FR2775287A1 - Peptides synthetiques consensus utilisables dans les essais biologiques pour la detection des infections dues aux virus vih 1 du groupe o - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne des peptides synthétiques trouvant leur application dans les essais biologiques de détection des infections dues aux virus VIH-1 du groupe O, leur procédé de préparation, des compositions et des trousses contenant de tels peptides ainsi que les essais biologiques mettant en oeuvre de tels peptides.
Description
L'invention concerne des peptides synthétiques utilisables dans les essais
biologiques pour la détection des infections dues aux virus VIH-1 du groupe O, leur procédé de préparation, des compositions et des trousses contenant de tels
peptides ainsi que les essais biologiques mettant en oeuvre de tels peptides.
Des rétrovirus VIH-1 du groupe O sont connus dans l'art antérieur. Le brevet EP 0 345 375 et la demande de brevet EP 0 657 532 décrivent les isolats ANT 70 et ANT 70 NA isolés chez des malades Camerounais. Ces documents décrivent plus précisément des antigènes et des compositions antigéniques contenant des lysats ou des protéines de ces isolats, les acides nucléiques correspondant à l'ARN génomique, des méthodes d'hybridation mettant en oeuvre ces acides nucléiques, des méthodes de production des isolats dénommés ci-dessus ainsi que des procédés de préparation de protéines p12,
p16, p25, gp41 gp120 de ces rétrovirus.
La demande EP 0591 914 décrit l'isolat MVP 5180/91. Cet isolat caractérisé par Western Blot présente, comme l'isolat précédent, des différences par rapport aux isolats du rétrovirus VIH-1 connus depuis longtemps. La demande EP 0 591 914 décrit précisément la séquence d'ADN de l'isolat MVP 5180/91 et indique précisément la localisation des gènes gag, pol et env. La demande EP 0 591 914 décrit encore des peptides synthétiques de la boucle V3 ainsi que de la région immunodominante (gp41). Ces derniers sont utiles pour
des essais biologiques, notamment pour la détection, in vitro, des anticorps VIH-
i du groupe O. La demande EP 0 673 948 décrit des peptides synthétiques ou recombinés constitués de 15 à 50 acides aminés (AA) et comportant la séquence -VWGIRQLRARLQALETLIQNQQRLNLWGXKGKLIXYTSVKWNTSWSGR- dans laquelle X représente soit un résidu de cystéine, soit un résidu de sérine. Ces peptides sont utiles dans le domaine diagnostique pour la détection des infections dues à certains isolats de rétrovirus VIH-1 du groupe O. On connaît également la demande EP 0 727 483 qui décrit l'isolat MVP 2901/94 qui fait aussi partie des rétrovirus appartenant à la famille VIH-1 du groupe O. Cette demande décrit certains antigènes ayant des séquences peptidiques bien déterminées. Ces séquences peptidiques correspondent à une
partie de la séquence de la gp120 de l'isolat MVP 2901/94.
La demande WO 96/12809 décrit deux nouveaux isolats appartenant à la famille VIH-1 du groupe O. Il s'agit des isolats VAU et DUR. Cette demande décrit certaines séquences peptidiques issues des deux virus cités ci-dessus, utiles pour la détection d'anticorps reconnaissant les sequences peptidiques VIH-1 VAU ou DUR. La demande WO 96/32293 décrit deux antigènes issus de la séquence de l'isolat ANT 70. Il s'agit de l'antigène appelé MDL061 et de l'antigène MDL056, de la région immunodominante de la gp41. Selon cette invention, pour détecter 100% des échantillons des sérums de malades infectés par le virus de VIH-1 du groupe O, il est nécessaire d'utiliser des compositions contenant ces deux peptides, puisque chaque peptide isolé ne permet pas à lui seul d'obtenir des
résultats satisfaisants.
En effet, il est connu, que même lorsque l'on utilise des réactifs sérologiques issus des isolats du groupe O, il n'est pas souvent possible de dépister tous les malades infectés par des rétrovirus VIH-1 du groupe O; cela signifie qu'il n'est pas possible d'obtenir des réactifs qui garantissent 100% de sensibilité. Le groupe O ainsi soulève pour la première fois un problème important; il s'agit de l'inadéquation de certains réactifs sérologiques à reconnaître des individus contaminés par des groupes ou sous-types particulièrement divergents. C'est le cas justement des VIH1 du groupe O. La demande WO 96/40763 insiste aussi sur la grande divergence du groupe O. Cette demande décrit des peptides qui incorporent, dans une séquence naturelle VIH-1 de type B, quelques petites modifications (remplacement d'un ou de deux acides aminés). Selon cette demande, ces peptides hybrides sont capables de réagir avec des anticorps anti groupe O. La demande WO 96/27013 décrit une série de nouveaux virus VIH1 du groupe O désignés BCF 01, BCF 02, BCF 03, BCF06, BCF 07, BCF 08, BCF09, BCF11, BCF12, BCF13 et BCF14 ainsi qu'une série de peptides de la région dominante de la gp41 correspondante dénommés ESS/BCF02, FAN/BCF01,
LOB/BCF06, MAN/BCF07, NKO/BCF08, POC/BCF03, NAN/BCF11, BCF09,
BCF12, BCF13 et BCF14. Un certain nombre de ces peptides sont peu maniables en diagnostic à cause de leur faible solubilité, notamment le peptide
BCF13.
De manière inattendue, il a été maintenant trouvé que certains peptides synthétiques sont des réactifs diagnostiques de qualité supérieure et permettent
de dépister de manière satisfaisante les malades infectés par les rétrovirus VIH-
1 du groupe O. Ces peptides sont composés de séquences variables articulées autour de courtes séquences très conservées, présentes dans les isolats des rétrovirus VIH-1 du groupe O. Les peptides de l'invention permettent d'obtenir des résultats beaucoup plus performants que ceux obtenus avec des peptides synthétiques porteurs d'épitopes immunodominants de la gp41 (env) de certains isolats VIH-1 du groupe O. Par la suite, pour dénommer les acides aminés, on utilisera la
nomenclature à trois lettres.
Les peptides synthétiques de l'invention répondent à la formule générale (I): A-Z-TrpGlyCys-O-CysTyrThrSer-Q (1) dans laquelle: -A représente un radical biotinyle, un radical biocytinyle, un atome d'hydrogène, un radical acétyle (CH3CO-), une chaîne aliphatique pouvant contenir une ou deux fonctions thiol, aldéhyde ou amine, la chaîne aliphatique étant de préférence une chaîne alkyle de 1 à 6 atomes de carbone ou une chaîne alcényle de 2 à 6 atomes de carbone, ou une chaîne aminoalkylcarbonyle de 2 à 6 atomes de carbone, -Z représente une séquence peptidique d'une des formules (Il) à (X): -=-Ser--=72 (11) Ser- -2 (111) -,-Ser (IV) -Wl-Gln-.2 (V) -Gln--2 (Vl) -=,-Gln (VI I) _,-Asn-=-2 (VIII) Asn-E2 (IX) -'-Asn (X) dans lesquelles: --, représente une séquence peptidique de 0 à 9 acides aminés et --2 représente une séquence peptidique de 0 à 5 acides aminés, - représente une séquence peptidique de formule (XI): -(AAl)-(AA2)- (AA3) -(AA4)-(AAs)- (Xl) dans laquelle: * (AA) représente soit un résidu lysine, soit un résidu arginine, soit un résidu ornithine, * (AA2) représente soit un résidu glycine, soit un résidu asparagine, * (AA3) représente soit un résidu lysine, soit un résidu arginine, soit un résidu ornithine, * (AA4) représente soit un résidu leucine, soit un résidu alanine, soit un résidu isoleucine, soit un résidu glutamine, * (AA5s) représente soit un résidu isoleucine, soit un résidu valine, soit un résidu leucine, soit un résidu thréonine, soit un résidu norleucine, soit un résidu norvaline, à condition toutefois que (AAM), (AA2), (AA3), (AA4) et (AAs) ne forment jamais ensemble les séquences peptidiques -Lys Gly Lys Leu le- et -Lys Gly Lys Leu Val-, -Q, fixé sur le groupe -CO- de la sérine représente: - un groupe hydroxyle (-OH) ou amino (-NH2), - un radical alcoxy comportant de 1 à 6 atomes de carbone, - une séquence peptidique de formule (XII) ou (XIII): -VaI-(AA6)-Trp Asn-(AA7)-(AA8) (XII) -Val-OH ou -Val-NH2 (XIII) dans lesquelles: * (AA6) représente un acide aminé différent de la lysine, * (AA7) représente un acide aminé, * (AA8) représente un résidu sérine ou thréonine, - ou une séquence peptidique de formule (la): -Z-TrpGlyCys-O-CysTyrThrSer-Q' (la) dans laquelle Z et E) ont la définition donnée pour la formule (I) et n' représente un radical hydroxy (OH), un radical amino (NH2), un radical alcoxy comportant de 1 à 6 atomes de carbone ou une
séquence peptidique de formule (XII) ou (XIII).
Lorsque Q représente une séquence peptidique de formule (la), le peptide de formule (I) devient un dimère, dont la taille peut varier de 26 à 66 acides aminés. Lorsque Q ne représente pas une séquence peptidique de formule (la), les peptides selon l'invention, de formule (I) sont de type monomère et la taille
peut varier de 13 à 33 acides aminés.
Les peptides selon l'invention peuvent être soit sous forme linéaire, soit
s sous forme cyclisée par l'intermédiaire de ponts disulfures intercystéines.
On préfère les composés de la formule (I) dans laquelle (AA5) représente soit un résidu valine, soit un résidu leucine, soit un résidu thréonine, et lorsque Q correspond à une séquence peptidique de formule (XII) (AA6) représente soit
un résidu glutamine, soit un résidu arginine.
On préfère les peptides de formule (I) dans laquelle: -A représente un radical biotinyle, un atome d'hydrogène, ou une chaîne aliphatique pouvant contenir une ou deux fonctions thiol, aldéhyde ou amine, la chaîne aliphatique étant de préférence une chaîne alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, ou une chaîne aminoalkylcarbonyle de 2 à 6 atomes de carbone, -Z représente une séquence peptidique de formule (Il) ou (V) dans lesquelles El représente une séquence peptidique de deux acides aminés et -=2 représente un acide aminé, ou une séquence de formule (IV) dans laquelle -, représente trois acides aminés, ou une séquence peptidique de formule (VIII) dans laquelle - représente une séquence peptidique de neuf, huit ou trois acides aminés et --2 une séquence peptidique de cinq acides aminés, -E représente une séquence peptidique de formule:
-Lys Gly Arg Leu Val-
ou
- Arg Gly Arg Leu Val-
et -Q représente un groupe hydroxyle, la séquence peptidique (XIII) ou une séquence peptidique de formule: - Val Arg Trp Asn Glu Thr De préférence Z représente une séquence peptidique de formule:
* -Leu Leu Ser Ser-
-Leu Leu Asn Ser-
* -Arg Leu Asn Ser-
* -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gin Asn Gin Gin Leu Leu Asn Ser-
* -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gin Asn Gin Gin Leu Leu Asn lie -
* -Leu Asn Gin Gin Arg Leu Leu Asn Ser-
OU ou
-Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gin Gin Arg Leu Leu Asn Ser-
On préfère tout peptide incluant l'une des séquences suivantes comportant de 16 à 50 acides aminés. Ces séquences sont données selon les nomenclatures à une et à trois lettres: Séquence N 1:
-LLSSWGCKGRLVCYTS-
ou
-Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser-
1 5 10 15
Séquence N 2:
-LLNSWGCKGRLVCYTS-
ou
-Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser-
i 5 10 15 Séquence N 3:
-ALETLLQNQQLLNSWGCRGRLVCYTSVRWNET-
ou -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gin Asn Gin Gin Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly
1 5 10 15
Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr-
25 30
Séquence N 4:
-ALETLLQNQQLLNIWGCRGRLVCYTSVRWNET-
ou -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gin Asn Gin Gin Leu Leu Asn lie Trp Gly Cys Arg Gly
1 5 10 15
Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr-
25 30
Séquence N 5:
-ALETLLQNQQLLDLWGCRGRLVCYTSVRWNET-
ou -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gin Asn Gin Gin Leu Leu Asp Leu Trp Gly Cys Arg Gly
1 5 10 15
Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr-
25 30
Séquence N 6:
-LNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV-
ou -Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr
1 5 10 15
Thr Ser Val-
Séquence N 7:
-RALETLLNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV-
ou - Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys i 5 10 15
Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val-
Séquence N 8:
-RLNSWGCKGRLVCYTSV-
ou
- Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val-
1 5 10 15
Les peptides synthétiques ci-après sont des peptides particulièrement préférés: Peptide N 1 (12B):
LLSSWGCKGRLVCYTS
ou Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser
1 5 10 15
Peptide N 2 (14B):
LLNSWGCKGRLVCYTS
ou Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser
1 5 10 15
Peptide N 3 (18B):
ALETLLQNQQLLNSWGCRGRLVCYTSVRWNET
ou Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gin Asn Gin Gin Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly
1 5 10 15
Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr
25 30
Peptide N 4 (19B):
ALETLLQNQQLLNIWGCRGRLVCYTSVRWNET
ou Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gin Asn Gin Gin Leu Leu Asn lie Trp Gly Cys Arg Gly
1 5 10 15
Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr
25 30
Peptide N 5 (20B):
ALETLLQNQQLLDLWGCRGRLVCYTSVRWNET
ou -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gin Asn Gin Gin Leu Leu Asp Leu Trp Gly Cys Arg Gly
1 5 10 15
Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr
20 25 30
Peptide N 6 (21 B):
LNQQ RLLNSWGCKGRLVCYTSV
ou Leu Asn Gin Gin Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr
1 5 10 15
Thr Ser Val Peptide N 7 (22B):
RALETLLNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV
ou Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gin Gin Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys
1 5 10 15
Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val
25
Peptide N 8 (23B):
RLNSWGCKGRLVCYTSV
ou Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val
1 5 10 15
Les peptides synthétiques de formule (1), objet de la présente invention, peuvent être obtenus par synthèse en phase solide selon des méthodes classiques: R.B. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. (1963), 85, pp. 21492154; R.C. Sheppard, in " Peptides 1971 ", Nesvadba H. (ed.) North Holland, Amsterdam, pp. 111; E. Atherton and R.L. Sheppard, in " Solid phase peptide synthesis, a practical approach ", IRL PRESS, (1989), Oxford University Press, pp. 25-34. Comme synthétiseur automatique, on peut utiliser le synthétiseur
" 9050 Plus Pep Synthesizer " de Millipore ou un synthétiseur équivalent.
Le support solide, utilisé pour les synthèses, doit être compatible avec la technique et la chimie utilisées. Par exemple, pour une synthèse sur le synthétiseur " 9050 Plus pep. Synthesizer ", il est recommandé d'utiliser une résine adaptée à la technique dite " en flux continu "; les résines PEG PS répondent à ces critères. Ces supports sont constitués d'un bras (" spacer ") à base de polyéthylène glycol (PEG) situé entre le groupement fonctionnel du polystyrène des billes et le point d'accrochage du premier acide aminé. La
nature de ce point d'ancrage peut varier selon la fonction C-terminale choisie.
Dans le cas présent, différentes résines PEG-PS ont été utilisées.
La résine de départ et les acides aminés utilisés comme matière première sont des produits disponibles dans le commerce (PerSeptive-Biosystem, ou Néosystem). Pour la synthèse peptidique, les groupements protecteurs de chaînes latérales suivants ont été utilisés: Acides aminés Groupement protecteur
Arginine Pentaméthyl-2,2,4,6,7-dihydrobenzofurane-5-
sulfonyle (Pbf) Asparagine, Glutamine Trityle (Trt) Cystéine Trityle (Trt) ou Acétamidométhyle (Acm) Sérine, Thréonine, Ether tert-butyle (tBu) Tyrosine Lysine, Tryptophane Tert-butyloxycarbonyle (Boc) La protection temporaire de la fonction amine primaire en oa des acides aminés utilisée est le groupement 9- fluorénylméthyloxylcarbonyle (Fmoc). La déprotection est effectuée par une solution de pipéridine à 20% en diméthylformamide. Pour le couplage, on utilise de préférence un excès de
diisopropylcarbodiimide (DIPCDI) et d'hydroxy-1-benzotriazole (HOBt).
Après synthèse, la résine est lavée avec des solvants organiques, (diméthylformamide, puis dichlorométhane) séchée sous vide puis traitée par une solution à base d'acide trifluoroacétique (TFA) refroidie à 0 C et contenant des " scavengers " appropriés. On peut utiliser, par exemple, le réactif K contenant 82% d'acide trifluoroacétique, 5% de phénol, 5% d'eau, 5% de
thioanisole et 3% d'éthanedithiol.
Après filtration de la résine, les peptides synthétiques sont précipités et
rincés à l'éther.
Les peptides synthétiques sont ensuite purifiés par chromatographie liquide en phase inverse et leur pureté est déterminée par spectrométrie de masse. Comme phase solide, on peut utiliser, par exemple, la phase Bondapack C-18. Les peptides sont élués en réalisant un gradient linéaire entre deux solutions tampons, le premier essentiellement aqueux (par exemple eau-TFA 0,1 %) et le second plutôt organique (par exemple un mélange contenant d'acétonitrile 60 %, eau 39,92 % et TFA 0,08 %). Les fractions pures collectées
sont rassemblées, concentrées sous vide et lyophilisées.
Pour la cyclisation, les peptides synthétiques purifiés sont dissous dans une solution d'acétate d'ammonium (10mM). Le pH est ajusté à 8,5 par addition d'ammoniaque 1 M. La solution est vigoureusement agitée. La cyclisation est complète après 18 heures. Le pH est ensuite abaissé à 6 par addition d'acide acétique. Les peptides cyclisés sont lyophilisés, puis purifiés par chromatographie liquide en phase inverse comme cela a été décrit précédemment. L'immunoréactivité des peptides de l'invention a été évaluée à l'aide de sérums de malades camerounais infectés par des rétrovirus VIH-1 du groupe O. Les différents essais effectués ont démontré que les peptides de l'invention, seuls ou en association (compositions de peptides), permettent de détecter 100% des sérums infectés par des rétrovirus VIH-1 du groupe O. Les peptides synthétiques de l'invention trouvent donc leur application
dans les immunoessais pour le dépistage des infections dues aux rétrovirus VIH-
1 du groupe O. Il est également possible d'utiliser des compositions de peptides synthétiques de formule (I). Ces compositions, qui peuvent contenir deux ou
plusieurs peptides de formule (I), font aussi partie de l'invention.
Il est également possible d'utiliser des peptides synthétiques de formule (I) de la présente invention en association avec des peptides recombinés VIH-1 du groupe O tels qu'ils peuvent être obtenus par des méthodes classiques et ayant les séquences décrites dans la demande EP 0 591 914. De telles compositions entrent aussi dans le cadre de la présente invention. Les peptides synthétiques de l'invention peuvent être également utilisés en association avec d'autres peptides synthétiques ou recombinés VIH-1 et/ou VIH-2, tels que les peptides décrits dans les demandes de brevets ou brevets EP 0 387 914, EP 0 239 425, EP 0 220 273, ou EP 267 802. Cette liste de demandes de brevets ou brevets n'est pas exhaustive et est donnée à titre
d'exemple.
Les compositions contenant un ou plusieurs peptides synthétiques de formule (I) et un ou plusieurs peptides synthétiques ou recombinés VIH-1 ou VIH-2 trouvent leur application en diagnostic pour le dépistage de malades infectés par différents rétrovirus VIH. Ces compositions font également partie de
la présente invention.
Des procédés d'immunodosage utilisant un ou plusieurs peptides synthétiques de formule (I), seuls ou en association avec des peptides recombinés VIH-1 du groupe O ou des peptides synthétiques ou recombinés
VIH-1 et/ou VIH-2, font également partie de l'invention.
L'invention vise également des trousses, pour la mise en oeuvre d'immunodosages, qui incluent un peptide de formule (I) ou une composition qui
contient au moins un peptide de formule (I).
Les exemples suivants illustrent l'invention et sont donnés à titre non limitatif.
EXEMPLE 1:
Préparation d'un composé selon l'invention: PEPTIDE N 7 (22B) Le peptide N 7 (22B) a été synthétisé en phase solide. La technique mise au point en 1963 par Merrifield (J. Am. Chem. Soc. (1963) ô, pp. 2149- 2154) consiste à fixer le premier acide aminé sur un support solide polymérique (résine) par sa fonction acide et à allonger la séquence peptidique à partir de ce
premier acide aminé, le peptide en cours de synthèse restant ancré sur la résine.
Pour la synthèse du peptide N 7 (22B), ont été utilisés, comme synthétiseur, le synthétiseur " 9050 Plus Pep Synthetiser " et comme résine, la
résine Fmoc PAL PEG-PS.
Les différentes étapes de la synthèse sont résumées dans le tableau I ci-
après:
Tableau I
RESIDU PROTECTION PROTECTION METHODE DE NOMBRE D'EQ -
ACIDE AMINE NH2 LATERALE COUPLAGE DUREE DE
COUPLAGE
Val Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Ser Fmoc tBu DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Thr Fmoc tBu DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Tyr Fmoc tBu DIPCDI/HOBt 5 eq mn Cys Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Val Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Leu Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Arg Fmoc Pbf DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Gly Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Lys Fmoc Boc DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Cys Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Gly Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Trp Fmoc Boc DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Ser Fmoc tBu DIPCDI/HOBt 5 eq mn Asn Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 e - 45 mn Leu Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Leu Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Arg Fmoc Pbf DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Gin Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Gin Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 eq mn Asn Fmoc Trt DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Leu Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Leu Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Thr Fmoc tBu DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Glu Fmoc OtBu DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Leu Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Ala Fmoc DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Arg Fmoc Pbf DIPCDI/HOBt 5 eq - 45 mn Après la fin de la synthèse, la résine a été lavée avec du diméthylformamide, puis du dichlorométhane et séchée sous vide. Ensuite, la résine a été traitée avec du réactif K (acide trifluoacétique 82 %; phénol 5 %; eau 5 %; thioanisole 5 %; éthanedithiol 3 %). Le peptide N 7 (22B) isolé par précipitation à l'aide de dioxyde de diéthyle, a été ensuite
rincé avec le même solvant. On a ainsi obtenu 140 mg du peptide N 7 (22B).
Le peptide N 7 (22B) a été ensuite purifié par chromatographie liquide en
phase inverse. Comme phase solide, il a été utilisé la phase Bondapack C18.
Le peptide a été élue en réalisant un gradient linéaire entre deux solutions tampons, le premier essentiellement aqueux (par exemple eau- TFA 0,1 %) et le second plutôt organique (par exemple un mélange contenant acétonitrile 60 %, eau 39,92 % et TFA 0,08 %). Les fractions pures collectées ont été rassemblées,
concentrées sous vide et lyophilisées.
Pour la cyclisation, le peptide synthétique purifié, ainsi obtenu a été dissous dans une solution d'acétate d'ammonium (10mM). Le pH a été ajusté à 8,5 par addition d'ammoniaque 1 M. La solution a été vigoureusement agitée. La cyclisation a été complète après 18 heures. Le pH a été ensuite abaissé à 6 par addition d'acide acétique. Le peptide cyclisé a été lyophilisé, puis purifié chromatographie liquide en phase inverse comme cela a été décrit précédemment. De manière équivalente, et en utilisant les résines et acides aminés
appropriés, les autres composés de l'invention ont été synthétisés.
Le tableau Il indique le poids moléculaire de certains peptides de formule
(I), sous forme non cyclisée, évalué par spectrométrie de masse.
Tableau II Peptide N Poids moléculaire (Daltons)
1 (12B) 1772
2 (14B) 1799
3 (18B) 3752
4 (19B) 3778
(20B) 3780
6 (21 B) 2538
7 (22B) 3222
8 (23B) 1941
EXEMPLE 2:
Evaluation par test immunoenzymatique de l'immunoréactivité des peptides selon l'invention Les échantillons de sérums de malades infectés par des rétrovirus VIH-1 du groupe O ont été obtenus par le Centre Pasteur de Yaoundé au Cameroun et ont été serotypés groupe O selon l'algorithme sérologique décrit dans AIDS
(1977), 11, pp. 445-453. Un échantillon (Maryland) genotypé provient des Etats-
Unis. Ces échantillons ont été préalablement dilués en sérum humain négatif aux dilutions données dans le tableau III afin de disposer d'un volume suffisant
pour les différents essais d'immunoréactivité.
Les peptides synthétiques utilisés ont été dissous dans l'eau à une concentration de 1 mg/ml (solution mère). Pour l'étape de sensibilisation de la phase solide (" coating "), 110!.l d'une solution à 2.g/ml de chaque peptide (obtenue par dilution de la solution mère avec de la solution tampon carbonate 0,1 M) ont été ajoutés à chaque cupule de plusieurs plaques de microtitrage MicrotiterTM (NUNC). Après incubation pendant une nuit à température ambiante, les microplaques ont été d'abord lavées avec une solution tampon Tris NaCI pH 7,4 contenant 0,1% de Tween 20 et du merthiolate de sodium à 0,001%, puis saturées avec une solution de PBS contenant 0,5% de RégilaitTM (lait écrémé desséché). Après aspiration de la solution de la saturation, les plaques ont été
chauffées pendant 10 mn à 50 C.
Les échantillons de sérums ont été dilués au 1/5 avec une solution de lait écrémé (en tampon citrate additionné de rouge de phénol à 0,01%, de chloroforme à 0,25% et de Kathon à 0,25%), déposés sur les cupules des
plaques et mis à incuber pendant 30 mn à 40 C.
Après lavage avec une solution tampon Tris NaCI pH 7,4 contenant 0,1% de Tween 20 et du merthiolate de sodium à 0,001%, 100 pl d'une solution de conjugué d'anticorps de chèvre anti IgG et IgM humaines marqués à la peroxydase du raifort, contenant comme conservateur du merthiolate de sodium à 0,01%, en solution dans une solution tampon citrate additionnée de glycérol à % et du sérum normal de veau foetal à 25%, ont été ajoutés à chaque cupule
des plaques puis ces dernières ont été mises à incuber pendant 30 mn à 40oC.
Après lavage avec une solution tampon Tris NaCI pH 7,4 contenant du Tween 20 à 0,1% et du merthiolate de sodium à 0,001%, le développement de la coloration a été obtenu par addition dans chaque cupule de 100 gl de O-phenylène diamine en solution dans du peroxyde d'hydrogène. Les microplaques ont été ensuite mises à incuber pendant 30 mn à température ambiante et à l'obscurité. La réaction colorée a été ensuite arrêtée par addition de 50!l d'acide sulfurique 4N. L'absorbance (A) a été déterminée à 490 et 620 nm. L'absorbance, ou densité optique, relative (A490-A620) lue dans chaque cupule est proportionnelle à l'immunoréactivité de chaque peptide. Cela indique l'aptitude de chaque peptide à réagir avec l'échantillon biologique avec lequel
est effectué l'essai.
La réactivité des peptides de l'invention, peptides N 2 (14B), N 3 (18B), N 4 (19B), N 6 (21B), N 7 (22B), N 8 (23B) tous sous forme cyclisée, a été comparée à celle de trois peptides synthétiques homologues, ayant comme séquence une partie de la séquence naturelle de l'enveloppe (env) de rétrovirus VIH-1 du groupe O (2 peptides dérivés de l'isolat VAU et 1 peptide dérivé de
lI'isolat MVP 5180) et comportant un épitope immunodominant de la gp41.
Ces trois peptides, sous forme cyclisée, ont les séquences suivantes: VAU 22 AA (désigné " VAU Rcy " sur le tableau III) Leu Leu Asn Leu Trp Gly Cys Lys Asn Arg Ala le Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp Asn
1 5 10 15
Lys Thr
22
VAU 35 AA (désigné " VAU lonq " sur le tableau III) Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Phe le Glu Glu Asn Glu Leu Leu Asn Leu Trp Gly Cys
1 5 10 15
Lys Asn Arg Ala lle Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp Asn Lys Thr
30 35
MVP 5180 (désigné " MVP 5180 " sur le tableau III) Arg Leu Gln Ala Leu Glu Thr Leu le Gln Asn Gin Giln Arg Leu Asn Leu Trp Gly Cys
1 5 10 15
Lys Gly Lys Leu lie Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp Asn Thr Ser
30 35
Les résultats de cette étude sont indiqués dans le tableau III.
Tableau III
PEPTIDES *
N 2 N 3 N 4 N 6 N 7 N 8 | MVP 1VAU VAU-SERUM _ _5180 long Rcy
ABSORBANCE
4280 0,022 0,686 0,201 0,286 0,689 0,033 0,382 0,013 0,021
au 1/50
NGO 0,067 0,335 0,193 0,157 0,315 0,110 0,184 0,055 0,040
au 1/50 _
NJEM 0,032 0,811 0,391 0,277 0,939 0,025 0,146 0,159 0,024
au 11100
MBASSI 1,217 1,150 0,747 2,134 2,010 2,683 0,248 0,120 0,257
au 11100
WANG 0,698 0,234 0,124 2,397 2,680 1,290 0,075 0,025 0,041
au 1/50
258 OUDI 0,587 0,373 0,226 0,764 1,184 1,692 0,116 0,058 0,100
au 1/100
DO15 1,613 0,859 1,286 3,357 3,693 3,038 0,673 0,036 0,075
au 1/100
DJOU 1,268 0,482 0,419 1,998 2,088 2,166 0,203 0,022 0,042
au 1/100
3600 0,482 0,360 0,249 0,716 0,801 0,933 0,206 0,025 0,058
au 11100
3613 1,108 0,837 0,773 1,508 1,627 1,679 0,478 0,250 0,396
au 1/400
6111 0,596 0,348 0,202 0,850 1,207 1,009 0,226 0,087 0,180
au 1/100
625 0,838 0,338 0,264 2,045 2,122 1,791 0,202 0,069 0,165
au 1/50 Maryland 0,524 0,370 0,285 0,734 0,844 1,229 0,241 0,054 0,168 au 1/400
3653 0,347 0,337 0,247 0,072 0,380 0,406 0,401 0,021 0,310
au 1/10 PHASE SOLIDE*: PEPTIDE 2pg/ml Pour chaque peptide testé, les échantillons ont été rangés en quatre classes (a, b, c, et d) correspondant à divers niveaux de densité optique relative lue aux longueurs d'onde A492-A620: * -poura: DO<0,100, - pour b: 0,100 <DO <0,500, - pour c: 0,500 < DO < 1,000, * -pourd:DO > 1,000, permettant ainsi d'évaluer le degré d'immunoréactivité des peptides. Les peptides les plus immunoréactifs sont ceux pour lesquels le plus grand nombre d'échantillons est trouvé dans les classes correspondant aux densités optiques
les plus élevées.
Les résultats sont indiqués dans le tableau IV.
Tableau IV
PEPTIDES *
N 2 N 3 N 4 N 6 N 7 N 8 MVP VAU VAU-
CLASSE l l 5180 long Rcy Nombre d'échantillons a 3 0 0 1 0 2 1 11 7 b 2 9 11 3 2 2 12 3 7 c 5 4 2 4 4 1 1 0 0 d 4 1 1 6 8 9 0 0 0 PHASE SOLIDE*: PEPTIDE 2pg/mi Les résultats montrent que tous les peptides de l'invention testés réalisent une meilleure performance en immunoréactivité que les peptides de référence de l'art antérieur qui dérivent d'isolats naturels (MVP 5180, VAU), les peptides de l'invention N 7 (22B), N 6 (21B), et N 8 (23B) s'avérant les plus immunoréactifs.
Claims (1)
1 du groupe O. 10. Composition contenant un ou plusieurs peptides synthétiques de formule (I), selon la revendication 1, et un ou plusieurs peptides synthétiques ou
recombinés VIH-1 et/ou VIH-2.
11. Procédé d'immunodosage mettant en oeuvre un ou plusieurs peptides
synthétiques de formule (I), selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
12. Procédé d'immunodosage mettant en oeuvre une composition selon l'une
quelconque des revendications 7 à 10.
13. Trousse de diagnostic incluant au moins un peptide synthétique de
formule (I), selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ou une composition
selon l'une quelconque des revendications 7 à 10.
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