FR2701481A1 - Protéines de champignons filamenteux capables de réaliser la fixation et le transport de lipides, leur procédé d'obtention et leurs applications. - Google Patents
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Abstract
Famille de protéines de fixation et de transport de lipides, leur procédé d'obtention à partir de champignons, ainsi que leurs applications en cosmétologie, dans l'industrie agro-alimentaire et dans le domaine de la pharmacie. Ces protéines sont aptes à réaliser la fixation, le transport et/ou le réarrangement intermembranaires de lipides, éventuellement associés à des principes actifs, sont hydrophobes et acides, présentent un poids moléculaire inférieur à 50 kDa, et sont susceptibles d'être obtenues à partir d'un champignon filamenteux non toxique, capable de se développer sur un milieu riche en lipides, notamment à partir d'extraits bruts de ces champignons.
Description
La présente invention est relative à une famille de protéines de fixation et de transport de lipides, à leur procédé d'obtention à partir de champignons, ainsi qu'à leurs applications en cosmétologie, dans l'industrie agro-alimentaire et dans le domaine de la pharmacie.
La présente invention est également relative à des extraits bruts de champignons contenant de telles protéines et à leurs applications dans le domaine de la pharmacie, de la cosmétologie et dans le domaine- agroalimentaire.
Les membranes sont le siège de nombreuses fonctions dans le développement des organismes vivants (reconnaissance et échange cellulaires, respiration, excrétion...).
L'ingénierie des biomembranes, en particulier, implique la modification de leur composition et de leur organisation.
Or, les membranes constituent une barrière difficilement modifiable.
La nécessité d'outils aisément utilisables pour induire de telles modifications se fait crucialement sentir, notamment pour améliorer l'efficacité de l'action des liposomes, dont les applications sont nombreuses aussi bien dans le domaine du médicament qu'en cosmétologie et de manière générale, pour produire des biomembranes modifiées.
La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à des protéines, susceptibles d'être produites par des champignons filamenteux et capables de réaliser des transports intermembranaires de lipides (phospholipides, acides gras, glycolipides, stérols) et de principes actifs, qui répondent mieux aux besoins de la pratique, notamment en ce qu'elles permettent d'améliorer les activités biologiques et tensioactives des membranes.
La présente invention a pour objet une famille de protéines, caractérisées
- en ce qu'elles sont aptes à réaliser la fixation, le transport et/ou le réarrangement intermembranaires de lipides, éventuellement associés à des principes actifs,
- en ce qu'elles sont hydrophobes et acides,
- en ce qu'elles présentent un poids moléculaire inférieur à 50 kDa, et
- en ce qu'elles sont susceptibles d'être obtenues à partir d'un champignon filamenteux non toxique, capable de se développer sur un milieu riche en lipides.
- en ce qu'elles sont aptes à réaliser la fixation, le transport et/ou le réarrangement intermembranaires de lipides, éventuellement associés à des principes actifs,
- en ce qu'elles sont hydrophobes et acides,
- en ce qu'elles présentent un poids moléculaire inférieur à 50 kDa, et
- en ce qu'elles sont susceptibles d'être obtenues à partir d'un champignon filamenteux non toxique, capable de se développer sur un milieu riche en lipides.
Ces protéines acides d'origine fongique permettent, en raison de leur capacité de fixation, de transport et de transfert intermembranaire de lipides (phospholipides, acides gras, stérols et glycolipides), d'améliorer, de manière surprenante, les activités biologiques et tensioactives des membranes cellulaires et des biomembranes.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdites protéines acides de transfert de lipide présentent un poids moléculaire d'environ 18 kDa.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdites protéines acides de transfert de lipide présentent un poids moléculaire d'environ 30 kDa.
Aussi bien la protéine de 18 kDa que la protéine de 30 kDa sont actives pour le transfert des lipides ; la protéine de 30 kDa est toutefois plus active que la protéine de 18 kDa, pour le transfert de la phosphatidylcholine.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ces protéines acides sont susceptibles d'être obtenues à partir d'un champignon filamenteux sélectionné dans le groupe comprenant les Ascomycètes, les Zygomycètes et les Basidiomycètes.
Au sens de la présente invention, ces diffé rents groupes incluent aussi bien les souches mères que les variants ou mutants de ces souches mères.
Selon#une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, les Ascomycètes sont choisis parmi Aspergillus candi dus, A. flavipes, A. fumigatus, A. giganteus,
A. niger, A. ochraceus, A. oryzae, A. terreus, A. versi color, A. wentii, Penicillium roquefortii et Eurotium chevalieri.
A. niger, A. ochraceus, A. oryzae, A. terreus, A. versi color, A. wentii, Penicillium roquefortii et Eurotium chevalieri.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, les Zygomycètes sont choisis parmi
Mucor mucedo et Rhizopus stolonifer.
Mucor mucedo et Rhizopus stolonifer.
Selon encore une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, les Basidiomycètes sont sélectionnés parmi l'espèce Phanerochaete chrysosporium,
Les différentes souches précitées, de manière non limitative, sont en particulier déposées auprès de collections, comme précisé dans le tableau ci-après
Les différentes souches précitées, de manière non limitative, sont en particulier déposées auprès de collections, comme précisé dans le tableau ci-après
<tb> <SEP> n <SEP> <SEP> de <SEP> la <SEP> souche <SEP> et
<tb> <SEP> Souches <SEP> Collection <SEP> où <SEP> la <SEP> souche
<tb> <SEP> a <SEP> été <SEP> déposée
<tb> Aspergillus <SEP> candidus <SEP> n <SEP> <SEP> 2.12 <SEP> LMTC
<tb> A. <SEP> flavipes <SEP> n <SEP> <SEP> 2.6 <SEP> LMTC
<tb> A. <SEP> fumigatus <SEP> n <SEP> <SEP> 978 <SEP> MUCL
<tb> A.<SEP> giganteus <SEP> n <SEP> <SEP> 2.8 <SEP> LMTC
<tb> A. <SEP> niger <SEP> n <SEP> <SEP> 2.7 <SEP> LMTC
<tb> A. <SEP> ochraceus <SEP> n <SEP> <SEP> 14207 <SEP> MUCL
<tb> A. <SEP> oryzae <SEP> n <SEP> <SEP> 2.14 <SEP> LMTC
<tb> A. <SEP> terreus <SEP> n <SEP> <SEP> 21932 <SEP> MUCL
<tb> A. <SEP> versicolor <SEP> n <SEP> <SEP> 2.1
<tb> A.<SEP> wentii <SEP> n <SEP> <SEP> 1043 <SEP> MUCL <SEP>
<tb> Penicillium <SEP> <SEP> roquefortii <SEP> n <SEP> <SEP> 29083 <SEP> MEJCL <SEP>
<tb> Eurotium <SEP> <SEP> chevalieri <SEP> n <SEP> <SEP> 2.10 <SEP> LMTC
<tb> Mucor <SEP> mucedo <SEP> n <SEP> <SEP> 18552 <SEP> MUCL
<tb> Rhizopus <SEP> stolonifer <SEP> n <SEP> <SEP> 5.4 <SEP> LMTC
<tb> Phanerochaete <SEP> chrysosporium <SEP> n <SEP> <SEP> F17-67 <SEP> LBCF
<tb>
Ces différentes souches sont accessibles, selon les cas, au Laboratoire de Microbiologie et Technologie Céréalières (LMTC) de 1'INRA de Nantes, à la
Mycothèque de l'Université Catholique de Louvain (MUCL,
Belgique) et au Laboratoire de Biotechnologie des Champi gnons Filamenteux (LBCF) de l'INRA de Marseille.
<tb> <SEP> Souches <SEP> Collection <SEP> où <SEP> la <SEP> souche
<tb> <SEP> a <SEP> été <SEP> déposée
<tb> Aspergillus <SEP> candidus <SEP> n <SEP> <SEP> 2.12 <SEP> LMTC
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<tb> Phanerochaete <SEP> chrysosporium <SEP> n <SEP> <SEP> F17-67 <SEP> LBCF
<tb>
Ces différentes souches sont accessibles, selon les cas, au Laboratoire de Microbiologie et Technologie Céréalières (LMTC) de 1'INRA de Nantes, à la
Mycothèque de l'Université Catholique de Louvain (MUCL,
Belgique) et au Laboratoire de Biotechnologie des Champi gnons Filamenteux (LBCF) de l'INRA de Marseille.
De telles protéines trouvent application en pharmacie, en cosmétologie et dans le domaine agro-alimentaire, associées à des lipides et de préférence à des liposomes. Elles sont avantageusement associées à ces derniers, soit en phase externe, soit en phase interne, sous une forme encapsulée.
De manière générale, de telles protéines de fixation et de transfert de lipides, également dénommées navettes protéiques améliorent l'efficacité de l'action des liposomes, par leur utilisation en tant que "vecteurs naturels" de phospholipides et d'autres molécules hydrophobes, dans toutes les applications de ces derniers.
Dans le domaine du médicament, les protéines navettes conformes à l'invention constituent des vecteurs de principes actifs et permettent de sélectionner les cellules à atteindre.
Dans le domaine agro-alimentaire, ces protéines permettent, en particulier, la valorisation des lécithines de soja (principales sources de phospholipides).
La présente invention a également pour objet des extraits bruts de champignons filamenteux, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins une protéine de fixation et de transfert de lipides (PTL) telle que définie ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux desdits extraits bruts, ils sont susceptibles d'être obtenus à partir d'un champignon filamenteux non toxique, capable de se développer sur un milieu riche en lipides, par
(a) mise en culture desdits champignons dans un milieu riche en phospholipides, jusqu'à l'obtention d'une quantité suffisante de mycélium,
(b) broyage desdits mycéliums dans un tampon d'extraction à pH neutre,
(c) séparation de l'extrait brut contenant les protéines de fixation et de transfert de lipides, à partir dudit broyat, par
centrifugation dudit broyat à une vitesse supérieure à 20 000 g (première centrifugation) et récupération du surnageant S1,
précipitation acide du surnageant S1, suivie d'une centrifugation à une vitesse supérieure à 20 000 g (deuxième centrifugation) et récupération du surnageant
S2,
(d) obtention de l'extrait brut contenant lesdites protéines de fixation et de transfert de lipides, à partir du surnageant S2, tamponné à pH sensiblement neutre.
(a) mise en culture desdits champignons dans un milieu riche en phospholipides, jusqu'à l'obtention d'une quantité suffisante de mycélium,
(b) broyage desdits mycéliums dans un tampon d'extraction à pH neutre,
(c) séparation de l'extrait brut contenant les protéines de fixation et de transfert de lipides, à partir dudit broyat, par
centrifugation dudit broyat à une vitesse supérieure à 20 000 g (première centrifugation) et récupération du surnageant S1,
précipitation acide du surnageant S1, suivie d'une centrifugation à une vitesse supérieure à 20 000 g (deuxième centrifugation) et récupération du surnageant
S2,
(d) obtention de l'extrait brut contenant lesdites protéines de fixation et de transfert de lipides, à partir du surnageant S2, tamponné à pH sensiblement neutre.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, l'étape (a) inclut
* la mise en culture desdits champignons sur un milieu de sporulation, riche en phospholipides,
* l'incubation pendant 2 à 13 jours jusqu'à obtention d'une quantité suffisante de spores,
* la mise en culture desdites spores sur un milieu de culture riche en phospholipides, et
* l'incubation jusqu'à obtention d'une quantité suffisante de mycélium.
* la mise en culture desdits champignons sur un milieu de sporulation, riche en phospholipides,
* l'incubation pendant 2 à 13 jours jusqu'à obtention d'une quantité suffisante de spores,
* la mise en culture desdites spores sur un milieu de culture riche en phospholipides, et
* l'incubation jusqu'à obtention d'une quantité suffisante de mycélium.
Selon une modalité avantageuse de cette disposition, le milieu de sporulation est avantageusement constitué de grains de mals entiers, humidifiés.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la précipitation acide de l'étape (c) est réalisée à pH 5,1.
La précipitation acide, de préférence à pH 5,1, offre, l'avantage de débarrasser les protéines de transfert de lipides des complexes lipoprotéiques solubles, qui interfèrent dans les essais de transfert de phospholipides. Il est, en outre, nécessaire de ramener le pH de l'extrait brut à pH neutre, de manière à stabiliser lesdites protéines.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, les étapes (b) et (c) sont réalisées à froid, de préférence à 4 C.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la souche de champignon filamenteux est de préférence A. oryzae.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation desdites protéines (PTL), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
(1) préparation d'un extrait brut à pH sensiblement neutre, tel que défini ci-dessus,
(2) concentration des protéines par précipitation dans un tampon à base de sel d'ammonium, suivie d'une séparation,
(3) obtention de fractions présentant une activité de fixation de transfert de lipides par gel filtration et sélection des fractions actives par mesure de l'activité de fixation et de transfert de lipides,
(4) purification des différentes fractions sélectionnées, par une succession d'étapes chromatographiques, et
(5) séparation des fractions actives obtenues en (4) par électrophorèse.
(1) préparation d'un extrait brut à pH sensiblement neutre, tel que défini ci-dessus,
(2) concentration des protéines par précipitation dans un tampon à base de sel d'ammonium, suivie d'une séparation,
(3) obtention de fractions présentant une activité de fixation de transfert de lipides par gel filtration et sélection des fractions actives par mesure de l'activité de fixation et de transfert de lipides,
(4) purification des différentes fractions sélectionnées, par une succession d'étapes chromatographiques, et
(5) séparation des fractions actives obtenues en (4) par électrophorèse.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, l'étape (5) fournit au moins deux fractions présentant une activité de transfert de lipides
une fraction P1, présentant une bande à environ 30-40 kDa et
une fraction P2, présentant une bande à environ 18 kDa.
une fraction P1, présentant une bande à environ 30-40 kDa et
une fraction P2, présentant une bande à environ 18 kDa.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Obtention d'un extrait brut, contenant les
PTL.
PTL.
1. Principe.
Les champignons filamenteux sont cultivés préalablement en milieu liquide agité, riche en phospholipides, qui, en fonction de leur nature, augmentent spécifiquement le réticulum endoplasmique des cellules- (x10) (lieu de synthèse des phospholipides) et donc la synthèse des protéines de transfert, afin d'obtenir une biomasse importante possédant des activités métaboliques accrues envers les lipides membranaires. Dans ces conditions, la synthèse des protéines de transfert de phospholipides est augmentée.
Les étapes suivantes consistent à extraire ces protéines après broyage du mycélium, et à doser l'activité de transfert de phospholipides de l'extrait par spectrométrie de fluorescence à l'aide de liposomes donneurs de sondes fluorescentes et de liposomes accepteurs, non marqués.
2. Souches sélectionnées.
Quinze souches de moisissures appartenant aux classes des Zygomycètes (ordre des Mucorales), des Ascomycètes et des Basidiomycètes ont été sélectionnées.
Ces souches ont pour origine et sont la propriété du Laboratoire de Microbiologie et Technologie
Céréalières (LMTC) de 1'INRA de Nantes, de la Mycothèque de l'Université Catholique de Louvain (MUCL, Belgique) et du Laboratoire de Biotechnologie des Champignons Filamenteux (LBCF) de 1'INRA de Marseille. Leur liste est donnée ci-après.
Céréalières (LMTC) de 1'INRA de Nantes, de la Mycothèque de l'Université Catholique de Louvain (MUCL, Belgique) et du Laboratoire de Biotechnologie des Champignons Filamenteux (LBCF) de 1'INRA de Marseille. Leur liste est donnée ci-après.
* Ascomycètes
Eurotium chevalieri
Espèces anamorphes
Aspergillus candi dus
A. flavipes
A. fumigatus
A. giganteus
A. niger
A. ochraceus
A. oryzae
A. terreus
A. versicolor
A. wentii
Penicillium roquefortii * Zygomycètes : Mucor mucedo
Rhizopus stolonifer * Basidiomycète : Phanerochaete chrysosporium
3. Précaration des inoculums et réalisation des cultures.
Eurotium chevalieri
Espèces anamorphes
Aspergillus candi dus
A. flavipes
A. fumigatus
A. giganteus
A. niger
A. ochraceus
A. oryzae
A. terreus
A. versicolor
A. wentii
Penicillium roquefortii * Zygomycètes : Mucor mucedo
Rhizopus stolonifer * Basidiomycète : Phanerochaete chrysosporium
3. Précaration des inoculums et réalisation des cultures.
Les souches sont cultivées au laboratoire sur un milieu naturel, à savoir sur des grains de mais entiers, humidifiés 48 heures à 4 C (en moyenne 40 grains par fiole de 100 ml) et stérilisés deux fois 30 min à 110ex. L'incubation est réalisée à 25 C pendant 10 à 13 jours (au maximum). Durant cette période, le mycélium se développe à la surface des grains en produisant des spores.
Ces spores sont décrochées de la surface des grains par agitation de billes de verre (diamètre de 3 mm) baignant dans une solution de Tween 80 stérile, à 0,033 g/l (afin d'éviter la floculation des spores). La suspension de spores ainsi obtenue est filtrée sur laine de verre, afin d'éliminer les fragments mycéliens et les débris de grains.
Un dénombrement est réalisé sur une cellule de
Malassez. On peut alors quantifier l'inoculum des cultures en utilisant un aliquot de volume connu de la solution de spores. La concentration de la solution mère est en général de l'ordre de 2.107 spores/ml.
Malassez. On peut alors quantifier l'inoculum des cultures en utilisant un aliquot de volume connu de la solution de spores. La concentration de la solution mère est en général de l'ordre de 2.107 spores/ml.
Deux autres milieux de sporulation ont été testés avec A. oryzae : des grains de soja (riches en phospholipides) humidifiés et stérilisés deux fois 30 min à 110 e C et un milieu synthétique (MYA2), composé de Malt solide (20 g/L), d'extrait de levure (1 g/l) et d'agar (13 g/l) stérilisé à l'autoclave 20 min à 120-C.
100 ml de milieu de culture (composition détaillée ci-dessous) sont utilisés dans des fioles bafflées de 500 ml de capacité. On inocule ces milieux par des spores, à raison de 2.105 spores/ml. Les cultures sont incubées à 25 C et soumises à une agitation rotative de 120 rotations/min pendant 3 jours. A la fin de cette période d'incubation, le mycélium est filtré sur verre fritté (n 2), pesé, puis congelé à -20'C.
* Composition du milieu de culture
- KH2PO4 0,2 g/l
- MgSO4, 7H2O 0,5 g/l
- CaC12, 2H2O 0,0132 g/l
- Tartrate d'ammonium 1,84 g/l
- Extrait de levure 0,5 g/l
- Source de phospholipides 10 g/l
* Préparation
Elle s'effectue à partir des volumes sui vante
- 50 ml d'eau distillée stérile,
- 10 ml de solution mère 1 :KH2PO4 2 g/l,
MgSO4, 7H2O 5 g/l, Cal2, 2H2O 0,132 g/l, autoclavée dans une fiole 20 min à 120-C et stockée à 4 C,
- 10 ml de solution mère 2 : tartrate d'ammonium 18,4 g/l autoclavée 20 min à 120-C et stockée à 4 C,
- 10 ml de solution mère 3 : extrait de levure 5 g/l, autoclavée 20 min à 120-C et stockée à 4 C,
- 20 ml de solution mère 4 : Nat 89 à 50 g/L, préparée en utilisant un bain à ultrason, puis agité. La solution est ensuite autoclavée 20 min à 120-C et stockée à 4 C.
- KH2PO4 0,2 g/l
- MgSO4, 7H2O 0,5 g/l
- CaC12, 2H2O 0,0132 g/l
- Tartrate d'ammonium 1,84 g/l
- Extrait de levure 0,5 g/l
- Source de phospholipides 10 g/l
* Préparation
Elle s'effectue à partir des volumes sui vante
- 50 ml d'eau distillée stérile,
- 10 ml de solution mère 1 :KH2PO4 2 g/l,
MgSO4, 7H2O 5 g/l, Cal2, 2H2O 0,132 g/l, autoclavée dans une fiole 20 min à 120-C et stockée à 4 C,
- 10 ml de solution mère 2 : tartrate d'ammonium 18,4 g/l autoclavée 20 min à 120-C et stockée à 4 C,
- 10 ml de solution mère 3 : extrait de levure 5 g/l, autoclavée 20 min à 120-C et stockée à 4 C,
- 20 ml de solution mère 4 : Nat 89 à 50 g/L, préparée en utilisant un bain à ultrason, puis agité. La solution est ensuite autoclavée 20 min à 120-C et stockée à 4 C.
4. Obtention de l'extrait brut.
2 grammes de mycélium (poids frais) sont broyés à 0 C en présence d'environ 2 g de sable de
Fontainebleau dans un mortier à l'aide d'un pilon. Le sable a été lavé avec une solution de HC1, rincé plusieurs fois à l'eau, puis stérilisé à 200 C, 30 min dans un four Pasteur.
Fontainebleau dans un mortier à l'aide d'un pilon. Le sable a été lavé avec une solution de HC1, rincé plusieurs fois à l'eau, puis stérilisé à 200 C, 30 min dans un four Pasteur.
Le broyage s'effectue dans un tampon contenant une solution de Tris-HCl 100 lLLLM pH 7,0, additionné d'EDTA 2 mM (inhibiteur de protéases-cations dépendantes), de saccharose 400 mM (agent protecteur osmotique), de dithiothréitol 2 mM et de 2-mercaptoéthanol 8 mM (agents réducteurs).
Les étapes suivantes (centrifugations et obtention de l'extrait brut) sont décrites à la figure 1.
La précipitation acide à pH 5,1 offre l'avan- tage de débarrasser les protéines de transfert de phospholipides des complexes lipoprotéiques solubles qui interfèrent dans les essais de transfert de phospholipides.
Dans l'étape finale, le pH est ramené à 7,8 pour stabiliser les protéines.
5. Mise en évidence de la présence des protéines de transfert de lipides.
a) Principe
Les mesures de transfert sont effectuées en suivant l'augmentation de fluorescence dans un tampon de dilution, après addition d'une solution protéique contenant les protéines de transfert de phospholipides, à un mélange de liposomes A donneurs marqués (par un monomère de pyrène), bloqués par effet de "quenching", et un excès de liposomes B receveurs non marqués.
Les mesures de transfert sont effectuées en suivant l'augmentation de fluorescence dans un tampon de dilution, après addition d'une solution protéique contenant les protéines de transfert de phospholipides, à un mélange de liposomes A donneurs marqués (par un monomère de pyrène), bloqués par effet de "quenching", et un excès de liposomes B receveurs non marqués.
L'effet de "quenching" se résume en une diminution, ou même une inhibition de fluorescence, due à une trop forte concentration de la sonde.
L'activité de transfert de phospholipides est suivie par les mouvements de la sonde entre les deux populations de liposomes après addition de l'extrait protéique fongique, conformément à la figure 2, qui illustre cette mesure de transfert de phospholipides par l'intermédiaire de navettes protéiques d'un liposome A donneur (~) constitué de pyrène phosphatidylcholine (sonde fluorescente) vers un liposome B accepteur (O) constitué de phosphatidylcholine d'oeuf.
b) Appareillage
On utilise pour les mesures un spectrofluorimètre SLM 4800 C Aminco (USA).
On utilise pour les mesures un spectrofluorimètre SLM 4800 C Aminco (USA).
La source lumineuse est une lampe xénon. Les monochromateurs d'excitation (Glan Thomson) et d'émission (film polariseur polaroïd) sélectionnent respectivement les longueurs d'onde de 346 et 378 nm. Une mesure corrigée des variations de la lampe est obtenue en divisant le signal d'émission de la solution analysée par celui observé avec la solution de référence (cellule à rhodamine). L'appareil est équipé d'un portoir de cuve thermostaté par circulation d'eau. Le spectrofluorimètre est piloté par un microordinateur qui permet l'acquisition et le traitement des données.
c) Liposomes donneurs A
Réactifs : la sonde fluorescente utilisée est le 3-palmitoyl-2-(l pyrène décanoyl)-L a phosphatidylcholine (Molecular Probes, USA) de poids moléculaire 852 (voir figure 2). Elle se présente sous forme d'un extrait sec de 1,17 Rmole/mg dans un tube plastique, conservée à -20C. Elle a un maximum d'excitation à 346 nm et un maximum d'émission à 378 nm.
Réactifs : la sonde fluorescente utilisée est le 3-palmitoyl-2-(l pyrène décanoyl)-L a phosphatidylcholine (Molecular Probes, USA) de poids moléculaire 852 (voir figure 2). Elle se présente sous forme d'un extrait sec de 1,17 Rmole/mg dans un tube plastique, conservée à -20C. Elle a un maximum d'excitation à 346 nm et un maximum d'émission à 378 nm.
Préparation: le contenu est solubilisé dans 10 ml d'alcool absolu. Cette solution mère a pour concentration, 117 mM. Elle est conditionnée en volume de 0,5 ml dans des tubes en verre et conservée à -20'C à l'abri de la lumière.
Pour le dosage, une prise d'essai de 10 1 permet d'avoir 1,17 nmole de la sonde dans la cuve de dosage.
d) Liposomes accepteurs B
Réactif : la préparation de ces liposomes s'effectue à partir d'une solution de L a phosphatidylcholine de jaune d'oeuf (voir figure 2) à 100 mg/ml (solubilisé dans du tétradécane (Sigma) et de poids moléculaire 775. Le stockage se fait à -20'C.
Réactif : la préparation de ces liposomes s'effectue à partir d'une solution de L a phosphatidylcholine de jaune d'oeuf (voir figure 2) à 100 mg/ml (solubilisé dans du tétradécane (Sigma) et de poids moléculaire 775. Le stockage se fait à -20'C.
Préparation : 285 1 de cette solution sont prélevés, évaporés 15 min sous un courant d'azote, puis dilués dans 10 ml de tampon de fluorescence (Tris-HCl 20 mM, EDTA 5 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4 filtré sur filtre
Millipore 0,45 A) pour obtenir une suspension de 5 mM constituée de vésicules multilamellaires (MLV) hétérogènes.
Millipore 0,45 A) pour obtenir une suspension de 5 mM constituée de vésicules multilamellaires (MLV) hétérogènes.
Pour passer au stade de vésicules unilamellaires (SUV), on a recours à la sonification. Les MLV sont soumises aux ultrasons à l'aide d'un Vibra Cell (Sonic and Materials, Danbury, Connecticut, USA) pourvu d'une microsonde de 1/2. La sonification s'effectue en pulsation avec une puissance moyenne (position 4) et une proportion de cycle de 50 %. L'opération se fait deux fois 10 min avec refroidissement dans un bain de glace.
La solution obtenue est filtrée sur filtre Sartorius 0,2 ffi et conservée à 4 C.
e) Conditions de dosage
Le dosage s'effectue dans 1,5 ml de tampon de fluorescence, avec 10 1 de sonde fluorescente et 14 1 de la solution de liposomes. Le rapport liposomes/sonde est de 60, afin d'être en excès de vésicules receveuses.
Le dosage s'effectue dans 1,5 ml de tampon de fluorescence, avec 10 1 de sonde fluorescente et 14 1 de la solution de liposomes. Le rapport liposomes/sonde est de 60, afin d'être en excès de vésicules receveuses.
La solution de protéines (50 1) est rajoutée en dernier pour démarrer la cinétique de transfert de phospholipides entre les deux populations de liposomes.
La réaction se fait à 25 C.
f) Conditions de mesure
Les mesures de fluorescence sont réalisées dans des cuves en quartz de 10 mm sur 4 mm de trajet optique en émission et en excitation respectivement.
Les mesures de fluorescence sont réalisées dans des cuves en quartz de 10 mm sur 4 mm de trajet optique en émission et en excitation respectivement.
Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission sont fixées respectivement à 346 et 378 nm (maximum d'excitation et d'émission de la sonde fluorescente) et les fentes des monochromateurs d'excitation et d'émission à 4 nm.
g) Calcul de l'activité de transfert de phospholipides
Les cinétiques de transfert sont réalisées sur 1400 secondes avec des enregistrements d'intensité toutes les 5 secondes. L'activité de transfert est représentée par la pente initiale de la cinétique (Unité de l'intensité de fluorescence relative sur le temps).
Les cinétiques de transfert sont réalisées sur 1400 secondes avec des enregistrements d'intensité toutes les 5 secondes. L'activité de transfert est représentée par la pente initiale de la cinétique (Unité de l'intensité de fluorescence relative sur le temps).
La valeur de l'activité de transfert relative est calculée par rapport à la valeur maximale de fluorescence. Ce maximum est obtenu par l'addition à l'échantillon d'une solution de SDS (50 A1) à 20 % (P/V). Le SDS dissocie les liposomes donneurs diluant la totalité des sondes fluorescentes dans la cuve de mesure, il supprime ainsi l'effet de "quenching". L'intensité de fluorescence obtenue dans ces conditions correspond donc à la quantité de sonde injectée dans l'essai (1,17 nmole).
L'activité spécifique est obtenue en effectuant le rapport de l'activité relative sur la quantité de protéine qui sont apportées dans l'essai. L'activité spécifique s'exprime en nmoles de phosphatidylcholine transférées par minutes et par mg de protéines.
6. Résultats.
a) Sélection de souches ayant une activité de transfert de phospholipides
Les cultures ont été récoltées à l'optimum de l'activité de transfert de phospholipides (âge des spores issues de grains de mais, 13 jours et âge des cultures, 3 jours).
Les cultures ont été récoltées à l'optimum de l'activité de transfert de phospholipides (âge des spores issues de grains de mais, 13 jours et âge des cultures, 3 jours).
Toutes les souches testées montrent une activité de transfert de phospholipides, mais avec toutefois une souche qui s'avère nettement plus performante (figure 3). Il s'agit d 'Aspergillus oryzae qui a une activité deux fois plus importante qu'A. candi dus ou A. niger.
La figure 3 illustre l'activité spécifique (nmoles de phosphatidylcholine transférées/min/mg) chez différentes souches.
b) Comparaison de la qualité de différents inoculums
Un milieu purement synthétique et un milieu naturel (les graines de soja) connues pour leur richesse en phospholipides ont été testées en plus des grains de mais.
Un milieu purement synthétique et un milieu naturel (les graines de soja) connues pour leur richesse en phospholipides ont été testées en plus des grains de mais.
On observe un maximum d'activité de transfert de phospholipides en trois jours de culture pour A. ory- zae issu d'un inoculum de grains de mals. Dès le deuxième jour, l'activité est détectée et elle décroît au delà de trois à quatre jours (figures 4 et 5).
La figure 4 illustre la croissance d'A. oryzae issu de différents inoculums (-I- : mals ; -w- : soja -À- : MYA2) et comporte en abscisse le nombre de jours de cultures et en ordonnée le poids sec (en g) de A. oryzae.
La figure 5 illustre l'activité de transfert de phospholipides d'A. oryzae issu de différents inoculums et comporte en abscisse le nombre de jours et en ordonnée l'activité de transfert des inoculums cultivés sur maïs (-z-), soja (-O-) ou milieu synthétique (MYA2) (-A-).
Le maximum d'activité de transfert pour
A. oryzae issu d'un inoculum de spores sur milieu synthétique se situe à trois jours comme observé sur grains de mals, mais il est moitié moindre. L'activité a ensuite tendance à décroître mais de façon moins brutale (figures 4 et 5).
A. oryzae issu d'un inoculum de spores sur milieu synthétique se situe à trois jours comme observé sur grains de mals, mais il est moitié moindre. L'activité a ensuite tendance à décroître mais de façon moins brutale (figures 4 et 5).
L'activité de transfert d'A. oryzae issu d'un inoculum de spores sur graines de soja est à son maximum plus tard, à cinq jours. L'activité est alors un peu plus faible qu'avec le mais pour inoculum (figures 4 et 5).
En conclusion, le maximum d'activité de transfert de phospholipides est obtenu avec A. oryzae issu d'un inoculum sur grains de mais. Les spores issues de l'inoculum de mais répondent aussi plus vite aux besoins de la cellule.
EXEMPLE 2 : Purification des protéines.
On purifie les p#rotéines à partir de l'extrait brut tel qu'obtenu à l'exemple 1, comme schématisé à la figure 6.
Pour cela, 900 g de mycélium (poids humide) sont broyés dans 3 litres de tampon d'extraction (Tris HC1 100 mM pH 7,0, EDTA 2 mM, dithiothréitol 2 mM, 2mercaptoéthanol 8 mM, saccharose 400 mM).
On précipite les protéines de l'extrait brut (surnageant de la précipitation acide à pH 5,1) dans une solution à 90 % de saturation (soit 616 g/litre à 74 C) en sulfate d'ammonium. Le culot est repris dans un minimum de volume (100 ml) de tampon A : Tris 50 mM pH 7,8, 2-mercaptoéthanol 8 mM. La suspension protéique est dialysée une nuit contre ce même tampon A.
Cette purification comprend plusieurs étapes, et à chaque étape, il y a
- contrôle de l'activité de transfert,
- électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate,
- dosage des protéines.
- contrôle de l'activité de transfert,
- électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate,
- dosage des protéines.
* 1ère étaDe de surification
Gel filtration sur colonne Séphadex G75@ (2,6 x 100 cm) équilibrée avec le tampon B : Tris 50 mM, 2-mercaptoéthanol 8 mM, NaCI 200 mM, glycérol 10 % (p/v) pH 7,8, avec un débit de 15 ml/heure. On collecte des fractions de 5 ml. Le profil d'élution est montré figure 7(A) ou figure 8(A) et comprend 2 pics d'activité : Pi et
P2. Les fractions actives sont séparément regroupées fractions 38 à 52 pour P1 et 62 à 79 pour P2.
Gel filtration sur colonne Séphadex G75@ (2,6 x 100 cm) équilibrée avec le tampon B : Tris 50 mM, 2-mercaptoéthanol 8 mM, NaCI 200 mM, glycérol 10 % (p/v) pH 7,8, avec un débit de 15 ml/heure. On collecte des fractions de 5 ml. Le profil d'élution est montré figure 7(A) ou figure 8(A) et comprend 2 pics d'activité : Pi et
P2. Les fractions actives sont séparément regroupées fractions 38 à 52 pour P1 et 62 à 79 pour P2.
* 2ème étane de nurification : DEAE-Séphacele (FPLC).
Les deux fractions (300 ml environ) provenant de la chromatographie Séphadex sont chargées sur colonne DEAE-Séphacel# 2,6 x 15 cm après dilution au 1/2 pour P2 (afin de baisser la force ionique). La colonne est équilibrée préalablement avec le tampon A. On élue la colonne jusqu'à ce que la densité optique soit revenue à la base, afin d'éliminer toutes les protéines non liées
a) les protéines de P1 sont éluées avec 200 ml d'un gradient linéaire (200-700 ml NaCl),
b) les protéines de P2 sont éluées avec 350 ml d'un gradient linéaire (100-500 ml NaCl).
a) les protéines de P1 sont éluées avec 200 ml d'un gradient linéaire (200-700 ml NaCl),
b) les protéines de P2 sont éluées avec 350 ml d'un gradient linéaire (100-500 ml NaCl).
Le débit est de 30 ml/heure et les fractions collectées de 5 ml.
Les activités de transfert correspondant à P1 et P2 sont respectivement éluées avec les fractions 23-36 (environ 500 nM en NaCl) et les fractions 51-61 (environ 350 mM en NaCl).
* 3ème étape de purification
3a. chromatographie Séphacryls S400. 166 ml de la fraction P1 issus de la DEAE sont chargés sur une colonne Séphacryls S400 (4,5 x 85 cm) équilibrée avec le tampon B. Le débit est de 60 ml/heure et les fractions collectées de 5 ml. La figure 7(C1) montre le profil avec un pic d'activité pour les fractions 185 à 204.
3a. chromatographie Séphacryls S400. 166 ml de la fraction P1 issus de la DEAE sont chargés sur une colonne Séphacryls S400 (4,5 x 85 cm) équilibrée avec le tampon B. Le débit est de 60 ml/heure et les fractions collectées de 5 ml. La figure 7(C1) montre le profil avec un pic d'activité pour les fractions 185 à 204.
3b. chromatographie Mono~ (FPLC). 30 ml de
P2 issus de la DEAE sont chargés sur une colonne Mono~
HR 515 équilibrée avec le tampon A. L'élution de la protéine active est faite avec 40 ml d'un gradient linéaire de 0 à 500 mM en NaCI dans le même tampon. Le débit est de 60 ml/heure et les fractions collectées de 2 ml.
P2 issus de la DEAE sont chargés sur une colonne Mono~
HR 515 équilibrée avec le tampon A. L'élution de la protéine active est faite avec 40 ml d'un gradient linéaire de 0 à 500 mM en NaCI dans le même tampon. Le débit est de 60 ml/heure et les fractions collectées de 2 ml.
L'activité de transfert de phospholipides est détectée pour environ 120 mM en NaCl.
Masse moléculaire : une bande de 30 kDa correspondant à la fraction P1 est observée sur gel de polyacrylamide. Une bande de 18 kDa est observée pour la fraction P2.
Les figures 7 et 8 illustrent ces différentes étapes de purification pour le pic P1 (figure 7) et le pic P2 (figure 8) et comportent en abscisse les numéros de fraction et en ordonnée, l'absorbance à 280 nm (axe gauche et trait continu) et l'activité de transfert de phospholipides, mesurée sur des aliquots (-) et exprimée en nmoles de phosphatidylcholine/min. (axe droit). Le gradient en NaCl (mM) est établi par mesure de conductivité (trait discontinu).
Les figures 7(A) et 8(A) sont équivalentes et correspondent à la gel filtration sur colonne
G75.
G75.
Les figures 7(B1) et 7(C1) illustrent les 2ème et 3ème étapes de purification du pic P1 (colonne DEAE, gradient 200-700 mM et SéphacrylO S400).
Les figures 8(B1) et 8(C1) illustrent les 2ème et 3ème étapes de purification du pic P2 (colonne DEAE, gradient 100-500 mM et Mono~, gradient 100-500 mM).
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.
Claims (19)
1 ) Famille de protéines, caractérisées
2 ) Protéines acides de fixation et de transfert de lipides selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles présentent un poids moléculaire d'environ 18 kDa.
3 ) Protéines acides de transfert selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles présentent un poids moléculaire d'environ 30 kDa.
Basidiomycètes.
4 ) Protéines acides de transfert de lipides selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles d'être obtenues à partir d'un champignon filamenteux sélectionné dans le groupe comprenant les Ascomycètes, les Zygomycètes et les
5 ) Protéines acides de transfert selon la revendication 4, caractérisées en ce que les Ascomycètes sont choisis parmi Aspergillus candi dus, A. flavipes, A.
fumigatus, A. giganteus, A. niger, A. ochraceus, A. ory- zae, A. terreus, A. versicolor, A. wentii, Penicillium roquefortii et Eurotium chevalieri.
6 ) ) Protéines acides de transfert selon la revendication 4, caractérisées en ce que les Zygomycètes sont choisis parmi Mucor mucedo et Rhizopus stolonifer.
7' ) Protéines acides de transfert selon la revendication 4, caractérisées en ce que les Basidiomy cètes sont sélectionnés parmi l'espèce Phanerochaete chsysosporium.
8 ) Extraits bruts de champignons filamenteux, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins une protéine de fixation et de transfert de lipides selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
(d) obtention de l'extrait brut contenant lesdites protéines de fixation et de transfert de lipides, à partir du surnageant S2, tamponné à pH sensiblement neutre.
S2,
précipitation acide du surnageant S1, suivie d'une centrifugation à une vitesse supérieure à 20 000 g (deuxième centrifugation) et récupération du surnageant
centrifugation dudit broyat à une vitesse supérieure à 20 000 g (première centrifugation) et récupération du surnageant S1,
(c) séparation de l'extrait brut contenant les protéines de fixation et de transfert de lipides, à partir dudit broyat, par
(b) broyage desdits mycéliums dans un tampon d'extraction à pH neutre,
(a) mise en culture desdits champignons dans un milieu riche en phospholipides, jusqu'à l'obtention d'une quantité suffisante de mycélium,
9 ) Extraits bruts selon la revendication 8, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus à partir d'un champignon filamenteux non toxique, capable de se développer sur un milieu riche en lipides, par
* l'incubation jusqu'à obtention d'une quantité suffisante de mycélium.
* la mise en culture desdites spores sur un milieu de culture riche en phospholipides, et
* l'incubation pendant 2 à 13 jours jusqu'à obtention d'une quantité suffisante de spores,
* la mise en culture desdits champignons sur un milieu de sporulation, riche en phospholipides,
10") Extraits bruts selon la revendication 9, susceptibles d'être obtenus à partir d'un champignon filamenteux non toxique, caractérisés en ce que, pour ladite obtention, l'étape (a) inclut
11 ) Extraits bruts selon la revendication 10, caractérisés en ce que pour leur obtention, le milieu de sporulation est avantageusement constitué de grains de mais entiers, humidifiés.
12-) Extraits bruts selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisés en ce que pour leur obtention, la précipitation acide de l'étape (c) est réalisée à pH 5,1.
13-) Extraits bruts selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, caractérisés en ce que pour leur obtention, les étapes (b) et (c) sont réalisées à froid.
14") Extraits bruts selon l'une quelconque des revendications 8 à 13, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus de préférence, à partir de la souche de champignon filamenteux A. oryzae.
(5) séparation des fractions actives obtenues en (4) par électrophorèse.
(4) purification des différentes fractions sélectionnées, par une succession d'étapes chromatogra phiques, et
(3) obtention de fractions présentant une activité de fixation et de transfert de lipides par gel filtration et sélection des fractions actives par mesure de l'activité de fixation et de transfert de lipides,
(2) concentration des protéines par précipitation dans un tampon à base de sel d'ammonium, suivie d'une séparation,
(1) préparation d'un extrait brut à pH sensiblement neutre, selon l'une quelconque des revendications 9 à 14,
15-) Procédé de préparation des protéines acides selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
une fraction P2, présentant une bande à environ 18 kDa.
une fraction P1, présentant une bande à environ 30-40 kDa et
16-) Procédé de préparation selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'étape (5) fournit au moins deux fractions présentant une activité de transfert de lipides
17") Biomembranes modifiées, caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles d'être obtenues par modification de leur structure lipidique à l'aide de protéines de fixation et de transfert de lipides selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
18-) Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent un principe actif hydrophobe, associé aux protéines de transfert de lipides, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
19 ) Compositions cosmétologiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent des liposomes appropriés, associés aux protéines de transfert de lipides, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
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| FR9301518A FR2701481B1 (fr) | 1993-02-11 | 1993-02-11 | Protéines de champignons filamenteux capables de réaliser la fixation et le transport de lipides, leur procédé d'obtention et leurs applications. |
| US08/318,699 US5717070A (en) | 1993-02-11 | 1994-02-10 | Filamentous fungus proteins for binding and transporting lipids, method for preparing them and their applications |
| AU60032/94A AU6003294A (en) | 1993-02-11 | 1994-02-10 | Filamentous fungus proteins for binding and transporting lipids, preparation method therefor and use thereof |
| EP94906260A EP0644898A1 (fr) | 1993-02-11 | 1994-02-10 | Proteines de champignons filamenteux capables de realiser la fixation et le transport de lipides, leur procede d'obtention et leurs applications |
| PCT/FR1994/000151 WO1994018240A1 (fr) | 1993-02-11 | 1994-02-10 | Proteines de champignons filamenteux capables de realiser la fixation et le transport de lipides, leur procede d'obtention et leurs applications |
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| JPH0556776A (ja) * | 1991-08-30 | 1993-03-09 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | ホスフアチジル基転移活性の高められた微生物の培養方法 |
-
1993
- 1993-02-11 FR FR9301518A patent/FR2701481B1/fr not_active Expired - Fee Related
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1994
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3815473A1 (de) * | 1988-05-06 | 1989-11-16 | Karl Heinz Prof Dr Dr Schmidt | Wirkstoff-system fuer den lipidaustausch mit zielstrukturen |
| EP0504043A1 (fr) * | 1991-03-12 | 1992-09-16 | Sanofi | Composition cosmétique à base de protéine de transfert de phospholipides |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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