FR2691475A1 - Séquence d'ADN des produits de fusion résultant de la translocation chromosomique récurrente t(11;22) (q24;q12) associée au développement d'un groupe de tumeurs cancéreuses. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne la séquence d'ADN constituée de tout ou partie de l'une ou l'autre ou de la fusion des séquences nucléotidiques des gènes des chromosomes 11 et 22 localisés au niveau du point de cassure de la translocation chromosomique récurrente t(11; 22)-(q24; q12), ainsi que les produits codés par ces gènes. L'invention a également pour objet la détection de l'un de ces gènes ou des produits pour lesquels ils codent dans un échantillon biologique provenant d'un patient susceptible de porter une translocation chromosomique t(11; 22).

Description

SEQUENCE D'ADN DES PRODUITS DE FUSION
RESULTANT DE LA TRANSLOCATION CHROMOSOMIQUE
RECURRENTE t(11;22)(q24;q12) ASSOCIEE AU
DEVELOPPEMENT D'UN GROUPE DE TUMEURS CANCEREUSES.

La présente invention concerne la séquence d'ADN des produits de fusion résultant de la translocation chromosomique récurrente t(11;22) (q24;q12) associée au développement d'un groupe de tumeurs cancéreuses; elle concerne aussi les séquences d'ADN des gènes des chromosomes 11 et 22 localisés au niveau du point de cassure de cette translocation chromosomique.

L'invention concerne les séquences d'ADNc de chacun des deux gènes impliqués dans la translocation chromosomique récurrente t(11;22) (q24;q12), ainsi que les séquences d'ADNc correspondant aux produits de fusion de ces gènes.

L'invention concerne également la détection des gènes impliqués dans la translocation chromosomique t(11;22), et plus particulièrement des gènes de fusion résultant de ladite translocation, à l'aide de sondes préparées à partir des séquences d'ADN précédentes, en vue du diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentés chez des sujets atteints de tumeurs dites "à petites cellules rondes" ou de tumeurs neuroectodermiques primitives périphériques; 1' invention concerne aussi la détection, aux mêmes fins, des produits pour lesquels codent ces gènes ainsi que les produits et réactifs pour la mise en oeuvre de ces procédés.

Les translocations récurrentes chromosomiques constituent un mécanisme d'activation d'oncogènes et sont donc impliquées dans l'apparition de nombreuses tumeurs pathogènes (Solomon E, Borrow J,
Goddard A D, Science 254, 1153-1160; (1991)). Parmi celles-ci les tumeurs dites "à petites cellules rondes" constituent un groupe de cancers hétérogènes. Un diagnostic précis de ces tumeurs est essentiel pour choisir correctement le protocole thérapeutique à utiliser pour les traiter. Un sous-ensemble de ces tumeurs porte une translocation chromosomique t(ll;22) (q24;12) et est sensible au même protocole thérapeutique.

Le sarcome d'Ewing constitue la seconde tumeur des os la plus fréquente chez l'enfant. Malgré l'absence de marqueur morphologique, les cellules du
Sarcome d'Ewing expriment occasionnellement des antigènes ou peuvent causer l'expression de figures morphologiques caractéristiques d'une différentiation neurale (Lipinsky M, Braham K, Philip I et al, Cancer
Res. 47, 183-187 (1987) ; Cavazzana A O, Miser J S,
Jefferson J, Triche T J, Am. J. Pathol. 127, 507-518 (1987)). Ainsi les techniques de diagnostic des tumeurs à petites cellules rondes utilisent des méthodes classiques de l'anatomopathologie et de la cytologie, et constituent donc un diagnostic d'exclusion qui n est pas totalement fiable.La démonstration de la présence d'une translocation chromosomique t(11;22) dans une tumeurs à petites cellules rondes peut être réalisée par une étude du caryotype; cette étude nécessite que les cellules parviennent vivantes au laboratoire, ce qui est souvent difficilement réalisable et entraîne un taux élevé d'échec; en outre, il existe des difficultés d'interprétation.

Le Sarcome d'Ewing (ES) a été rattaché à un sous-type de Tumeurs Neuroectodermiques Primitives
Périphériques (PNET) dénommées Neuroépithéliome
Périphérique (PN). Cette relation est en outre supportée par l'expression hautement spécifique de l'antigène MIC2 à la fois dans le Sarcome d'Ewing (ES) et le Neuroépithéliome Périphérique (PN), alors que cet antigène n'est pas exprimé dans la plupart des autres tumeurs humaines (Ambros I M, Ambros P F, Strehl S et al, Cancer 67, 1886-1893 (1991) ; Garin-Chesa P,
Fellinger E J, Huvos A G et al, Am. J. Pathol. 139, 275286 (1991)). Avec d'autres sous-types rares de Tumeurs
Neuroectodermiques Primitives (Whang-Peng J, Freter C E,
Knutsen T, Nanfro J J, Gazdar a, Cancer Genet.

Cytogenet. 29, 155-157 (1987) ; De Chadarevian J P,
Vekemans M, Seemayer T A, N. Engl. J. Med. 311, 17021703, (1984) ; Cavazzana A O, Navarro S, Noguera R et al, Adv. Neuroblastoma Res. 2,463-473 (1988) ; Vigfusson
N V, Allen L J, Philip J H, Alschibaja T, Riches W G,
Cancer Genet. Cytogenet. 22, 211-218 (1986)), le Sarcome d'Ewing et le Neuroépithéliome Périphérique partagent une translocation chromosomique t(11;22) (q24;q12) très spécifique et cytogénétiquement identique (Aurias A,
Rimbaut C, Buffe C, Dubousset J, Mazabraud A, N. Engl.

J. Med. 309, 496-497 (1983) ; Turc-Carel C, Philip I,
Berger M P, Philip T, Lenoir G M, N. Engl. J. Med. 309, 497-498, (1983) ; Whang Peng J, Triche T J, Knutsen T,
Miser J, Douglass E C, Israel M A, N. Engl. J. Med. 311, 584-585 (1984)). Cette translocation a été observée dans 83 % des cas de Sarcome d'Ewing. Des variantes de cette translocation ou des translocations plus complexes ont été observées dans 9 % des autres cas et impliquent de manière constante la bande 22ql2 (Turc-Carel C, Aurias
A, Mugneret F et al, Cancer Genet. Cytogenet. 32, 229238 (1988)). La région 22q12 apparaît donc comme l'un des principaux sites d'apparition d'altérations chromosomiques récurrentes rencontrées dans un groupe défini de tumeurs humaines.

Les travaux de recherches menés sur la cartographie physique du bras long du chromosome 22 (Zhang F, Delattre O, Rouleau G, Couturier J, Lefrançois
D, Thomas G, Aurias A, Genomics 6, 174-177 (1990)
Zhang F R, Aurias A, Delattre O, Stern M H, Benitez J,
Rouleau G, Thomas G, Genomics 7, 319-324 (1990)
Delattre O, Azambuja C J, Aurias A, Zucman J, Peter M,
Zhang F, Hors-Cayla M C, Rouleau G, Thomas G, Genomics 9, 721-727 (1991)), et l'isolement de sondes à proximité du point de cassure chromosomique (Zucman J, Delattre O,
Desmaze C, Azambuja C, Rouleau G, De Jong P, Aurias A,
Thomas G, Genomics, sous presse) ont conduit les
Inventeurs à mettre en évidence que la translocation t(1l;22) (q24;q12) fusionne un gène porté par le chromosome 22 et un gène porté par le chromosome 11; cette fusion conduisant à la formation d'un gène hybride associé à la pathologie.Ces deux gènes ont été caractérisés et les produits de leur fusion ont pu être définis.

Le gène du chromosome 22 impliqué dans la translocation t(11;22), dénommé Ews, a été isolé et son
ADNc séquencé; la séquence de la protéine pour laquelle il code a été déduite de la séquence de l'ADNc; le gène
Ews comporte une région dénommée EWSR1 d'environ 7 Kb au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 22.

Le gène du chromosome 11 impliqué dans la translocation t(11;22), dénommé Hum-Fli-l, a été isolé et son ADNc séquencé; la séquence de la protéine pour laquelle il code a été déduite de la séquence de l'ADNc; le gène Hum-Fli-l comporte une région dénommée EWSR2 d'environ 40 Kb au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 11. En outre, les Inventeurs ont mis en évidence la forte homologie du gène Hum-Fli-l avec les gènes de la famille Ets et plus particulièrement avec le gène murin Fli-l.

L'invention concerne en conséquence la séquence d'ADN constituée de tout ou partie de l'une ou l'autre ou de la fusion des séquences nucléotidiques des gènes des chromosomes 11 et 22 localisés au niveau du point de cassure de la translocation chromosomique récurrente t(11;22)(q24;q12).

La séquence d'ADN de l'invention est donc constituée de tout ou partie de la séquence nucléotidique du gène Ews; ou de tout ou partie de la séquence nucléotidique du gène Hum-Fli-l; ou encore, de la séquence nucléotidique d'un produit de fusion résultant de la translocation t(11;22) (q12;24), laquelle est constituée d'une partie de la séquence nucléotidique du gène Ews et d'une partie de la séquence nucléotidique du gène Hum-Fli-l.

Plus précisément, la séquence d'ADN correspondant à un des produits de fusion des gènes Ews et Hum-Fli-l est constituée d'une partie de la séquence nucléotidique du gène Ews, depuis son origine jusqu'à la région EWSR1 d'environ 7 Kb au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 22 et, d'une partie de la séquence nucléotidique du gène Hum-Fli-l, depuis la région EWSR2 de 40 Kb au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 11 jusqu'à son extrémité 3'.

Les Inventeurs ont étudié en détail les mécanismes donnant naissance aux différents gènes de fusion de la translocation t(11;22).

Les structures exoniques des gènes Ews et
Hum-Fli-l ont été déterminées. Il apparait que les positions précises des points de cassures situés au niveau des régions EWSR1 et EWSR2 se trouvent le plus souvent, et peut être exclusivement dans les introns des deux gènes afin que, par le jeu des épissages ayant lieu au cours de la maturation du transcrit primaire, un cadre ouvert de lecture puisse être restauré. La position des exons par rapport aux sites de restriction a été définie pour les gènes Ews et Hum-Fli-l.

Les cadres ouverts de lectures sont divisés et chaque intron entre deux exons codant interrompt les cadres de lectures; la détermination de la majorité des jonctions introns-exons a été réalisée pour les deux gènes Ews et Hum-Fli-l.

A partir de ces travaux, il a été possible de déduire la taille approximative des introns, sites des points de cassures chromosomiques, et de prévoir la multiplicité des produits de fusion possibles. En outre, la séquence promotrice du gène EWS a été déterminée.

De manière avantageuse, la séquence d'ADN de l'invention est constituée de tout ou partie de la séquence nucléotidique de l'ADNc du gène Ews, ou de tout ou partie de la séquence nucléotidique de l'ADNc du gène
Hum-Fli-l, ou encore de la séquence nucléotidique d'un
ADNc résultant de la fusion de ces deux gènes.

Des sondes nucléotidiques ou homologues, capables de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence nucléotidique des gènes Ews ou Hum-Fli-l ou encore avec l'ADNc de l'un de ces gènes ont été préparées. Parmi celles-ci des sondes capables de s'hybrider spécifiquement avec une partie du gène Ews ou une partie du gène Hum-Fli-l ont été sélectionnées.

Des sondes complémentaires de tout ou partie de la séquence d'ADN d'un gène de fusion constitué de la partie des gènes Ews et Hum-Fli-l altérées par la translocation t(11;22), ou encore avec l'ADNc de ce gène de fusion ont été obtenues en vue de détecter par hybridation, chez un sujet la présence éventuelle d'une translocation t(1l;22).

Des oligonucléotides de synthèses ont été obtenues à partir des séquences d'ADN de l'invention afin de préparer par transcription réverse d'ARNm issu d'un échantillon à analyser, l'ADNc correspondant à la zone de fusion. L'amplification génique in vitro de cet
ADNc par PCR, à l'aide d'oligonucléotides amorces, permet l'analyse des produits amplifiés par des méthodes radioactives ou colorimétriques simples du type électrophorèse sur gel et coloration au bromure d'éthidium, ou révélation immunologique.

L'invention concerne en conséquence les séquences nucléotidiques ou leurs analogues constituant ces sondes génétiques capables de s'hybrider avec les séquences d'ADN de l'invention, ainsi que des oligonucléotides issus de ces séquences et constituant des amorces pour la réalisation d'une transcription réverse d'ARN ou la mise en oeuvre d'un processus d'amplification génique par PCR.

La translocation chromosomique t(11;22) observée dans les tumeurs neurectodermiques donne naissance à des gènes de fusion hybrides capables de coder pour des protéines chimères ayant conservées la partie N-terminale de la protéine EWS codée par le gène
Ews et la partie C-terminale de la protéine HUM-FLI-1 codée par le gène Hum-Fli-l.La séquence en acides aminées de ces protéines chimères peut être déduite des
ADNc des gènes de fusion résultant de la translocation t(ll;22); plusieurs de ces protéines ont été produites in vitro afin notamment de préparer des anticorps polyclonaux et monoclonaux capables de se lier avec les cellules produisant ces protéines et, en conséquence, présentant la translocation t(îl;22) . L'invention concerne donc aussi les protéines EWS, HUM-FLI-1 et les protéines chimères résultant de la translocation chromosomique t(11;22), ainsi que les anticorps pour la détection immunologique de la présence de ces protéines et plus particulièrement d'une protéine chimère dans un échantillon biologique provenant d'un sujet susceptible de porter une translocation chromosomique t(ll;22).

L'invention concerne la détection de l'un ou l'autre des gènes Ews ou Hum-Fli-l ou encore d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(11;22).

Dans une première forme de réalisation, un procédé de détection de ces gènes comprend les étapes suivantes
- la mise en contact d'une sonde de l'invention spécifique de la séquence d'ADN du gène Ews ou de la séquence d'ADN du gène Hum-Fli-l ou encore de la séquence D'ADN d'un gène de fusion, ou d'un mélange de ces sondes, avec un échantillon biologique provenant d'un patient susceptible de porter une translocation chromosomique t(ll;22), traité de façon à ce que les cellules qu'il contient soient lysées et éventuellement à ce que les acides nucléiques contenus dans lesdites cellules soient fragmentés à l'aide d'enzyme de restriction, dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre la (ou les) sonde(s) et 1'ADN ou l'ARN cible contenu dans l'échantillon; ;
- la mise en évidence par tout moyen approprié des hybrides éventuellement formés.

Ce procédé peut être mis en oeuvre dans des tests sur membrane ou sur plaque ou sur tout autre support adapté, selon des méthodes de dot blot ou de
Southern blot ou encore de filtration.

Dans une deuxième forme de réalisation, un procédé de détection de ces gènes consiste, à partir de l'ARNm extrait d'un échantillon biologique provenant d'un patient susceptible de porter une translocation chromosomique t(11;22), à effectuer une transcription réverse à l'aide d'un oligonucléotide de synthèse adéquat pour obtenir un ADNc correspondant; puis à amplifier ledit ADNc selon un processus d'amplification enzymatique à l'aide d'ADN polymérase et d'amorces adéquats, connu sous le nom de PCR, consistant à répéter des cycles de dénaturation de 1'ADN, hybridation des amorces et extension à partir des amorces, un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre.Les produits d'amplification sont analysés par exemple par électrophorèse pour détecter la présence d'un produit correspordant à l'un ou l'autre des gènes impliqués dans la translocation t(11;22) ou à un gène de fusion. Des méthodes de détection des produits amplifiés par adsorption sur microplaques sont aussi possibles.

L'invention concerne aussi la détection des protéines codées par l'un ou l'autre des gènes Ews ou
Hum-Fli-l, ou d'une protéine chimère codée par le gène de fusion résultant de la translocation t(11;22). Un tel procédé comprend les étapes suivantes
- le traitement d'un échantillon biologique provenant d'un patient susceptible de porter une translocation chromosomique t(11;22), de façon à rendre les protéines qu'il contient accessibles à des anticorps monoclonaux;
- la mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps monoclonal spécifique de la protéine codée par le gène Ews ou un anticorps monoclonal spécifique de la protéine codée par le gène
Hum-Fli-l, ou un anticorps monoclonal spécifique de la protéine chimère codée par le gène de fusion résultant de la translocation t(11;;22), ou un mélange de ces anticorps, dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps et les protéines présentes dans les cellules de l'échantillon;
- la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés.

De manière spécifique la détection d'ADN ou d'ARN de fusion ou encore d'une protéine chimère permet le diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées chez les sujets présentant des tumeurs à petites cellules rondes.

L'invention a en conséquence pour objet un procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, consistant, à partir d'un échantillon biologique traiter de façon à rendre les acides nucléiques qu'il contient apte à s'hybrider avec une sonde, à détecter la présence d'une translocation t(11;22).Un tel procédé comprend les étapes suivantes
- la mise en contact d'une sonde de l'invention spécifique de la séquence d'ADN d'un gène de fusion ou d'un mélange de ces sondes, avec l'échantillon biologique traité de façon à ce que les cellules qu'il contient soient lysées et éventuellement à ce que les acides nucléiques contenus dans lesdites cellules soient fragmentés à l'aide d'enzyme de restriction, dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre la (ou les) sonde(s) et l'ADN ou l'ARN cible contenu dans l'échantillon;
- la mise en évidence par tout moyen approprié des hybrides éventuellement formés.

Comme précédemment, ce procédé peut être mis en oeuvre dans des tests sur membrane ou sur plaque ou sur tout autre support adapté, selon des méthodes de dot blot ou de Southern blot ou encore de filtration.

Dans une autre forme de réalisation, un procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, consiste, à partir de 1'ARNm extrait d'un échantillon biologique, à effectuer une transcription réverse à l'aide d'un oligonucléotide desynthèse adéquat pour obtenir un ADNc correspondant; puis à amplifier ledit ADNc selon un processus d'amplification enzymatique à l'aide d'ADN polymérase et d'amorces adéquats, connu sous le nom de PCR, consistant à répéter des cycles de dénaturation de 1'ADN, hybridation des amorces et extension à partir des amorces, un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre.Les produits d'amplification sont analysés par exemple par électrophorèse pour détecter la présence d'un produit correspondant à un gène de fusion de la translocation t(ll;22). . Des méthodes de détection des produits amplifiés par adsorption sur microplaques sont aussi possibles.

Dans une autre forme de réalisation, un procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentés, consiste, à partir d'un échantillon cellulaire mis en contact avec un ou plusieurs anticorps de l'invention spécifiques de protéines de fusion, à détecter immunologiquement la présence d'une protéine codée par un gène de fusion résultant de la translocation t(11;22). Un tel procédé comprend les étapes suivantes
- le traitement d'un échantillon biologique provenant d'un patient susceptible de porter une translocation chromosomique t(11;22), de façon à rendre les protéines qu'il contient accessibles à des anticorps monoclonaux;;
- la mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps monoclonal selon la revendication 21 ou un mélange de ces anticorps, dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps(s) et les protéines présentes dans les cellules de l'échantillon;
- la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés.

Des trousses pour la mise en oeuvre de ces procédés peuvent avantageusement être préparées. Ces trousses ou kits contiennent, dans le cas d'un procédé par hybridation, des sondes selon l'invention ainsi que des échantillons d'ADN ou d'ARN témoins; dans le cas d'un procédé par transcription réverse et PCR, les oligonucléotides adéquats pour la mise en oeuvre en oeuvre de chacune de ces techniques ainsi des échantillons d'ADN ou d'ARN témoins; dans le cas d'un procédé immunologique, les anticorps monoclonaux ainsi que des échantillons témoins de réactivité connue.

L'invention concerne également l'utilisation des séquences d'ADN de l'invention pour préparer des nucléotides anti-sens, ou analogues, ayant une activité anti-tumorale; lesquels par hybridation avec tout ou partie du gène de fusion inhibent sa transcription et ainsi empêchent la production d'ARNm et de protéines chimères, et/ou, dans une autre de forme de mise en oeuvre, s'hybride avec l'ARNm transcrit et inhibe alors la production de protéines chimères.

L'invention concerne en conséquence un procédé d'inhibition de l'expression de l'ADN de fusion résultant de la translocation chromosomique t(11;22) présente chez les patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées, consistant à introduire dans les cellules tumorales une séquence nucléotidique, ou un analogue de cette séquence, capable de s'hybrider avec une séquence d'ADN correspondant au gène de fusion avec son promoteur.

Dans une forme de réalisation, un tel procédé consiste à inhiber la traduction de protéines chimères résultant de la translocation chromosomique t(11;22) présente chez les patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées, en introduisant dans les cellules tumorales une séquence nucléotidique, ou un analogue de cette séquence, capable de s'hybrider avec une séquence d'ARN correspondant à la séquence d'ADN du gène de fusion.

L'invention a en conséquence également pour objet, l'utilisation d'une séquence nucléotidique ou analogue, capable de s'hybrider avec une séquence d'ADN correspondant au gène de fusion avec son promoteur, pour inhiber l'expression de 1'ADN de fusion résultant de la translocation chromosomique t (11;22) ; ou encore l'utilisation d'une séquence nucléotidique ou analogue, capable de s'hybrider avec une séquence d'ARN correspondant à la séquence d'ADN du gène de fusion pour inhiber la traduction de protéines chimères résultant de la translocation chromosomique t(11;22) présent chez les patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées.

Les séquences d'ADN de l'invention peuvent être introduites dans des vecteurs d'expression dérivés de plasmides ou de virus, dans le but, notamment, de produire les protéines correspondant à ces séquences d'ADN, afin de préparer des anticorps spécifiques de ces protéines, ou encore afin de disposer de modèles d'étude pharmacologique.

D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront au cours de la description qui suit et qui se réfèrent à des exemples, étant entendu que ces exemples ne sauraient constituer une quelconque limitation à la portée des revendications.

I - Clonage des points de cassures
En utilisant un panel de cellules somatiques hybrides, il a été montré que le locus identifié avec la sonde VIIIF2 et celui codant pour le Facteur d'Inhibition de la Leucémie (LIF) sont de chaque coté et à proximité du point de cassure du chromosome 22 (Delattre O, Azambuja C J, Aurias A et al, Genomics 9, 721-727, (1991)). Selon l'échelle définie par Trask et al. (Trask B, Pinkel D, Van Den Engh G, Genomics 5, 710717 (1989)), la distance entre ces deux loci a été estimée -par Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur noyaux interphasiques entre 1,5 et 2 Mégabases.

Le criblage différentiel d'une banque de cosmides spécifiques du chromosome 22 avec plusieurs produits Alu-PCR (Nelson D L, Ledbetter S A, Corbo L,
Victoria M F, Ramirez-Solis R, Webster T D, Ledbetter D
H, Caskey C T, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6686-6690 (1989)) générés à partir de quatre cellules hybrides, a conduit à l'identification de trois loci indépendants qui sont télomériques au point de cassure et à proximité du locus LIF (Zucman J, Delattre O, Desmaze C et al,
Genomics, sous presse). Deux d'entre-eux sont disposés sur un large contig de 450 Kilobases préalablement construit par expansion du locus LIF. Par la technique
FISH bi-couleur sur noyaux interphasiques, le troisième locus, identifié grâce aux cosmides chevauchant Cos5 et
Cos6 (Zucman J, Delattre O, Desmaze C et al, Genomics, sous presse), a été localisé entre les loci VIIIF2 et
LIF.Le locus Cos5/Cos6 a été progressivement étendu par isolement récurrent de clones chevauchant en utilisant une banque de cosmides spécifiques du chromosome 22.

Au cours de cette procédure, il a été mis en évidence que deux cosmides, dénommés B6 et G9, chevauchent le point de cassure du chromosome 22 sur le dérivé 11 de la translocation t(11;22), de A3EW2-3B et
Alu6, deux cellules hybrides dérivant respectivement des tumeurs ES et PN et contenant le der (11) (Geurts van
Kessel A H M, Turc-Carel C, Klein A de et al, Mol. Cel.

Biol. 5, 427-429 (1985) ; Zhang F, Delattre O, Rouleau G et al, Genomics 6, 174-177 (1990)).

La technique FISH sur chromosomes métaphasiques d'une lignée cellulaire PN mise en oeuvre avec l'un de ces deux cosmides confirme que le point de cassure a été franchi car un signal fluorescent est alors observé sur le dérivé 22 de la translocation.

Des fragments d'ADN, en copies uniques dans le génome humain, proches du point de cassure du chromosome 22 ont été sélectionnés pour analyser 1'ADN d'un groupe de 20 tumeurs ES et PN. Dans tous les cas, un point de cassure est observé dans la même région de environ 7 Kb, laquelle a été dénommée EWSR1 pour
Région 1 du Sarcome d'Ewing.

Une banque de cosmides fabriquée à partir de la lignée cellulaire ICB104 dérivant d'une tumeur PN (Zhang F, Delattre O, Rouleau G et al, Genomics 6, 174177 (1990)) a été criblée avec des sondes issues de
EWSR1. Trois groupes de cosmides chevauchant ont été isolés, l'un correspondant au chromosome 22 normal et les deux autres à chacun des deux dérivés de la translocation. Par la suite, des fragments non issus du chromosome 22 mais provenant de ces cosmides ont été utilisés pour identifier un clone, dont il a été mis en évidence par la technique FISH qu'il dérivait de la région q24 du chromosome 11.

La comparaison des cartes de restriction des régions intactes et réarrangées des chromosomes 11 et 22 indique, au niveau de résolution autorisée par l'étude, que la translocation est simple et réciproque.

Le locus du chromosome 11 a été étendu sur 100 Kb par isolement récurrent de cosmides chevauchants.

Le criblage du même groupe de 20 tumeurs avec des sondes de cette région a permis d'identifier 17 points de cassures sur le chromosome 11. Ils sont répartis, sans agrégation évidente, sur une région de plus de 40 Kb dénommée EWSR2. De manière intéressante, les deux tumeurs avec une translocation variante et présentant toutes les deux un chromosome 11 cytogénétiquement intact sont altérées dans la région EWSR2; ce qui met en évidence un réarrangement sub-microscopique dans ces tumeurs.

Au niveau moléculaire, les positions des points de cassure dans les tumeurs ES et PN ne démontrent pas une spécificité évidente, suggèrant qu'ils ne permettent pas de différencier ces deux cancers très proches.

II - Caractérisation des gènes impliqués dans la translocation
La région EWSR1 est flanquée de trois groupes de sites pour une endonucléase à site de restriction rare. I1 apparaît dans les cellules humaines que ces sites sont au moins partiellement non méthylés, ce qui suggère qu'ils font partie d'îlots HTF (Lindsay
S, Bird A P, Nature 327, 336-338, (1987))
Comme cela a été mis en évidence par hybridation croisée sur de 1'ADN de souris et de hamster, la région EWSR1 est inclue dans une région phylogénétiquement conservée. Des fragments ont été sélectionnés pour cribler des northern blots préparés à partir d'ARN extrait de 7 tumeurs PNET présentant une translocation t(11;22), 3 tumeurs ES non caryotypées et plusieurs tissus normaux (poumon, coeur, foie, pancréas, placenta, rein, muscle squelettique) et 4 tumeurs de contrôle ou lignées cellulaires (neuroblastome, phéochromocytome, adenocarcinome du colon, HeLa).

Un fragment de restriction EcoRl de 3 Kb dénommé 22RR3, centromérique de la région EWSR1, détecte dans tous les échantillons un transcrit de 2,5 Kb et dans les 10 PNET testés un autre transcrit spécifique de taille variable.

Le même transcrit de 2,5 Kb et non les transcrits spécifiques des tumeurs PNET, est observé avec une sonde télomérique de la région EWSR1 (sonde 22RR12). . A l'inverse, une sonde distale de la région
EWSR2 du chromosome 11 (sonde llRRl) donne le résultat opposé en détectant le transcrit spécifique des tumeurs
PNET et pas le transcrit de 2,5 Kb. Ces résultats suggèrent fortement la présence dans les tumeurs PNET testées d'un ARN chimère liant ensemble les séquences codées par le chromosome 22 et le chromosome 11. En outre, la sonde llRRl montre à l'évidence un transcrit dans les ARN messagers des tissus du poumon, du coeur et du foie, lequel n'est pas observé dans les autres tissus normaux testés.

Des sondes dénommées 22RR3 et 22RR12 ont été utilisées pour cribler une banque d'ADNc humain, et les clones chevauchants hybridant avec les deux sondes ont été caractérisés. Le clone le plus grand contient 1968 pb dont la phase de lecture ouverte comporte un premier codon ATG se présentant dans le contexte d'une séquence consensus Kozak, il code une protéine de 656 acides aminés dénommée EWS. Une recherche dans des bases de données (NBRF et Swissprot) a révélé que la séquence des 285 premiers acides aminés présente une homologie avec des protéines telles que le glutène, la gliadine, la protéine chorionique S36, 1 ' annexine VII, les ordéines B1 et C.

Toutefois, les plus grandes homologies ont été observées avec le domaine C-terminal de la grosse sous-unité des ARN polymérases II Eucaryote (CTD-polII).

Ces différentes molécules contiennent un domaine comprenant la répétition d'un peptide de sept résidus d'acides aminés dont la tyrosine et un taux important de proline et serine. Ce domaine peut adopter une structure secondaire particulière dénommée pro- (Matsushima N, Creutz C E, Kretsinger R H, Proteins 7, 125-155, (1990))
La portion C-terminale de la protéine EWS contient trois régions (300-340, 454-513, 559-640) riches en glycine (46%), arginine (19%) et proline (13%) qui présente des homologies avec les protéines riches en glycines telles que le collagène, la kératine et les protéines liant les acides nucléiques simples brins.

Une séquence de 85 acides aminés disposée entre la première et la deuxième région est homologue à une séquence rencontrée dans plusieurs protéines liant l'ARN. Ce domaine contient les séquences consensus RNP-1 et RNP-2 (Bandziulis R J, Swanson M S, Dreyfuss G, Genes
Dev. 3, 431-437 (1989)) et a été montré comme le motif de reconnaissance de l'ARN pour la protéine snRNP U1 de 70 Kd (Query C C, Bentley R C, Keene J D, Cell 57, 89101 (1989)). Dans cette région, d'autres marques d'homologies similaires ont été trouvées avec plusieurs protéines liant l'ARN et fonctionnellement caractérisées.Toutefois, le taux le plus élevé d'homologie a été obtenu avec le produit de traduction de l'ADNc du clone pen p19 de Drosophile, lequel n'a pas de fonction connue et contient des éléments du type pen répétés (Haynes S R, Rebbert M L, Mozer B A, Forquignon F, Dawid I B, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1819-1823 (1987)).

La sonde dénommée llRRl a été utilisée pour retrouver 11 clones se chevauchant issus d'une banque d'ADNc de moelle humaine. Le clone le plus long, dénommé
BM025, avec un insert de 2939 pb, contient une phase ouverte de lecture de 1356 pb.

L'analyse de la séquence en acides aminés déduite, révèle une homologie avec des membres de la famille des gènes Ets. Pour le gène humain Ets-l, cette homologie est proche de 33 % dans le domaine d'activation de la transcription (Gutman A, Wasylyk C,
Trends Genet. 7, 49-54 (1991)) et atteint 70 % pour le domaine de fixation de 1'ADN (Karim F D, Urness L D,
Thummel C S et al, Genes Dev. 4, 1451-1453 (1990)).

L'homologie la plus frappante a été mise en évidence avec le gène Fli-l de souris pour lequel l'identité en acides aminés atteint 97 % (Ben-David Y,
Giddens E B, Letwin K, Bernstein A, Genes Dev. 5, 908918 (1991)).

III - Caractérisation des ARNm chimères codant pour les protéines hybrides
L'hybridation des extrémités 5' des deux
ADNc sur les contigs des chromosomes 11 et 22 a montré que les deux gènes sont transcrits dans le sens du centromère vers le télomère.

Le transcrit de fusion vu en northern blots est initialisé sur le chromosome 22 et terminé sur le chromosome 11. Afin d'étudier la jonction des deux gènes, les Inventeurs ont recherché les exons flanquants de manière centromérique la région EWSR1 et de manière télomérique la région EWRS2. Deux fragments génomiques dénommés 22HP.5 et llRRl qui s'hybrident respectivement avec les ADNc codant pour les protéines EWS et Hum-Fli1 ont été séquencés et ont révélé dans chaque cas la présence d'un exon.

Des oligonucléotides homologues à ces exons ont été utilisés pour réaliser une transcription réverse et amplifié par PCR les ARN issus de différentes sources.

A la différence des ARN issus de tissus de sein, de neuroblastome (IMR32), de phéochromocytome, de lymphome, de carcinome ovarien, tous les ARN issus de 7 tumeurs PNET avec une translocation t(11;22) et ceux issus de 3 tumeurs ES non-caryotypées permettent l'amplification d'un produit spécifique. Selon la tumeur, trois tailles différentes de produits d'amplification ont été observées dans un premier temps.

Leurs séquences révèlent trois types de transcrits de fusion.

Le premier type contient des séquences exoniques présentes dans les fragments 22HP.5 et llRRl et une séquence de 174 pb issue de l'exon adjacent le plus centromérque du gène Hum-Fli-l.

Les deuxième et troisième types diffèrent du premier du fait de la présence au niveau du site de jonction de séquences supplémentaires provenant respectivement de la région codante des gènes Ews et
Hum-Fli-l. Dans tous les cas, la fusion est en phase, et les protéines chimères résultantes diffèrent de la protéine EWS par la substitution du domaine de fixation de l'ARN, par le domaine de fixation de l'ADN de la protéine HUM-FLI-1 homologue au domaine de la protéine
ETS. Une étude similaire réalisée sur environ 40 tumeurs
ES et PN a permis de mettre en évidence d'autres types de gènes de fusion résultant de la translocation chromosomique t(ll;22).

IV - Discussion
La protéine EWS partage à travers- sa séquence totale des homologies avec des protéines connues pour interagir avec des acides nucléiques simples brins et plus particulièrement avec l'ARN.

Premièrement, la région C-terminale contient un motif de reconnaissance de l'ARN qui est aussi rencontré dans un groupes de protéines qui participent au processus post-transcriptionnel de l'ARN (Frankel A
D, Mattaj I W, Rio D C, Cell 67, 1041-1046 (1991)). En outre, dans la protéine Ews ce motif est flanqué par des séquences d'acides aminés riches en glycine. De telles séquences, observées dans plusieurs protéines de fixation de l'ARN, interagissent également avec l'ARN (Kumar A, Casas-Finet J R, Luneau Cj et al, J. Biol.

Chem. 265, 17094-17100 (1990) ; Munroe S H, Dong X,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 895-899 (1992)).

Deuxièmement, la région N-terminale de la protéine EWS présente une homologie avec la région
CTD-polII. I1 a été suggéré que ce domaine interagit avec les facteurs de transcription au niveau du complexe d'initiation (Corden J L, TIBS 15, 383-387 (1990)).

Ces homologies de la protéine EWS suggèrent qu'elle possède deux domaines fonctionnels différents qui participent ensemble au mécanisme d'expression génétique.

La famille des gènes Ets est impliqus à travers différents mécanismes dans les erythroleucémies induites chez la souris et la poule par des rétrovirus.

Le premier membre de cette famille a été découvert comme étant un élément génétique co-transduit donnant jour à des protéines hybrides contenant les séquences MYB et
ETS-1 (Watson D K, Ascione R, Papas T s, Crit. Rev.

Oncogenesis 1, 409-436 (1990)). Indépendamment, deux autres membres de cette famille, Spi-l (PU1) et Fli-l, sont activés par l'intégration rétrovirale de différents souches du virus de la leucémie de Friend (Ben-David Y,
Bernstein A, Cell 66, 831-834 (1991)). Tous les membres de cette famille de protéines ont une région hautement conservée, dénommée domaine ETS (Karim F D, Urness L D,
Thummel C S et al; Genes Dev. 4, 1451-1453 (1990)), dont on a montré dans la plupart des cas qu'il se fixe spécifiquement à des éléments de la région promotrice riches en purine, et favorise l'activation transcriptionnelle de différents gènes viraux ou cellulaires d'eucaryotes (Gutman A, Wasylyk C, Trends
Genet. 7, 49-54 (1991) ; Lim F, Kraut N, Frampton J,
Graf T, EMBO J. 11, 643-652 (1992) ;Hipskind R A, Rao V
N, Mueller C G F et al, Nature 354, 531-534, (1991)). En poutre, du côté N-terminal, les protéines ETS-1 et ETS-2 contiennent une région qui favorise la transcription lorsque celle-ci est liée au domaine de fixation de l'ADN de LexA (Wasylyk B, Gutman A, Flore.s P, Begue A,
Leprince D, Stehelin D, Nature 346, 191-193 (1990)) ou
Gal4 (Seneca S, Punyammalee B, Bailly M et al, Oncogene 6, 357-360 (1991)).

La plus forte homologie concernant le produit de traduction de Hum-Fli-l apparaît avec la protéine murine FLI-1 (Ben-David Y, Giddens E B, Letwin
K, Bernstein A, Genes Dev. 5, 908-918 (1991)), une protéine pour laquelle les homologies avec les domaines de fixation de l'ADN et d'activation de la transcription de ETS-1 peuvent être clairement identifiées.

Il a été montré que le site d'insertion rétroviral activant le gène murin Fli-l est situé à proximité du gène Ets-l sur le chromosome 9 de la souris. Le site d'insertion est phylogénétiquement conservé et est homologue à une région du chromosome 11 humain proche du gène Ets-l (Baud V, Lipinski M, Rassart
E, Poliquin L, Bergeron D, Genomics 11, 223-224 (1991)).

Sur la base à la fois de cette homologie et de cette conservation synténique, il est proposé que Hum-Fli-l représente l'ADNc du gène humain homologue au gène murin
Fli-l.

Le clonage des points de cassure des translocations chromosomiques récurrentes somatiquement acquises a éclairé deux mécanismes majeurs de cancérisation : la dérégulation de l'expression d'un gène et la génération de protéines de fusion (Solomon E,
Borrow J, Goddard A D, Science 254, 1153-1160; (1991)).

La translocation décrite dans l'exposé de l'invention résulte clairement de la fusion de deux gènes qui appartiennent à des familles jusqu'alors non impliquées dans la carcinogénèse humaine : la famille
ETS des protéines se fixant à l'ADN et la famille des protéines se fixant à l'ARN. Du fait que la translocation est réciproque sans perte apparente de matériel génétique, sur chacun des deux chromosomes dérivés, l'extrémité 5' du gène est juxtaposée à l'extrémité 3' de l'autre gène.

Le gène chimère généré sur le der(ll) n'est pas exprimé à un niveau suffisant pour être mesuré en northern blots et ne semble pas être impliqué dans le phénotype tumoral puisque le der(11) peut occasionnellement être perdu dans les tumeurs ES (Turc
Carel C, Philip I, Berger M P, Philip T, Lenoir G M,
Cancer Genet. Cytogenet. 12, 1-19 (1984) ; Douglass E C,
Valentine M, Green A A, Hayes F A, Thompson E i, J. N.

C. I. 77, 1211-1213 (1986)). Au contraire, l'hybride transcrit généré par le der(22) est visible en northern blots bien que son niveau intracellulaire semble diminuer en comparaison avec le transcrit normal du gène
Ews codé par le chromosome 22. Cette différence pourrait être due à une instabilité conférée par une longue séquence 3' non codante riche en AT (Brawerman G, Cell 57, 9-10 (1989)), telle que celle rencontrée dans le transcrit Hum-Fli-l.

La translocation t(11;22) a deux conséquences directes
- Premièrement, elle place l'expression du domaine de fixation de 1'ADN, HUM-FL-1, sous le contrôle d'un promoteur ectopique, le promoteur Ews, dont il a été montré par hybridation en northern blot, qu'il ne partage pas la spécificité de tissus du promoteur Hum Flil.

- Deuxièmement, la translocation substitue le domaine de fixation de 1'ADN, HUM-FLI-1, par un domaine de fixation de 1'ARN et le relie par la même chaîne polypeptidique à un domaine qui présente une homologie avec la CTD-polII.

L'implication constante de la bande 22q12 et plus précisément de la région EWSR1 dans les tumeurs ES et PN indique que ce. dernier domaine joue un rôle essentiel dans le processus de cancérisation. La structure de la protéine chimère indique que ce rôle est probablement mis en oeuvre via l'altération de la régulation de transcription des gènes cibles de Hum
Fli-l.

Par analogie avec le mode d'action de la
CTD-polII (Peterson C L, Krugen W, Herskowitz I, Cell 64, 1135-1143 (1991)), la protéine chimère peut gêner fonctionnellement les éléments de régulation négatifs contrôlant la transcription. Un exemple possible d'une telle altération pourrait être l'antigène MIC2, lequel est spécifiquement surexprimé dans les tumeurs PNET présentant une translocation t(11;22) (Ambros I M,
Ambros P F, Strehl S et al, Cancer 67, 1886-1893 (1991) ; Garin-Chesa P, Fellinger E J, Huvos A G et al, Am. J.

Pathol. 139, 275-286 (1991)).

L'implication dans une tumeur solide d'un gène du type Ets indique que le rôle de la famille des protéines ETS dans le processus de cancérisation n'est pas limité aux cancers hématologiques. Dans le cas des érythroleucémies, dans lesquelles cette famille est impliquée, un phénotype hautement transformé est associé à d'autres altérations, intervenant soit par cotransduction des séquences Myb, soit par une altération du gène TP53 (Ben-David Y, Bernstein A, Cell 66, 831-834 (1991)).

Dans le cas du Sarcome d'Ewing, outre la translocation t (11;22), d'autres d'aberrations chromosomiques récurrentes incluant une translocation t(lql6p) non compensée ont été décrites (Douglass E C,
Valentine M, Green A A, Hayes F A, Thompson E i, J. N.

C. I. 77, 1211-1213 (1986) ; Mugneret F, Lizard S,
Aurias A, Turc-Carel C, Cancer Genet. Cytogenet. 30, 239-245 (1988)) . Leur contribution au phénotype tumoral reste à évaluer.

Les analyses de caryotypes démontrant la présence d'une translocation t(11;22) dans les tumeurs à petites cellules rondes ont été utilisées pendant plusieurs années comme un critère de diagnostic des tumeurs ES et PN. Deux nouvelles approches pour un diagnostic sont maintenant disponibles
- la première repose sur le fait que la petite taille de la région EWSR1 autorise une détection simple des réarrangements génomiques par la technique de
Southern;
- la seconde repose sur une transcription réverse et une amplification génique par PCR et fourni une méthode sensible pour montrer la présence de transcrits de fusion dans les tumeurs et dans leurs sites métastasiques potentiels.

Il est à présent possible d'obtenir des indications sur la fréquence et la spécificité des altérations Ews et Hum-Fli-l dans les tumeurs humaines, et plus particulièrement dans celles présentant des aberrations cytogénétiques 22q12 et/ou llq24 (Whang-Peng
J, Freter C E, Knutsen T, Nanfro J J, Gazdar a, Cancer
Genet. Cytogenet. 29, 155-157 (1987) ; De Chadarevian J
P, Vekemans M, Seemayer T A, N. Engl. J. Med. 311, 17021703, (1984) ; Cavazzana A O, Navarro S, Noguera R et al, Adv. Neuroblastoma Res. 2,463-473 (1988) ; Vigfusson
N V, Allen L J, Philip J H, Alschibaja T, Riches W G,
Cancer Genet. Cytogenet. 22, 211-218 (1986) ; Aurias A,
Rimbaut C, Buffe C, Dubousset J, Mazabraud A, N. Engl.

J. Med. 309, 496-497 (1983) ; Turc-Carel C, Philip I,
Berger M P, Philip T, Lenoir G M, N. Engl. J. Med. 309, 497-498, (1983) ; Whang Peng J, Triche T J, Knutsen T,
Miser J, Douglass E C, Israel M A, N. Engl. J. Med. 311, 584-585 (1984) ; Turc-Carel C, Aurias A, Mugneret F et al, Cancer Genet. Cytogenet. 32, 229-238 (1988)) ; Turc
Carel C, Dal Cin P, Rao U, Karakousis C, Sandberg A,
Cancer Genet. Cytogenet. 30, 145-150 (1988) ; Shen W P
V, Young R F, Walter B N, Choi B H, Smith M J, Katz J,
Cancer Genet. Cytogenet. 45, 207-217 (1990) ; Trent J M,
Kaneko Y, Mitelman F, Cytogenet.Cell Genet. 51, 533-562 (1989))
L'hypothèse d'une relation entre Ews et un défaut génétique héréditaire responsable de la
Neurofibromatose de type II, qui a été localisé dans la même région 22q12 (Rouleau G A, Seizinger B R,
Wertelecki W et al., Am. J. Hum. Genet. 46, 323-328 (1990)) peut également être examinée.

V - Description des figures
FIGURE 1
1) Résultats
La figure 1 représente la carte de la région
EWSR1 sur le chromosome 22
- En A est représentée de manière schématique une partie du contig résultant de l'expansion du locus Cos5/Cos6 identifié par hybridation différentielle Alu-PCR (Zucman J, Delattre O, Desmaze C,
Azambuja C, Rouleau G, De Jong P, Aurias A, Thomas G, Genomicsr sous presse).

La position du contig est indiquée en rapport avec différents autres loci proches. Les cosmides B6 et G9 recouvrent les points de cassure de
A3EW2-3B et ALU 6, deux cellules somatiques hybrides qui contiennent le der(ll) respectivement des tumeurs ES et
PN (Geurts van Kessel A H M, Turc-Carel C, Klein A de et al, Mol. Cel. Biol. 5, 427-429 (1985) ; Zhang F,
Delattre O, Rouleau G et al, Genomics 6, 174-177 (1990)) .

- En B est représentée la carte de restriction EcoRl d'un fragment de 100 Kb centré autour de la région EWSR1. La position de trois régions de dinucléotides CpG est indiquée : CpG1 contient 3 sites
SacII, 3 sites BssHII et 1 site MluI; CpG2A contient 3 sites SacII, 3 sites BssHII; CpG2B contient 3 sites
BssH2, 3 sites SacII et 1 site NotI.

- En C est représentée une carte de restriction détaillée de la région EWSR1 sur laquelle les sites PstI sont marqués (P), les sites BamHI sont marqués (B), les sites XbaI sont marqués (X) et les sites EcoRI sont marqués (R). Les flèches verticales indiquent les fragments de restriction réarrangés dans chacune des 20 tumeurs testées.

2) Méthode
a) Une banque spécifique du chromosome 22,
LL22NC01 construite à partir de vecteur cosmidique
Lawrist 5 a été utilisée pour mener les expériences sur le chromosome 22. Les fragments terminaux où l'insert entier ont été marqués par random priming en utilisant un dCTP marqué en alpha par le 32P. Les séquences humaines répétitives et les vecteurs contaminant résiduels ont été inhibés avec un large excès d'ADN humain total et de vecteurs d'ADN.

La sonde préincubée a été alors utilisée pour cribler la banque selon les procédures standards et les cosmides chevauchants ont été identifiés.

b) Les échantillons de tumeurs ont été récupérés immédiatement après opération.

Un fragment a été utilisé pour l'analyse de caryotype
- les tumeurs T2 à Tll présentent une translocation t(11;22)(q24;q12) typique;
- la tumeur T12 présente une translocation complexe t(10;îl;22;12) (q22;q24;ql2;q24);
- la tumeur T13 présente une variante de translocation t(14;22) (q32;q12);
- la tumeur T14 présente une variante de translocation t(7;22) (q35;q12);
- la tumeur T15 présente une translocation complexe t(11;11;22) (q13;q24;q12).

L'analyse des carayotypes des tumeurs 16 à 19 n'a pas été réalisée et la tumeur T20 présente uniquement des métaphases normales. L'analyse en FISH bi-couleur sur noyaux interphasiques des tumeurs T17 et
T19 montre l'apparition d'un point de cassure dans la bande 22ql2 (Desmaze C, Zucman J, Delattre O, Thomas G,
Aurias A, Genes Chr. Cancer, sous presse).

La tumeur T1 correspond à la lignée cellulaire hybride A3EW2. La lignée cellulaire hybride
Alu6 est issue de la tumeur T8. Les tumeurs T7 à T13 sont des tumeurs PN; toutes les autres tumeurs ont été diagnostiquées Sarcome d'Ewing. L'ADN des échantillons de sang (N) et d'échantillons de tumeurs (T) a été digéré avec l'enzyme PstI et analysé selon la méthode de
Southern avec la sonde 5.5-sac.

FIGURE2
Cette figure représente la détection de bandes réarrangées dans des tumeurs; plus particulièrement, la détection de fragments génomiques anormaux dans 6 tumeurs. Le numéro de la tumeur est indiqué en haut des bandes. Les échantillons d'ADN provenant de sang des patients porteurs des tumeurs T16 et T18 sont indiqués par (N). Dans chaque cas, le fragment correspondant à la jonction réarrangée est indiqué par une flèche horizontale.

FIGURE3
1) Résultats
La figure 3 représente la carte de restriction des régions impliquées dans la translocation chromosomique t(11;22) (q24;q12); les régions normales (22N) et (île) et les deux dérivés 11 et 22 de la translocation t(1;22), der(ll) et der(22) sont représentées pour la tumeur Tll.

La double ligne représente le chromosome 11, la ligne épaisse représente le chromosome 22.

Dans les dérivés der(11) et der(22), la simple ligne entre les parties des chromosome 11 et 22 représente le fragment de fusion EcoRl. EWSR1 et EWSR2 représente la région la plus petite qui contient tous les points de cassures identifiés respectivement sur le chromosome 22 et le chromosome 11. Les flèches verticales indiquent la position des fragments réarrangés EcoR1 identifiés dans 17 tumeurs.

Les abréviations désignant les tumeurs sont identiques à celles utilisées à la Figure 1.

Enfin, les positions des sondes 22RR3, 22RR12, 22HP.5 et llRRl sont indiquées.

2) Méthodes
Un linker XhoI a été inséré au niveau du site BamHI d'un vecteur SuperCos commercialisé par la
Société Stratagene. L'extrémité 3' de 1'ADN partiellement digéré par MboI d'une lignée cellulaire
ICB 104 dérivée de la tumeur Tll (Zhang F, Delattre O,
Rouleau G et al, Genomics 6, 174-177 (1990)), a été partiellement comblé avec des dGTP et dATP. Les fragments de haut poids moléculaire ont été purifiés sur gel et lié au site XhoI du vecteur SuperCos modifié et comblé partiellement avec des dTTP et dCTP. Après conditionnement avec le kit Gigapack Gold de la Société
Stratagene, les virions ont été utilisés pour infecter la souche d'E. coli DH5 alpha MCR.

La banque obtenue de 4.105 cosmides indépendants a été criblée avec les sondes 22RR3 et 22RR12. Les groupes de clones chevauchants contenant soit une région EWSR1 non altérée (22N) ou le fragment de jonction du dérivé 22 de la translocation, der(22), ou du dérivé 11 de la translocation, der(ll), ont été identifiés. La sonde llRRl a permis de retrouver un cosmide, lequel par hybridation fluorescente in situ sur chromosome est montré comme provenant de la bande llq24. Ce cosmide a été utilisé pour étendre la locus sur le chromosome 11 normal.

Figure4
Cette Figure montre la détection en Northern blots de transcrits anormaux dans le Sarcome d'Ewing ou des lignées cellulaires.

Le même northern blot contenant 1 Rg d'ARNm polyadéSylé provenant des tumeurs T19, Tll, T8 et T18 ou de la lignée de neuroblastome IMR32 a été successivement hybridé avec les sondes 22RR3, 22RR12 et llRRl.

N représente le transcrit normal du gène Ews, R représente les transcrits de fusion.

Selon la tumeur, les tailles des transcrits anormaux sont sensiblement différentes. Les mêmes transcrits anormaux sont détectés à la fois avec la sonde 22RR3 et la sonde llRRl, ce qui indique que la translocation donne lieu à la synthèse d'un transcrit chimère.

FIGURE 5
1) Résultats
Cette figure représente la détection par transcription réverse et PCR de trois types de transcrits chimères.

M est un marqueur de taille. Breast correspond à un tissu de sein; OVARY correspond à un carcinome ovarien; IMR32 correspond à une lignée cellulaire de neuroblastomes. Les abréviations désignant les patients sont identiques à ceux de la figure 1.

Les trois types de transcrits décrits à la figure 9 ci-après sont indiqués 1, 2, 3 par une flèche.

2) Méthode
L'oligonucléotide lIA de formule suivante
5' AGAAGGGTACTTGTACATGG 3'
a été utilisé comme amorce pour la transcription réverse de 1 Ag d'ARN total en utilisant un kit de PCR Gen Amp RNA de la Société Cetus. L'ADNc résultant a été soumis à 30 cycles d'amplification par
PCR avec les amorces 11.3 et 22.3 respectivement de formules suivantes
5' ACTCCCCGTTGGTCCCCTCC 3'
5' TCCTACAGCCAAGCTCCAAGTC 3'
Chaque cycle comprenant une étape de dénaturation à 900C pendant 30 secondes, puis à 650C pendant 1 minute, une étape d'extension à 720C pendant 2 minutes. Le fragment amplifié a été identifié par électrophorèse sur gel et révélé au bromure d'éthidium.

FIGURE 6
1) Résultats
Cette figure représente la séquence nucléotidique de l'ADNc contenant la région codante entière et l'extrémité 3' non transcrite du gène Ews;
Ainsi que la séquence en acides aminés déduites de cet
ADNc codon par codon.

Ces séquences sont numérotées sur la gauche.

Deux signaux de polyadénylation, l'un commençant au nucléotide 2143 et l'autre au nucléotide 2332 sont soulignés.

Le premier codon de la méthionine est localisé avec une purine (A) en position -3 et une guanosine (G) en position +4 en accord avec la séquence consensus Kozak.

2) Méthode
Les sondes 22RR3 et 22RR12 ont été utilisées pour cribler une banque d'ADNc de cerveau foetal humain (Stratagene cat. nO 936206) et ont permis d'identifier un clone qui a été dénommé BFlAC5. La sonde llRR1 a été utilisée pour cribler une banque d'ADNc de moelle humaine (Clontech cat. nO HL1058) et a permis d'identifier un clone qui a été dénommé BM025. Un million de clones ont été mis sur plaques et criblés dans chaque banque. Les fragments d'ADN sous-clonés dans les phases M13mpl8 ou M13mpl9 ont été utilisés comme matrices pour déterminer les séquences nucléotidiques en utilisant la méthode de terminaison de chaîne didéoxy et soit une polymérase T7 modifiée, soit la taq polymérase commercialisée par la Société Amersham. Les séquences d'ADNc de 2372 pb et 2939 pb des clones FLAC5 et BM025 ont été déterminées sur les brins des sous-clones chevauchant, en utilisant soit l'amorce M13, soit des amorces du commerce. I1 a été montré qu ils contiennent la séquence codante entière des gènes Ews et Hum-Fli-1.

Le séquençage direct des produits d'amplification PCR a été effectué avec un Sequenase commercialisé par la Société USB après 30 cycles d'amplification asymétrique avec soit l'amorce 11.3, soit l'amorce 22.3, puis purification à travers une membrane Centricon 100 commercialisé par la Société
Amicon.

FIGURE7
Cette figure représente l'ADNc du gène Hum-Fli-1.

FIGURE 8
La figure 8 représente la séquence nucléotidique de l'ADNc de fusion obtenue par réverse transcription et amplification par PCR du transcrit de fusion de type 1.

La séquence homologue (à l'extrémité 5') ou complémentaire (à l'extrémité 3') aux amorces utilisées pour l'amplification par PCR sont soulignées. La ligne verticale indique la jonction entre les deux gènes qui se présentent entre la première et la seconde position du codon 265 du gène Ews et entre les mêmes positions du codon 219 du gène Hum-Fli-l.

FIGURE 9
Cette figure représente les différentes domaines de la protéine EWS codée par le gène Ews.

- en A, sont représentés les différents domaines peptidiques. La région hachurée représente les 270 premiers acides aminés contenant une forte proportion de tyrosine, glutamine, serine, thréonine, glycine, alanine et proline, lesquels représentent ensemble environ 90% de tous les résidus. Dans cette région, la plupart des tyrosines sont présentes tous les 5 à 9 résidus et définissent un motif dégénéré répété 31 fois. Après la tyrosine, les résidus les plus récurrents dans la répétition sont une sérine en position -1 (50%), une glycine en position +1 (50%), et deux glutamines enpositions +2 et +3 (respectivement 70% et 40%). Cette partie de la molécule présente une homologie avec la
CTD-polII.

Les trois zones ombrées correspondent à des régions riches en glycine, arginine et proline.

La zone marquée "RNA BD" représente un domaine supposé de fixation de 1'ARN, lequel est exposé en B.

Les flèches indiquent la position du point de jonction Hum-Fli-l pour les trois types différents de protéines chimères telles que déduites par transcription réverse et amplification par PCR exposées précédemment.

- en B, on montre les alignements les plus significatifs de la protéine EWS dans la région supposée de fixation de l'ARN. Dpen p19 pou le clone pen p19 de
Drosophile (Haynes S R, Rebbert M L, Mozert B A,
Forquignon F, Dawid I B, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1819-1823 (1987)); H nucl pour nucléoline humaine (Srivastava M, McBride O W, Flemming P J, Pollard H B,
Burns A L, J. Biol. Chem. 265, 14922-14931 (1990));
HsnRNP U1 pour snRNP U1 humaine de 70 Kd (Spritz R A,
Strunk K, Surowy C S, Hoch S O, Barton D E, Francke U,
Nuclei. Acid. Res. 15, 10173-10391 (1987)); HhnRNP Al et B1 pour hnRNP humaine Al (Biiamonti G, Buvoli M, Bassi M
T, Morandi C, Cobianchi F, Riva S, J. Mol.Biol. 207, 491-503 (1988)) et B1 (Burd C G, Swanson M S, Goerlach
M, Dreyfuss G, Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 9788-9792 (1989)); HPABP pour protéine de fixation poly(A) humaine (Grange T, Martin de sa C, Oddos J, Pictet R, Nuc. Acids
Res. 15, 4771-4787 (1987)).#2, #3 and #4 se rapportent à différents domaine de fixation de l'ARN au sein de la même protéine. Les positions invariables parmi ces protéines sont ombrées et les substitutions minimums entre EWS et au moins 4 des 6 protéines sont indiquées en caractères gras.

Les domaines I à IV ont été décrits par
Query C C, Bentley R C, Keene J D, Cell 57, 89-101 (1989) . RNP-1 et RNP-2 se rapportent aux motifs consensus commentés par Brandzilius R J, Swanson M S,
Dreyfuss G, Genes Dev. 3, 431-437 (1989). A la droite de la Figure 8 B, il est indiqué par ItIdentities'l le pourcentage de résidus identiques entre EWS et chacun des domaines de fixation d'ARN considérés. Il est en outre indiqué du côté C-terminal la présence d'une région riche en résidu glycine (GR) et d'un domaine basique (Basic D).

FIGURE 10
Cette figure représente de manière schématique les protéines codées par le gène EWS normal (EWS), le gène Hum-Fli-l normal (Hum-Fli-l), et leurs gènes de fusion (EWS/Hum-Fli-l type 1, 2 et 3).

Dans les trois types de protéines chimères, la portion C terminale de EWS contenant le domaine supposé de fixation de l'ARN (désigné RNA BD) est remplacée par la partie C-terminale du gène Hum-Fli-l contenant le domaine ETS (désigné ETS D). La protéine chimère de type 1 est entièrement représentée sur la figure; les protéines de type 2 ou 3 peuvent être déduites de celle de type 1 par l'insertion de 84 ou 22 acides aminés supplémentaires provenant respectivement de EWS ou Hum-Fli-l. Les positions des codons interrompus sont indiqués dans tous les cas.

FIGURES 11 et 12
La figure 11 représente la carte de restriction des gènes Ews et Hum-Fli-l au niveau de leur région de cassure EWSR1 et EWSR2. La position approximative des exons est indiquée par rapport aux sites de restrictions. Les cadres ouverts de lecture sont divisés par les différents exons; chaque intron entre deux exons codant interrompt le cadre ouvert de lecture suivant une des trois phases : A, B ou C.

La figure 12 représente la structure exonique du gène Ews.

Il a été en outre possible de séquencer la majorité des jonctions introns-exons pour ce gène (les exons sont indiqués en gras)
EXON 1
Site accepteur AAAATGGCGTCCACGGGTGAGTATGGTGGACTGCGTATCGA
EXON 2
Site accepteur : Non fait
Site donneur
CTGCNGCGCA (GC)AGGGGTAAGTCAGTCTTTTATAACCGTATTTTGTGTGTG
ATTAATATTTTTTGAATATGGAGCCTTCTATAATTGTAGAGGTGTATTTGAATGTT
CTCTATTCAAGTTATTGCATTT
EXON 3
Site accepteur
GGTGGTATTTGAATGTTCTCTATTCAAGTTATTCCATTTAATTCTTTTGCAGCTA
CAGTGCTTACACCGNCCAGC
Site donneur
CCACTCAAGGATATGCACAGACCACCCAGGTAATCTTTAAAATAATTACATG
T
EXON 4
Site accepteur
AAAAGNNNACGTATGAAGTTCTTGNATTCGGTTTTTTTTTGGAGCAGGCATATGG
GNNACAAAGC
Site donneur :Non fait
EXON 5
Site accepteur
CGCACCTACAAGGTAAGNCCATGGTGCCCTTAATGCGTCAGTCTTATGTGGAGG
GAAAGAAAG CAA
Site donneur : Non fait
EXON 6
Site accepteur
TTTTTAATTTTATTTATTATTTCTCCTCTTAGACCGCAGGATGGAAACAAGCC
CACTGAGACTAGTCAACC
Site donneur
GTCACTGCACCTCCATCCTACCCTCCTACCAGGTCAGTCTACTTTTTNTGG
CAAAACAAAAACAGTGACAAAACAG
EXON 7
Site accepteur
AAAAANGNTTTTTTTTTTTTCTCCTTCCT (A) CTCTCTTTCAGGCTATTCCTCT
ANACCAGCCGACTAGTT
Site donneur
AACANAGCAGCAGCTACGGGCAGCAGAGTGAGNGCTANGAGAGAAAACCAAA
TAAGAA
EXON 8
Site accepteur
AAAGTACATCAGGCAGTGGTGTAAATGATGGTCCATGGCTTACAGATGTGTCACTC
TTTCCTCA(G)GTTCATTCCACAGNCCACCCCAGTAGCATGGGTGTTTAT
GGGCAGGAGTCTGGAGNATTTTCCGGACCAGGAGAGAA
Site donneur
GCATGAGCAGAGGTGGGCGGGGAGGAGGACGCGGTGGAATGGGGTAAGAA
CAAACCTTTTCTCCTTTTACCTAATTTTGTTTCATCCATAGGATTTTCAGTGGAAA
GAAGGGA
EXON 9
Site accepteur
TTTTAAAGGGAAAGGCCTTCATTTCTTCGTTTATCCCCCCAGCAGCGCTGGAGA
GCGAGGTGGCTT
Site donneur
CAATAAGCCTGGTGGTAAGTTTTGAGTATTACCATAGATAGTGTTTAPS AAAA
ATGC
EXON 10
Site accepteur CGTGCACTAATAATATTTATATGATCTTTCCTGGTTGGCAGGACCCATGGA
Site donneur
TGAAGGACCAGATCTTGATCTAGGTAAT
EXON li :Non fait
EXON 12
Site accepteur
TTTTTTCTCCCAAATTAGTATATTCTAGTCATGCCTAACTATGCTATTCTTTGTCT
TAGATGAACAAGAGAACTGGG
Site donneur TGGAATGGTTTGATGGTGAGATGTACTNACTGGCATTCTTAATCTCCC
EXON 13
Site accepteur
TTGATGATGAT GTGGAGTTGGTGAACAGGGAGTACAGGGGNGTAATTGATGTTCTG
TTGTCTTGTTCCAGGGAAAGATTTTCAAGGGAGCAAACTTAAA
Site donneur
AGCTGGAGACTGGCAGTGTNCCAATCCG (T) (A) TGTACTNGNNTTNNCAAA
TTGANNCCCTACG
EXON 14
Site accepteur
TCTTCCTTAGTTCAATTGGTGATTTCTGCTGTGATGTAATTGTATGCAGGGGTTG
TGGAAACCAGAACTTCGCCTGGAGAACA
Site donneur
CCCTTTCCGCCCCCGGGTAGGTGCAGGTTTCATGAGTGTCCCCTCAGCTTCCT
GGTGCTAAACCTCTTTTCTTATTT
EXON 15
Site accepteur
CCCACTGACTGCTTTCGCCCTGCTATTCTCACCTTAGGTGGTGATCGTGGCAG
A
Site donneur
CCTGGAAAAATGGATAAGTAAGTGCTGGTGAAAAGCAGCTGTGGGCCGCCAGN
ACAGT
Il a été également possible de séquencer la majorité des jonctions introns-exons du gène Hum-Fli-l :
EXON P3
Site accepteur
AACTTCCCTTGNAAGTNTTGACCCCCTTGGGCTTTTGCCCCCTCCTCACTTTAGG
GAGTCTCCGGTGGAC
Site donneur
TCGTCCCCGCAGGTAATTCGAGAACCAGGCTGCCTGGGCGCCATTCACTTCCCC
ACTCTCT
EXON P4
Site accepteur
CCTCTACCTTCCTGCAGTCCTTGCTAACAACGTCTTCTCCTCTGCAGACCCCACA
CTG
Site donneur CCTCAGGGAAAGTAAGTGCCGCCCAAGTACCCAGGGCTGGGAGGAAGCTTTG
EXON P5 ::
Site accepteur TTTTGGTTATAACCTGTTTATGTTTTCCCTCTNAGGTTCACTGCTGGCC
Site donneur
TGTCAAAGAAGGTAAGTTTGTCCTTTTGTGCACTTAAAATTTNCTNCTGTACC
EXON P6
Site accepteur TAATGTACCCCTATTTGTNATTGTTCATTAGACCCTTCTTATGAC
Site donneur
CCTCAAC AAAGTANGTAAATGTTTTATAGTTCTTTGGNGGAAGCATGTTTCT
EXON P7
Site accepteur GGGCCTACCACTGAATNTTTCCCCTTTCANAGGTCCTCCCCTTGG
Site donneur CCCAGCCAGGTCCTCCCCAGGATATGTAATCTCTCCTTTGTTCCTCAC
EXON P8
Site accepteur : Non fait
Site donneur TAGCCAACCCTGGNGAGTTTACCTTGGCCTNAAAGCCTTTTTT
EXON P9
Site accepteur GTGTTCTGTTCTCTCCCGTTTCCTCACGGCGTGCAGGAAGCGGGCAGATC
Il est donc possible à partir de ces informations de prévoir la multiplicité des produits de fusions possibles des deux gènes. A titre d'exemple, par transcription réverse puis amplification génique par
PCR, les produits de fusion juxtaposant les exons suivants ont été observés
Gène Ews Gène Hum-Fli-l
Exon 7 avec Exon P5
Exon 7 avec Exon P6
Exon 9 avec Exon P4
Exon 10 avec Exon P5
Exon 10 avec Exon P6
Exon 10 avec Exon P8
Figure 13
Cette figure représente la séquence de la région promotrice du gène Ews.

Claims (31)

REVENDICATIONS

1) Séquence d'ADN constituée de tout ou partie de l'une ou l'autre ou de la fusion des séquences nucléotidiques des gènes des chromosomes 11 et 22 localisés au niveau du point de cassure de la translocation chromosomique récurrente t(11;22) (q24;q12)

2) Séquence d'ADN selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée de tout ou partie de la séquence nucléotidique du gène Ews.

3) Séquence d'ADN selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est constituée de tout ou partie de la séquence nucléotidique de 1'ADNc du gène

EWS de la figure 6.

4) Séquence d'ADN selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée de tout ou partie de la séquence nucléotidique du gène Hum-Fli-l.

5) Séquence d'ADN selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est constituée de tout ou partie de la séquence nucléotidique de 1'ADNc du gène

Hum-Fli-l de la figure 7.

6) Séquence d'ADN du gène de fusion résultant de la translocation t(11;22) (q12;24) selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une partie de la séquence nucléotidique du gène Ews et d'une partie de la séquence nucléotidique du gène Hum-Fli-l.

7) Séquence d'ADN selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est constituée de la partie de la séquence nucléotidique du gène Ews jusqu'à la région EWSR1 de 7 Kb au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 22 et, de la partie de la séquence nucléotidique du gène Hum-Fli-l jusqu'à la région EWSR2 de 40 Kb au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 11.

8) Séquence d'ADN selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une partie de la séquence nucléotidique de l'ADNc du gène Ews de la figure 6 et, d'une partie de la séquence nucléotidique de l'ADNc du gène Hum-Fli-l de la figure 7.

9) Séquence d'ADN selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est constituée par ou comprend la séquence représentée à la figure 8.

10) Sonde caractérisée en ce qu'elle est capable de s'hybrider avec tout ou partie d'au moins une des séquences d'ADN selon l'une des revendications 1 à 9.

11) Oligonucléotide comprenant environ 20 bases caractérisé en ce qu'il est issu d'une sonde selon la revendication 10.

12) Oligonucléotide selon la revendication 11 pour la transcription réverse d'ARNm de fusion, caractérisé en ce qu'il est constitué de la séquence de formule suivante

5' AGAAGGGTACTTGTACATGG 3'

13) Oligonucléotides selon la revendication 11 constituant des amorces pour l'amplification génique par PCR d'un ADNc de fusion, caractérisés en ce qu'ils sont constitués des séquences de formules suivantes

5' ACTCCCCGTTGGTCCCCTCC 3'

5t TCCTACAGCCAAGCTCCAAGTC 3'

14) Protéine codée par la séquence d'ADN du

Gène Ews selon l'une des revendications 2 et 3, dont la séquence est représentée à la figure 6.

15) Protéine codée par la séquence d'ADN du

Gène Hum-Fli-l selon l'une des revendications 4 et 5, dont la-séquence est représentée à la figure 7.

16) Protéine de fusion présente dans les cellules des patients présentant une translocation chromosomique t(11;22), caractérisée en ce qu'elle est constituée de la séquence en acide aminée codée par la séquence d'ADN de fusion selon l'une des revendications 6 à 9.

17) Protéine selon la revendication 16, caractérisée en qu'elle a conservé la partie N-terminale de la protéine EWS et la partie C-terminale de la protéine Hum-Fli-l.

18) Protéine selon l'une des revendications 16 à 17, caractérisée en ce que sa séquence en acides aminés est constituée par ou comprend la séquence représentée à la figure 8.

19) Anticorps spécifique de la protéine EWS selon la revendication 14.

20) Anticorps spécifique de la protéine HUM

FLI-1 selon la revendication 15.

21) Anticorps spécifique de la protéine de fusion présente dans les cellules des patients présentant une translocation t(11;22) selon l'une des revendication 16 à 18.

22) Procédé de détection de l'un ou l'autre des gènes Ews ou Hum-Fli-l ou encore d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(11;22), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes " - le traitement d'un échantillon biologique provenant d'un patient susceptible de porter une translocation chromosomique t(11;22), de façon à rendre les acides nucléiques qu'il contient aptes à s'hybrider avec une sonde;

- la mise en contact d'une sonde selon la revendication 10 spécifique, soit de la séquence d'ADN du gène Ews, soit de la séquence d'ADN du gène

Hum-Fli-l, soit de la séquence D'ADN d'un gène de fusion, ou d'un mélange de ces sondes, avec l'échantillon biologique, dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre la (ou les) sonde(s) et 1'ADN ou 1'ARN cible contenu dans l'échantillon;;

- la mise en évidence par tout moyen approprié des hybrides éventuellement formés.

23) Procédé de détection de l'un ou l'autre des gènes Ews ou Hum-Fli-l ou encore d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(11;22), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes

- l'extraction d'ARNm d'un échantillon biologique provenant d'un patient susceptible de porter une translocation chromosomique t(11;22);

- la synthèse, par transcription réverse de cet ARNm à l'aide d'un oligonucléotide selon la revendication 11, d'un ADNc correspondant;

- L'amplification génique à l'aide d'ADN polymérase et de deux oligonucléotides amorces selon la revendications 13, de cet ADNc;

- l'analyse des produits amplifiés.

24) Procédé de détection de l'un ou l'autre des gènes Ews ou Hum-Fli-l ou encore d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(11;22), caractérisé en ce qu il comprend les étapes suivantes

- le traitement d'un échantillon biologique provenant d'un patient susceptible de porter une translocation chromosomique t(11;22), de façon à rendre les protéines qu'il contient accessibles à des anticorps monoclonaux; ;

- la mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps monoclonal selon la revendication 19 spécifique de la protéine EWS, ou un anticorps monoclonal selon la revendication 20 spécifique de la protéine HUM-FLI-1, ou un anticorps monoclonal selon la revendication 21 spécifique d'une protéine chimère, ou un mélange de ces anticorps, dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps(s) et les protéines présentes dans les cellules de l'échantillon;

- la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés.

25) Procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes

- le traitement d'un échantillon biologique provenant d'un patient susceptible de porter une translocation chromosomique t(11;22), de façon à rendre les acides nucléiques qu'il contient aptes à s'hybrider avec une sonde;

- la mise en contact de l'échantillon biologique avec une sonde selon la revendication 10 ou un mélange de ces sondes, dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre la (ou les) sonde(s) et l'ADN ou l'ARN cible contenu dans l'échantillon;

- la mise en évidence par tout moyen approprié des hybrides éventuellement formés.

26) Procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes

- l'extraction d'ARNm d'un échantillon biologique provenant d'un patient susceptible de porter une translocation chromosomique t(11;22);

- la synthèse, par transcription réverse de cet ARNm à l'aide d'un oligonucléotide selon l'une des revendications 11 et 12, d'un ADNc correspondant;

- L'amplification génique, à l'aide d'ADN polymérase et d'oligonucléotides amorces selon l'une des revendications 11 et 13, de cet ADNc;

- l'analyse des produits amplifiés pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la translocation t(11;22).

27) Procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes

- le traitement d'un échantillon biologique provenant d'un patient susceptible de porter une translocation chromosomique t(11;22), de façon à rendre les protéines qu'il contient accessibles à des anticorps monoclonaux;

- la mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps monoclonal selon la revendication 21 ou un mélange de ces anticorps, dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps et les protéines présentent dans les cellules de l'échantillon;

- la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés.

28) Utilisation d'une séquence nucléotidique ou d'un analogue de cette séquence, capable de s'hybrider avec une séquence d'ADNcorrespondant au gène de fusion avec son promoteur selon l'une des revendication 6 à 9, pour préparer un agent thérapeutique inhibant l'expression de l'ADN de fusion résultant de la translocation chromosomique t(11;22) dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées.

29) Agent thérapeutique pour inhiber l'expression de l'ADN de fusion résultant de la translocation chromosomique t(11;22) dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique, ou un analogue de cette séquence, capable de s'hybrider avec une séquence d'ADN correspondant au gène de fusion avec son promoteur selon l'une des revendications 6 à 9.

30) Utilisation d'une séquence nucléotidique ou d'un analogue de cette séquence, capable de s'hybrider avec une séquence d'ARN correspondant à la séquence d'ADN du gène de fusion selon l'une des revendication 6 à 9, pour préparer un agent thérapeutique inhibant la traduction de protéines chimères résultant de la translocation chromosomique t(11;22) dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées.

31) Agent thérapeutique pour inhiber la traduction de protéines chimères résultant de la translocation chromosomique t(11;22) dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique, ou un analogue de cette séquence, capable de s'hybrider avec une séquence d'ARN correspondant au gène de fusion selon l'une des revendications 6 à 9.