FR2695939A1 - Cellules transformées, humaines, animales ou végétales encapsulant dans leurs cytoplasmes au moins une particule de latex. - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à des cellules vivantes transformées, humaines, animales ou végétales, autres que des macrophages, caractérisées en ce qu'elles incorporent dans leurs cytoplasmes au moins une particule de latex de préférence activée. Elle vise également un procédé de préparation des dites cellules et leurs utilisations.
Description
CELLULES HUMAINES, ANIMALES OU VEGETALES ENCAPSULANT
DANS LEURS CYTOPLASMES AU MOINS UNE PARTICULE DE LATEX
La présente invention a pour objet des cellules vivantes, humaines, animales ou végétales, transformées chimiquement et l'utilisation des cellules ainsi transformées dans des cultures cellulaires.
DANS LEURS CYTOPLASMES AU MOINS UNE PARTICULE DE LATEX
La présente invention a pour objet des cellules vivantes, humaines, animales ou végétales, transformées chimiquement et l'utilisation des cellules ainsi transformées dans des cultures cellulaires.
L'utilisation conjointe de cellules avec des particules de latex a déjà été décrite dans la littérature. Toutefois, les écrits et expérimentations correspondants font essentiellement état de particules de latex fixées à la surface externe des cellules par une réaction antigène-anticorps. La surface de la cellule se trouve de cette manière tapissée de particules. La spécificité de ce système de sélection est assurée par la réactio,- antigène-anticorps.
Ce type de greffage cellulaire, appliqué à des particules de latex magnétisées, ouvre notamment la voie à des techniques séparatives très efficaces. La cellule greffée devient sensible à un champ magnétique et peut être aisément isolée par aimantation.
Les applications de cette méthode de sélection cellulaire sont aujourd'hui nombreuses et se situent pour l'essentiel dans le domaine biomédical. A titre d'exemple, on peut en particulier citer l'élimination de cellules tumorales contenues dans des moelles osseuses, I'isolement et la quantification de lymphocytes dans le sang périphérique et le tri cellulaire magnétique.
Malheureusement, cette technique de couplage cellule-particule de latex n'est pas totalement satisfaisante.
Tout d'abord, elle nécessite au préalable le couplage des particules de latex à des anticorps monoclonaux ou polyclonaux, susceptibles de réagir avec des sites récepteurs présents à la surface cellulaire.
En outre, il est clair que ces applications sont exclusivement séparatives. Les cellules couvertes d'anticorps, reliés à des particules de latex, ne sont en effet pas réutilisables dans de nouvelles cultures cellulaires.
Enfin, la couverture de ces cellules par des particules de latex magnétiques est loin d'être homogène ce qui limite fortement les méthodes de séparation.
La présente invention a précisément pour objet de proposer une nouvelle méthode de fonctionnalisation des cellules à l'aide de particules de latex.
Dans les organismes vivants, certaines cellules sont capables d'ingérer des corps étrangers. Ce phénomène biologique est désigné par le terme phagocytose. Les cellules concernées sont notamment les cellules du système immunitaire qui sont spécialisées dans la phagocytose de particules étrangères comme les toxines, protéines et microorganismes circulant dans le sang. Elles sont encore désignées sous le nom de macrophages.
De manière inattendue, la Demanderesse a mis en évidence que ce phénomène de phagocytose pouvait être appliqué efficacement pour faire pénétrer à l'intérieur de cellules, autres que des macrophages, des particules de latex sans altérer les processus biologiques propres aux cellules concernées à savoir leur métabolisme, leur faculté à se multiplier et le cas échéant leur activité secrétrice (hormones, enzymes, anticorps...).
Plus précisément, la présente invention se rapporte à des cellules vivantes transformées, humaines, animales c végétales , autres que des macrophages, caractérisées en ce qu'elles contiennent dans leurs cytoplasmes au moins une particule de latex de préférence activée.
Les cellules, objets de la présente invention, sont beaucoup plus avantageuses que les cellules classiques c'est à dire fonctionnalisées à leur surface par des particules de latex. Tout d'abord, elles ne nécessitent pas la fonctionnalisation préalable des particules de latex. Enfin et surtout, elles sont susceptibles d'être réemployées efficacement pour de nouvelles cultures cellulaires.
Par latex, on entend désigner selon l'invention des dispersions aqueuses de polymères obtenus par polymérisation de monomères insaturés éthyléniquement.
II s'agit d'un homopolymère ou copolymère contenant des motifs dérivés de monomères vinylaromatiques, éthyléniques, d'acides ou d'esters alcanoiques ou éthyléniques, éventuellement fonctionnalisés.
Ce type de polymère est facilement accessible à tout homme de l'art et nous nous contenterons d'en citer quelques uns ci-après, à titre non limitatif de l'invention. II peut s'agir de polymères obtenus à partir de: - monomères éthyléniques de type isoprène, 1,3 butadiène, chlorure de vinylidène, acrylonitrile, - monomères vinylaromatiques comme le styrène, le bromostyrène,l'alphaméthylstyrène, I'éthylstyrène, le vinyltoluène, le chlorostyrène ou le vinylnaphtalène, - acides, esters ou anhydrides alcanoïques comme les acides acrylique, méthacrylique, acrylates, méthacrylates et hydroxyacrylates d'alkyle dont le groupe allyle possède 3 à 10 atomes de carbone, les esters d'acides éthyléniques à 4 ou 5 atomes de carbone - monomères multifonctionnels tels que le divinylbenzène ou le diacrylate de 2,2-diméthyl-1 ,3-propylène - ainsi que les copolymères de ces monomères entre eux et/ou d'autres monomères copolymérisables insolubles dans l'eau.
Les monomères peuvent porter, le cas échéant, des groupements anioniques ou cationiques de type sulfate, sulfonate, phosphonate ou ammonium quaternaire. II peut également s'agir de groupements susceptibles de réagir, directement ou indirectement, avec des groupements fonctionnels de type amine par exemple, portés par des molécules biologiques comme les protéines et les enzymes. A titre représentatif de ces groupes fonctionnels, on peut citer les halogènes, les groupements carboxyles, amines, isocyanates, aziridines, aldéhydes, sulfonyles et les fonctions époxy.
Les monomères, plus particulièrement utilisés dans le cadre de la présente invention, appartiennent préférentiellement à la famille des composés vinylaromatiques tels que: styrène, alpha-méthylstyrène, éthylstyrène, tertiobutylstyrène et vinyltoluène. De préférence, ces monomères sont substitués par un ou plusieurs groupements fonctionnels de type halogène, amine, alkoxy, carboxyle et/ou sulfonyle. Ils sont utilisés seuls ou en mélange entre eux en toute proportion, ou encore en mélange avec un autre monomère copolymérisable choisis parmi ceux précités.
Les particules de polymères peuvent être obtenues par la mise en oeuvre d'une quelconque technique de polymérisation comme la polymérisation en émulsion classique, en microémulsion, en microsuspension ou le cas échéant par polymérisation en milieu organique. Ces techniques familières à l'homme de l'art ne seront pas rappelées ici.
Les particules, de latex possèdent de préférence une taille généralement comprise entre 0,02 micron et 5 microns et de préférence inférieure à 2 microns.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention ces particules de latex sont activées.
Par particules activées, on entend désigner selon l'invention des particules soit fonctionnalisées à leur surface par exemple par des groupements chimiques ou biologiques soit contenant dans leur matrice polymère des agents réactifs de type agent fluorescent ou agent magnétique.
Dans le cadre de la présente invention, il s'agit de préférence de particules magnétiques.
Les particules de latex magnétisées incorporent de préférence à titre de matériau magnétique soit: -des métaux ou leurs alliages tels que fer, fer-silicium, nickel, cobalt samarium, -des oxydes de fer pur ou en combinaison avec d'autres oxydes comme les oxydes de cobalt, manganèse, zinc, baryum, terres rares -de l'hématite ou de la magnétite - ou du dioxyde de chrome.
Les particules de latex magnétisées, mises en oeuvre selon l'invention, contiennent de 0,5 à 70% en poids et de préférence de 5 à 60% en poids d'une charge magnétique dont la taille est de préférence comprise entre 2-20 nm.
Cette charge magnétique peut être concentrée au coeur de la particule ou au contraire répartie uniformément dans la matrice polymère.
La présente invention s'étend à toute cellule vivante, humaine, animale ou végétale et autres que les macrophages, incorporant dans son cytoplasme au moins une particule de latex.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, il s'agit de cellules capables de secréter des matière actives de type hormones, enzymes, protéines ou anticorps. II peut en particulier s'agir d'hybridomes spécialisés dans la production d'anticorps spécifiques. Leur charge en particules de latex varie environ entre 1 et 800 et est de préférence comprise entre environ 60 et 200.
La présente invention se rapporte également à un procédé de préparation des cellules selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend l'ensemencement par des cellules, d'un milieu de culture approprié au développement cellulaire desdites cellules et contenant des particules de latex de préférence activées, la conservation de ce milieu de culture ensemencé jusqu'à obtention d'un optimum de prolifération cellulaire et l'isolement des cellules ayant incorporé au moins une particule de latex.
Les cellules et les particules de latex sont mises en présence à l'ensemencement dans un rapport particules/cellules compris entre environ 1 000 et 20 000 et de préférence de l'ordre de 5 000 à 8 000.
Afin d'éviter tout risque de contamination, néfaste à la croissance cellulaire, les particules de latex mises en oeuvre sont préalablement purifiées et stérilisées de préférence par traitement thermique.
Dans le cas où les particules de latex mises en oeuvre sont des particules de latex magnétisées, I'isolement des cellules selon l'invention du milieu de culture peut être effectué par simple application d'un champ magnétique.
La présente invention vise également I'uti8isation des cellules selon l'invention dans des cultures cellulaires pour la production de substances actives de type anticorps, hormones, enzymes ou autre substance biologique.
Plus particulièrement, la présente invention vise l'emploi de cellules selon l'invention incorporant des particules de latex magnétisées.
Dans les procédés de culture cellulaire classiques, la séparation des cellules secrétrices de la matière active secrétée est d'ordinaire réalisée par des techniques de filtration appliquées au détriment des cellules génératrices. Cellesci très fragiles sont en effet détruites lors de la filtration. La contamination bactériologique et/ou chimique des milieux de culture au cours du temps est également un autre facteur affectant la viabilité des cellules.
Dans les deux cas précités, II est Elors nécessaire de procéder à un nouvel ensemencement d'un milieu de culture avec de nouvelles cellules. II est clair qu'il s'en suit un surcroît de coût et de temps.
L'emploi de cellules selon l'invention, c'est à dire magnétisées à l'aide de particules de latex, permet d'optimiser considérablement la production des matières actives comparativement aux méthodes classiques pour les raisons suivantes:
Elles sont tout d'abord aisément et sans altération isolées du milieu de culture par simple aimantation. En outre, isolées du milieu de culture, elles conservent toute leur potentialité et sont donc aptes à poursuivre la sécrétion de matières actives dans une nouvelle culture cellulaire.
Elles sont tout d'abord aisément et sans altération isolées du milieu de culture par simple aimantation. En outre, isolées du milieu de culture, elles conservent toute leur potentialité et sont donc aptes à poursuivre la sécrétion de matières actives dans une nouvelle culture cellulaire.
Les exemples et figures présentés ci après à titre non limitatif de l'invention permettront de mettre en évidence d'autres avantages et caractéristiques de celle-ci.
La figure 1 est une photographie d'un hybridome murin phagocytant des particules de latex prise à l'aide d'un microscope électronique à balayage.
La figure 2 rend compte des cinétiques de croissance d'hybridomes murins cultivés en présence de particules de latex de différents diamètres.
II MATERIEL ET METHODES -Les souches de cellules utilisées sont les suivantes:
HEP 2: II s'agit de cellules humaines d'un épiderme cancéreux de pharynx. Les
HEP2 sont une lignée continue. Elles présentent un aspect arrondi et ont le pouvoir de se multiplier à l'infini.
HEP 2: II s'agit de cellules humaines d'un épiderme cancéreux de pharynx. Les
HEP2 sont une lignée continue. Elles présentent un aspect arrondi et ont le pouvoir de se multiplier à l'infini.
MRC5 : Ce sont des cellules diploïdes de poumons humains présentant une forme allongée et qui ressemblent à des fibroblastes. Elles appartiennent également à une lignée continue et peuvent se répliquer un grand nombre de fois.
SP2: il s'agit de cellules de myélomes < 'e souris. Les cellules de la souche SP2 proviennent de la culture d'un myélome murin et elles aussi constituent une lignée continue. Ces cellules sont utilisées pour l'obtention d'hybridomes.
Des hybridomes murins: Ils proviennent de la fusion cellulaire d'un lymphocyte B de souris avec une cellule myélomateuse murine. La souche utilisée est référencée ci-après A. Elle est sécrétrice d'un anticorps monoclonal.
Les Particules de polymère.
Nous avons utilisé des latex magnétiques commercialisés sous la dénomination
Estapor z M1 070/60, en suspension aqueuse à 10 % de solide. Différents diamètres de particules de latex ont été mis en oeuvre. Leurs caractéristiques sont présentées dans le tableau I ci-après:
Estapor z M1 070/60, en suspension aqueuse à 10 % de solide. Différents diamètres de particules de latex ont été mis en oeuvre. Leurs caractéristiques sont présentées dans le tableau I ci-après:
<tb> <SEP> Lot <SEP> ~ <SEP> <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> <SEP> 2 <SEP> 3
<tb> <SEP> diamètre <SEP> moyen <SEP> 1,42 <SEP> 0,92 <SEP> 0,63
<tb> <SEP> im <SEP>
<tb> fraction <SEP> massique <SEP> 66 <SEP> 64,3 <SEP> 61.8
<tb> <SEP> en <SEP> pigment
<tb> <SEP> magnétique
<tb>
TABLEAU I -Les méthodes de culture
Trois types de cultures ont été testés:: - culture en plaques à puits, - culture en tubes de leighton, - culture en suspension.
<tb> <SEP> diamètre <SEP> moyen <SEP> 1,42 <SEP> 0,92 <SEP> 0,63
<tb> <SEP> im <SEP>
<tb> fraction <SEP> massique <SEP> 66 <SEP> 64,3 <SEP> 61.8
<tb> <SEP> en <SEP> pigment
<tb> <SEP> magnétique
<tb>
TABLEAU I -Les méthodes de culture
Trois types de cultures ont été testés:: - culture en plaques à puits, - culture en tubes de leighton, - culture en suspension.
Dans tous les cas, la culture cellulaire est effectuée en présence du latex testé.
Cultures en plaques à puits:
Ce type de culture a été réalisée sur toutes les souches cellulaires (HEP2,
MRC5, SP2 et hybridomes). Les plaques en polystyrène correspondantes présentent 24 puits d'une contenance maximum de 3 ml. Les cellules sont mises en culture dans ces puits, en présence ou en absence de latex.
Ce type de culture a été réalisée sur toutes les souches cellulaires (HEP2,
MRC5, SP2 et hybridomes). Les plaques en polystyrène correspondantes présentent 24 puits d'une contenance maximum de 3 ml. Les cellules sont mises en culture dans ces puits, en présence ou en absence de latex.
Culture en tube de Leigthon:
Ces cultures se réalisent dans des tubes fermés à raison de 2,5 ml de milieu de culture. Un tapis cellulaire se développe à la surface des lames de verre contenues dans ces tubes. La récupération de ces lames de verre permet l'observation des cultures en microscopie.
Ces cultures se réalisent dans des tubes fermés à raison de 2,5 ml de milieu de culture. Un tapis cellulaire se développe à la surface des lames de verre contenues dans ces tubes. La récupération de ces lames de verre permet l'observation des cultures en microscopie.
Culture en suspension
Les premières cultures en suspension ont été effectuées avec les souches
HEP2 et MRC5. Les essais correspondants ont été réalisés dans un ballon thermostaté pourvu d'une agitation.
Les premières cultures en suspension ont été effectuées avec les souches
HEP2 et MRC5. Les essais correspondants ont été réalisés dans un ballon thermostaté pourvu d'une agitation.
Les souches de SP2 et d'hybridomes murins ont été cultivées dans un fermenteur de deux litres contenant 650 ml de milieu de culture. Les cultures en fermenteurs s'effectuent sous hotte à flux laminaire. La température et le pH sont mesurés et régulés en continu.
Les multiplications et la viabilité des cellules sont surveillées deux fois par jour par prélèvement et dénombrements cellulaires.
L'optimisation de ces cultures a permis d'obtenir une génération cellulaire par jour. Les plaques à puits et les tubes de LeightonX sont entreposés dans un incubateur à C02 à une température de 37"C pour les souches HEP2 et MRC5 et à 36"C pour les SP2 et les hybridomes. L'atmosphère est saturée en eau et à 5%deCO2.
- Les milieux de culture
Les milieux de culture utilisés sont des milieux de culture enrichis. II s'agit soit d'un milieu essentiel minimum de Eagle modifié avec des sels de Eagle( pour les cultures stationnaires ou d'un milieu essentiel minimum de Beagle modifié par Dubelco pour les cultures en suspension.
Les milieux de culture utilisés sont des milieux de culture enrichis. II s'agit soit d'un milieu essentiel minimum de Eagle modifié avec des sels de Eagle( pour les cultures stationnaires ou d'un milieu essentiel minimum de Beagle modifié par Dubelco pour les cultures en suspension.
La seule différence entre ces deux milieux est la présence de CaCI2 (264,9 mg/l) pour les cultures stationnaires et son absence pour les cultures en suspension. Le calcium joue un rôle important lors des processus d'adhésion cellulaire.
Ces milieux sont enrichis de la façon suivante: - 10 ml de sérum de veau foetal, - 2 ml de pénicilline/streptomycine, - 1 ml d'acides aminés non essentiels, - 1 ml de L glutamine.
Pour les cultures des SP2 et d'hybridomes, 1 ml de pyruvate de sodium et 1 ml d'Hepes sont en outre rajoutés.
A ces milieux de culture, suivant l'expérimentation, on rajoute ou non du latex magnétique dont la concentration finale dans le milieu variera de O à 2,06 mg/ml.
Dans tous les cas, le latex est rajouté au milieu de culture après cinq rinçages successifs dont deux en tampon phosphate à pH = 7 et trois dans le milieu de culture. Au préalable, le latex a été pesé et autoclavé pour éviter les contaminations bactériennes.
-Contrôle des cultures
Les contrôles ont été réalisés au niveau de la croissance cellulaire et de l'incorporation du latex.
Les contrôles ont été réalisés au niveau de la croissance cellulaire et de l'incorporation du latex.
-Contrôle de la croissance cellulaire
Ce contrôle s'effectue par prélèvement et comptage en cellule de Malassez, en présence de bleu Trypan qui est un colorant vital. Les cellules mortes sont perméables à ce colorant et prennent une coloration bleue, les cellules vivantes quant à elles sont imperméables et restent incolores. Cette technique très simple permet de suivre la croissance cellulaire et le taux de viabilité de la culture.
Ce contrôle s'effectue par prélèvement et comptage en cellule de Malassez, en présence de bleu Trypan qui est un colorant vital. Les cellules mortes sont perméables à ce colorant et prennent une coloration bleue, les cellules vivantes quant à elles sont imperméables et restent incolores. Cette technique très simple permet de suivre la croissance cellulaire et le taux de viabilité de la culture.
-Contrôle de l'incorporation du latex
La vérification de l'incorporation du latex à l'intérieur des cellules s'effectue en microscopie électronique à transmission. L'observation de coupes cellulaires par cette technique permet de visualiser des particules de latex à l'intérieur du cytoplasme des cellules.
La vérification de l'incorporation du latex à l'intérieur des cellules s'effectue en microscopie électronique à transmission. L'observation de coupes cellulaires par cette technique permet de visualiser des particules de latex à l'intérieur du cytoplasme des cellules.
Méthodes de séparation
Les essais de séparation cellules/milieu sont effectués à l'aide d'un électroaimant sur des volumes de 10 ml. Des hybridomes en suspension dans un milieu contenant du latex magnétique sont répartis dans deux cristallisoirs en pyrex (hauteur du liquide 0,7 cm). Un cristallisoir est placé sur l'électroaimant et est soumis à un champ magnétique, l'autre cristallisoir servant de témoin est placé en dehors de toute aimantation.
Les essais de séparation cellules/milieu sont effectués à l'aide d'un électroaimant sur des volumes de 10 ml. Des hybridomes en suspension dans un milieu contenant du latex magnétique sont répartis dans deux cristallisoirs en pyrex (hauteur du liquide 0,7 cm). Un cristallisoir est placé sur l'électroaimant et est soumis à un champ magnétique, l'autre cristallisoir servant de témoin est placé en dehors de toute aimantation.
Des cinétiques par comptage cellulaires sont effectuées parallèlement sur ces deux cristallisoirs.
Les caractéristiques de l'électroaimant utilisé sont les suivantes: - nombres de spires n = 1000 - self L = 0,044 H
Ca. 9,5 /1,25 A noyau de fer de forme carré 40/40 mm.
Ca. 9,5 /1,25 A noyau de fer de forme carré 40/40 mm.
Le cristallisoir est posé directement sur le noyau de fer. On peut faire varier l'intensité du champ magnétique en fonction de l'intensité électrique.
Exemple 1:
Culture de cellules HEP2 et MRC5 en présence de particules de latex
Les cultures de cellules ont été réalisées selon les trois méthodes, culture en puits, en tubes de LeightonX et en suspension. Le diamètre du latex utilisé est 1,5 ,um. Le contrôle de l'incorporation du latex est effectué en microscopie optique après coloration des cellules à la fuschine de Ziehl et en microscopie électronique à transmission. L'observation en microscopie optique révèle simplement que les cellules croissent parfaitement en présence de latex.
Culture de cellules HEP2 et MRC5 en présence de particules de latex
Les cultures de cellules ont été réalisées selon les trois méthodes, culture en puits, en tubes de LeightonX et en suspension. Le diamètre du latex utilisé est 1,5 ,um. Le contrôle de l'incorporation du latex est effectué en microscopie optique après coloration des cellules à la fuschine de Ziehl et en microscopie électronique à transmission. L'observation en microscopie optique révèle simplement que les cellules croissent parfaitement en présence de latex.
L'observation en microscopie électronique à transmission permet en revanche de conclure à la présence de latex à l'intérieur des cellules ; certaines cellules ont été observées au moment même de la phagocytose.
Culture de cellules SP2
Pour ces cultures de cellules SP2, trois diamètres de latex ont été utilisés 1,42 ,um, 0,92 Fm et 0,63 um. Les cultures ont été réalisées en tubes de Leighton et fermenteur de deux litres. Les cultures en fermenteurs sont réalisées dans un volume de 700ml. Le contrôle de l'incorporation du latex s'effectue aussi par microscopie optique et électronique. Pour les deux types de culture, stationnaire et en suspension, nous notons une incorporation du latex par phagocytose pour les cellules SP2.
Pour ces cultures de cellules SP2, trois diamètres de latex ont été utilisés 1,42 ,um, 0,92 Fm et 0,63 um. Les cultures ont été réalisées en tubes de Leighton et fermenteur de deux litres. Les cultures en fermenteurs sont réalisées dans un volume de 700ml. Le contrôle de l'incorporation du latex s'effectue aussi par microscopie optique et électronique. Pour les deux types de culture, stationnaire et en suspension, nous notons une incorporation du latex par phagocytose pour les cellules SP2.
Exemple 2:
Croissance des hybridomes en présence de latex magnétique de différents diamètres
Pour effectuer cette étude, nous utilisons la souche référencée A.
Croissance des hybridomes en présence de latex magnétique de différents diamètres
Pour effectuer cette étude, nous utilisons la souche référencée A.
La culture d'hybridomes est effectuée en tubes de Leighton et en fermenteurs de 2 litres.
Les cultures en tubes de Leighton ont été effectuées pour les trois diamètres de latex disponibles 1,42 lim ; 0,92 ,um et 0,63 tjm.
La microscopie électronique à transmission montre l'incorporation de latex à l'intérieur des hybridomes. La microscopie électronique à balayage permet de visualiser la surface des hybridomes et d'observer des phagocytoses de particules de latex (figure. 1).
Quel que soit le diamètre considéré, on observe le phénomène de phagocytose attendu.
Exemple3
Croissance d'hvbridomes en présence de quantités croissantes de latex magnétique dans le milieu de culture
La culture des hybridomes de la souche A ,en suspension, est effectuée en fermenteur de deux litres avec un latex magnétique de diamètre 0,63 Fm.
Croissance d'hvbridomes en présence de quantités croissantes de latex magnétique dans le milieu de culture
La culture des hybridomes de la souche A ,en suspension, est effectuée en fermenteur de deux litres avec un latex magnétique de diamètre 0,63 Fm.
L'optimisation de la culture nous a permis d'obtenir une génération cellulaire par jour.
La croissance cellulaire est évaluée par comptage cellulaire 3 à 4 jours après inoculation des milieux de culture avec la souche en présence ou non de latex.
Les résultats de croissance obtenus avec addition ou non de latex magnétique dans le milieu de culture sont classés dans le tableau II
A titre indicatif, des concentrations en latex de l'ordre de 0,94 1 0-3g/ml et de 1,110-3g/ml correspondent respectivement à la mise en présence à l'ensemencement de 800 à 8000 et de 1000 à 10 000 particules de latex par cellule.
A titre indicatif, des concentrations en latex de l'ordre de 0,94 1 0-3g/ml et de 1,110-3g/ml correspondent respectivement à la mise en présence à l'ensemencement de 800 à 8000 et de 1000 à 10 000 particules de latex par cellule.
<tb>
CONCENTRATION <SEP> EN <SEP> NOMBRE <SEP> MAXIMUM <SEP> DE
<tb> <SEP> LATEX <SEP> CELLULES
<tb> <SEP> - <SEP> Témoins <SEP> 12,4 <SEP> 105 <SEP> cellules <SEP> /ml <SEP>
<tb> <SEP> 0,33 <SEP> 10-3 <SEP> /ml <SEP> 10,9 <SEP> 105 <SEP> cellules <SEP> /ml
<tb> <SEP> 0,39 <SEP> 10-3 <SEP> /ml <SEP> 12,5 <SEP> 105 <SEP> cellules <SEP> /ml <SEP>
<tb> <SEP> 0,53 <SEP> 10-3 <SEP> g/ml <SEP> 12,1 <SEP> 105 <SEP> cellules/ml
<tb> <SEP> 0,64 <SEP> 10-3 <SEP> g/ml <SEP> 11,5 <SEP> 105 <SEP> cellules/ml <SEP>
<tb> <SEP> 0,73 <SEP> 10-3 <SEP> g/ml <SEP> 12,2 <SEP> 105 <SEP> cellules <SEP> /ml
<tb> <SEP> 0,94 <SEP> 10-3 <SEP> /ml <SEP> 12,3 <SEP> 105 <SEP> cellules/ml
<tb> <SEP> 1,1 <SEP> 10-3 <SEP> g/ml <SEP> 7,5 <SEP> 105 <SEP> <SEP> cellules <SEP> /ml
<tb> <SEP> 1,2 <SEP> 10-3 <SEP> glml <SEP> 8,3 <SEP> 105 <SEP> cellules/ml
<tb> <SEP> î,510-3 <SEP> g/ml <SEP> 7,1 <SEP> 105 <SEP> cellules/ml <SEP>
<tb> <SEP> 1,69 <SEP> îO-3 <SEP> ImI <SEP> nbre <SEP> initial <SEP> ensemen.
<tb>
<tb> <SEP> LATEX <SEP> CELLULES
<tb> <SEP> - <SEP> Témoins <SEP> 12,4 <SEP> 105 <SEP> cellules <SEP> /ml <SEP>
<tb> <SEP> 0,33 <SEP> 10-3 <SEP> /ml <SEP> 10,9 <SEP> 105 <SEP> cellules <SEP> /ml
<tb> <SEP> 0,39 <SEP> 10-3 <SEP> /ml <SEP> 12,5 <SEP> 105 <SEP> cellules <SEP> /ml <SEP>
<tb> <SEP> 0,53 <SEP> 10-3 <SEP> g/ml <SEP> 12,1 <SEP> 105 <SEP> cellules/ml
<tb> <SEP> 0,64 <SEP> 10-3 <SEP> g/ml <SEP> 11,5 <SEP> 105 <SEP> cellules/ml <SEP>
<tb> <SEP> 0,73 <SEP> 10-3 <SEP> g/ml <SEP> 12,2 <SEP> 105 <SEP> cellules <SEP> /ml
<tb> <SEP> 0,94 <SEP> 10-3 <SEP> /ml <SEP> 12,3 <SEP> 105 <SEP> cellules/ml
<tb> <SEP> 1,1 <SEP> 10-3 <SEP> g/ml <SEP> 7,5 <SEP> 105 <SEP> <SEP> cellules <SEP> /ml
<tb> <SEP> 1,2 <SEP> 10-3 <SEP> glml <SEP> 8,3 <SEP> 105 <SEP> cellules/ml
<tb> <SEP> î,510-3 <SEP> g/ml <SEP> 7,1 <SEP> 105 <SEP> cellules/ml <SEP>
<tb> <SEP> 1,69 <SEP> îO-3 <SEP> ImI <SEP> nbre <SEP> initial <SEP> ensemen.
<tb>
<SEP> 2,06 <SEP> 10-3 <SEP> g/ml <SEP> nbre <SEP> initial <SEP> ensemen.
<tb>
<tb>
Tableau II
La production d'anticorps monoclonaux a en outre été contrôlée par tests
Elisa. On note que lorsque l'on atteint un optimum de croissance à partir d'une concentration de latex égale à 0,39. 10-3 g/ml. Pour des concentrations trop importantes en latex c'est à dire supérieure à 1. 1 0-3g/ml on observe une inhibition de la croissance cellulaire.
La production d'anticorps monoclonaux a en outre été contrôlée par tests
Elisa. On note que lorsque l'on atteint un optimum de croissance à partir d'une concentration de latex égale à 0,39. 10-3 g/ml. Pour des concentrations trop importantes en latex c'est à dire supérieure à 1. 1 0-3g/ml on observe une inhibition de la croissance cellulaire.
Exemple 4
Etude de la cinétique de croissance des hybridomes en présence de différentes quantités de latex
Cette étude est effectuée avec différentes concentrations de latex dans le milieu. Ces cinétiques ont été réalisées comme suit: - culture témoin 0 g de latex/ I de milieu de culture, - culture à 0, 94 g de latex / I de milieu de culture, - culture à 1,10 g de latex/I de milieu de culture - culture à 2,06 g de latex / I de milieu de culture.
Etude de la cinétique de croissance des hybridomes en présence de différentes quantités de latex
Cette étude est effectuée avec différentes concentrations de latex dans le milieu. Ces cinétiques ont été réalisées comme suit: - culture témoin 0 g de latex/ I de milieu de culture, - culture à 0, 94 g de latex / I de milieu de culture, - culture à 1,10 g de latex/I de milieu de culture - culture à 2,06 g de latex / I de milieu de culture.
La figure 2 rend compte des résultats obtenus.
L'analyse des différents essais et des cinétiques de croissance obtenues montrent que pour une concentration en latex inférieure ou égale à 0,94 g de latex par litre de milieu de culture, les croissances cellulaires obtenues sont équivalentes ou sensiblement supérieures à celles obtenues pour une culture témoin. Pour des concentrations de latex de l'ordre de 1,1 g / I, les hybridomes ont du mal à se multiplier et pour une concentration de 2,06 g I, il n'y a plus de croissance cellulaire.
Exemple 5:
Estimation du nombre de coupes cellulaires ayant incorDoré du latex magnétique.
Estimation du nombre de coupes cellulaires ayant incorDoré du latex magnétique.
Une estimation du pourcentage de cellules ayant incorporé du latex est effectuée sur les prélèvements de culture en fermenteur. Nous avons mesuré à l'aide d'un micromètre adapté sur un microscope photonique le diamètre moyen d'un hybridome qui est de l'ordre de 17,5 clam. L'observation en microscopie électronique à transmission nécessite des coupes de 70 nm d'épaisseur donc 250 est le nombre moyen de coupes obtenues sur une même cellule.
L'observation des préparations au microscope électronique montre que 70 à 80 % des coupes obtenues contiennent au moins une particule de latex.
Cette étude montre également que le taux de latex incorporé maximal est observé avec des cellules ayant été cultivées en présence de particules de latex à une concentration de l'ordre de 0,9 10-3g/ml.
Exemple 6:
Séparation cellulaire par aimantation sur cultures d'hybridomes.
Séparation cellulaire par aimantation sur cultures d'hybridomes.
Les essais de séparation par aimantation ont été réalisés selon le protocole décrit précédemment. Ces essais sont effectués sur des hybridomes murins ayant phagocytés des particules de latex de 0,63 lim de diamètre. Les résultats sont présentés dans le tableau III:
<tb> <SEP> latex <SEP> Témoins <SEP> Essais <SEP> % <SEP> de <SEP> cellules
<tb> fermenteur <SEP> sédimentées
<tb> <SEP> g/l
<tb> <SEP> 0,77 <SEP> t=0 <SEP> 7,8105C/ml <SEP> t=0 <SEP> 7,7 <SEP> 105C/ml <SEP> 41,5 <SEP> %
<tb> <SEP> | <SEP> t= <SEP> 15 <SEP> 7,8 <SEP> 105 <SEP> C/ml <SEP> t= <SEP> 15 <SEP> 4,5 <SEP> 105C/ml <SEP>
<tb> <SEP> t=0 <SEP> 6,2 <SEP> 105C/ml <SEP> t=0 <SEP> 6,3105C/ml <SEP> 43%
<tb> <SEP> t=15 <SEP> 6,3 <SEP> 105 <SEP> C/ml <SEP> =15 <SEP> 3,6 <SEP> 105C/ml <SEP>
<tb> <SEP> t=0 <SEP> 8,1105 <SEP> C/ml <SEP> t=0 <SEP> 8,1 <SEP> 105 <SEP> C/ml <SEP> 48% <SEP>
<tb> <SEP> t <SEP> = <SEP> 15 <SEP> 8,1 <SEP> 105C/ml <SEP> t <SEP> = <SEP> 15 <SEP> 4,2 <SEP> 105C/ml <SEP>
<tb>
TABLEAU III
Les deux mesures réalisées sur les échantillons témoins montrent qu'au cours des 15 minutes, durée d'aimantation appliquée aux essais, aucune dégradation cellulaire n'est observée.
<tb> fermenteur <SEP> sédimentées
<tb> <SEP> g/l
<tb> <SEP> 0,77 <SEP> t=0 <SEP> 7,8105C/ml <SEP> t=0 <SEP> 7,7 <SEP> 105C/ml <SEP> 41,5 <SEP> %
<tb> <SEP> | <SEP> t= <SEP> 15 <SEP> 7,8 <SEP> 105 <SEP> C/ml <SEP> t= <SEP> 15 <SEP> 4,5 <SEP> 105C/ml <SEP>
<tb> <SEP> t=0 <SEP> 6,2 <SEP> 105C/ml <SEP> t=0 <SEP> 6,3105C/ml <SEP> 43%
<tb> <SEP> t=15 <SEP> 6,3 <SEP> 105 <SEP> C/ml <SEP> =15 <SEP> 3,6 <SEP> 105C/ml <SEP>
<tb> <SEP> t=0 <SEP> 8,1105 <SEP> C/ml <SEP> t=0 <SEP> 8,1 <SEP> 105 <SEP> C/ml <SEP> 48% <SEP>
<tb> <SEP> t <SEP> = <SEP> 15 <SEP> 8,1 <SEP> 105C/ml <SEP> t <SEP> = <SEP> 15 <SEP> 4,2 <SEP> 105C/ml <SEP>
<tb>
TABLEAU III
Les deux mesures réalisées sur les échantillons témoins montrent qu'au cours des 15 minutes, durée d'aimantation appliquée aux essais, aucune dégradation cellulaire n'est observée.
La diminution de la concentration cellulaire observée pour chaque essai est donc à imputer uniquement à l'isolement du milieu de culture, des cellules ayant encapsulé des particules de latex magnétique.
Claims (11)
1. Cellules vivantes transformées, humaines, animales ou végétales, autres que des macrophages, caractérisées en ce qu'elles contiennent dans leurs cytoplasmes au moins une particule de latex de préférence activée.
2. Cellules transformées selon la revendication 1 caractérisées en ce que leur charge en particules de latex varie entre 1 et 800 et est de préférence comprise entre environ 60 et 200.
3. Cellules transformées selon la revendication 1 ou 2 caractérisées en ce que les particules de latex sont constituées d'un homopolymère ou copolymère contenant des motifs dérivés de monomères vinylaromatiques, éthyléniques, d'acides ou d' esters alcanoïques ou éthylèniques éventuellement fonctionnalisés.
4. Cellules transformées selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisées en ce que la taille des particules de latex varie environ entre 0,02 et 5 microns.
5. Cellules transformées selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisées en ce qu'il s'agit de préférence de particules de latex fonctionnalisées à leur surface chimiquement ou biologiquement ou de particules contenant dans leur matrice polymère au moins un agent fluorescent ou un agent magnétique.
6. Cellules transformées selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisées en ce qu'il s'agit de particules de latex magnétique.
7. Cellules transformées selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles de se développer en culture cellulaire et de produire des matières actives.
8. Procédé de préparation de cellules transformées selon l'une quelconque des revendications de 1à 7 caractérisé en ce qu'il comprend l'ensemencement par des cellules, d'un milieu de culture approprié au développement cellulaire desdites cellules et contenant des particules de latex de préférence activées, la conservation de ce milieu de culture ensemencé jusqu'à obtention d'un optimum de prolifération cellulaire et l'isolément des cellules ayant incorporées au moins une particule de latex.
9. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que les cellules et les particules de latex sont mis en présence dans un rapport particules/cellules compris entre environ 1 000 et 20 000 et de préférence de l'ordre de 5 000 à 8 000.
10. Utilisation des cellules selon l'une quelconque des revendications de 1 à 8 à dans des milieux de culture cellulaire pour la production de substances actives.
11. Utilisation de cellules selon la revendication 1 1 pour la production d'anticorps.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9211375A FR2695939B1 (fr) | 1992-09-24 | 1992-09-24 | Cellules transformées, humaines, animales ou végétales encapsulant dans leurs cytoplasmes au moins une particule de latex. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9211375A FR2695939B1 (fr) | 1992-09-24 | 1992-09-24 | Cellules transformées, humaines, animales ou végétales encapsulant dans leurs cytoplasmes au moins une particule de latex. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2695939A1 true FR2695939A1 (fr) | 1994-03-25 |
| FR2695939B1 FR2695939B1 (fr) | 1995-03-03 |
Family
ID=9433832
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9211375A Expired - Fee Related FR2695939B1 (fr) | 1992-09-24 | 1992-09-24 | Cellules transformées, humaines, animales ou végétales encapsulant dans leurs cytoplasmes au moins une particule de latex. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2695939B1 (fr) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0162819A1 (fr) * | 1984-03-01 | 1985-11-27 | Schröder, Ulf | Une méthode de diagnostic in vitro et un agent diagnostique |
| EP0230768A1 (fr) * | 1985-12-20 | 1987-08-05 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Procédé de séparation de particules |
| DE3811566A1 (de) * | 1987-04-11 | 1988-10-27 | Hitachi Ltd | Verfahren zur zellmessung |
-
1992
- 1992-09-24 FR FR9211375A patent/FR2695939B1/fr not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0162819A1 (fr) * | 1984-03-01 | 1985-11-27 | Schröder, Ulf | Une méthode de diagnostic in vitro et un agent diagnostique |
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| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 98, 1983, Columbus, Ohio, US; abstract no. 141398w, PANTAZIS ET AL 'MORPHOLOGICAL CHANGES IN CULTURED HUMAN LEUKEMIC CELLS (K562) TREATED WITH THE TUMOR PROMOTER 12-O-TETRADECANONYLPHORBOL-13-ACETATE' page 410 ;colonne 2 ; * |
| DATABASE WPIL Section Ch, Week 8844, Derwent Publications Ltd., London, GB; Class A96, AN 88-308610 & DE-A-3 811 566 (HITACHI KK) 27 Octobre 1988 * |
| FILE SERVER STN KARLSRUHE,FILE MEDLINE ABSTRACT NO. 77054735 * |
| JOURNAL OF MOLECULAR REGOGONITION vol. 1, no. 1, 1988, LONDON,GB pages 9 - 18 LEA ET AL 'MONOSIZED,MAGNETIC POLYMER PARTICLES:THEIR USE IN SEPARATION OF CELLS AND SUBCELLULAR COMPONENTS,AND IN THE STUDY OF LYMPHOCYTE FUNCTION IN VITRO' * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2695939B1 (fr) | 1995-03-03 |
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|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |