WO1999054432A1 - Procede de production et d'extraction de composes aromatiques - Google Patents

Procede de production et d'extraction de composes aromatiques Download PDF

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WO1999054432A1
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aromas
culture
compounds
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Christian Ambid
Séverine CARLE
Gustavo De Billerbeck
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Revico
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to means for recovering residues from the distillation of fermentation products and in particular a process for the production of compounds of economic interest from these residues from the distillation of fermentation products. This production process also includes steps suitable for the extraction of these compounds.
  • the invention relates in particular to the recovery of distillation residues from fermentation products from the food industry.
  • these residues or by-products are used as substrates for the culture of microorganisms capable of developing and producing molecules of economic interest; these compounds are in particular molecules with high added value such as flavors, colors, enzymes, amino acids, lipids, carbohydrates, biologically active products in the therapeutic, food-processing or agricultural fields, etc.
  • Patent FR 2 705 971 describes a process for the production of R- ⁇ -decalactone comprising the culture of microorganisms of the genus Sporidiobolus or Fusu um in a culture medium containing a precursor of R- ⁇ -decalactone chosen from ricinoleic acid, lesberolic acid or the salts or esters with C1 to C3 alcohols of these acids.
  • the extraction of the R- ⁇ -decalactone produced is carried out during the culture, with an extraction solvent immiscible with water.
  • the inventors have, in the context of this invention, observed that residual products from the distillation of wine, and in particular Cognac wine (these residual products being designated in this specific case by the expression "vinasse”), are susceptible to constitute suitable substrates for the culture of microorganisms, with the aim of producing molecules of interest economic.
  • the present patent application therefore relates to a process for the preparation of compounds of economic interest from substrates constituted by or comprising residues from the distillation of fermentation products and the use of microorganisms for the implementation of this process.
  • the present application also relates to a process for extracting the compounds produced, said process being advantageously associated with the production process.
  • the extraction steps proposed according to the invention can follow the phase or phases of production of the compounds or be integrated into this phase.
  • the conditions chosen for the extraction are determined as a function of their influence on the production of the compounds, for example on the production yield.
  • the invention relates to a process for the preparation of compounds of economic interest (called “compounds”), comprising the steps of: a) culturing under aerobic fermentation conditions, at least one microorganism chosen for its ability to synthesize said said compounds, in the presence of a substrate comprising a residue from the distillation of fermentation products, b) recovery of the compounds produced.
  • the subject of the invention is in particular a process for the production of odorous volatile compounds (or flavors).
  • the invention provides a process which allows the formation of natural flavors.
  • fermentation can be carried out in an aerobic, anaerobic or mixed environment.
  • the substrate used for carrying out the process comprises, for example, a residue resulting from the distillation of fermentation products from plant organs (roots, tubers, etc.) or more generally from parts of plants.
  • the substrate placed work includes a residue from the distillation of wine and, for example, a residue from the distillation of Cognac or Armagnac wine. This residue is called "vinasse”.
  • Vinasses are the liquid by-product obtained from the still after distillation of the wine. Cognac is produced on lees and generates large volumes of vinasse: around two thirds of the volume of distilled wine. The vinasses no longer contain alcohol, and almost no more aromatic compounds, these being passed through the distillate. However, they contain a certain number of substances, and in particular non-negligible quantities of organic acids (7.55 to 10.05 g / l).
  • the average composition of the Cognac distillery vinasses is as follows:
  • Citric and malic acid 0.05 g / l
  • Glycerol for vinasse about 7g / l normal
  • COD is the Chemical Oxygen Demand, that is to say the quantity of oxygen necessary to oxidize the organic matter contained in the effluents.
  • BOD 5 is the Biological Oxygen Demand necessary, for 5 days, for microorganisms contained in water to oxidize part of the materials carbonaceous.
  • the tartaric acid of Cognac distillery vinasses is in the form of potassium bitartrate (KHC 4 H 4 O 6 ).
  • the substrate is chosen from the distillation residues of fermentation products of fruit, beets, sugar cane, cereals, in particular malt, barley, wheat , corn or rice.
  • the distillation residues of fermentation products from apple juice are the distillation residues of calvados
  • the distillation residues of fermentation products from sugar cane are the distillation residues of rum, etc.
  • the substrates thus defined taken in isolation or as a mixture, can be used to produce various compounds such as volatile odorous compounds (or flavors). Other compounds such as proteins, amino acids, lipids, carbohydrates, nucleosides, alcohols or derivatives of these compounds can be produced simultaneously with these flavors obtained according to the invention.
  • the substrates described can thus, depending on the microorganism chosen for the implementation of the process, generally allow the production of biologically active compounds.
  • the substrates defined in the context of the invention can be adapted for the culture of various microorganisms and in particular bacteria, yeasts, or fungi.
  • the defined method is characterized in that the culture step uses at least one yeast of the genus Sporobolomyces odorus capable of producing aromas, under culture conditions allowing the growth of said strain S. odorus and the production of aromas from a substrate comprising vinasse.
  • Sporobolomyces odorus is a strain of yeast known for its ability to produce aromas such as lactone, in particular ⁇ - decalactone.
  • the subject of the invention is therefore a process for the preparation of flavorings comprising the steps of a) cultivation under aerobic fermentation conditions of Sporobolomyces odorus in the presence of a substrate comprising vinasse, the pH of the medium being between 4 and 7, preferably equal to about 6, the reaction temperature being compatible with the growth of S. odorus. b) recovery of the aromas produced.
  • the process thus defined is advantageously carried out with stirring between 50 and 1000 rpm, preferably between 100 and 700 rpm and with aeration from 0.10 to 10 vvm, preferably from 0.10 to 5 vvm.
  • the temperature of the culture step can vary depending on the strain (s) of microorganisms used.
  • the culture is carried out at a temperature between 10 and 50 ° C, preferably between 20 and 40 ° C, advantageously close to 24 ° C; this temperature is regulated to be kept essentially constant.
  • the recovery of the aromas produced can be carried out continuously by solid-liquid extraction.
  • the stages of recovery of the compounds produced comprises a stage by which the medium constituted by the culture defined above carried out in aqueous phase, is brought into contact with a medium in lipid phase, for a time sufficient to allow the absorption in the lipid phase of all or part of the compounds products, the medium in the lipid phase being solid at room temperature.
  • the invention proposes in this regard the use of lipid media comprising or consisting of vegetable fats or mixtures of vegetable fats.
  • lipid media comprising or consisting of vegetable fats or mixtures of vegetable fats.
  • HNCH hydrogenated coconut oil
  • TTT Fluka Chemie AG
  • triolein 20%
  • a vegetable fat suitable for carrying out the invention has the property of being odorless, slightly oxidizable in particular to avoid the formation of the "rancid" odor and insoluble at low temperature (notably below 0 ° C. at -20 ° C) in ethanol.
  • the invention has demonstrated that an appropriate extraction system is advantageously based on a phase balance between the aqueous phase and the lipid phase, in order to improve both the viability of the microorganisms and the production of compounds, in particular aromas.
  • the aromas produced are essentially dissolved in the culture medium which is an aqueous phase. Their partition coefficients being more favorable for a lipid phase, the separation of the aromas from the fermentation medium can be carried out by solid-liquid extraction using a solid oil at room temperature (or vegetable fat). The aromas produced are thus recovered and concentrated in the solid oil in which they are absorbed. It is also possible to obtain the aromas in an alcoholate, that is to say, in solution in ethanol. To do this, the solid oil containing the odorous compounds is dissolved in ethanol. The mixture is then advantageously cooled to between -5 and -20 ° C, for example in melting ice, to separate the solid oil from the alcoholate which contains the aromas in solution. The latter can then be distilled to purify the odorous compounds.
  • Vegetable fat can be made up of a mixture of vegetable fat.
  • the substrate used can be optionally enriched to promote the growth of the microorganism strains and / or to promote the production of the desired compounds.
  • an enrichment in carbohydrate compounds and in particular in glucose will be used.
  • the enrichment may alternatively or in addition take into account all the compounds participating in the formation of aromas, such as organic or mineral compounds, in particular metals, for example zinc, magnesium or manganese.
  • the method may also include the use, during the culture step, of a precursor capable of promoting the production of the desired compounds, in particular of a precursor used for bioconversion, by the microorganism (s) ) used.
  • the method is characterized in that the stage of culture of Sporobolomyces odorus is carried out in the presence of selected substrates and ricinoleic acid or derivatives of ricinoleic acid, for example an ester, which can be assimilated by the microorganism (s).
  • the microorganism chosen is S. odorus and the precursor is an ester of ricinoleic acid such as methyl ricinoleate.
  • the inventors have observed that the implementation of the process leads to a particularly high level of production of the desired compounds, when the incorporation of the precursor and in particular of methyl ricinoleate in the culture medium is carried out in fractionated form throughout the culture stage.
  • This fractionation makes it possible to increase the production of desired compounds present in the aqueous phase.
  • this fractionation can take account of stages of extraction of the produced compounds interspersed with the contributions in precursors.
  • the inventors have found that a contribution of precursor and in particular of methyl ricinoleate, within the framework of carrying out the process, is advantageously carried out early during the culture step and preferably as soon as it is placed in culture, this contribution being advantageously renewed in quantities, equal or different, at different times later during the culture step.
  • the supply of precursor and in particular of methyl ricinoleate can be divided into four supplies, when the duration of the culture is for example close to 3 days.
  • the process of the invention is characterized in a particular embodiment, in that the amount of methyl ricinoleate introduced during each supply is between 0.008% (v / v) and 5% (v / v), preferably between 0.008% (v / v) and 0.2% (v / v), advantageously between 0.03% and 0.10% (v / v), preferably close to 0.03% (v / v ) or advantageously around 0.18% (V / V) when the extraction is carried out with vegetable fats.
  • the amount of methyl ricinoleate introduced into the culture can be adjusted according to the desired result.
  • the amount of methyl ricinoleate introduced during each addition is close to 0.07% (v / v) until a total amount added of between 0.1% (v / v) and 5% (v / v), advantageously between 0.03 and 0.7% (v / v) or 0.1% (V / V) and 0.7 (VA) at the end of culture.
  • this quantity is close to 5% (V / V) at the end of the culture.
  • the various parameters for optimizing the process will be optimized as a function of the quantity of compounds that one seeks to produce and when these compounds are aromas such as ⁇ -decalactone; these parameters can be chosen so as to produce between 50 mg / l and 1 g / l, for example between 50 mg / l and 700 mg / l, in particular between 50 mg / l and 150 mg / l of ⁇ -decalactone in phase aqueous.
  • the total amount and the amount of each fraction of added precursor is determined according to its influence on the bioconversion reaction, the possible toxicity of the compounds produced on the development of the strains of microorganisms and according to the duration of the culture step.
  • the method of the invention is thus characterized in that the cultivation step can be carried out for a variable duration and in particular can be carried out for a duration of between a few hours and several days, for example up to 10 days, in particular a minimum duration of 24 hours, in particular a duration between 24 and 72 hours.
  • an initial cell density (OD at 620 nm) of the microorganisms provided is used between 0.1 and 20, preferably between 0, 2 and 15 advantageously between 1 and 15.
  • the initial optical density of the microorganisms provided for carrying out the culture step is between 5 and 15 or between 5 and 10.
  • surfactants such as Tween 20® or anti-foaming agents will advantageously be used.
  • the inventors have observed that the production of flavors and in particular of ⁇ -decalactone is improved by the contribution of these surfactants or anti-foaming agents and that the initial cell density (initial biomass) influences this improvement and that the availability of the precursor in the phase aqueous varies the level of ⁇ -decalactone production.
  • substrates of the invention can be varied and can in particular be chosen from the following strains, where appropriate after recombination, capable of giving rise to the production of the compounds identified below:
  • Cylindrocarpon radicicola steroids Lactococcus lactis aromas Aspergillus enzymes aromas, Bacillus enzymes aromas, aromas
  • ATCC under the reference 8661 is used as an example.
  • the substrate used for the culture of the microorganisms is sterilized by any suitable means and for example in an autoclave, before the cultivation. If necessary, the substrate can be used without prior sterilization.
  • the step of recovering the products formed can be carried out in any suitable manner and in particular the products obtained can be isolated and purified by extraction with a solvent, by distillation, by solid-liquid extraction, by coupled gas-liquid extraction. to one 11
  • cryocondensation by supercritical fluids, by membrane processes, in particular perstraction and pervaporation or by chromatographic separation, in particular HPLC, as well as by combinations of these separation techniques.
  • the recovery of the compounds can be carried out at the end of the culture step or several times, by interrupting the culture step at determined times for example according to the quantity produced of compounds and in particular to take account of the toxicity of the compounds produced with respect to microorganisms in the culture medium.
  • recovery can be carried out in situ, in particular when the compounds produced can have a certain level of toxicity with respect to the microorganisms used.
  • the latter can be carried out in the same compartment as that of the production, for example in the same tank, or on the contrary these two stages can be separated spatially.
  • the extraction step carried out continuously with the production of the compounds can influence the yield of the reaction.
  • a precursor depending on its partition coefficient and its concentration in the lipid phase, its availability in the aqueous phase can be affected, consequently reducing its use by the microorganism (s).
  • the extraction can also favor the production of the compounds since the extraction carried out continuously or in a determined manner alternating with the production, reduces the possible toxic activity of the compounds produced with respect to the microorganism (s) of the medium. culture.
  • the extraction of the compounds produced by absorption in vegetable fat is followed by a separation of the compounds, in particular of the aromas produced by means of an alcohol.
  • a separation of the compounds in particular of the aromas produced by means of an alcohol.
  • the invention also relates to the aroma extraction process, implemented independently of the aroma production step.
  • This extraction process comprises bringing the medium in aqueous phase containing the flavors into contact with a medium in the lipid phase for a time sufficient to allow the absorption of all or part of the flavors in the lipid phase, this process being characterized in that the medium in the lipid phase is a solid medium at room temperature.
  • Figure 1A Relationship between biomass (expressed in g / l of dry matter) and cell density (OD at 620 nm). 13
  • Figure 1 B Relationship between the biomass (expressed in g / l of dry matter) and the volume of mycelium.
  • Figure 2A State of cultures of S. odorus aged 77 hours on different vinasse-based media.
  • Figure 2B Kinetics of growth and development of S. odorus on MT2-malt.
  • Figure 2C Growth and development kinetics of S. odorus on MV2-malt.
  • Figure 9 Growth and production kinetics of ⁇ -decalactone in S. odorus after fractional additions of methyl ricinoleate.
  • the arrow indicates when the precursor was added.
  • Figure 10 Growth, ⁇ -decalactone production and bioconversion yield by cultivated S. odorus after fractional additions of methyl ricinoleate.
  • the arrow indicates when the precursor was added.
  • the arrow indicates when the precursor was added.
  • FIG. 13 Impact of a simultaneous supply of Tween 20 and RM on the production of ⁇ -decalactone.
  • the arrow indicates when the precursor was added.
  • i indicates when the RM additions were made.
  • Biomass ⁇ [ ⁇ -decalactone] i indicates the time when the additions of RM were made.
  • the Sporobolomyces odorus strain used is the strain deposited under the reference CBS 2636. 1.2 THE LENZITES BETULINA STRAIN
  • the strain used is the strain deposited under the reference MIC 38.
  • Two culture media were tested in order to determine which one allows the best production of ⁇ -decalactone. These media can be used as control media for testing the substrates.
  • the first of these media has the following composition (JOURDAIN, 1985): - 30 g / l of glucose
  • the second medium used (FERON, 1996) is formulated as follows: - 1 g / l of glucose
  • the Sporobolomyces odorus strain was stored on a petri dish at 4 ° C.
  • an MT2 type medium was used. 15 g / l of agarose were added (JOURDAIN, 1985). The medium thus obtained was autoclave 20 minutes at 120 ° C.
  • the pH was adjusted to 4.8 using 5 N sodium hydroxide in the case of LMV and HCM N in the case of LMT. 18
  • Lenzites betulina was stored at 4 ° C on petri dishes containing a medium prepared as follows:
  • BIOMASS PRODUCED 111.1 CASE OF SPOROBOLOMYCES ODORUS
  • the odorous volatile compounds must be extracted from the medium.
  • the liquid-liquid extraction method with an organic solvent was used with pentane (C 5 H 12 ). This technique is based on the immiscibility of the solvent with the culture medium which is aqueous, and on the superior affinity that aromatic molecules have for it. Thus, the free volatile compounds pass from the aqueous phase to the organic phase.
  • the technique known as the internal standard was used. This method is based on the use of pentane containing an aromatic compound to carry out the extraction.
  • the chosen compound must have the following characteristics: - be added at a known concentration,
  • the internal standard used was geraniol, at a concentration of 30 mg / l.
  • the first assays of the organic extracts showed that the quantities of volatile compounds present were insufficient to allow reliable measurements.
  • the samples were concentrated approximately 5 times. For this, a very low flow of dry air was used. Upon contact, the highly volatile solvent evaporated while the odorous molecules concentrated in the remaining volume. It is considered that the compounds produced by the microorganisms do not evaporate, or else that they evaporate in the same proportions as the internal standard.
  • chromatograph HEWLETT PACKARD HP 5890 Series II, fitted with a capillary column of fused silica impregnated with Carbowax 20M (polymerized polyethylene glycol) 25 m in length and 0.25 mm in diameter.
  • Carbowax 20M polymerized polyethylene glycol
  • composition of the medium used was optimized to determine whether the vinasse could serve as a substrate for the production of lactone.
  • the formulation of the medium has been modified by eliminating certain compounds: - vinasse medium without malt extract
  • the malt-free medium can therefore be chosen as a reference medium (MT2-malt) for carrying out growth, production, pH evolution and glucose and lactone concentration kinetics on this medium, whether or not containing vinasse. ( Figures 2B and 2C).
  • the main source of ricinoleic acid is castor oil in which it represents about 90% of fatty acids and is mainly found in the form of triglycerides.
  • carbohydrate is not necessary for effective bioconversion of the ricinoleic acid contained in castor oil.
  • a second possibility consists in using methyl ricinoleate, that is to say the ester of ricinoleic acid.
  • Table 2 Influence of the amount of methyl ricinoleate (RM) supplied to 60 ml cultures after 24 hours, the measurements were made after 77 hours of culture.
  • RM methyl ricinoleate
  • Table 3 Influence of an early and fractionated supply of RM on the growth and production of ⁇ -decalactone by S. odorus after 77 hours of culture.
  • this mode of supplying the RM has made it possible to minimize the quantities of precursor necessary, and to increase the quantity of ⁇ -decalactone present in the aqueous phase.
  • the results obtained after 96 h of culture are presented in Table 4.
  • the extraction of the lactone from the culture medium is favored by the RM, compound in which it is more soluble than in the culture medium, - the transfer of the RM would be limited by a reduction in the exchange surface due to its coalescence which increases with the quantity supplied,
  • Figures 12 and 13 illustrate the production of biomass and ⁇ -decalactone respectively. With regard to growth, this was not affected during the first 48 hours of culture by the presence of
  • cultures of 96 h on media having been supplemented were carried out as follows: medium 0: vinasse medium 1: vinasse + -0.01 g / l of FeS0 - 0.13 g / l of CaCl 2 - 3 g / l of MgS0 4 medium 2: vinasse + 1 g / l of yeast extract.
  • medium 0 vinasse medium 1: vinasse + -0.01 g / l of FeS0 - 0.13 g / l of CaCl 2 - 3 g / l of MgS0 4
  • medium 2 vinasse + 1 g / l of yeast extract.
  • Table 5 Influence of complementation of the vinasse medium on the growth and production of ⁇ -decalactone by S. odorus. The results presented were obtained after 96 h of culture.
  • composition of the vinasse is not an element liable to limit the production of ⁇ -decalactone
  • toxic effect of ⁇ -decalactone observed beyond 250 mg / l could be at the origin of the limitation of its production by S. odorus, 34
  • the solid particles contained in the crude vinasse are separated by centrifugation.
  • the pH of the vinasse is adjusted to 6 with 5 M NaOH and antifoam (Struktol®) is added at 0.01% (v / v).
  • the substrate thus obtained is introduced into the fermenter where it is sterilized at 120 ° C for 20 minutes at 1.4 bars.
  • the fermenter is seeded at an optical density of 0.2 (read at 620 nm) from a preculture.
  • Sterile methyl ricinoleate is added at a rate of
  • the culture can be carried out continuously.
  • the parameters of the reaction can vary according to the following indications given by way of example: 35
  • the extraction substance used is an oil, an equilibrium is established between the aqueous and lipid phases. Given the consumption by the cells of RM in the aqueous phase, there is a transfer of the precursor from the lipid phase to the aqueous phase.
  • HNCH hydrogenated coconut oil
  • TTT solid fat
  • the RM being lipid, it also dissolves in the HNCH.
  • FIG. 14 show that the growth kinetics of the yeast are identical, whether the additions of RM are 4 ⁇ 0.03, 0.06 or
  • the solid fat used (hydrogenated coconut oil) therefore proves to be a good system for extracting ⁇ -decalactone.
  • the total lactone production (Table II) is improved by the presence of Struktol ® and to a lesser extent by the supply of Tween 20 ® when the initial cell density is 0.2.
  • the influence of these adjuvants on the ⁇ -decalactone differs total production in tests with a cell seeding 4. Indeed, in the latter case, the concentration of the lactone obtained in the presence of Struktol ® (990 mg / L) East 39
  • the TTT vegetable fat mixture has been tested as an in situ extraction system for ⁇ -decalactone.
  • a culture of initial cell density of 4 provided with TTT (5 g / vial) is added with 0.18% (v / v) of RM, 0.01% (v / v) of Tween 20® and 0.01 (v / v) of Struktol ® .
  • Lee SJ, Lin SJ and Chou CC "Growth of and production of ⁇ -décalactone by Sporobolomyces odorus in jar fermentor as affected by pH, aeration and fed-batch technique", Journal of fermentation and bioengineering, 82 (1), 195- 199 (1995).
  • Dufossé L.H. et al Strategies to overcome toxicity during favor production by micro-organisms: the case of ⁇ -décalactone from Sporidiobolus salmonicolor. International Symposium on Flavors and Sensory Related Aspects March 6-7, 1997.

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Abstract

Procédé de préparation de composés d'intérêt économique (appelés 'composés'), comprenant les étapes de: a) culture dans des conditions de fermentation, d'au moins un microorganisme choisi pour sa capacité à synthétiser lesdits composés odorants volatils (dits arômes), en présence d'un substrat comprenant un résidu issu de la distillation de produits de fermentation de parties de plantes, d'organes végétaux par exemple, b) récupération des composés produits.

Description

PROCEDE DE PRODUCTION ET D'EXTRACTION DE COMPOSES
AROMATIQUES.
La présente invention a pour objet des moyens de valorisation de résidus de distillation de produits de fermentation et en particulier un procédé pour la production de composés d'intérêt économique à partir de ces résidus de distillation de produits de fermentation. Ce procédé de production comprend également des étapes adaptées à l'extraction de ces composés.
L'invention concerne en particulier la valorisation des résidus de distillation de produits de fermentation issus de l'industrie agro-alimentaire.
Dans le cadre de l'invention, ces résidus ou sous-produits sont utilisés comme substrats pour la culture de microorganismes capables de se développer et de produire des molécules d'intérêt économique ; ces composés sont en particulier des molécules à haute valeur ajoutée telles que des arômes, des colorants, des enzymes, des acides aminés, des lipides, des glucides, des produits biologiquement actifs dans le domaine thérapeutique, agro-alimentaire ou pour l'agriculture, etc.
Le brevet FR 2 705 971 décrit un procédé de production de R-γ- décalactone comprenant la culture de microorganismes du genre Sporidiobolus ou Fusu um dans un milieu de culture contenant un précurseur de la R-γ- décalactone choisi parmi l'acide ricinoléique, l'acide lesquérolique ou les sels ou les esters avec des alcools en C1 à C3 de ces acides. L'extraction de la R-γ- décalactone produite est réalisée durant la culture, avec un solvant d'extraction non miscible avec l'eau. Les inventeurs ont, dans le cadre de cette invention, observé que des produits résiduels de la distillation du vin, et en particulier du vin de Cognac (ces produits résiduels étant désignés dans ce cas spécifique par l'expression "vinasse"), sont susceptibles de constituer des substrats appropriés pour la culture de microorganismes, dans le but de produire des molécules d'intérêt économique.
La présente demande de brevet a donc pour objet un procédé de préparation de composés d'intérêt économique à partir de substrats constitués par ou comprenant des résidus de distillation de produits de fermentation et l'utilisation de microorganismes pour la mise en oeuvre ce de procédé.
La présente demande a également pour objet un procédé d'extraction des composés produits, ledit procédé étant avantageusement associé au procédé de production. Ainsi, les étapes d'extraction proposées selon l'invention peuvent suivre la ou les phases de production des composés ou être intégrées à cette phase. Le cas échéant, les conditions choisies pour l'extraction sont déterminées en fonction de leur influence sur la production des composés, par exemple sur le rendement de production.
Ainsi l'invention concerne un procédé de préparation de composés d'intérêt économique (appelés "composés"), comprenant les étapes de : a) culture dans des conditions de fermentation aérobie, d'au moins un microorganisme choisi pour sa capacité à synthétiser lesdits composés, en présence d'un substrat comprenant un résidu issu de la distillation de produits de fermentation, b) récupération des composés produits. L'invention a pour objet en particulier, un procédé pour la production de composés volatils odorants (ou arômes).
De façon avantageuse, l'invention fournit un procédé qui permet la formation d'arômes naturels.
Pour l'étape de culture, la fermentation peut être réalisée en milieu aérobie, anaerobie ou mixte. Le substrat mis en oeuvre pour la réalisation du procédé comprend par exemple un résidu issu de la distillation de produits de fermentation d'organes végétaux (racines, tubercules...) ou plus généralement de parties de plantes.
Selon un premier mode de réalisation du procédé, le substrat mis en oeuvre comprend un résidu de la distillation du vin et, à titre d'exemple, un résidu de la distillation du vin de Cognac ou d'Armagnac. Ce résidu est appelé "vinasse".
Les vinasses sont le sous-produit liquide obtenu en sortie d'alambic après distillation du vin. L'élaboration du Cognac est réalisée sur lies et génère de gros volumes de vinasse : environ deux tiers du volume de vin distillé. Les vinasses ne contiennent plus d'alcool, et quasiment plus de composés aromatiques, ceux-ci étant passés dans le distillât. Elles contiennent cependant un certain nombre de substances, et notamment des quantités non négligeables d'acides organiques (7,55 à 10,05 g/l).
La composition moyenne des vinasses de distillerie de Cognac est la suivante :
pH 3,5
Matières solubles 1 g/i
Matières dissoutes 30 g/l
Cendres 3 g/l
DCO 30 g/l
DBO5 20 g/l
Azote total 0,5 g/l
P2O5 0,6-0,5 g/l
K2O 2-3 g/l
Figure imgf000005_0001
Cl 0,03 g/l
Acide tartrique 5-6 g/l
Acide succinique 0,5-1 g/l
Acide lactique 2-3 g/l
Acide citrique et malique 0,05 g/l
Total 7,55-10,05 g/l
Glycérol, pour vinasse environ 7g/l normale
La DCO est la Demande Chimique en Oxygène, c'est-à-dire la quantité d'oxygène nécessaire pour oxyder les matières organiques contenues dans les effluents.
La DBO5 est la Demande Biologique en Oxygène nécessaire, pendant 5 jours, aux microorganismes contenus dans l'eau pour oxyder une partie des matières carbonées.
L'acide tartrique des vinasses de distillerie de Cognac est sous forme de bitartrate de potassium (KHC4H4O6).
Alternativement, selon un autre mode de réalisation de l'invention, le substrat est choisi parmi les résidus de distillation de produits de fermentation de fruits, de betteraves, de canne à sucre, de céréales, notamment de malt, d'orge, de blé, de maïs ou de riz.
A titre d'exemple, les résidus de distillation de produits de fermentation du jus de pomme sont les résidus de distillation du calvados, les résidus de distillation de produits de fermentation de la canne à sucre sont les résidus de distillation du rhum, etc.
Les substrats ainsi définis, pris isolément ou en mélange, peuvent être utilisés pour produire différents composés tels que des composés odorants volatils (ou arômes). Peuvent être produits simultanément à ces arômes obtenus selon l'invention, d'autres composés comme des protéines, des acides aminés, des lipides, des glucides, des nucléosides, des alcools ou des dérivés de ces composés. Les substrats décrits peuvent ainsi, en fonction du microorganisme choisi pour la mise en oeuvre du procédé, permettre de façon générale la production de composés biologiquement actifs. Les substrats définis dans le cadre de l'invention peuvent être adaptés pour la culture de microorganismes variés et en particulier de bactéries, de levures, ou de champignons.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé défini est caractérisé en ce que l'étape de culture met en oeuvre au moins une levure du genre Sporobolomyces odorus capable de produire des arômes, dans des conditions de culture permettant la croissance de ladite souche S. odorus et la production d'arômes à partir d'un substrat comprenant de la vinasse.
Sporobolomyces odorus est une souche de levure connue pour sa capacité à produire des arômes tels que la lactone, en particulier la γ- décalactone.
L'invention a donc pour objet un procédé pour la préparation d'arômes comprenant les étapes de a) culture dans des conditions de fermentation aérobie de Sporobolomyces odorus en présence d'un substrat comprenant de la vinasse, le pH du milieu étant compris entre 4 et 7, de préférence égal à environ 6, la température de la réaction étant compatible avec la croissance de S. odorus. b) récupération des arômes produits.
Le procédé ainsi défini est avantageusement réalisé sous agitation entre 50 et 1000 rpm, de préférence entre 100 et 700 rpm et avec une aération de 0,10 à 10 vvm, de préférence de 0,10 à 5 vvm.
La température de l'étape de culture peut varier selon la(les) souches de microorganismes utilisées. Pour Sporobolomyces odorus. la culture est effectuée à une température comprise entre 10 et 50°C, de préférence entre 20 et 40°C, avantageusement voisine de 24°C ; cette température est régulée pour être maintenue essentiellement constante.
La récupération des arômes produits peut être réalisée en continu par extraction solide-liquide.
Les produits obtenus, parmi lesquels des arômes, peuvent être isolés et purifiés par extraction par un solvant, par distillation, par extraction solide- liquide, par extraction gaz-liquide couplée à une cryocondensation, par fluides supercritiques, par des procédés membrannaires, en particulier la perstraction et la pervaporation ou par séparation chromatographique, en particulier HPLC, ainsi que par des combinaisons de ces techniques séparatives. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'étape de récupération des composés produits comprend une étape par laquelle le milieu constitué par la culture ci-dessus définie réalisée en phase aqueuse, est mis en contact avec un milieu en phase lipidique, pendant un temps suffisant pour permettre l'absorption dans la phase lipidique, de tout ou partie des composés produits, le milieu en phase lipidique étant solide à température ambiante.
L'invention propose à cet égard l'utilisation de milieux lipidiques comprenant ou constitués par des graisses végétales ou des mélanges de graisses végétales. A titre d'exemples, on citera l'huile de noix de coco hydrogénée (HNCH) (Végétaline de Lesieur), le TTT (Fluka Chemie AG) constitué par un mélange de tripalmitine (40%) tristéarine (40%) et trioléine (20%). De façon générale, une graisse végétale adaptée pour la réalisation de l'invention a la propriété d'être inodore, faiblement oxydable notamment pour éviter la formation de l'odeur de "rance" et insoluble à basse température (inférieure à 0°C notamment à -20°C) dans l'éthanol.
L'invention a mis en évidence qu'un système d'extraction approprié, est avantageusement fondé sur un équilibre de phases entre phase aqueuse et phase lipidique, afin d'améliorer à la fois la viabilité des microorganismes et la production de composés, en particulier d'arômes. Les arômes produits se trouvent essentiellement dissous dans le milieu de culture qui est une phase aqueuse. Leurs coefficients de partage étant plus favorables pour une phase lipidique, la séparation des arômes du milieu de fermentation peut être réalisée par extraction solide-liquide utilisant une huile solide à température ambiante (ou graisse végétale). Les arômes produits sont ainsi récupérés et concentrés dans l'huile solide dans laquelle ils sont absorbés. Il est aussi possible d'obtenir les arômes dans un alcoolat, c'est à dire, en solution dans de l'éthanol. Pour ce faire, l'huile solide contenant les composés odorants est solubilisée dans de l'éthanol. Le mélange est ensuite refroidi avantageusement entre -5 et -20°C par exemple dans de la glace fondante, pour séparer l'huile solide de l'alcoolat qui contient les arômes en solution. Ce dernier peut être ensuite distillé pour purifier les composés odorants.
La graisse végétale peut être constituée par un mélange de graisses végétales. Le substrat utilisé peut être le cas échéant enrichi pour favoriser la croissance des souches de microorganismes et/ou pour favoriser la production des composés recherchés. Par exemple, on aura recours à un enrichissement en composés glucidiques et notamment en glucose. L'enrichissement pourra alternativement ou de façon complémentaire prendre en compte tous composés participant à la formation d'arômes, tels que des composés organiques ou minéraux, notamment des métaux, par exemple le zinc, le magnésium ou le manganèse.
Le procédé peut également comprendre la mise en oeuvre, lors de l'étape de culture, d'un précurseur susceptible de favoriser la production des composés recherchés, en particulier d'un précurseur utilisé pour la bioconversion, par le(les) microorganisme(s) utilisé(s).
Ainsi, selon le mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé est caractérisé en ce que l'étape de culture de Sporobolomyces odorus est réalisée en présence de substrats choisis et d'acide ricinoléique ou de dérivés d'acide ricinoléique, par exemple d'un ester, assimilables par le(les) microorganisme(s).
De façon particulièrement intéressante, lorsque le substrat est la vinasse, le microorganisme choisi est S. odorus et le précurseur est un ester d'acide ricinoléique tel que le ricinoléate de méthyle.
Les inventeurs ont observé que la mise en oeuvre du procédé conduit à un niveau de production des composés recherchés particulièrement élevé, lorsque l'incorporation du précurseur et en particulier du ricinoléate de méthyle dans le milieu de culture est réalisée sous forme fractionnée tout au long de l'étape de culture.
Ce fractionnement permet d'augmenter la production de composés recherchés présents dans la phase aqueuse.
Le cas échéant, ce fractionnement peut tenir compte d'étapes d'extraction des composés produits intercalées avec les apports en précurseurs.
Par ailleurs, les inventeurs ont constaté qu'un apport de précurseur et en particulier en ricinoléate de méthyle, dans le cadre de la réalisation du procédé, est avantageusement effectué précocement lors de l'étape de culture et de préférence dès la mise en culture, cet apport étant avantageusement reconduit en quantités, égales ou différentes, à différents moments ultérieurement au cours de l'étape de culture.
Par exemple, l'apport en précurseur et en particulier en ricinoléate de méthyle peut être fractionné en quatre apports, lorsque la durée de la culture est par exemple voisine de 3 jours.
Le procédé de l'invention est caractérisé dans un mode de réalisation particulier, en ce que la quantité de ricinoléate de méthyle introduite au cours de chaque apport est comprise entre 0,008 % (v/v) et 5 % (v/v), de préférence comprise entre 0,008 % (v/v) et 0,2 % (v/v), avantageusement entre 0,03 % et 0,10 % (v/v), de préférence voisine de 0,03 % (v/v) ou avantageusement voisine de 0,18% (V/V) quand l'extraction est réalisée avec des graisses végétales.
La quantité de ricinoléate de méthyle introduite dans la culture peut être aménagée en fonction du résultat recherché. Avantageusement, la quantité de ricinoléate de méthyle introduite au cours de chaque apport est voisine de 0,07 % (v/v) jusqu'à l'obtention d'une quantité totale ajoutée comprise entre 0,1 % (v/v) et 5 % (v/v), avantageusement entre 0,03 et 0,7 % (v/v) ou 0,1 % (V/V) et 0,7 (VA ) en fin de culture. En particulier, quand l'extraction est réalisée au moyen de graisses végétales, cette quantité est voisine de 5 % (V/V) en fin de culture.
Pour la culture avec Sporobolomyces odorus. on optimisera les différents paramètres pour la réalisation du procédé en fonction de la quantité de composés que l'on cherche à produire et lorsque ces composés sont des arômes tels que la γ-décalactone ; ces paramètres peuvent être choisis de façon à produire entre 50 mg/l et 1 g/l, par exemple entre 50 mg/l et 700 mg/l, notamment entre 50 mg/l et 150 mg/l de γ-décalactone en phase aqueuse.
De façon générale, la quantité totale et la quantité de chaque fraction de précurseur ajouté est déterminée en fonction de son influence sur la réaction de bioconversion, de la toxicité éventuelle des composés produits sur le développement des souches de micro-organismes et en fonction de la durée de l'étape de culture.
Le procédé de l'invention est ainsi caractérisé en ce que l'étape de culture peut être réalisée pendant une durée variable et en particulier peut être conduite pendant une durée comprise entre quelques heures et plusieurs jours, par exemple jusqu'à 10 jours, notamment une durée minimum de 24 h, en particulier une durée comprise entre 24 et 72 heures.
Avantageusement, pour optimiser les paramètres de la réalisation du procédé, on utilise une densité cellulaire (DO à 620 nm) initiale des microorganismes apportés pour la réalisation de l'étape de culture est comprise entre 0,1 et 20, de préférence entre 0,2 et 15 avantageusement entre 1 et 15.
Avantageusement, la densité optique initiale des microorganismes apportés pour la réalisation de l'étape de culture est comprise entre 5 et 15 ou entre 5 et 10.
D'autres composés peuvent encore être ajoutés au milieu de culture et en particulier on utilisera avantageusement des tensioactifs tels que le Tween 20® ou des antimoussants.
Les inventeurs ont observé que la production d'arômes et notamment de γ-décalactone est améliorée par l'apport de ces agents tensioactifs ou antimoussants et que la densité cellulaire initiale (biomasse initiale) influence cette amélioration et que la disponibilité du précurseur dans la phase aqueuse fait varier le niveau de production de la γ-décalactone.
Les microorganismes susceptibles d'être cultivés en présence des 10
substrats de l'invention peuvent être variés et peuvent notamment être choisis parmi les souches suivantes, le cas échéant après recombinaison, capables de donner lieu à la production des composés identifiés ci-après :
Souches Produits Sporobolomyces odorus arômes, colorants, biomasse
Yarrowia lipolytica arômes, biomasse, polyols
Saccharomyces cerevisiae biomasse, ergostérol (-> vitamine D)
Lenzites betulina arômes
Pénicillium sp. analgésiques, arômes Fusarium sp. antihypertenseurs
Fusarium moniliforme substance de croissance végétale, arômes
Cylindrocarpon radicicola stéroïdes, arômes Lactococcus lactis arômes Aspergillus enzymes, arômes Bacillus enzymes, arômes
Claviceps purpurea alcaloïdes, arômes Streptomyces dimorphogenes inhibiteurs d'enzymes, arômes
Une souche Yarrowia lipolytica telle que celle qui figure au catalogue
ATCC sous la référence 8661 est utilisée à titre d'exemple.
De façon avantageuse, pour la réalisation de l'invention, le substrat utilisé pour la culture des microorganismes est stérilisé par tout moyen approprié et par exemple en autoclave, préalablement à la mise en culture. Le cas échéant, le substrat peut être utilisé sans stérilisation préalable.
Par ailleurs, l'étape de récupération des produits formés peut être conduite de toute manière appropriée et en particulier les produits obtenus peuvent être isolés et purifiés par extraction par un solvant, par distillation, par extraction solide-liquide, par extraction gaz-liquide couplée à une 11
cryocondensation, par fluides supercritiques, par des procédés membranaires, en particulier la perstraction et la pervaporation ou par séparation chromatographique, en particulier HPLC, ainsi que par des combinaisons de ces techniques séparatives. La récupération des composés peut être effectuée à l'issue de l'étape de culture ou à plusieurs reprises, en interrompant l'étape de culture à des moments déterminés par exemple en fonction de la quantité produite de composés et notamment pour tenir compte de la toxicité des composés produits à l'égard des microorganismes du milieu de culture. Alternativement, la récupération peut être effectuée in situ, notamment lorsque les composés produits peuvent présenter un certain niveau de toxicité par rapport aux microorganismes utilisés.
Selon l'un ou l'autre des moments de réalisation de l'extraction, cette dernière peut être réalisée dans le même compartiment que celui de la production, par exemple dans la même cuve, ou au contraire ces deux étapes peuvent être séparées spatialement.
Le cas échéant, l'étape d'extraction réalisée en continu avec la production des composés, peut influencer le rendement de la réaction. Ainsi, lorsqu'un précurseur est utilisé, en fonction de son coefficient de partage et de sa concentration dans la phase lipidique, sa disponibilité dans la phase aqueuse peut être affectée, diminuant par conséquent son utilisation par le(les) microorganisme(s).
L'extraction peut également favoriser la production des composés puisque l'extraction réalisée en continu ou de façon déterminée en alternance avec la production, diminue l'activité toxique éventuelle des composés produits vis à vis du (des) microorganisme(s) du milieu de culture.
Les variantes proposées, de l'étape de récupération des composés produits sont applicables a priori quelles que soient les conditions de réalisation de l'étape de culture nécessaire à la production des composés, en particulier 12
quels que soient les microorganismes, substrats et/ou précurseurs mis en oeuvre.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'extraction des composés produits par absorption dans la graisse végétale, est suivie d'une séparation des composés, notamment des arômes produits au moyen d'un alcool. Avantageusement, un tel procédé comprend les étapes de
1 ) solubilisation du milieu lipidique solide dans l'éthanol 96° à raison de 1V/10V,
2) barattage de la solution éthanolique à -20°C pendant une heure, 3) séparation de l'alcool contenant les arômes du milieu lipidique cristallisé, par exemple par filtration.
L'invention a aussi pour objet le procédé d'extraction d'arômes, mis en oeuvre indépendamment de l'étape de production des arômes. Ce procédé d'extraction comprend la mise en contact du milieu en phase aqueuse contenant les arômes, avec un milieu en phase lipidique, pendant un temps suffisant pour permettre l'absorption de tout ou partie des arômes dans la phase lipidique, ce procédé étant caractérisé en ce que le milieu en phase lipidique est un milieu solide à température ambiante.
Les conditions de réalisation de ce procédé générales et spécifiques, décrites dans les pages précédentes sont applicables dans le cadre de sa mise en oeuvre indépendamment des conditions de production des arômes.
Les caractéristiques de l'invention sont également illustrées dans les exemples et les figures qui suivent :
Légende des figures
Figure 1A. Relation entre la biomasse (exprimée en g/l de matière sèche) et la densité cellulaire (DO à 620 nm). 13
Figure 1 B. Relation entre la biomasse (exprimée en g/l de matière sèche) et le volume de mycélium.
Figure 2A. Etat de cultures de S. odorus âgées de 77 heures sur différents milieux à base de vinasse.
Figure 2B. Cinétique de croissance et de développement de S. odorus sur MT2-malt.
Figure 2C. Cinétique de croissance et de développement de S. odorus sur MV2-malt.
Figure 3. Evolution de la production de biomasse dans les conditions standards et sur vinasse non complémentée.
Figure 4. Evolution de la production de lactone dans les conditions standards et sur vinasse non complémentée.
Figure 5. Influence d'un ajout de 1 ,66 % d'huile de ricin sur l'évolution de la production de biomasse.
Figure 6. Influence d'un ajout de 1 ,66 % d'huile de ricin sur la production de lactone.
Figure 7. Evolution de la production de biomasse en fonction de la nature du composé lipidique ajouté.
Figure 8. Evolution de la production de lactone en fonction de la nature du composé lipidique ajouté. 14
Figure 9. Cinétiques de croissance et de production de γ-décalactone chez S. odorus après additions fractionnées de ricinoléate de méthyle. Le précurseur est ajouté à t = 0, 24, 48 et 72 h à raison de 0,06 % (v/v). La flèche indique le moment où le précurseur a été ajouté.
Figure 10. Croissance, production de γ-décalactone et rendement de bioconversion par S. odorus cultivé après additions fractionnées de ricinoléate de méthyle. Le précurseur est ajouté à t = 0, 24, 48 et 72 h à raison de 0,008 % (v/v). La flèche indique le moment où le précurseur a été ajouté.
Figure 11. Croissance de Sporobolomyces odorus en fonction de la quantité de γ-décalactone présente initialement dans le milieu.
Figure 12. Impact d'un apport simultané de Tween 20 et de RM sur la croissance de S. odorus.
La flèche indique le moment où le précurseur a été ajouté.
Figure 13. Impact d'un apport simultané de Tween 20 et de RM sur la production de γ-décalactone. La flèche indique le moment où le précurseur a été ajouté.
Figure 14. Influence de la quantité de RM apportée sur la cinétique de croissance de S^ odorus en présence de HNCH (5g/flacon). apport de 4x 0,003% de RM u apport de 4x0,06% de RM Δ apport de 4x0,12% de RM 15
x apport de 4x0,18% de RM
i indique le moment où les ajouts de RM ont été réalisés.
Figure 15.
Influence d'apports supplémentaires de RM, de Tween 20® et de Struktol® sur les cinétiques de biomasse et de production de γ-décalactone des cellules de
S. odorus ensemencées à une densité initiale de 4 en présence de HNCH
(5g/flacon)
6 apports de RM: Biomasse Δ 4 apports de RM: Biomasse «6 apports de RM - [g-décalactone] x 4 apports de RM : [g-décalactone].
4 indique le moment où les ajouts de RM ont été réalisés.
Figure 16.
Cinétiques de biomasse et de production de γ-décalactone lors de la culture de S. odorus ensemencée à une densité initiale de 4 en présence de TTT (5 g/flacon).
Δ Biomasse ^ [γ-décalactone] i indique le moment où les ajouts de RM ont été réalisés.
A. Matériel et Méthodes
I. LES SOUCHES
1.1 M SOUCHE DE SPOROBOLOMYCES ODORUS 16
La souche de Sporobolomyces odorus utilisée est la souche déposée sous la référence CBS 2636. 1.2 LA SOUCHE DE LENZITES BETULINA
La souche utilisée est la souche déposée sous la référence MIC 38.
Il LES MILIEUX DE CULTURE ET DE CONSERVATION DE DIFFERENTS MICROORGANISMES 11.1 SPOROBOLOMYCES ODORUS
11.1.1- COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE DES SPOROBOLOMYCES ODORUS
Deux milieux de culture ont été testés, afin de déterminer lequel permet la meilleure production de γ-décalactone. Ces milieux peuvent être utilisés comme milieux témoins pour le test des substrats.
Le premier de ces milieux a la composition suivante (JOURDAIN, 1985) : - 30 g/l de glucose
- 3,5 g/l de peptone
- 1 g/l d'extrait de malt
- 2g/l de KH2PO4 - 0,13g/l de CaCI2, 2H2O - 0,01 g/l de FeS04, 7H2O
- 3 g/l de MgSO4, 7H2O
- H2O (milieu MT1 ) ou vinasse concentrée trois fois et centrifugée 5 minutes à 1 000 g (milieu MV1 ) qsp 1 I.
Le second milieu utilisé (FERON, 1996) est formulé comme suit : - 1 g/l de glucose
- 0,5 g/l de bacto tryptone - 1 g/l d'extrait de levure
- 1 g/l d'extrait de malt
- 2 g/l de casamino acides 17
- 2 g/l de KH2PO4 - 0,13 g/l de CaCI2, 2H20
- 0,01 g/l de FeSO4, 7H2O
- 3 g/l de MgSO4, 7H2O - H20 (milieu MT2) ou vinasse concentrée trois fois et centrifugée 5 minutes à 1 000 g (milieu MV2) qsp 1 I.
Dans les deux cas, le pH a été ajusté à 6 à l'aide de soude 5 N, puis le milieu a été réparti à raison de 60 ml dans des erienmeyers de 250 ml et autoclave 20 minutes à 120 °C. Au cours des cultures, réalisées en milieu liquide, la température a été maintenue à 24 °C et l'agitation à 250 rpm (tours par minute). 11.1.2 - COMPOSITION DU MILIEU DE CONSERVATION DE SPOROBOLOMYCES ODORUS
La souche de Sporobolomyces odorus a été conservée sur boite de pétri à 4°C. Dans ce cas, un milieu de type MT2 a été utilisé. 15 g/l d'agarose ont été ajoutés (JOURDAIN, 1985). Le milieu ainsi obtenu a été autoclave 20 minutes à 120 °C.
Il .2 LENZITES BETULINA
11.2.1. MILIEU DE CULTURE DE LENZITES BETULINA Le milieu de culture utilisé pour ce champignon basidiomycète a la composition suivante (GALLOIS, 1990) : - 10 g/l de glucose
- 0,5 g/l d'extrait de levure
- 0,2 g/l de KH2PO4 - 0,032 g/l de CaCI2, 2H2O
- H2O (LMT) ou vinasse concentrée trois fois et centrifugée 5 minutes à 1 000 g (LMV) qsp 1 I.
Le pH a été ajusté à 4,8 à l'aide de soude 5 N dans le cas de LMV et de HCM N dans le cas de LMT. 18
Les cultures, réalisées en milieu liquide dans des erienmeyers de 250 ml contenant 100 ml de milieu, ont été placées à 24°C sous une agitation de 180 rpm.
II.2.2 - MILIEU DE CONSERVATION DE LENZITES BETULINA
Lenzites betulina a été conservée à 4°C sur des boites de pétri contenant un milieu préparé de la façon suivante :
- dissoudre 39 g/l de potato-dextrose agar, dans de l'eau
- autoclaver la solution obtenue 20 minutes à 120 °C - laisser refroidir jusqu'à 45-50°C
- ajouter 14 ml/l d'acide tartrique à 10%
- répartir le mélange dans des boîtes de pétri.
III- EVALUATION DE LA BIOMASSE PRODUITE 111.1 - CAS DE SPOROBOLOMYCES ODORUS
L'évolution de la quantité de biomasse produite au cours des cultures de cette levure a été suivie en mesurant la densité optique (DO) de la suspension cellulaire à 620 nm. Au spectrophotomètre, le 0 était réalisé avec un échantillon de milieu vierge. Alternativement, des mesures de matière sèche (MS) produite ont été réalisées. Pour cela, 30 ml d'une suspension cellulaire ont été prélevés et on a mesuré la DO. Après centrifugation 5 minutes à 2 000 g de cette suspension et élimination du surnageant, le culot a été placé dans une étuve à 37°C pendant 48 heures, puis pesé. La matière sèche correspondant à différentes valeurs de DO a été pesée afin de tracer la courbe MS=f(DO) représentée à la figure 1A. Celle-ci permet de déterminer la quantité de biomasse correspondant à une DO donnée. III.2 - CAS DES CHAMPIGNONS FILAMENTEUX
Dans le cas de ces champignons, les mycélia forment des "pelets" 19
(pelotes) lorsqu'ils sont cultivés en milieu liquide agité. La biomasse produite a été évaluée en mesurant le poids de matière sèche (MS). Pour cela, un échantillon de culture ayant un volume donné a été centrifugé 5 minutes à 2000 g dans un tube gradué. A l'issue de cette centrifugation, le surnageant a été éliminé puis le volume (V) de mycélium obtenu mesuré. Ce culot a été placé à l'étuve à 37°C pendant 48 heures et pesé.
Ces mesures ont permis de tracer la courbe MS=f(V) (figure 1B). Ainsi, on a pu déduire directement du volume de mycélia obtenu la quantité de biomasse sèche correspondante.
IV - DOSAGE DES ELEMENTS CONTENUS DANS LES MILIEUX DE
CULTURE
IV.1 . EXTRACTION LIQUIDE-LIQUIDE DES COMPOSES VOLATILS
PRESENTS DANS LA PHASE AQUEUSE Avant d'être dosés, les composés volatils odorants doivent être extraits du milieu. Pour cela, la méthode d'extraction liquide-liquide par un solvant organique a été utilisée avec le pentane (C5H12). Cette technique repose sur la non miscibilité du solvant avec le milieu de culture qui est aqueux, et sur l'affinité supérieure qu'ont pour lui les molécules aromatiques. Ainsi, les composés volatils libres passent de la phase aqueuse à la phase organique.
Afin de doser les composés volatils extraits, la technique dite du standard interne a été utilisée. Cette méthode est fondée sur l'utilisation de pentane contenant un composé aromatique pour réaliser l'extraction. Le composé choisi doit présenter les caractéristiques suivantes : - être ajouté à une concentration connue,
- ne pas être présent dans le milieu dont on veut extraire les composés volatils produits par les microorganismes,
- avoir un comportement chromatographique (temps de rétention, aire de pic.) proche du ou des composés à extraire. 20
Dans le cas des dosages de la lactone produite par Sporobolomyces odorus, le standard interne utilisé était le géraniol, à une concentration de 30 mg/l.
Le protocole suivi était le suivant : - centrifuger le milieu 5 minutes à 2 000 g afin d'en éliminer les cellules en suspension ou les "pelets"
- remplir une fiole de 25 ml avec le surnageant obtenu précédemment
- ajouter 1 ml de pentane contenant le standard interne,
- agiter 1 minute afin de mettre les deux phases en contact et de permettre l'extraction des composés volatils de la phase aqueuse,
- laisser les phases se séparer en les laissant environ 30 minutes dans de la glace,
- prélever la phase organique et la mettre dans un tube Eppendorf. Afin de déstabiliser totalement l'emulsion, il peut s'avérer nécessaire d'ajouter une goutte d'éthanol absolu au mélange.
IV.2. - CONCENTRATION DES ECHANTILLONS
Les premiers dosages des extraits organiques ont montré que les quantités de composés volatils présentes étaient insuffisantes pour permettre des mesures fiables.
Afin de remédier à ce problème, les échantillons ont été concentrés environ 5 fois. Pour cela, un flux d'air sec à très faible débit a été utilisé. A son contact, le solvant, très volatil, s'est évaporé alors que les molécules odorantes se concentraient dans le volume restant. On considère que les composés produits par les microorganismes ne s'évaporent pas, ou bien qu'ils s'évaporent dans les mêmes proportions que le standard interne.
IV.3 - DOSAGE DES COMPOSES CONTENUS DANS LA PHASE AQUEUSE PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE (CPG) • Matériel 21
Le chromatographe suivant a été utilisé : HEWLETT PACKARD HP 5890 Séries II, muni d'une colonne capillaire en silice fondue imprégnée de Carbowax 20M (polyéthylène glycol polymérisé) de 25 m de longueur et 0,25 mm de diamètre. Les chromatographies ont été réalisées dans les conditions décrites ci- dessous :
- gaz vecteur : azote avec un débit de 75 ml/min
- gaz de combustion : mélange air/hydrogène
- température - de l'injecteur : 200°C - du détecteur : 250°C
- du four -> initiale : 40°C
-> augmentation : 4°C/min -> finale : 200°C Le chromatographe est relié à un intégrateur de type HELWETT PACKARD HP 3394A, utilisé dans les conditions suivantes :
- atténuation (ATT2A):0
- vitesse du papier (CHT SP): 0,5 cm/min
- sensibilité (PK WD): 0,04
- discrimination (THRSH): 0 • Principe de la quantification des composés à l'aide du standard interne
La quantification des composés produits a été établie de la façon suivante : une CPG à partir d'une solution contenant 30 μl/l de standard interne et 30 μl/l du composé à doser a été réalisée : la lactone dans le cas des cultures de Sporobolomyces odorus. Ceci a permis de calculer le rapport existant entre les aires de pic des deux molécules sachant qu'elles sont présentes à la même concentration. Ainsi on obtient : Concentrationcomposé x = (aire∞mposé x / airestandard interne)* coefficient de réponse où le coefficient de réponse (CR) a la valeur suivante :
CR= 30μl/l (airestandard interne à 30μl/|/a'recomposé x à 30 μl/l) 22
B. Production de composés volatils odorants à partir de vinasse, en présence de S. Odorus et facultativement Ricinoléate De Méthyle I ETUDE DU COMPORTEMENT DE SPOROBOLOMYCES ODORUS SUR VINASSE
Pour déterminer si la vinasse n'exerce pas une inhibition sur le développement ou le potentiel de bioproduction de la levure, on a fait croître S.odorus sur un milieu ayant la même composition que celui utilisé comme témoin (MT) mais en remplaçant l'eau, qui servait de solvant aux différents constituants, par de la vinasse concentrée trois fois et préalablement centrifugée afin d'éliminer les impuretés en suspension qu'elle contient. Après 72 heures de culture, la DO est de 12 (tableau 1 ), c'est-à-dire comparable à celle obtenue sur le milieu MT2. Ces résultats ajoutés au fait que la présence de γ-décalactone a été détectée montrent que les éléments contenus dans la vinasse ne perturbent ni la croissance de la levure, ni la production de lactone. Tableau 1 : Production de biomasse de S.odorus après 72 heures de culture dans différentes conditions
MV1 MV2 milieu MT1 MT2 MV1 MV2 pH=3,2 pH=3,2
DO
7,0 12,6 10,0 12,0 3,2 6,6 à 620 nm
lactone +++ +++ ++ ++ -+ -+
Figure imgf000024_0001
1. Evaluation de l'effet du pH de la vinasse sur le développement de la levure 23
La vinasse ayant un pH très acide (environ 3,2) et tamponné, il faut une assez grande quantité de soude (environ 6 g/l) pour l'amener au pH optimal de la levure qui est de 6 (FERON, 1996). On a recherché si de telles quantités de soude ne perturbent pas le développement de la levure et si le pH initial du milieu à base de vinasse ne permettrait pas une croissance et une production satisfaisante. Pour cela une culture sur un milieu identique à celui précédemment décrit, sans ajustement de pH a été réalisée
Sporobolomyces odorus se développe beaucoup moins bien (la DO était de 6,6), et surtout que la production de lactone se trouve très affectée (tableau 2). Ceci permet de dire qu'un pH de 3 ne permet ni un développement correct de la levure, ni le maintien de son potentiel de production de lactone par rapport aux essais réalisés sur vinasse à pH6.
2. Recherche d'un milieu standard optimal de développement de Sporobolomyces odorus
A l'issue de ces premiers résultats, la composition du milieu utilisé a été optimisée pour déterminer si la vinasse pouvait servir de substrat pour la production de lactone. La formulation du milieu a été modifiée en éliminant certains composés : - milieu vinasse sans extrait de malt
- milieu vinasse sans casamino acides
- milieu vinasse sans glucose.
Après 77 heures de culture, les productions de biomasse et de γ- décalactone ont été évaluées (figure 2A). Ces mesures font apparaître que sans extrait de malt, la croissance de S. odorus est améliorée.
En revanche, le fait d'éliminer les casamino acides du milieu ne semble avoir aucun effet sur le développement de la levure et sur la production de lactone puisque les résultats obtenus sont comparables à ceux observés sur le milieu MV2. 24
Enfin, le fait de supprimer le glucose semble avoir un impact négatif sur la production de lactone, puisque celle-ci est considérablement diminuée.
Le milieu sans malt peut donc être choisi comme milieu de référence (MT2-malt) pour réaliser des cinétiques de croissance, de production, d'évolution du pH et de la concentration en glucose et en lactone sur ce milieu contenant ou non de la vinasse (figures 2B et 2C).
3. Production de la y-décalactone sur de la vinasse non complémentée
Après avoir mis en évidence que tous les éléments contenus dans le milieu vinasse standard ne sont pas indispensables au développement de la levure et à sa production de composés volatils, sa capacité à se développer et à produire sur de la vinasse non complémentée a été testée.
Pour cela des cinétiques de croissance et de production ont été réalisées sur de la vinasse pure et concentrée trois fois. Les résultats obtenus montrent que S. odorus est capable de se développer et de bioproduire dans ces conditions, c'est-à-dire sans aucun apport glucidique (figures 3 et 4). Au bout de 77 heures, les cultures atteignent une DO de 14,3. Cette DO permet d'affirmer que la levure se développe de manière satisfaisante, même si la DO reste inférieure à celle obtenue dans les conditions standards qui est de 18. En ce qui concerne la concentration de lactone, elle atteint respectivement 1 ,14 mg/l dans les conditions de référence et 1 ,02 mg/l sur de la vinasse non complémentée. Il semble donc que les éléments contenus dans la vinasse suffisent à la croissance de S. odorus et au maintien de sa capacité de production. Ainsi, aucun apport glucidique ne semble nécessaire à la production de lactone. Ces résultats sont contradictoires avec ceux précédemment présentés, mais ils seraient explicables par le fait qu'il devait y avoir, dans le milieu complémenté, des éléments susceptibles de limiter l'utilisation des acides organiques de la vinasse dans le métabolisme de synthèse des lactones, soit 25
en réagissant avec eux, soit en favorisant par leur seule présence d'autres voies de synthèse.
4. Utilisation du potentiel endogène de Sporobolomyces odorus à oxyder l'acide ricinoléique, intermédiaire métabolique de la synthèse de la γ- décalactone
Afin d'améliorer la production de composés aromatiques, nous avons voulu tester la voie de la bioconversion. Cette stratégie est basée sur la capacité de Sporobolomyces odorus à utiliser l'acide ricinoléique comme précurseur dans le métabolisme de synthèse de la γ-décalactone.
4.1. Impact, sur la production de lactone, d'une addition d'huile de ricin à la vinasse
La principale source d'acide ricinoléique est l'huile de ricin dans laquelle il représente environ 90% des acides gras et se trouve majoritairement sous forme de triglycérides.
Afin d'étudier l'impact de l'ajout d'huile de ricin sur la production de γ- décalactone, nous avons réalisé les cultures suivantes:
- vinasse + 1 ,66 % (v/v) d'huile de ricin - vinasse + 5 g/l de glucose + 1 ,66 % (v/v) d'huile de ricin
- vinasse + 10 g/l de glucose + 1 ,66 % (v/v) d'huile de ricin.
Les résultats obtenus montrent que l'apport d'huile de ricin dans le milieu ne perturbe pas le développement de S. odorus puisque dans tous les cas, la DO atteinte au bout de 77 heures de culture est proche de 14 (figure 5). En revanche, la production de γ-décalactone est considérablement améliorée : elle passe de 1 ,02 mg/l à 6,47 mg/l, soit 6 fois plus (figure 6).
D'autre part, la production est légèrement accélérée sur les milieux complémentés en glucose mais les concentrations obtenues restent inférieures à celles atteintes sans glucose exogène (figure 6). Il semble donc qu'un apport 26
glucidique ne soit pas nécessaire à une bioconversion efficace de l'acide ricinoléique contenu dans l'huile de ricin.
4.2. Effet d'un apport de ricinoléate de méthyle sur la production de γ- décalactone
Une seconde possibilité consiste à utiliser du ricinoléate de méthyle, c'est-à-dire l'ester de l'acide ricinoléique.
Afin de tester l'effet d'un apport de ricinoléate de méthyle à des cultures de S. odorus sur vinasse seule, 1 ml de ce précurseur a été ajouté à des suspensions cellulaires de 60 ml âgées de 24 heures. Le suivi de celles-ci a montré que si la production de biomasse est réduite (11 ,06 de DO au bout de 77 heures au lieu de 14,3 sur de la vinasse seule, figure 7) celle de γ- décalactone est considérablement améliorée. En effet, au lieu d'une concentration finale, au bout de 77 heures, de 1 ,02 mg/l sur vinasse ou de 6,47 mg/l dans le cas où nous avions ajouté de l'huile de ricin, nous avons atteint des concentrations de 28,23 mg/l (figure 8). Ce résultat est explicable par le fait que l'enzyme lipolytique intervenant dans la dégradation des triglycérides n'est pas synthétisée de manière constitutive chez cette levure. Elle deviendrait donc rapidement limitante dans l'obtention d'acide ricinoléique libre à partir d'huile de ricin. L'ajout de ricinoléate de méthyle directement utilisable remédie à ce problème et permet d'améliorer les rendements de production de lactone.
5. Influence du facteur temps sur la production de y-décalactone
Ces résultats étant fort intéressants, nous avons cherché à savoir si les concentrations obtenues seraient augmentées en laissant les cellules se développer pendant 144 heures. Il s'est avéré qu'au bout de 120 heures, le milieu renferme 36,78 mg/l de lactone et 72,24 mg/l au bout de 144 heures. Autrement dit, en 1 ,8 fois plus de temps, la production est multipliée par 2,5. Cette augmentation de la production coïncide avec l'arrêt de la croissance 27
cellulaire qui se produit au bout de 72 à 77 heures de culture, et renforce l'hypothèse d'un découplage entre la production de lactone et celle de biomasse.
6. Influence de la quantité de ricinoléate de méthyle ajoutée
Afin d'optimiser la quantité de ricinoléate de méthyle apportée, nous avons réalisé des cultures auxquelles nous avons ajouté au bout de 24 heures soit 0,83 %, soit 1 ,66 %, soit 10 % (v/v) de ricinoléate de méthyle. Les résultats obtenus (tableau 3) montrent que c'est en apportant 0,83 % (v/v) de cet ester que l'on obtient la teneur la plus élevée en γ-décalactone dans la phase aqueuse et ce sans que la production de biomasse ne soit affectée.
Tableau 2 : Influence de la quantité de ricinoléate de méthyle (RM) apporté à des cultures de 60 ml au bout de 24 heures, les mesures ont été faites après 77 heures de culture.
Quantité de 0 ml 0,5 ml 1 ml 6 ml RM ajoutée
DO à 620nm 8,74 8,00 7,94 8,98
Lactone 1 ,02 32,22 27,24 18,78 en mg/l
Figure imgf000029_0001
L'exploitation du potentiel de bioconversion du ricinoléate de méthyle en γ-décalactone, sur de la vinasse non complémentée, par Sporobolomyces odorus présente manifestement un intérêt. En effet, grâce à un apport de
1 ,66 % (v/v) de ce précurseur, des concentrations de l'ordre de 45 mg/l de composé odorant sont obtenus en 144 h de culture, dont 16,9 mg/l en 77 h, ce 28
qui constituait une nette amélioration de la production. Sans addition de précurseur la levure ne produisait que 0,95 mg/l d'arôme après 77h de culture. Cette concentration était portée à 5,7 mg/l en présence de 1 ,66 % (v/v) d'huile de ricin exogène. De plus, il a été montré que la production de γ-décalactone augmentait avec l'apport de précurseur. En effet, lorsque l'apport de RM était de 0,83 %, la concentration de lactone après 77 h de culture était de 15,1 mg/l et de 32,5 mg/l lorsque l'addition de précurseur était de 10,0 %. L'effet inverse était observé sur le rendement de bioconversion, lequel diminue avec la quantité ajoutée de RM. Ceci est dû à un accroissement de la quantité résiduelle de RM.
6.1 Optimisation de l'apport de ricinoléate de méthyle 6.1.1. Effet d'un apport précoce de précurseur Dans les manipulations réalisées précédemment l'apport du précurseur était effectué après 24 h de culture. Les cellules devaient alors dans un premier temps adapter leur métabolisme à la bioconversion du RM.
Afin de déterminer si la présence précoce du précurseur permet d'améliorer la production en limitant ce temps d'adaptation, un apport initial de RM a été réalisé.
Tableau 3 : Influence d'un apport précoce et fractionné de RM sur la croissance et la production de γ-décalactone par S. odorus après 77 heures de culture.
Apport de RM Témoin 0,06 % à t = 0 h + (% v/v) 0,83 % à t = 24 h 0,83 % à t = 24 h
Biomasse 8,0 8,4 (DO à 620 nm)
[γ-décaiactone] 15,1 47,7
Figure imgf000030_0001
(mg/l)
Les résultats obtenus, présentés dans le tableau 3, démontrent qu'un 29
ajout de 0,06 % (v/v) de RM au temps 0, suivi d'une deuxième addition 24 h plus tard de 0,83 % (v/v), a permis d'améliorer de façon significative la production de lactone par rapport au témoin. La concentration de γ-décalactone est multipliée par 3 après 77 h de culture.
6.1.2 Effet d'un apport fractionné de précurseur
A la suite des résultats précédents, l'optimisation du système a été entreprise en modifiant d'une part les quantités de RM ajoutées et d'autre part, les moments auxquels elles sont apportées au milieu de culture. Dans les expériences conduites, les additions de précurseur ont été réalisées aux instants t=0, 24, 48 et 72 h. Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 9. Leur analyse a montré que ce fractionnement ne modifiait pas la croissance de la levure par rapport à un témoin mais favorisait considérablement les quantités de lactone produites. Au bout de 144 h, 142,7 mg/l ont été obtenus au lieu de 44,7 mg/ 1 si l'ajout était fait en une seule fois. Cette stratégie a permis d'atteindre des concentrations de 285 mg/l d'arôme au bout de 216 h.
De plus, ce mode d'apport du RM a permis de minimiser les quantités de précurseur nécessaires, et d'accroître la quantité de γ-décalactone présente dans la phase aqueuse.
6.1.3- Recherche des quantités optimales de précurseur à apporter
Dans l'optique de déterminer la concentration de RM qui permet d'atteindre une concentration maximale de γ-décalactone dans la phase aqueuse, des quantités variables de RM ont été apportées de manière fractionnée aux temps t = 0, 24, 48 et 72 h. Les résultats obtenus au bout de 96 h de culture sont présentés dans le tableau 4.
Tableau 4 : Influence de la quantité de RM apportée sur la production de γ- 30
décalactone et le rendement de bioconversion par S. odorus. Les résultats présentés ont été obtenus après 96 h de culture. Les apports de RM ont été effectués à t = 0, 24, 48 et 72 h.
Quantité de 0,008 0,016 0,032 0,060 0,067 0,083 0;170 précurseur ajoutée (% v/v)
Total ajouté (% v/v) 0,033 0,066 0,132 0,240 0,268 0,322 0,680
[γ-décalactone] (phase 59,7 102,0 1 1 1 ,0 96,8 84,2 93,5 53,5 aq.mg/l)
Rendement apparent 19,5 17,5 9,1 4,4 3,5 3,1 0,8 de bioconversion (%
Figure imgf000032_0001
m/m)*
(masse γ-décalactone) phase aqueuse x 100
(masse RM) apportée
Le tableau 4 montre que :
- le rendement apparent de bioconversion diminue parallèlement à la teneur en ricinoléate de méthyle,
- les quantités de lactone produites augmentent parallèlement à la quantité de ricinoléate de méthyle exogène. Au-delà de 0,032 % (v/v), la teneur en γ-décalactone diminue.
Ces évolutions peuvent être expliquées par:
- l'extraction de la lactone du milieu de culture est favorisée par le RM, composé dans lequel elle est plus soluble que dans le milieu de culture, - le transfert du RM serait limité par une diminution de la surface d'échange due à sa coalescence qui augmente avec la quantité apportée,
- la quantité de RM résiduelle augmente avec l'apport de RM, ce qui abaisse le rendement de bioconversion observé,
- un effet toxique du RM qui augmente avec l'apport, - un défaut dans la composition de la vinasse. En effet, il suffirait d'une 31
carence en un oligo-élément pour que la synthèse de la lactone soit bloquée.
La validité de ces hypothèses a été vérifiée et fait l'objet des paragraphes à venir.
6.1.4 - Recherche du potentiel réel de bioconversion du RM en lactone par S. odorus
Afin de déterminer avec quelle efficacité S. odorus est capable de bioconvertir le RM en γ-décalactone, des cinétiques de croissance et de production ont été réalisées en apportant des quantités de précurseur limitantes. En effet, dans ces conditions, il n'y a pas de RM résiduel en fin de culture, comme le montrent les analyses chromatographiques, ce qui permet de déterminer le rendement de bioconversion réel. Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 10. Ils font apparaître que le rendement maximal obtenu était de 24%, alors que le rendement théorique est de 55 %. Il semble donc que tout le RM apporté ne soit pas utilisé uniquement pour la biosynthèse de γ-décalactone, mais qu'il intervienne également dans d'autres métabolismes de la cellule.
A ce stade, il apparaît que : - l'apport séquence de RM est préférable à une addition unique pour la production de γ-décalactone,
- un apport de RM en début de culture est également favorable à la production de lactone,
- le potentiel réel de bioconversion du RM en lactone par S. odorus est de 24% dans les conditions de culture utilisées.
6.2 - La y-décalactone est-elle toxique ?
Afin de déterminer si la γ-décalactone est toxique pour les cellules, des cinétiques de croissance de la levure sur un milieu vinasse contenant soit 50 32
mg/l, soit 250 mg/l de lactone ont été réalisées (figure 11 ). La dose 50 mg/l de composé odorant n'affectait pas la croissance de la levure pendant les 50 premières heures de culture. Au delà, un décalage était observé. En revanche, en présence de 250 mg/l de lactone, la croissance du microorganisme était significativement inférieure. En effet, la DO maximale atteinte était de 4 au lieu de 15 dans le témoin. Ce même phénomène a déjà été observé par Feron et col. (1996) qui ont déterminé que la dose compatible avec un taux de croissance non nul des cellules est comprise entre 100 et 200 mg/l. Ceci expliquerait en partie pourquoi des concentrations de 250 à 300 mg/l de lactone n'ont pas été dépassées dans les conditions expérimentales retenues.
6.3 - Le transfert du RM est-il limitant ?
Des cinétiques de croissance et de production de lactone sur un milieu vinasse ont été réalisées en faisant appel à un tensioactif, le Tween 20 ®, connu pour ses propriétés dispersantes. Celui-ci a été mélangé au RM dans les proportions un tiers-deux tiers (v/v). La solution obtenue a été ajoutée à raison de 0,09 % (v/v) au milieu vinasse aux temps t = 0, 24, 48 et 72 h.
Les figures 12 et 13 illustrent la production de biomasse et de γ- décalactone respectivement. En ce qui concerne la croissance, celle-ci n'était pas affectée au cours des 48 premières heures de culture par la présence de
Tween 20 ®. Au delà un palier a été obtenu alors que les cellules continuaient de croître en l'absence de ce tensioactif.
La comparaison des concentrations de lactone mesurées dans la phase aqueuse avec et sans Tween 20 ® permet de mettre en évidence que la présence de cet élément augmente les quantités d'arôme présents dans cette phase : on mesure 220 mg/l de γ-décalactone après 120 h de culture en présence de Tween 20 © et 135 mg/l dans le témoin, ce qui représente une augmentation de 63 %. 33
6.4- La composition du milieu présente-t-elle des carences ?
Afin de vérifier si le blocage de la synthèse de γ-décalactone n'était pas dû à une carence en un ou plusieurs oligo-éléments, des cultures de 96 h sur des milieux ayant été complémentés ont été réalisées comme suit : milieu 0 : vinasse milieu 1 : vinasse +-0,01 g/l de FeS0 - 0,13 g/l de CaCI2 - 3 g/l de MgS04 milieu 2 : vinasse + 1 g/l d'extrait de levure. A ces milieux, du ricinoléate de méthyle (4 fois 0,06 %) a été ajouté aux instants t = 0, 24, 48 et 72 h.
Les résultats obtenus au bout de 96 h de culture sont rassemblés dans le tableau 5. Leur observation suggère que la croissance et la production de lactone ne sont pas fondamentalement modifiées par les apports en sels et extraits de levure.
Tableau 5 : Influence de la complémentation du milieu vinasse sur la croissance et la production de γ-décalactone par S. odorus. Les résultats présentés ont été obtenus après 96 h de culture.
Milieu milieu 0 milieu 1 milieu 2
Biomasse 15,8 12,1 14,8 (D.O. à 620 nm)
[γ-décalactone] 96,1 104,0 114,0
Figure imgf000035_0001
(mg/l)
A ce stade, il apparaît que :
- la composition de la vinasse n'est pas un élément susceptible de limiter la production de γ-décalactone, - l'effet toxique de la γ-décalactone observé au delà de 250 mg/l pourrait être à l'origine de la limitation de sa production par S. odorus, 34
- l'effet positif du Tween 20 ® sur la réaction de bioconversion suggère que la dispersion du RM pourrait améliorer la quantité de γ-décalactone présente dans la phase aqueuse.
7 - Exemple de production de y-décalactone par Sporobolomyces odorus à partir de vinasses et de ricinoléate de méthyle en fermenteur
PREPARATION DU SUBSTRAT :
Après dissolution par chauffage et agitation des sels précipités, les particules solides contenues dans la vinasse brute sont séparées par centrifugation. Le pH de la vinasse est ajusté à 6 avec du NaOH 5 M et de l'antimousse (Struktol®) est ajouté à raison 0,01 % (v/v).
STERILISATION DU SUBSTRAT ET DU FERMENTEUR : Le substrat ainsi obtenu est introduit dans le fermenteur où il est stérilisé à 120°C pendant 20 minutes sous 1 ,4 bars.
CULTURE DISCONTINUE :
Le fermenteur est ensemencé à une densité optique de 0,2 (lue à 620 nm) à partir d'une préculture. Du ricinoléate de méthyle stérile est ajouté à raison de
0,06 % (v/v) à différents temps après l'inititation de la culture, soit aux temps t = 0, 24, 48 et 72 heures. La température est régulée à 24°C, l'agitation à 500 rpm et l'aération à 0,4 WM.
En variante, la culture peut être réalisée en continu. Les paramètres de la réaction peuvent varier selon les indications suivantes données à titre d'exemple : 35
PARAMETRE INTERVALLE AVANTAGEUSEMENT
Température 10-50°C 20-40°C
Agitation 50-1000 rpm 100-700 rpm
Agitation 0,10-10 VVM 0,10-5 WM
Aération 0,01-20% (v/v) 0,01-20 % (v/v)
Figure imgf000037_0001
C. Extraction in situ de la γ-décalactone
1.1. Choix du système d'extraction La concentration de 250 mg/L de γ-décalactone n'a pas été dépassée lors de la production sans extraction de cette molécule odorante par Sporobolomyces odorus développée sur vinasse. Ceci est lié à la toxicité qu'exerce cette molécule sur la levure au-delà de 150 mg/l. Afin d'éviter que cette concentration seuil soit atteinte au cours de la culture, il est nécessaire de l'extraire de la phase aqueuse au fur et à mesure de sa genèse. La γ- décalactone étant lipophile, son extraction in situ est réalisable à l'aide de substances hydrophobes.
Le précurseur utilisé dans la biosynthèse de γ-décalactone, le ricinoléate de méthyle (RM), étant lui aussi liposoluble, il est extrait au même titre que l'arôme naturel produit. Lorsque la substance d'extraction utilisée est une huile, il s'établit un équilibre entre les phases aqueuses et lipidique. Compte tenu de la consommation par les cellules, du RM dans la phase aqueuse, il se produit un transfert du précurseur de la phase lipidique vers la phase aqueuse.
Les études suivantes ont été réalisées principalement en utilisant de l'huile de noix de coco hydrogénée (HNCH) et ponctuellement du TTT comme graisse solide pour l'extraction in situ de la γ-décalactone.
1.2. Etude de la dose de précurseur à apporter dans le cas de cultures réalisées en présence de HNCH
Le RM étant lipidique, il se solubilise également dans l'HNCH. La 36
quantité de précurseur présente dans la phase aqueuse dépend alors de son coefficient de partage entre les deux phases. Ce paramètre étant largement en faveur de la phase lipidique, seule une faible quantité du RM apportée reste dans la phase aqueuse et est donc disponible pour les cellules. Il est alors probable que le précurseur, devienne limitant à la synthèse de γ-décalactone, et ce d'autant plus que les cellules ne sont plus soumises à la toxicité de cette molécule. Quatre cultures ont été réalisées, recevant respectivement :
• 4 x 0,03 % (v/v) de RM • 4 x 0,06 % (v/v) de RM (témoin)
• 4 x 0,12 % (v/v) de RM
• 4 x 0,18 % (v/v) de RM
Les apports de RM ont été réalisés aux temps t= 0, 24, 48 et 72 heures.
Ces cultures ont été effectuées dans des Erienmeyers de 250 ml contenant 5 g de HNCH et 60 ml de vinasse ensemencé à une densité cellulaire initiale en levures de 0,2 unités de DO620 (densité optique mesurée à 620 nm).
Les résultats obtenus (figure 14) montrent que la cinétique de croissance de la levure est identique, que les ajouts de RM soient de 4 x 0,03, 0,06 ou
0,12 % (v/v). De plus, la vitesse de croissance est sensiblement la même pour tous les essais durant les 75 premières heures de culture. Par contre, un apport de 4 x 0,18 % (v/v) de précurseur améliore nettement la croissance de
S. odorus. Après 150 heures de culture, la DO620 atteint une valeur de 15 contre 8 seulement dans les autres cas.
En ce qui concerne la production de γ-décaiactone (tableau I), elle augmente avec la dose de précurseur ajoutée et atteint 980 mg/l au bout de
312 heures de culture avec un apport de 4 x 0,18 % (v/v). Cette concentration en lactone dépasse largement celle de 250 mg/l obtenue antérieurement en absence de HNCH. 37
Tableau I. Production de γ-décalactone par S. odorus en fonction de la quantité de RM apportée et en présence de HNCH (5g/flacon). Les mesures ont été réalisées après 312 heures de culture.
Quantité de RM 4 x 0,03 % 4 x 0,06 % 4 x 0,12 % 4 x 0,18 % apportée
[γ-décalactone, 147 265 370 980 mg/l
Figure imgf000039_0001
La graisse solide utilisée (huile de noix de coco hydrogénée) s'avère donc être un bon système d'extraction de la γ-décalactone. En multipliant par 3 la dose de RM apportée, il permet d'augmenter d'un facteur 4 la concentration de 250 mg/l obtenue lors des cultures réalisées en l'absence de cette "graisse d'extraction".
1.3. Influence d'un apport de Tween 20® ou de Struktol® en présence de HNCH.
L'absorption du ricinoléate de méthyle dans la graisse d'extraction ayant été constatée lors du dosage chromatographique de la γ-décalactone, il nous a paru intéressant d'essayer de limiter ce phénomène par l'apport d'adjuvants, tels qu'un tensio-actif à une concentration respectueuse de l'intégrité cellulaire, le Tween 20® , ou d'un antimousse, le Struktol® , pouvant agir également en tant que vecteur de solubilisation.
Les expériences suivantes ont été réalisées :
• 4 apports de 0,18 % (v/v) de RM,
• 4 apports de 0,18 % (v/v) de rM + 0,01 % (v/v) de Struktol® ,
• 4 apports de 0,18 % (v/v) de RM + 0,01 % (v/v) de Tween 20® .
Le RM a été apporté (seul ou mélangé aux adjuvants) aux temps t=0, 38
24, 48 et 72 heures.
Dans l'optique d'augmenter la productivité de ce système mettant en oeuvre une extracdtion in situ de la γ-décalactone, 2 séries d'essais ont été réalisées; l'une à une densité cellulaire initiale de 0,2 (témoin), l'autre à une densité cellulaire initiale de 4.
Tableau II. Influence d'un apport de Tween 20® [0,01 % (v/v)) ou de Struktol® [0,01 % (v/v)] lors de la culture de S. odorus en présence de HNCH (5g/fiacon) aux densités cellulaires initiales de 0,2 et de 4. L'évaluation de la biomasse et de la production de γ-décalactone a été réalisée après 312 heures de culture.
Conditions de culture
Biomasse initiale Paramètres Témoin Struktor Tween 20^ (DO à 620 nm)
Biomasse finale 17,54 9,87 9,43
0,2 Production totale de γ- 810 1400 1180 décalactone (mg/L)
Biomasse finale 21 ,37 11 ,97 15,38
4 Production totale de γ- 1110 990 1530 décalactone (mg/L)
Figure imgf000040_0001
Les résultats obtenus (tableau II) montrent que, quelle que soit la densité initiale d'ensemencement, l'apport des adjuvants diminue la concentration cellulaire atteinte après 312 heures de culture.
La production totale de lactone (tableau II), quant à elle, est améliorée par la présence de Struktol® et dans une moindre mesure par l'apport de Tween 20® lorsque la densité cellulaire initiale est de 0,2. L'influence de ces adjuvants sur la production totale de γ-décalactone diffère dans les essais réalisés avec un ensemencement cellulaire de 4. En effet, dans ce dernier cas, la concentration en lactone obtenue en présence de Struktol® (990 mg/L) est 39
inférieure à celle du témoin (1 1 1 1 mg/L). Seul le Tween 20® permet dans les deux cas d'augmenter la quantité de lactone produite.
Il apparaît donc que les conditions permettant la meilleure production totale de γ-décalactone sont les suivantes : Densité cellulaire initiale de 4,
Apports aux temps t= 0, 24, 48 et 72 heures de 0,18 % (v/v) de RM + 0,01 % (v/v) de Tween 20®.
1.4. influence d'apports supplémentaires de précurseur.
Afin de vérifier si la disponiblité du précurseur dans la phase aqueuse est bien le facteur limitant à la synthèse de lactone au-delà de 150 heures, une culture de densité cellulaire initiale de 4 est initiée. Après inoculation, la suspension est additionnée de • 0,18 % (v/v) de RM
• 0,01 % (v/v) de Tween 20® et
• 0,01 % (v/v) de Struktol®
Ces apports sont réalisés aux temps t = 0, 24, 48, 72, 144 et 168 heures. Ces addititifs sont utilisés dans l'optique, d'une part, de limiter la production de mousse lors de la culture (Struktol®) et, d'autre part, pour optimiser le transfert du précurseur vers les cellules à travers la membrane cellulaire Tween 20®.
• Les résultats obtenus (figure 15) montrent que si la croissance de la biomasse n'est pas affectée par les deux apports supplémentaires de RM, il n'en est pas de même pour la productivité de γ-décalactone. Cette dernière est de 5,3 mg/l/h au cours de 150 premières heures de culture, puis elle reprend avec une vitesse de 19 mg/l/h à la suite des nouveaux ajouts de précurseur et se poursuit jusqu'à t=216 heures. La productivité totale sur les 240 heures de culture est alors de 6,66 mg/l/h. L'hypothèse émise précédemment est donc vérifiée : le transfert du RM de la phase lipidique 40
vers la phase aqueuse devient limitant pour la production de lactone au-delà de 150 heures. Enfin, un nouvel apport de RM et d'adjuvants après 144 heures relance la production de γ-décalactone avec une vitesse environ 4 fois supérieure. • A cet stade, il apparaît que : l'apport conjoint de RM, de Tween 20® et de Struktol® permet d'atteindre une productivité totale de 5,3 mg/l/h au cours des 150 premières heures de culture.La disponibilité du RM dans la phase aqueuse est rapidement limitante à la production de lactone. Une des solutions à ce problème pourrait consister en une séparation "spatiale" des étapes de conversion du RM et d'extraction de la lactone.
1.5. Cinétique de production de γ-décalactone en présence de TTT
Outre l'huile de noix de coco hydrogénée, le mélange de graisses végétales TTT a été expérimenté comme système d'extraction in situ de la γ- décalactone. A cet effet, une culture de densité cellulaire initiale de 4 pourvue en TTT (5g/flacon), est additionnée de 0,18 % (v/v) de RM, 0,01 % (v/v) de Tween 20® et de 0,01 (v/v) de Struktol®. Ces apports sont réalisés aux temps t = 0, 24, 48, 72, 144 et 168 heures.Après stérilisation à 120°C pendant 20 min, du mélange TTT (5g) contenu dans un Erlenmeyer de 250ml, ce dernier est à nouveau fondu par chauffage et réparti sur la surface interne de l'Erlenmeyer jusqu'à hauteur de 5cm (mesurée à partir du fond) par rotation autour de son axe vertical incliné à environ 45°C. Une fois la graisse solidifiée, 60ml de vinasse préalablement stérilisée et refroidie sont introduits dans l'Erlemeyer. L'ensemencement est réalisé après que le RM, le Tween 20 et le Struktol aient été ajoutés. Les résultats obtenus (figure 16) montrent que la croissance des levures s'arrête après 72 heures de culture. Au delà, un plateau s'établit autour d'une valeur de biomasse sensiblement égale à 11. En ce qui concerne la γ- décalactone, sa vitesse de production est de 6 mg/l/h au cours de la phase de croissance. Elle continue d'augmenter ensuite et garde une valeur constante de 7,8 mg/l/h. 41
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Claims

42REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation de composés odorants volatils, comprenant les étapes de : a) culture dans des conditions de fermentation, d'au moins un microorganisme choisi pour sa capacité à synthétiser lesdits composés odorants volatils (dits arômes), en présence d'un substrat comprenant un résidu issu de la distillation de produits de fermentation de parties de plantes, d'organes végétaux par exemple, b) récupération des composés produits.
2. Procédé de préparation de composés odorants volatils (dits arômes) selon la revendication 1 , comprenant les étapes de : a) culture dans des conditions de fermentation dans un milieu en phase aqueuse, d'au moins un microorganisme choisi pour sa capacité à synthétiser lesdits composés, en présence d'un substrat comprenant un résidu issu de la distillation de produits de fermentation de parties de plantes par exemple, d'organes végétaux, b) mise en contact du milieu constitué à l'étape a) avec un milieu en phase lipidique solide à température ambiante, pendant un temps suffisant pour permettre la récupération par absorption dans la phase lipidique, de tout ou partie des composés odorants volatils produits.
3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que le substrat comprend un résidu de la distillation du vin.
4. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que le substrat est choisi parmi les résidus de distillation de produits de fermentation, de betteraves, de canne à sucre, de malt, d'orge, de blé.
5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le substrat comprend un résidu de la distillation du vin et en ce que le milieu en phase lipidique est une graisse végétale ou un mélange de graisses végétales. 43
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le microorganisme est une bactérie, une levure ou un champignon.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'étape de culture met en oeuvre au moins un microorganisme du genre Sporobolomyces odorus capable de produire des arômes et un substrat comprenant de la vinasse.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la préparation d'arômes, caractérisé en ce que l'étape de culture est réalisée dans des conditions de fermentation aérobie, de S. odorus en présence d'un substrat comprenant de la vinasse, le pH du milieu étant compris entre 4 et 7, de préférence égal à environ 6, la température étant comprise entre 10°C et 50°C, de préférence voisine de 24°C.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la vinasse est enrichie en composés organiques, par exemple glucidiques, notamment en glucose, ou minéraux, utiles pour la formation d'arômes.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'étape de culture est réalisée en présence d'un précurseur favorisant la synthèse des composés recherchés.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'étape de culture est réalisée en présence d'acide ricinoléique ou de dérivé d'acide ricinoléique tels que des sels d'acide ricinoléique assimilable par le(les) microorganisme(s).
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , caractérisé en ce que l'étape de culture est réalisée en présence d'un ester d'acide ricinoléique, notamment en présence de ricinoléate de méthyle.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 caractérisé en ce que l'étape de culture comprend la culture de S. odorus en présence d'un substrat comprenant de la vinasse et du ricinoléate de méthyle, dans des conditions de fermentation aérobie, le pH du milieu étant compris 44
entre 4 et 7 et la température étant comprise entre 10°C et 50°C le ricinoléate de méthyle étant introduit dans le milieu de culture de façon fractionnée au cours de l'étape de culture, jusqu'à atteindre une quantité comprise entre 0,03 et 5 % à la fin de l'étape de culture.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'un apport de ricinoléate de méthyle est effectué précocement dès la mise en culture.
15. Procédé selon la revendication 13 ou la revendication 14, caractérisé en ce que la quantité de ricinoléate de méthyle introduite lors de l'étape de culture est fractionnée en au moins 4 apports.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que la quantité de ricinoléate de méthyle introduite au cours de chaque apport est comprise entre 0,008 % (v/v) et 5 % (v/v), de préférence comprise entre 0,008 % (v/v) et 0,2 % (v/v), avantageusement entre 0,03 %
(v/v) 0,10 % (v/v).
17. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que la quantité de ricinoléate de méthyle introduite au cours de chaque apport est voisine de
0,18 % (v/v).
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que la quantité de ricinoléate de méthyle mise en oeuvre lors de l'étape de culture est telle que la quantité produite de γ-décalactone est comprise entre 50 mg/l et 700 mg/l en phase aqueuse.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que l'étape de culture est réalisée sur une durée minimum de 24 heures.
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que la densité optique (DO à 620 nm) initiale des microorganismes apportés pour la réalisation de l'étape de culture est comprise entre 0,1 et 20, de préférence entre 0,2 et 15 avantageusement entre 1 et 15.
21 . Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que la densité 45
optique (DO à 620 nm) initiale des microorganismes apportés pour la réalisation de l'étape de culture est comprise entre 5 et 15 ou entre 5 et 10.
22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 21 , caractérisé en ce que le milieu de culture comprend un tensioactif.
23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, caractérisé en ce que les microorganismes sont choisis parmi les suivants, le cas échéant après recombinaison :
Sporobolomyces odorus, Yarrowia lipolytica, Saccharomyces cerevisiae, Lenzites betulina, Pénicillium sp., Fusarium sp., Fusarium moniliforme, Cylindrocarpon radicicola, Lactococcus lactis, Bacillus, Aspergillus, Claviceps purpurea, Streptomyces dimorphogenes.
24. Procédé selon l'une quelconques des revendications 2 à 23, caractérisé en ce que le milieu en phase lipidique comprend une huile de noix de coco hydrogénée ou un mélange de type TTT.
25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 24, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de séparation des arômes absorbés dans le milieu en phase lipidique par extraction avec un alcool.
26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que l'extraction au moyen d'un alcool comprend les étapes de 1 ) solubilisation du milieu lipidique solide dans l'éthanol 96° à raison de
1V/10V,
2) barattage de la solution éthanolique à -20°C pendant une heure,
3) séparation de l'alcool contenant les arômes du milieu lipidique cristallisé, par exemple par filtration.
27. Procédé d'extraction d'arômes contenus dans un milieu en phase aqueuse comprenant la mise en contact du milieu en phase aqueuse contenant les arômes, avec un milieu en phase lipidique, pendant un temps suffisant pour permettre l'absorption de tout ou partie des arômes dans la phase lipidique, caractérisé en ce que le milieu en phase lipidique est un milieu solide à 46
température ambiante.
28. Procédé d'extraction d'arômes contenus dans un milieu en phase aqueuse selon la revendication 27, caractérisé en ce que le milieu en phase lipidique est une graisse végétale ou un mélange de graisses végétales, par exemple une huile de noix de coco hydrogénée ou un mélange de type TTT.
29. Procédé d'extraction d'arômes contenus dans un milieu en phase aqueuse selon l'une quelconque des revendications 27 ou 28, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de séparation des arômes absorbés dans le milieu en phase lipidique par extraction avec un alcool.
30. Procédé d'extraction selon la revendication 29, caractérisé en ce que l'extraction au moyen d'un alcool comprend les étapes de
1 ) solubilisation du milieu lipidique solide dans l'éthanol 96° à raison 1V/10V,
2) barattage de la solution éthanolique à -20°C pendant une heure, 3) séparation de l'alcool contenant les arômes du milieu lipidique cristallisé par exemple par filtration.
31. Procédé d'extraction d'arômes selon l'une quelconque des revendications 1 à 28, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre in situ de façon continue avec la production des arômes dans le milieu en phase aqueuse.
32. Procédé d'extraction d'arômes selon l'une quelconque des revendications 1 à 28, caractérisé en ce que la production des arômes et l'extraction des arômes sont réalisées dans des compartiments séparés.
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