 g/l d'agarose ont été ajoutés (JOURDAIN, 1985). Le milieu ainsi obtenu a été autoclavé 20 minutes à 120 0C.

11.2 LENZITES BETULINA 11.2.1. MILIEU DE CULTURE DE LENZITESBETULINA
Le milieu de culture utilisé pour ce champignon basidiomycète a la composition suivante (GALLOIS, 1990):
- 10 g/l de glucose
- 0,5 g/l d'extrait de levure
- 0,2 g/l de KH2PO4
- 0,032 g/l de CaCI2, 2H2O
- H2O (LMT) ou vinasse concentrée trois fois et centrifugée 5 minutes à 1 000 g (LMV) qsp i 1.

Le pH a été ajusté à 4,8 à l'aide de soude 5 N dans le cas de LMV et de
HCI 1N dans le cas de LMT.

Les cultures, réalisées en milieu liquide dans des erlenmeyers de 250 ml contenant 100 ml de milieu, ont été placées à 24"C sous une agitation de 180 rpm.

11.2.2 - MILIEU DE CONSERVATION DE LENZITES BETULINA
Lenzites betulina a été conservée à 4"C sur des boites de pétri contenant un milieu préparé de la façon suivante
- dissoudre 39 g/l de potato-dextrose agar, dans de l'eau
- autoclaver la solution obtenue 20 minutes à 120 "C
- laisser refroidir jusqu'à 45-50"C
- ajouter 14 ml/l d'acide tartrique à 10%
- répartir le mélange dans des boîtes de pétri.

111- EVALUATION DE LA BIOMASSE PRODUITE 111.1 - CAS DE SPOROBOLOMYCES ODORUS
L'évolution de la quantité de biomasse produite au cours des cultures de cette levure a été suivie en mesurant la densité optique (DO) de la suspension cellulaire à 620 nm. Au spectrophotomètre, le 0 était réalisé avec un échantillon de milieu vierge.

Alternativement, des mesures de matière sèche (MS) produite ont été réalisées. Pour cela, 30 ml d'une suspension cellulaire ont été prélevés et on a mesuré la DO. Après centrifugation 5 minutes à 2 000 g de cette suspension et élimination du surnageant, le culot a été placé dans une étuve à 37"C pendant 48 heures, puis pesé.

La matière sèche correspondant à différentes valeurs de DO a été pesée afin de tracer la courbe MS=f(DO) représentée à la figure 1A. Celle-ci permet de déterminer la quantité de biomasse correspondant à une DO donnée.

111.2 - CAS DES CHAMPIGNONS FILAMENTEUX
Dans le cas de ces champignons, les mycélia forment des "pelets" (pelotes) lorsqu'ils sont cultivés en milieu liquide agité. La biomasse produite a été évaluée en mesurant le poids de matière sèche (MS). Pour cela, un échantillon de culture ayant un volume donné a été centrifugé 5 minutes à 2000 g dans un tube gradué. A l'issue de cette centrifugation, le surnageant a été éliminé puis le volume (V) de mycélium obtenu mesuré. Ce culot a été placé à l'étuve à 37"C pendant 48 heures et pesé.

Ces mesures ont permis de tracer la courbe MS=f(V) (figure 1B). Ainsi, on a pu déduire directement du volume de mycélia obtenu la quantité de biomasse sèche correspondante.

IV - DOSAGE DES ELEMENTS CONTENUS DANS LES MILIEUX DE
CULTURE lV.1. EXTRACTION LIQUIDE-LIQUIDE DES COMPOSES VOLATILS
PRESENTS DANS LA PHASE AQUEUSE
Avant d'être dosés, les composés volatils odorants doivent être extraits du milieu. Pour cela, la méthode d'extraction liquide-liquide par un solvant organique a été utilisée avec le pentane (C5H,2). Cette technique repose sur la non miscibilité du solvant avec le milieu de culture qui est aqueux, et sur l'affinité supérieure qu'ont pour lui les molécules aromatiques. Ainsi, les composés volatils libres passent de la phase aqueuse à la phase organique.

Afin de doser les composés volatils extraits, la technique dite du standard interne a été utilisée. Cette méthode est fondée sur l'utilisation de pentane contenant un composé aromatique pour réaliser l'extraction. Le composé choisi doit présenter les caractéristiques suivantes:
- être ajouté à une concentration connue,
- ne pas être présent dans le milieu dont on veut extraire les composés volatils produits par les microorganismes,
- avoir un comportement chromatographique (temps de rétention, aire de pic...) proche du ou des composés à extraire.

Dans le cas des dosages de la lactone produite par Sporobolomyces odorus, le standard interne utilisé était le géraniol, à une concentration de 30 mg/l.

Le protocole suivi était le suivant:
- centrifuger le milieu 5 minutes à 2 000 g afin d'en éliminer les cellules en suspension ou les "pelets"
- remplir une fiole de 25 ml avec le surnageant obtenu précédemment
- ajouter 1 ml de pentane contenant le standard interne,
- agiter 1 minute afin de mettre les deux phases en contact et de permettre l'extraction des composés volatils de la phase aqueuse,
- laisser les phases se séparer en les laissant environ 30 minutes dans de la glace,
- prélever la phase organique et la mettre dans un tube Eppendorf. Afin de destabiliser totalement l'émulsion, il peut s'avérer nécessaire d'ajouter une goutte d'éthanol absolu au mélange.

IV.2. - CONCENTRATION DES ECHANTILLONS
Les premiers dosages des extraits organiques ont montré que les quantités de composés volatils présentes étaient insuffisantes pour permettre des mesures fiables.

Afin de remédier à ce problème, les échantillons ont été concentrés environ 5 fois. Pour cela, un flux d'air sec à très faible débit a été utilisé. A son contact, le solvant, très volatil, s'est évaporé alors que les molécules odorantes se concentraient dans le volume restant. On considère que les composés produits par les microorganismes ne s'évaporent pas, ou bien qu'ils s'évaporent dans les mêmes proportions que le standard interne.

IV.3 - DOSAGE DES COMPOSES CONTENUS DANS LA PHASE AQUEUSE
PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE (CPG) Matériel
Le chromatographe suivant a été utilisé: HEWLETT PACKARD HP 5890
Séries II, muni d'une colonne capillaire en silice fondue imprégnée de
Carbowax 20M (polyéthylène glycol polymérisé) de 25 m de longueur et 0,25 mm de diamètre.

Les chromatographies ont été réalisées dans les conditions décrites cidessous:
- gaz vecteur: azote avec un débit de 75 ml/min
- gaz de combustion: mélange air/hydrogène
- température - de l'injecteur: 2000C
- du détecteur: 250 C
- du four - > initiale : 400C
- > augmentation : 4 C/min
- > finale : 200 C
Le chromatographe est relié à un intégrateur de type HELWETT
PACKARD HP 3394A, utilisé dans les conditions suivantes:
- atténuation (ATT2A):0
- vitesse du papier (CHT SP): 0,5 cm/min
- sensibilité (PK WD): 0,04
- discrimination (THRSH): 0
Principe de la quantification des composés à l'aide du standard interne
La quantification des composés produits a été établie de la façon suivante : une CPG à partir d'une solution contenant 30 ,ul/l de standard interne et 30 ,ul/l du composé à doser a été réalisée : la lactone dans le cas des cultures de Sporobolomyces odorus. Ceci a permis de calculer le rapport existant entre les aires de pic des deux molécules sachant qu'elles sont présentes à la même concentration. Ainsi on obtient:
Concentrationcomposé x = (airecomposé x/airestandard interne)* coefficient de réponse où le coefficient de réponse (CR) a la valeur suivante:
CR= 30 l/l*(airestandard interne à 30 l/l/airecomposé x à 30 l/l)
B PRODUCTION DE COMPOSES VOLATILS ODORANTS A PARTIR DE
VINASSE. EN PRESENCE DE S. ODORUS ET FACULTATIVEMENT
RICINOLEATE DE METHYLE
ETUDE DU COMPORTEMENT DE SPOROBOLOMYCES ODORUS
SUR VINASSE
Pour déterminer si la vinasse n'exerce pas une inhibition sur le développement ou le potentiel de bioproduction de la levure, on a fait croître S.odorus sur un milieu ayant la même composition que celui utilisé comme témoin (MT) mais en remplaçant l'eau, qui servait de solvant aux différents constituants, par de la vinasse concentrée trois fois et préalablement centrifugée afin d'éliminer les impuretés en suspension qu'elle contient. Après 72 heures de culture, la DO est de 12 (tableau 1), c'est-à-dire comparable à celle obtenue sur le milieu MT2. Ces résultats ajoutés au fait que la présence de y-décalactone a été détectée montrent que les éléments contenus dans la vinasse ne perturbent ni la croissance de la levure, ni la production de lactone.

Tableau 1: Production de biomasse de S.odorus après 72 heures de
culture soude ne perturbent pas le développement de la levure et si le pH initial du milieu à base de vinasse ne permettrait pas une croissance et une production satisfaisante. Pour cela une culture sur un milieu identique à celui précédemment décrit, sans ajustement de pH a été réalisée
Sporobolomyces odorus se développe beaucoup moins bien (la DO était de 6,6), et surtout que la production de lactone se trouve très affectée (tableau 2). Ceci permet de dire qu'un pH de 3 ne permet ni un développement correct de la levure, ni le maintien de son potentiel de production de lactone par rapport aux essais réalisés sur vinasse à pH6.

2. Recherche d'un milieu standard optimal de développement de
Sporobolomyces odorus
A l'issue de ces premiers résultats, la composition du milieu utilisé a été optimisée pour déterminer si la vinasse pouvait servir de substrat pour la production de lactone. La formulation du milieu a été modifiée en éliminant certains composés:
- milieu vinasse sans extrait de malt
- milieu vinasse sans casamino acides
- milieu vinasse sans glucose.

Après 77 heures de culture, les productions de biomasse et de ydécalactone ont été évaluées (figure 2A). Ces mesures font apparaître que sans extrait de malt, la croissance de S. odorus est améliorée.

En revanche, le fait d'éliminer les casamino acides du milieu ne semble avoir aucun effet sur le développement de la levure et sur la production de lactone puisque les résultats obtenus sont comparables à ceux observés sur le milieu MV2.

Enfin, le fait de supprimer le glucose semble avoir un impact négatif sur la production de lactone, puisque celle-ci est considérablement diminuée.

Le milieu sans malt peut donc être choisi comme milieu de référence (MT2-malt) pour réaliser des cinétiques de croissance, de production, d'évolution du pH et de la concentration en glucose et en lactone sur ce milieu contenant ou non de la vinasse (figures 2B et 2C).

3. Production de la y-décalactone sur de la vinasse non complémentée
Après avoir mis en évidence que tous les éléments contenus dans le milieu vinasse standard ne sont pas indispensables au développement de la levure et à sa production de composés volatils, sa capacité à se développer et à produire sur de la vinasse non complémentée a été testée.

Pour cela des cinétiques de croissance et de production ont été réalisées sur de la vinasse pure et concentrée trois fois. Les résultats obtenus montrent que S. odorus est capable de se développer et de bioproduire dans ces conditions, c'est-à-dire sans aucun apport glucidique (figures 3 et 4). Au bout de 77 heures, les cultures atteignent une DO de 14,3. Cette DO permet d'affirmer que la levure se développe de manière satisfaisante, même si la DO reste inférieure à celle obtenue dans les conditions standards qui est de 18. En ce qui concerne la concentration de lactone, elle atteint respectivement 1,14 mg/l dans les conditions de référence et 1,02 mg/l sur de la vinasse non complémentée. II semble donc que les éléments contenus dans la vinasse suffisent à la croissance de S. odorus et au maintien de sa capacité de production.

Ainsi, aucun apport glucidique ne semble nécessaire à la production de lactone. Ces résultats sont contradictoires avec ceux précédemment présentés, mais ils seraient explicables par le fait qu'il devait y avoir, dans le milieu complémenté, des éléments susceptibles de limiter l'utilisation des acides organiques de la vinasse dans le métabolisme de synthèse des lactones, soit en réagissant avec eux, soit en favorisant par leur seule présence d'autres voies de synthèse.

4. Utilisation du potentiel en do gène de Sporobolomyces odorus à oxyder l'acide ricinoléique, intermédiaire métabolique de la synthèse de la ydécalactone
Afin d'améliorer la production de composés aromatiques, nous avons voulu tester la voie de la bioconversion. Cette stratégie est basée sur la capacité de Sporobolornyces odorus à utiliser l'acide ricinoléique comme précurseur dans le métabolisme de synthèse de la y-décalactone.

4.1. Impact, sur la production de lactone, d'une addition d'huile de ricin à la vinasse
La principale source d'acide ricinoléique est l'huile de ricin dans laquelle il représente environ 90% des acides gras et se trouve majoritairement sous forme de triglycérides.

Afin d'étudier l'impact de l'ajout d'huile de ricin sur la production de ydécalactone, nous avons réalisé les cultures suivantes:
- vinasse + 1,66 % (v/v) d'huile de ricin
- vinasse + 5 g/l de glucose + 1,66 % (v/v) d'huile de ricin
- vinasse + 10 g/l de glucose + 1,66 % (v/v) d'huile de ricin.

Les résultats obtenus montrent que l'apport d'huile de ricin dans le milieu ne perturbe pas le développement de S. odorus puisque dans tous les cas, la
DO atteinte au bout de 77 heures de culture est proche de 14 (figure 5).

En revanche, la production de y-décalactone est considérablement améliorée : elle passe de 1,02 mg/I à 6,47 mg/l, soit 6 fois plus (figure 6).

D'autre part, la production est légèrement accélérée sur les milieux complémentés en glucose mais les concentrations obtenues restent inférieures à celles atteintes sans glucose exogène (figure 6). 11 semble donc qu'un apport glucidique ne soit pas nécessaire à une bioconversion efficace de l'acide ricinoléique contenu dans l'huile de ricin.

4.2. Effet d'un apport de ricinoléate de méthyle sur la production de ydécalactone
Une seconde possibilité consiste à utiliser du ricinoléate de méthyle, c'est-à-dire l'ester de l'acide ricinoléique.

Afin de tester l'effet d'un apport de ricinoléate de méthyle à des cultures de S. odorus sur vinasse seule, 1 ml de ce précurseur a été ajouté à des suspensions cellulaires de 60 ml âgées de 24 heures. Le suivi de celles-ci a montré que si la production de biomasse est réduite (11,06 de DO au bout de 77 heures au lieu de 14,3 sur de la vinasse seule, figure 7) celle de ydécalactone est considérablement améliorée. En effet, au lieu d'une concentration finale, au bout de 77 heures, de 1,02 mg/l sur vinasse ou de 6,47 mg/l dans le cas où nous avions ajouté de l'huile de ricin, nous avons atteint des concentrations de 28,23 mg/l (figure 8). Ce résultat est explicable par le fait que l'enzyme lipolytique intervenant dans la dégradation des triglycérides n'est pas synthétisée de manière constitutive chez cette levure. Elle deviendrait donc rapidement limitante dans l'obtention d'acide ricinoléique libre à partir d'huile de ricin. L'ajout de ricinoléate de méthyle directement utilisable remédie à ce problème et permet d'améliorer les rendements de production de lactone.

5. Influence du facteur temps sur la production de y-décalactone
Ces résultats étant fort intéressants, nous avons cherché à savoir si les concentrations obtenues seraient augmentées en laissant les cellules se développer pendant 144 heures. II s'est avéré qu'au bout de 120 heures, le milieu renferme 36,78 mg/l de lactone et 72,24 mg/l au bout de 144 heures.

Autrement dit, en 1,8 fois plus de temps, la production est multipliée par 2,5.

Cette augmentation de la production coïncide avec l'arrêt de la croissance cellulaire qui se produit au bout de 72 à 77 heures de culture, et renforce l'hypothèse d'un découplage entre la production de lactone et celle de biomasse.

6. Influence de la quantité de ricin aléa te de méthyle ajoutée
Afin d'optimiser la quantité de ricinoléate de méthyle apportée, nous avons réalisé des cultures auxquelles nous avons ajouté au bout de 24 heures soit 0,83 %, soit 1,66 %, soit 10 % (v/v) de ricinoléate de méthyle. Les résultats obtenus (tableau 3) montrent que c'est en apportant 0,83 % (v/v) de cet ester que l'on obtient la teneur la plus élevée en y-décalactone dans la phase aqueuse et ce sans que la production de biomasse ne soit affectée.

Tableau 2: Influence de la quantité de ricinoléate de méthyle (RM)
apporté à des cultures de 60 ml au bout de 24 heures. les
mesures ont été faites après 77 heures de culture.

<tb>

Quantité <SEP> de <SEP> 0 <SEP> ml <SEP> 0,5 <SEP> ml <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> 6 <SEP> ml <SEP>
<tb> RM <SEP> ajoutée
<tb> DO <SEP> à <SEP> 620nm <SEP> 8,74 <SEP> 8,00 <SEP> 7,94 <SEP> 8,98
<tb> <SEP> Lactone <SEP> 1,02 <SEP> 32,22 <SEP> 27,24 <SEP> 18,78
<tb> <SEP> en <SEP> mg/l
<tb>
L'exploitation du potentiel de bioconversion du ricinoléate de méthyle en y-décalactone, sur de la vinasse non complémentée, par Sporobolomyces odorus présente manifestement un intérêt. En effet, grâce à un apport de 1,66 % (v/v) de ce précurseur, des concentrations de l'ordre de 45 mg/l de composé odorant sont obtenus en 144 h de culture, dont 16,9 mg/l en 77 h, ce qui constituait une nette amélioration de la production. Sans addition de précurseur la levure ne produisait que 0,95 mg/I d'arôme après 77h de culture.

Cette concentration était portée à 5,7 mg/l en présence de 1,66 % (v/v) d'huile de ricin exogène.

De plus, il a été montré que la production de y-décalactone augmentait avec l'apport de précurseur. En effet, lorsque l'apport de RM était de 0,83 %, la concentration de lactone après 77 h de culture était de 15,1 mg/l et de 32,5 mg/l lorsque l'addition de précurseur était de 10,0 %. L'effet inverse était observé sur le rendement de bioconversion, lequel diminue avec la quantité ajoutée de RM. Ceci est dû à un accroissement de la quantité résiduelle de
RM.

6.1 Optimisation de l'apport de ricinoléate de méthyle 6.1.1. Effet d'un apport précoce de précurseur
Dans les manipulations réalisées précédemment l'apport du précurseur était effectué après 24 h de culture. Les cellules devaient alors dans un premier temps adapter leur métabolisme à la bioconversion du RM.

Afin de déterminer si la présence précoce du précurseur permet d'améliorer la production en limitant ce temps d'adaptation, un apport initial de
RM a été réalisé.

Tableau 3 : Influence d'un apport précoce et fractionné de RM sur la croissance et la production de y-décalactone par S. odorus après 77 heures de culture.

<tb>

<SEP> Apport <SEP> de <SEP> RM <SEP> Témoin <SEP> 0,06 <SEP> % <SEP> à <SEP> t <SEP> = <SEP> 0 <SEP> h <SEP>
<tb> <SEP> (%vlv) <SEP> 0,83%àt=24h <SEP> 0,83%àt=24h <SEP>
<tb> <SEP> Biomasse <SEP> 8,0 <SEP> 8,4
<tb> (DO <SEP> à <SEP> 620 <SEP> nm)
<tb> [y-décalactone] <SEP> 15,1 <SEP> 47,7
<tb> <SEP> (mg/l)
<tb>
Les résultats obtenus, présentés dans le tableau 3, démontrent qu'un ajout de 0,06 % (v/v) de RM au temps 0, suivi d'une deuxième addition 24 h plus tard de 0,83 % (v/v), a permis d'améliorer de façon significative la production de lactone par rapport au témoin. La concentration de y-décalactone est multipliée par 3 après 77 h de culture.

6.1.2 Effet d'un apport fractionné de précurseur
A la suite des résultats précédents, I'optimisation du système a été entreprise en modifiant d'une part les quantités de RM ajoutées et d'autre part, les moments auxquels elles sont apportées au milieu de culture.

Dans les expériences conduites, les additions de précurseur ont été réalisées aux instants t=0, 24, 48 et 72 h. Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 9. Leur analyse a montré que ce fractionnement ne modifiait pas la croissance de la levure par rapport à un témoin mais favorisait considérablement les quantités de lactone produites. Au bout de 144 h, 142,7 mg/l ont été obtenus au lieu de 44,7 mg/I si l'ajout était fait en une seule fois.

Cette stratégie a permis d'atteindre des concentrations de 285 mg/l d'arôme au bout de 216 h.

De plus, ce mode d'apport du RM a permis de minimiser les quantités de précurseur nécessaires, et d'accroître la quantité de y-décalactone présente dans la phase aqueuse.

6.1.3- Recherche des quantités optimales de précurseur à apporter
Dans l'optique de déterminer la concentration de RM qui permet d'atteindre une concentration maximale de y-décalactone dans la phase aqueuse, des quantités variables de RM ont été apportées de manière fractionnée aux temps t = 0, 24, 48 et 72 h. Les résultats obtenus au bout de 96 h de culture sont présentés dans le tableau 4.

Tableau 4: Influence de la quantité de RM apportée sur la production de ydécalactone et le rendement de bioconversion par S. odorus. Les résultats présentés ont été obtenus après 96 h de culture. Les apports de RM ont été effectuésàt=0,24,48et72h.

<tb>

Quantité <SEP> de <SEP> 0,008 <SEP> 0,016 <SEP> 0,032 <SEP> 0,060 <SEP> 0,067 <SEP> 0,083 <SEP> 0;170
<tb> précurseur <SEP> ajoutée <SEP> (%
<tb> vlv) <SEP>
<tb> Total <SEP> ajouté <SEP> (% <SEP> v/v) <SEP> 0,033 <SEP> 0,066 <SEP> 0,132 <SEP> 0,240 <SEP> 0,268 <SEP> 0,322 <SEP> 0,680
<tb> [y-décalactone) <SEP> (phase <SEP> 59,7 <SEP> 102,0 <SEP> 111,0 <SEP> 96,8 <SEP> 84,2 <SEP> 93,5 <SEP> 53,5
<tb> aq.mg/l)
<tb> Rendement <SEP> apparent <SEP> 19,5 <SEP> 17,5 <SEP> 9,1 <SEP> 4,4 <SEP> 3,5 <SEP> 3,1 <SEP> 0,8
<tb> de <SEP> bioconversion <SEP> (%
<tb> mim)*
<tb> * (masse y-décalactone) phase gazeuse ---------------------------------------------------------- x 100
(masse RM) apportée
Le tableau 4 montre que:
- le rendement apparent de bioconversion diminue parallèlement à la teneur en ricinoléate de méthyle,
- les quantités de lactone produites augmentent parallèlement à la quantité de ricinoléate de méthyle exogène. Au-delà de 0,032 % (v/v), la teneur en y-décalactone diminue.

Ces évolutions peuvent être expliquées par:
- I'extraction de la lactone du milieu de culture est favorisée par le RM, composé dans lequel elle est plus soluble que dans le milieu de culture,
- le transfert du RM serait limité par une diminution de la surface d'échange due à sa coalescence qui augmente avec la quantité apportée,
- la quantité de RM résiduelle augmente avec l'apport de RM, ce qui abaisse le rendement de bioconversion observé,
- un effet toxique du RM qui augmente avec l'apport,
- un défaut dans la composition de la vinasse. En effet, il suffirait d'une carence en un oligo-élément pour que la synthèse de la lactone soit bloquée.

La validité de ces hypothèses a été vérifiée et fait l'objet des paragraphes à venir.

6.1.4 - Recherche du potentiel réel de bioconversion du RM en lactone par
S. odorus
Afin de déterminer avec quelle efficacité S. odorus est capable de bioconvertir le RM en y-décalactone, des cinétiques de croissance et de production ont été réalisées en apportant des quantités de précurseur limitantes. En effet, dans ces conditions, il n'y a pas de RM résiduel en fin de culture, comme le montrent les analyses chromatographiques, ce qui permet de déterminer le rendement de bioconversion réel. Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 10. Ils font apparaître que le rendement maximal obtenu était de 24%, alors que le rendement théorique est de 55 %. Il semble donc que tout le RM apporté ne soit pas utilisé uniquement pour la biosynthèse de y-décalactone, mais qu'il intervienne également dans d'autres métabolismes de la cellule.

A ce stade, il apparaît que: - L'apport séquencé de RM est préférable à une addition unique pour la production de y-décalactone, - un apport de RM en début de culture est également favorable à la production de lactone, - le potentiel réel de bioconversion du RM en lactone par S. odorus est de 24% dans les conditions de culture utilisées.

6.2 - La y-décalactone est-elle toxique?
Afin de déterminer si la y-décalactone est toxique pour les cellules, des cinétiques de croissance de la levure sur un milieu vinasse contenant soit 50 mg/l, soit 250 mg/I de lactone ont été réalisées (figure 11). La dose 50 mg/l de composé odorant n'affectait pas la croissance de la levure pendant les 50 premières heures de culture. Au delà, un décalage était observé. En revanche, en présence de 250 mg/l de lactone, la croissance du microorganisme était significativement inférieure. En effet, la DO maximale atteinte était de 4 au lieu de 15 dans le témoin. Ce même phénomène a déjà été observé par Feron et col. (1996) qui ont déterminé que la dose compatible avec un taux de croissance non nul des cellules est comprise entre 100 et 200 mg/l. Ceci expliquerait en partie pourquoi des concentrations de 250 à 300 mg/l de lactone n'ont pas été dépassées dans les conditions expérimentales retenues.

6.3 - Le transfert du RM est-il limitant?
Des cinétiques de croissance et de production de lactone sur un milieu vinasse ont été réalisées en faisant appel à un tensioactif, le Tween 20 (D, connu pour ses propriétés dispersantes. Celui-ci a été mélangé au RM dans les proportions un tiers-deux tiers (v/v). La solution obtenue a été ajoutée à raison de 0,09 % (v/v) au milieu vinasse aux temps t = 0, 24, 48 et 72 h.

Les figures 12 et 13 illustrent la production de biomasse et de ydécalactone respectivement. En ce qui concerne la croissance, celle-ci n'était pas affectée au cours des 48 premières heures de culture par la présence de
Tween 20 . Au delà un palier a été obtenu alors que les cellules continuaient de croître en l'absence de ce tensioactif.

La comparaison des concentrations de lactone mesurées dans la phase aqueuse avec et sans Tween 20 6D permet de mettre en évidence que la présence de cet élément augmente les quantités d'arôme présents dans cette phase : on mesure 220 mg/l de y-décalactone après 120 h de culture en présence de Tween 20 R et 135 mg/l dans le témoin, ce qui représente une augmentation de 63 %.

6.4 La composition du milieu présente-t-elle des carences ?
Afin de vérifier si le blocage de la synthèse de y-décalactone n'était pas dû à une carence en un ou plusieurs oligo-éléments, des cultures de 96 h sur des milieux ayant été complémentés ont été réalisées comme suit:
milieu 0: vinasse
milieu 1: vinasse ±0,01 g/l de FeSO4
- 0,13 g/l de CaCI2
- 3 g/l de MgSO4
milieu 2 : vinasse + 1 g/l d'extrait de levure.

A ces milieux, du ricinoléate de méthyle (4 fois 0,06 %) a été ajouté aux instants t = 0, 24, 48 et 72 h.

Les résultats obtenus au bout de 96 h de culture sont rassemblés dans le tableau 5. Leur observation suggère que la croissance et la production de lactone ne sont pas fondamentalement modifiées par les apports en sels et extraits de levure.

Tableau 5 : Influence de la complémentation du milieu vinasse sur la croissance et la production de y-décalactone par S. odorus. Les résultats présentés ont été obtenus après 96 h de culture.

<tb>

<SEP> Milieu <SEP> milieu <SEP> O <SEP> milieu <SEP> 1 <SEP> milieu <SEP> 2
<tb> <SEP> Biomasse <SEP> 15,8 <SEP> 12,1 <SEP> 14,8
<tb> (D.O. <SEP> à <SEP> 620 <SEP> nm)
<tb> y-décalactonel <SEP> 96,1 <SEP> 104,0 <SEP> 114,0
<tb> <SEP> (mil) <SEP>
<tb>
A ce stade, il apparaît que: - la composition de la vinasse n'est pas un élément susceptible de limiter la production de y-décalactone, - L'effet toxique de la y-décalactone observé au delà de 250 mg/l pourrait être à l'origine de la limitation de sa production par S. odorus, - L'effet positif du Tween 20 z sur la réaction de bioconversion suggère que la dispersion du RM pourrait améliorer la quantité de y-décalactone présente dans la phase aqueuse.

7 - Exemple de production de y-décalactone par Sporobolomyces odorus à partir de vinasses et de ricinoléate de méthyle en fermenteur
PREPARATION DU SUBSTRAT:
Après dissolution par chauffage et agitation des sels précipités, les particules solides contenues dans la vinasse brute sont séparées par centrifugation. Le pH de la vinasse est ajusté à 6 avec du NaOH 5 M et de l'antimousse (Stwktol) est ajouté à raison 0,01 % (v/v).

STERILISATION DU SUBSTRAT ET DU FERMENTEUR:
Le substrat ainsi obtenu est introduit dans le fermenteur où il est stérilisé à 120"C pendant 20 minutes sous 1,4 bars.

CULTURE DISCONTINUE:
Le fermenteur est ensemencé à une densité optique de 0,2 (lue à 620 nm) à partir d'une préculture. Du ricinoléate de méthyle stérile est ajouté à raison de 0,06 % (v/v) à différents temps après l'inititation de la culture, soit aux temps t = 0, 24, 48 et 72 heures. La température est régulée à 24"C, l'agitation à 500 rpm et l'aération à 0,4 VVM.

En variante, la culture peut être réalisée en continu.
Les paramètres de la réaction peuvent varier selon les indications suivantes données à titre d'exemple:
PARAMETRE INTERVALLE AVANTAGEUSEMENT
Température 10-50 C 20-40"C
Agitation 50-1000 rpm 100-700 rpm
Agitation 0,10-10 VVM 0,10-5 VVM
Aération 0,01-20% (v/v) 0,01-20 % (v/v)
BIBLIOGRAPHIE
Lee S.J., Lin S.J. et Chou C.C.: "Growth of and production of y-décalactone by
Sporobolomyces odorus in jar fermentor as affected by pH, aeration and fedbatch technique", Journal of fermentation and bioengineering, 82(1), 195-199 (1995).

Feron G., Dufosse L., Pierrard E., Bonnarme P., Le Quere J.L., Spinnler H.E.: "Production, identification, and toxicity of y-décalactone and 4-hydroxydecanoic acid from Sporidiobolus spp", Applied and environmental microbiology, 62(8), 2826-2831(1996).

Jourdain N., Goli T., Jallajeas J.C.: Aroma components production by immobilized cells. In Topic and flavour research, Eds Berger R.G., Nitz S.,
Shreier P., 1-2 April, München, D, 427-441 (1985).

Gallois A., Gross B., Langlois D.: Influence of culture conditions on production of flavour compounds by 29 lignolytic Basidiomyucetes. Mycol. Res., 94 (4), 494-504 (1990).

Claims (25)

REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation de composés d'intérêt économique (appelés "composés"), comprenant les étapes de

a) culture dans des conditions de fermentation, d'au moins un microorganisme choisi pour sa capacité à synthétiser lesdits composés, en présence d'un substrat comprenant un résidu issu de la distillation de produits de fermentation,

b) récupération des composés produits.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat comprend un résidu de la distillation du vin.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat est choisi parmi les résidus de distillation de produits de fermentation de fruits, de betteraves, de canne à sucre, de céréales, notamment de malt, d'orge, de blé.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le microorganisme est capable de produire des arômes.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le microorganisme est capable de produire des composés choisis parmi les acides aminés, les lipides, les glucides, les alcools, les nucléosides, ou dérivés.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le microorganisme est capable de produire des composés biologiquement actifs, en particulier des insecticides, des pesticides, des herbicides, des substances favorisant la croissance végétale.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le microorganisme est capable de produire des composés susceptibles de constituer des principes actifs de médicaments.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le microorganisme est une bactérie, une levure ou un champignon.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que l'étape de culture met en oeuvre au moins un microorganisme du genre Sporobolomyces odorus capable de produire des arômes et un substrat comprenant de la vinasse.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 4, 8 ou 9 pour la préparation d'arômes, comprenant les étapes de:

a) culture dans des conditions de fermentation aérobie, de S. odorus en présence d'un substrat comprenant de la vinasse, le pH du milieu étant compris entre 4 et 7, de préférence égal à environ 6, la température étant comprise entre 10 C et 500C,.de préférence voisine de 24"C,

b) récupération des arômes produits.

11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la vinasse est enrichie en composés glucidiques, notamment en glucose.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 4, 8 à 10, caractérisé en ce que l'étape de culture est réalisée en présence d'un précurseur favorisant la synthèse des composés recherchés.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 4, 8 à 12, caractérisé en ce que l'étape de culture est réalisée en présence d'acide ricinoléique ou de dérivé d'acide ricinoléique tels que des sels d'acide ricinoléique assimilable par le(les) microorganisme(s).

14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 4, 8 à 12, caractérisé en ce que l'étape de culture est réalisée en présence d'un ester d'acide ricinoléique, notamment en présence de ricinoléate de méthyle.

15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 4, 8 à 14 comprenant les étapes de:

a) culture de S. odorus en présence d'un substrat comprenant de la vinasse et du ricinoléate de méthyle, dans des conditions de fermentation aérobie, le pH du milieu étant compris entre 4 et 7 et la température étant comprise entre 10"C et 50"C le ricinoléate de méthyle étant introduit dans le milieu de culture de façon fractionnée au cours de l'étape de culture, jusqu'à atteindre une quantité comprise entre 0,03 et 0,7 % (v/v) à la fin de l'étape de culture,

b) récupération des composés produits.

16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'un apport de ricinoléate de méthyle est effectué précocément dès la mise en culture.

17. Procédé selon la revendication 15 ou la revendication 16, caractérisé en ce que la quantité de ricinoléate de méthyle introduite lors de l'étape de culture est fractionnée en au moins 4 apports.

18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisé en ce que la quantité de ricinoléate de méthyle introduite au cours de chaque apport est comprise entre 0,008 % (v/v) et 5 % (v/v), de préférence comprise entre 0,008 % (v/v) et 0,2 % (v/v), avantageusement entre 0,03 % (v/v) 0,10 % (v/v).

19. Procédé selon la revendication 18 caractérisé en ce que la quantité de ricinoléate de méthyle introduite au cours de chaque apport est voisine de 0,03 % (v/v).

20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 4, 8 à 19, caractérisé en ce que la quantité de ricinoléate de méthyle mise en oeuvre lors de l'étape de culture est telle que la quantité produite de y-décalactone est comprise entre 50 mg/l et 700 mg/l en phase aqueuse.

21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 4, 8 à 19, caractérisé en ce que l'étape de culture est réalisée sur une durée minimum de 24 heures.

22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, caractérisé en ce que la densité optique (DO à 620 nm) initiale des microorganismes apportés pour la réalisation de l'étape de culture est comprise entre 0,1 et 20, de préférence entre 0,2 et 15 avantageusement entre 1 et 15.

23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que la densité optique (DO à 620 nm) initiale des microorganismes apportés pour la réalisation de l'étape de culture est comprise entre 5 et 15 ou entre 5 et 10.

24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, caractérisé en ce que le milieu de culture comprend un tensioactif.

25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, Il à 13, 16 à 19, 21 à 24, caractérisé en ce que les microorganismes sont choisis parmi les suivants, le cas échéant après recombinaison

Sporobolomyces odorus, Yarrowia lipolytica, Saccharomyces cerevisiae,

Candida guillermondii, Candida utilis, Candida utiles, Lenzites betulina,

Penicillium chrysogenum, Penicillium sp., Penicillium citrinum, Aureobasidium pullulans, Fusarium sp., Tolypocladium inflatum, Coflolus versicolor, Beauveria bassiana, Puccinia chondrillinna, Fusarium monillforme, Cylindrocarpon ra dicicola, Lactococcus lactis, Bacillus, Aspergillus, Pseudomonas putida,

Bacillus ammoniagenes, Bacillus pumilus, Bacilllus cereus, Bacillus thuringiensis, Claviceps purpurea, Streptomyces diasta tic us, Streptomyces pla tensis, Streptomyces dimorphogenes, Streptomyces hygroscopicus,

Streptomyces cinnamonensis, Arthrobotrys inregularis.