FR2633639A1 - Nouvelles sequences d'acides amines, acides nucleiques codant pour ces sequences d'acides amines et leurs applications, notamment pour le diagnostic, in vitro, de pathologies liees a l'action de facteurs oncogenes - Google Patents
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Abstract
L'invention a pour objet de nouvelles séquences d'acides aminés contenant l'un au moins des enchaînements d'acides aminés suivants : (CF DESSIN DANS BOPI) Ces séquences d'acides aminés peuvent être utilisées pour le diagnostic in vitro de pathologies liées à des facteurs oncogènes.
Description
NOUVELLES SEQUENCES D'ACIDES AMINES, ACIDES NUCLEIQUES
CODANT POUR CES SEQUENCES D'ACIDES AMINES ET LEURS
APPLICATIONS, NOTAMMENT POUR LE DIAGNOSTIC, IN VITRO, DE
PATHOLOGIES LIEES A L'ACTION DE FACTEURS ONCOGENES
L'invention a pour objet de nouvelles séquences d'acides aminés, les acides nucléiques codant pour ces séquences d'acides aminés et leurs applications, notamment pour le diagnostic, in vitro, de pathologies liées à l'action de facteurs oncogènes.
CODANT POUR CES SEQUENCES D'ACIDES AMINES ET LEURS
APPLICATIONS, NOTAMMENT POUR LE DIAGNOSTIC, IN VITRO, DE
PATHOLOGIES LIEES A L'ACTION DE FACTEURS ONCOGENES
L'invention a pour objet de nouvelles séquences d'acides aminés, les acides nucléiques codant pour ces séquences d'acides aminés et leurs applications, notamment pour le diagnostic, in vitro, de pathologies liées à l'action de facteurs oncogènes.
On connait des protooncogènes tels que H-ras,
K-ras et N-ras (De Feo et al., (1981) Proc. Natl. Acad.
K-ras et N-ras (De Feo et al., (1981) Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 78, 3328-3332 ; Ellis et al., (1981), Nature, 292, 506-511 ; Shimizu et al. (1983) Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 80, 383=87) et on a identifié de nouveaux gènes dans une grande variété d'organismes sur la base de leur homologie avec le gène ras des mammifères.
Dans les mammifères, les protéines codées par ces gènes voisins des gènes ras (ral, R-ras, rho et rab) présentent 50 à 30 s d'homologie avec les protéines ras (Chardin et al., (1986) EMBO J., 5, 2203-2208 ; Madaule et al., (1985) Cell, 41, 31-40 ; Touchot et al., (1987)
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 8210-8214).
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 8210-8214).
Les protéines ras et les protéines voisines des protéines ras présentent des poids moléculaires d'environ 21 000 à 24 000 d.
Les protéines ras sont actives lorsqu'elles sont associées au GTP (Guanosine 5'-triphosphate) et sont inactives lorsqu'elles sont associées au GDP (Guanosine 5'-diphosphate) et l'hydrolyse du GTP a lieu par action de leur faible activité intrinsèque GTPase (Papageorge et al., (1982) J. Virol., 44, 509-519
Mcgrath et al., (1984) Nature, 310, 644-649).
Mcgrath et al., (1984) Nature, 310, 644-649).
Les protéines ras transformantes détectées dans les tumeurs humaines présentent très fréquemment une substitution amino acide dans le domaine de liaison au GTP, en position 12, 13 ou 61 (Barbacid (1987) Annual
Review of Biochemistry, 56, 779-827).
Review of Biochemistry, 56, 779-827).
Ce domaine joue un rôle essentiel dans la régulation des propriétés biologiques des protéines ras.
Le site de liaison au GTP consiste en quatre régions non contigues qui appartiennent à toutes les protéines ras.
Parmi ces régions, six amino acides : DTGAQE en position 57 à 62 de la protéine K-ras, semblent etre une caractéristique de la protéine ras et de toutes les protéines ras voisines (Chardin et al., (1986) EMBO J., 5, 2203-2208 ; Touchot et al., (1987) Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 84, 8210-8214). Ces six résidus sont strictement conservés dans les protéines ras, ral et rab.
Dans les protéines H-ras, on a trouvé (Der-et al., (1986) Cell, 44, 167-176) que pratiquement chaque mutation du résidu en position 61 de la protéine ras est corrélé à l'acquisition du potentiel transformant.
Or,- la Demanderesse a trouvé de nouvelles séquences d'acides aminés, parmi lesquelles la position 61 est une threonine, et qui cependant ont des propriétés non transformantes.
L'un des aspects de l'invention est de proposer de nouvelles séquences d'acides aminés, ayant la capacité de fixer le GTP et le GDP ayant une activité
GTPase.
GTPase.
L'un des autres aspects de l'invention est de proposer de nouveaux acides nucléiques codant pour des séquences d'acides aminés présentent des propriétés biologiques intéressantes.
L'un des autres aspects de l'invention est de proposer des moyens de dépistage, in vitro, de certaines pathologies liées à des teneurs en protéines situées en dehors du domaine des valeurs qu'elles ont généralement chez un individu sain.
L'invention a pour objet de nouvelles séquences d'acides aminés caractérisée en ce qu'elle contiennent l'un au moins des enchaînements d'acides aminés suivants
MREYKLVVL (I) ALTVQFVQGIFVEKYDPTIEDSYRKQVEVDCQQCMLEIL (II) QFTAMRDLYMKNGQGFALVYSITAQSTFNDLQDLREQILRVKDTEDVPM (III)
EDERVVGKEQGQNLARQWCNCAFL (1V).
MREYKLVVL (I) ALTVQFVQGIFVEKYDPTIEDSYRKQVEVDCQQCMLEIL (II) QFTAMRDLYMKNGQGFALVYSITAQSTFNDLQDLREQILRVKDTEDVPM (III)
EDERVVGKEQGQNLARQWCNCAFL (1V).
SKINVNEIFYDLVRQINRKTPVEKKKPKKKSCLLL (V)
MREYKLVVL (VI)
ALTVQFVQGIFVEKYDPTIEDSYRKQVEVDAQQCMLEIL (VII)
QFTAMRDLYMKNGQGFALVYSITAQSTFNDLQDLREQILRVKDTDDVPMI(VIII)
EDERVVGKEQGQNLARQWNNCAFL (IX)
SKINVNEIFYDLVRQINRKTPVPGKARKKS5CQLL (X)
MREYKVVVL (XI)
ALTVQFVTGTFIEKYDPTIEDFYRKEIEVDSSPSVLEIL (XII)
QFÁSMRDLYIKNGQGFILVYSLVNQQSFQDIKPMRDQIIRVKRYEKVPVI(XIII)
ESEREVSSSEGRALAEEWGCPFM (XIV) SKTMVDELFAEIVRQMNYAAQPDKDDPCCSACNIQ (XV)
Dans ce qui précède et ce qui suit, les acides aminés sont représentés par une lettre unique, conformément à la nomenclature classiquement utilisée dans ce domaine.
MREYKLVVL (VI)
ALTVQFVQGIFVEKYDPTIEDSYRKQVEVDAQQCMLEIL (VII)
QFTAMRDLYMKNGQGFALVYSITAQSTFNDLQDLREQILRVKDTDDVPMI(VIII)
EDERVVGKEQGQNLARQWNNCAFL (IX)
SKINVNEIFYDLVRQINRKTPVPGKARKKS5CQLL (X)
MREYKVVVL (XI)
ALTVQFVTGTFIEKYDPTIEDFYRKEIEVDSSPSVLEIL (XII)
QFÁSMRDLYIKNGQGFILVYSLVNQQSFQDIKPMRDQIIRVKRYEKVPVI(XIII)
ESEREVSSSEGRALAEEWGCPFM (XIV) SKTMVDELFAEIVRQMNYAAQPDKDDPCCSACNIQ (XV)
Dans ce qui précède et ce qui suit, les acides aminés sont représentés par une lettre unique, conformément à la nomenclature classiquement utilisée dans ce domaine.
Les séquences d'acides aminés sont écrites de telle façon que l'extrémité la plus à gauche correspond à l'extrémité N-terminale du premier amino acide délimitant les susdites séquences et l'extrémité la plus à droite correspond à l'extrémité C-terminale du dernier amino acide délimitant les susdites séquences.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les séquences d'acides aminés de l'invention contiennent au moins l'un des enchaînements (I), (II), (III), (IV) ou (V) définis ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les séquences d'acides aminés de l'invention contiennent au moins l'un des enchaînements (VI), (VII), (VIII), (IX) ou (X) définis ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les séquences d'acides aminés de l'invention contiennent au moins l'un des enchaînements (XI), (XII), (XIII), (XIV) ou (XV) définis ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les séquences d'acides aminés de l'invention comportent une threonine en position 61.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, les séquences d'acides aminés de l'invention sont telles que le quatrième amino acide à partir du dernier amino acide C-terminal est une cystéine.
Selon un autre mode de réalisation selon l'invention, les séquences d'acides aminés contiennent les 5 enchaînements (I), (II), (III), (IV) et (V) définis ci-dessus.
Lorsque les séquences d'acides aminés selon l'invention comportent les 5 enchaînements indiqués ci-dessus, ceux-ci sont avantageusement situés, de gauche à droite, dans l'ordre (I)-(II)-(III8-(IV)-(V), ces enchaînements étant en outre avantageement non contigus.
Selon un autre mode de réalisation selon l'invention, les séquences d'acides aminés contiennent les 5 enchaînements (VI), (VII), (VIII), (IX) et (X) définis ci-dessus.
Lorsque les séquences d'acides aminés selon l'invention comportent les 5 enchaînements indiqués ci-dessus, ceux-ci sont avantageusement situés, de gauche à droite, dans l'ordre (VI)-(VII)-(VIII)-(IX) (X), ces enchaînements étant en outre avantageusement non contigus.
Selon un autre mode de réalisation selon l'invention, les séquences d'acides aminés contiennent les 5 enchaînements (XI), (XII), (XIII), (XIV) et (XV) définis ci-dessus.
Lorsque les séquences d'acides aminés selon l'invention comportent les 5 enchaînements indiqués ci-dessus, ceux-ci sont avantageusement situés1 de gauche à droite, dans l'ordre (XI)-.(XII)-(XIII)-(XIV) (XV), ces enchaînements étant en outre avantageusement non contigus.
Des séquences d'acides aminés selon l'invention particulièrement avantageuses contiennent l'enchainement d'acides aminés XVI, représenté sur la figure 1.
Des séquences d'acides aminés selon l'invention particulièrement avantageuses sont constituées par l'enchaînement d'acides aminés XVI, représenté sur la figure 1.
Des séquences d'acides aminés selon l'invention particulièrement avantageuses contiennent l'enchainement d'acides aminés XVII, représenté sur la figure 2.
Des séquences d'acides aminés selon l'invention particulièrement avantageuses sont constituées par l'enchaînement d'acides aminés XVII, représenté sur la figure 2.
Des séquences d'acides aminés selon l'invention particulièrement avantageuses contiennent l'enchai- nement d'acides aminés XVIII, représenté sur la figure 3.
Des séquences d'acides aminés selon l'invention particulièrement avantageuses sont constituées par l'enchaînement d'acides aminés XVIII, représenté sur la figure 3.
Les séquences d'acides aminés XVI, XVII et
XVIII seront également respectivement désignées par
RAP1A, RAP1B et RAP2 dans la suite du texte.
XVIII seront également respectivement désignées par
RAP1A, RAP1B et RAP2 dans la suite du texte.
Ces séquences d'acides aminés présentent une threonine en position 61 et une cystéine 4 acides aminés à partir du dernier amino acide C-terminal.
A cet égard, pour les séquences d'acides aminés représentées respectivement sur la figure 1, 2 et 3, la position d'un acide aminé déterminé est repérée par rapport au premier acide aminé de la séquence alors que pour les séquences nucléotidiques (figurant également sur les figures 1, 2 et 3) la position d'un nucléotide déterminé est répérée par rapport au premier nucléotide.
Ces séquences d'acides aminés présentent d'intéressantes propriétés biochimiques et biologiques elles sont la capacité de fixer le GTP et le GDP et présentent une activité GTPase.
Elles sont par ailleurs non transformantes, c'est-à-dire notamment ne modifient pas les propriétés morphologiques et cinétiques de la cellule et n'altèrent pas la propriété d'inhibition de contact des cellules.
Ceci étant, leur absence, leur surexpression (c'est-à-dire leur expression en des quantités supérieures à celles généralement contenues chez un individu sain), ainsi que certaines de leurs mutations peuvent correspondre à un état pathologique.
Ces séquences d'acides aminés sont également susceptibles de se lier à la membrane intracellulaire.
Les séquences d'acides aminés précédentes peuvent être modifiées dès lors qu'elles conservent les propriétés biochimiques et biologiques des séquences d'acides aminés (XVI), (XVII) et (XVIII) définies précédemment.
Par exemple, et de façon non limitative, des séquences d'acides aminés entrant dans le cadre de l'invention peuvent se distinguer des séquences d'acides aminés définies ci-dessus
- par addition et/ou
- suppression d'un ou de plusieurs acides aminés et/ou
- modification d'un ou de plusieurs acides aminés, sous réserve que les propriétés biochimiques et biologiques comme indiqué ci-dessus soient conservées.
- par addition et/ou
- suppression d'un ou de plusieurs acides aminés et/ou
- modification d'un ou de plusieurs acides aminés, sous réserve que les propriétés biochimiques et biologiques comme indiqué ci-dessus soient conservées.
Entrent également dans le cadre de l'invention les séquences d'acides aminés (XVI), (XVII) et (XVIII) présentant des mutations en position 12 (c'est-à-dire remplacement de la glutamine en 12 par n'importe quel autre acide aminé).
Entrent également dans le cadre de l'invention les séquences d'acides aminés (XVI), (XVII) et (XVIII) présentant des mutation en position 61 (cest-à-dire remplacement de la threonine en 61 par n importe quel autre acide aminé et notamment par la glutamine et la valine).
L'invention vise également les séquences d'acides aminés contenant l'un au moins des enchaînements d'acides aminés codés par les enchaînements nucléotidiques suivants
ATG CGT GAG TAC AAG CTA GTG GTC CTT (1)
GCT CTG ACA GTT CAG TTT GTT CAG GGA ATT TTT GTT GAA AAA
TAT GAC CCA ACG ATA GAA GAT TCC TAC AGA AAG CAA GTT GAA
GTC GAT TGC CAA CAG TGT ATG CTC GAA ATC CTG (2)
CAA TTT ACA GCA ATG AGG GAT TTG TAT ATG AAG AAC GGC CAA
GGT TTT GCA CTA GTA TAT TCT ATT ACA GCT CAG TCC ACG TTT
AAC GAC TTA CAG GAC CTG AGG GAA CAG ATT TTA CGG GTT AAG
GAC ACG GAA GAT GTT CCA ATG ATT (3)
GAA GAT GAG CGA GTA GTT GGC AAA GAG CAG GGC CAG AAT TTA
GCA AGA CAG TGG TGT AAC TGT GCC TTT TTA (4)
TCA AAG ATC AAT-GTT AAT GAG ATA TTT TAT GAC CTG GTC AGA
CAG ATA AAT AGG AAA ACA CCA GTG GAA AAG AAG AAG CCT AAA
AAG AAA TCA TGT CTG CTG CTC (5)
ATG CGT GAG TAT AAG CTA GTC GTT CTT (6)
GCT TTG ACT GTA CAA TTT GTT CAA GGA ATT TTT GTA GAA AAA
TAC GAT CCT ACG ATA GAA GAT TCT TAT AGA AAG CAA GTT GAA
GTA GAT GCA CAA CAG TGT ATG CTT GAA ATC TTG (7)
CAA TTT ACA GCA ATG AGG GAT TTA TAC ATG AAA AAT GGA CAA
GGA TTT GCA TTA GTT TAT TCC ATC ACA GCA CAG TCC ACA TTT
AAC GAT TTA CAA GAC CTG AGA GAA CAG ATT CTT CGA GTT AAA
GAC ACT GAT GAT GTT CCA ATG ATT (8)
GAA GAT GAA AGA GTT GTA GGG AAG GAA CAA GGT CAA AAT CTA
GCA AGA CAA TGG AAC AAC TGT GCA TTC TTA (9)
TCA AAA ATA-AAT GTT AAT GAG ATC TTT TAT GAC CTA GTG CGG
CAA ATT AAC AGA AAA ACT CCA GTG CCT GGG AAG GCT CGC AAA
AAG TCA TCA TGT CAG CTG CTT (10)
ATG CGC GAG TAC AAA GTG GTG GTG CTG (11)
GCC CTG ACC GTG CAG TTC GTG ACC GGC ACC TTC ATC GAG AAA
TAC GAC CCC ACC ATC GAG GAC TTC TAC CGC AAG GAG ATC GAG
GTG GAT TCG TCG CCG TCG GTG CTG GAG ATC CT (12)
CAG TTC GCG TCC ATG CGG GAC CTG TAC ATC AAG AAC GGC CAG
GGC TTC ATC CTC GTC TAC AGC CTC GTC AAC CAG CAG AGC TTC
CAG GAC ATC AAG CCC ATG CGG GAC CAG ATC ATC CGC GTG AAG
CGG TAT GAG AAA GTG CCA GTC ATC (13)
GAA AGT GAG AGA GAA GTA TCG TCC AGC GAA GGC AGA GCC CTT
GCT GAA GAG TGG GGC TGC CCC TTT ATG (14)
AGT AAA ACA ATG GTG GAC GAA CTC TTT GCA GAA ATT GTG AGG
CAG ATG AAC TAT GCT GCT CAG CCT GAC AAA GAT GAC CCA TGC
TGT TCT GCA TGT AAC ATA CAA (15)
Entrent également dans le cadre de l'invention les acides nucléiques contenant l'un au moins des en chainements de nucléotides codant pour les séquences d'acides aminés définies précédemment.
ATG CGT GAG TAC AAG CTA GTG GTC CTT (1)
GCT CTG ACA GTT CAG TTT GTT CAG GGA ATT TTT GTT GAA AAA
TAT GAC CCA ACG ATA GAA GAT TCC TAC AGA AAG CAA GTT GAA
GTC GAT TGC CAA CAG TGT ATG CTC GAA ATC CTG (2)
CAA TTT ACA GCA ATG AGG GAT TTG TAT ATG AAG AAC GGC CAA
GGT TTT GCA CTA GTA TAT TCT ATT ACA GCT CAG TCC ACG TTT
AAC GAC TTA CAG GAC CTG AGG GAA CAG ATT TTA CGG GTT AAG
GAC ACG GAA GAT GTT CCA ATG ATT (3)
GAA GAT GAG CGA GTA GTT GGC AAA GAG CAG GGC CAG AAT TTA
GCA AGA CAG TGG TGT AAC TGT GCC TTT TTA (4)
TCA AAG ATC AAT-GTT AAT GAG ATA TTT TAT GAC CTG GTC AGA
CAG ATA AAT AGG AAA ACA CCA GTG GAA AAG AAG AAG CCT AAA
AAG AAA TCA TGT CTG CTG CTC (5)
ATG CGT GAG TAT AAG CTA GTC GTT CTT (6)
GCT TTG ACT GTA CAA TTT GTT CAA GGA ATT TTT GTA GAA AAA
TAC GAT CCT ACG ATA GAA GAT TCT TAT AGA AAG CAA GTT GAA
GTA GAT GCA CAA CAG TGT ATG CTT GAA ATC TTG (7)
CAA TTT ACA GCA ATG AGG GAT TTA TAC ATG AAA AAT GGA CAA
GGA TTT GCA TTA GTT TAT TCC ATC ACA GCA CAG TCC ACA TTT
AAC GAT TTA CAA GAC CTG AGA GAA CAG ATT CTT CGA GTT AAA
GAC ACT GAT GAT GTT CCA ATG ATT (8)
GAA GAT GAA AGA GTT GTA GGG AAG GAA CAA GGT CAA AAT CTA
GCA AGA CAA TGG AAC AAC TGT GCA TTC TTA (9)
TCA AAA ATA-AAT GTT AAT GAG ATC TTT TAT GAC CTA GTG CGG
CAA ATT AAC AGA AAA ACT CCA GTG CCT GGG AAG GCT CGC AAA
AAG TCA TCA TGT CAG CTG CTT (10)
ATG CGC GAG TAC AAA GTG GTG GTG CTG (11)
GCC CTG ACC GTG CAG TTC GTG ACC GGC ACC TTC ATC GAG AAA
TAC GAC CCC ACC ATC GAG GAC TTC TAC CGC AAG GAG ATC GAG
GTG GAT TCG TCG CCG TCG GTG CTG GAG ATC CT (12)
CAG TTC GCG TCC ATG CGG GAC CTG TAC ATC AAG AAC GGC CAG
GGC TTC ATC CTC GTC TAC AGC CTC GTC AAC CAG CAG AGC TTC
CAG GAC ATC AAG CCC ATG CGG GAC CAG ATC ATC CGC GTG AAG
CGG TAT GAG AAA GTG CCA GTC ATC (13)
GAA AGT GAG AGA GAA GTA TCG TCC AGC GAA GGC AGA GCC CTT
GCT GAA GAG TGG GGC TGC CCC TTT ATG (14)
AGT AAA ACA ATG GTG GAC GAA CTC TTT GCA GAA ATT GTG AGG
CAG ATG AAC TAT GCT GCT CAG CCT GAC AAA GAT GAC CCA TGC
TGT TCT GCA TGT AAC ATA CAA (15)
Entrent également dans le cadre de l'invention les acides nucléiques contenant l'un au moins des en chainements de nucléotides codant pour les séquences d'acides aminés définies précédemment.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les acides nucléiques appartiennent au génome humain.
Selon un mode de réalisation avantageux, les acides nucléiques de l'invention codent pour les enchai- nements d'acides aminés I à XVIII définis ci-dessus.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux, les séquences d'acides nucléiques de l'invention codent pour les séquences d'acides aminés contenant les enchaînements XVI, XVII et XVIII définis ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, les séquences d'acides nucléiques de l'invention codent pour les enchaînements d'acides aminés XVI, XVII et XVIII définis ci-dessus.
Des acides nucléiques avantageux de l'invention sont ceux contenant l'un au moins des enchaînements de nucléotides suivants
ATG CGT GAG TAC AAG CTA GTG GTC CTT (1)
GCT CTG ACA GTT CAG TTT GTT CAG GGA ATT TTT GTT GAA AAA
TAT GAC CCA ACG ATA GAA GAT TCC TAC AGA AAG CAA GTT GAA
GTC GAT TGC CAA CAG TGT ATG CTC GAA ATC CTG (2)
CAA TTT ACA GCA ATG AGG GAT TTG TAT ATG AAG AAC GGC CAA
GGT TTT GCA CTA GTA TAT TCT ATT ACA GCT CAG TCC ACG TTT
AAC GAC TTA CAG GAC CTG AGG GAA CAG ATT TTA CGG GTT AAG
GAC ACG GAA GAT GTT CCA ATG ATT (3)
GAA GAT GAG CGA GTA GTT GGC AAA GAG CAG GGC CAG AAT TTA
GCA AGA CAG TGG TGT AAC TGT GCC TTT TTA (4)
TCA AAG ATC AAT GTT AAT GAG ATA TTT TAT GAC CTG GTC AGA
CAG ATA AAT AGG AAA ACA CCA GTG GAA AAG AAG AAG CCT AAA
AAG AAA TCA TGT CTG CTG CTC (5)
ATG CGT GAG TAT AAG CTA GTC GTT CTT (6)
GCT TTG ACT GTA CAA TTT GTT CAA OGA ATT TTT GTA GAA AAA
TAC GAT CCT ACG ATA GAA GAT TCT TAT AGA AAG CAA GTT GAA
GTA GAT GCA CAA CAG TGT ATG CTT GAA ATC TTG (7)
CAA TTT ACA GCA ATG AGG GAT TTA TAC ATG AAA AAT GGA CAA
GGA TTT GCA TTA GTT TAT TCC ATC ACA GCA CAG TCC ACA TTT
AAC GAT TTA CAA GAC CTG AGA GAA CAG ATT CTT CGA GTT AAA
GAC ACT GAT GAT GTT CCA ATG ATT (8)
GAA GAT GAA AGA GTT GTA GGG AAG GAA CAA GGT CAA AAT CTA
GCA AGA CAA TGG AAC AAC TGT GCA TTC TTA (9)
TCA AAA ATA AAT GTT AAT GAG ATC TTT TAT GAC CTA GTG CGG
CAA ATT AAC AGA AAA ACT CCA GTG CCT GGG AAG GCT CGC AAA
AAG TCA TCA TGT CAG CTG CTT (10)
ATG CGC GAG TAC AAA GTG GTG GTG CTG (11)
GCC CTG ACC GTG CAG TTC GTG ACC GGC ACC TTC ATC GAG AAA
TAC GAC CCC ACC ATC GAG GAC TTC TAC CGC AAG GAG ATC GAG
GTG GAT TCG TCG CCG TCG GTG CTG GAG ATC CTG (12)
CAG TTC GCG TCC ATG CGG GAC CTG TAC ATC AAG AAC GGC CAG
GGC TTC ATC CTC GTC TAC AGC CTC GTC AAC CAG CAG AGC TTC
CAG GAC ATC AAG CCC ATG CGG GAC CAG ATC ATC CGC GTG AAG
CGG TAT GAG AAA GTG CCA GTC ATC (13)
GAA AGT GAG AGA GAA GTA TCG TCC AGC GAA GGC AGA GCC CTT
GCT GAA GAG TGG GGC TOC CCC TTT ATG (14)
AGT AAA ACA ATG GTG GAC GAA CTC TTT GCA GAA ATT GTG AGG
CAG ATG AAC TAT GCT GCT CAG CCT GAC AAA GAT GAC CCA TGC
TGT TCT GCA TGT AAC ATA CAA (15)
Selon un autre mode de réalisation avantageux, les acides nucléiques de l'invention contiennent les cinq enchaînements de nucléotides (1), (2), (3), (4) et (5), définis ci-dessus.
ATG CGT GAG TAC AAG CTA GTG GTC CTT (1)
GCT CTG ACA GTT CAG TTT GTT CAG GGA ATT TTT GTT GAA AAA
TAT GAC CCA ACG ATA GAA GAT TCC TAC AGA AAG CAA GTT GAA
GTC GAT TGC CAA CAG TGT ATG CTC GAA ATC CTG (2)
CAA TTT ACA GCA ATG AGG GAT TTG TAT ATG AAG AAC GGC CAA
GGT TTT GCA CTA GTA TAT TCT ATT ACA GCT CAG TCC ACG TTT
AAC GAC TTA CAG GAC CTG AGG GAA CAG ATT TTA CGG GTT AAG
GAC ACG GAA GAT GTT CCA ATG ATT (3)
GAA GAT GAG CGA GTA GTT GGC AAA GAG CAG GGC CAG AAT TTA
GCA AGA CAG TGG TGT AAC TGT GCC TTT TTA (4)
TCA AAG ATC AAT GTT AAT GAG ATA TTT TAT GAC CTG GTC AGA
CAG ATA AAT AGG AAA ACA CCA GTG GAA AAG AAG AAG CCT AAA
AAG AAA TCA TGT CTG CTG CTC (5)
ATG CGT GAG TAT AAG CTA GTC GTT CTT (6)
GCT TTG ACT GTA CAA TTT GTT CAA OGA ATT TTT GTA GAA AAA
TAC GAT CCT ACG ATA GAA GAT TCT TAT AGA AAG CAA GTT GAA
GTA GAT GCA CAA CAG TGT ATG CTT GAA ATC TTG (7)
CAA TTT ACA GCA ATG AGG GAT TTA TAC ATG AAA AAT GGA CAA
GGA TTT GCA TTA GTT TAT TCC ATC ACA GCA CAG TCC ACA TTT
AAC GAT TTA CAA GAC CTG AGA GAA CAG ATT CTT CGA GTT AAA
GAC ACT GAT GAT GTT CCA ATG ATT (8)
GAA GAT GAA AGA GTT GTA GGG AAG GAA CAA GGT CAA AAT CTA
GCA AGA CAA TGG AAC AAC TGT GCA TTC TTA (9)
TCA AAA ATA AAT GTT AAT GAG ATC TTT TAT GAC CTA GTG CGG
CAA ATT AAC AGA AAA ACT CCA GTG CCT GGG AAG GCT CGC AAA
AAG TCA TCA TGT CAG CTG CTT (10)
ATG CGC GAG TAC AAA GTG GTG GTG CTG (11)
GCC CTG ACC GTG CAG TTC GTG ACC GGC ACC TTC ATC GAG AAA
TAC GAC CCC ACC ATC GAG GAC TTC TAC CGC AAG GAG ATC GAG
GTG GAT TCG TCG CCG TCG GTG CTG GAG ATC CTG (12)
CAG TTC GCG TCC ATG CGG GAC CTG TAC ATC AAG AAC GGC CAG
GGC TTC ATC CTC GTC TAC AGC CTC GTC AAC CAG CAG AGC TTC
CAG GAC ATC AAG CCC ATG CGG GAC CAG ATC ATC CGC GTG AAG
CGG TAT GAG AAA GTG CCA GTC ATC (13)
GAA AGT GAG AGA GAA GTA TCG TCC AGC GAA GGC AGA GCC CTT
GCT GAA GAG TGG GGC TOC CCC TTT ATG (14)
AGT AAA ACA ATG GTG GAC GAA CTC TTT GCA GAA ATT GTG AGG
CAG ATG AAC TAT GCT GCT CAG CCT GAC AAA GAT GAC CCA TGC
TGT TCT GCA TGT AAC ATA CAA (15)
Selon un autre mode de réalisation avantageux, les acides nucléiques de l'invention contiennent les cinq enchaînements de nucléotides (1), (2), (3), (4) et (5), définis ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, les acides nucléiques de l'invention contiennent les cinq enchaînements de nucléotides (6), (7), (8), (9) et (10), définis ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, les acides nucléiques de l'invention contiennent les cinq enchaînements de nucléotides (11), (12), (13), (14) et (15), définis ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, les acides nucléiques de l'invention contiennent l'enchaînement de nucléotides (16), délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 43 et 594 de la figure 1.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, les acides nucléiques de l'invention sont constitués par l'enchaînement de nucléotides (16), délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 43 et 594 de la figure 1.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, les acides nucléiques de l'invention contiennent l'en chainement de nucléotides (19) délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 1 et 605 de la figure 1.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, les acides nucléiques de l'invention sont constitués par l'enchaînement de nucléotides (19) délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 1 et 605 de la figure 1.
Selon encore un autre mode de réalisation, les acides nucléiques de l'invention contiennent l'enchainement de nucléotides (17), délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 54 et 605 de la figure 2.
Selon encore un autre mode de réalisation, les acides nucléiques de l'invention sont constitués par l'enchaînement de nucléotides (17), délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 54 et 605 de la figure 2.
Selon encore un autre mode de réalisation, les acides nucléiques de l'invention contiennent l'enchaîne- ment de nucléotides (20) délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 1 et 838 de la figure 2.
Selon encore un autre mode de réalisation, les acides nucléiques de l'invention sont constitués par l'enchaînement de nucléotides (20) délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 1 et 838 de la figure 2.
Selon encore un autre mode de réalisation, les acides nucléiques de l'invention contiennent l'enchainement de nucléotides (18), délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 4 et 552 de la figure 3.
Selon encore un autre mode de réalisation, les acides nucléiques de l'invention sont constitués par l'enchaînement de nucléotides (18), délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 4 et 552 de la figure 3.
Selon encore un autre mode de réalisation, les acides nucléiques de l'invention contiennent l'enchainement de nucléotides (21) délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 1 et 558 de la figure 3.
Selon encore un autre mode de réalisation, les acides nucléiques de l'invention sont constitués par l'enchaînement de nucléotides (21)- délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 1 et 558 de la figure 3.
Les acides nucléiques (16), (i7), (18), (19), (20) et (21) de l'invention présentent tous la particularité d'hybrider avec le gène Dras-3 de la drosophile tel que représenté sur la figure 5, dans les conditions faiblement stringentes définies ci-après
hybridation à 60-C dans 5X SSC, 5X Denhardt, 0,1 Ó SDS et 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon,
dernier lavage dans 2X SSC et 0,1 % de SDS, à 60-C pendant environ 15 mn.
hybridation à 60-C dans 5X SSC, 5X Denhardt, 0,1 Ó SDS et 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon,
dernier lavage dans 2X SSC et 0,1 % de SDS, à 60-C pendant environ 15 mn.
Les acides nucléiques (16), (17), (18), (19), (20) et (21) peuvent être modifiés dès lors que les séquences d'acides aminés qu'ils codent conservent leurs propriétés biochimiques et biologiques.
De telles modifications non limitatives conduisent par exemple à des acides nucléiques variants qui se distinguent des acides nucléiques ci-dessus
- par addition et/ou
- suppression d'un ou de plusieurs nucléotides et/ou
- modification d'un ou de plusieurs nucléotides, sous réserve que l'enchaînement ainsi formé soit capable d'hybrider avec la même séquence d'ARN ou d'ADN que l'enchaînement correspondant non modifié, et que les séquences d'acides aminés, codées par ces acides nucléiques, conservent les propriétés biochimiques et biologiques indiquées ci-dessus.
- par addition et/ou
- suppression d'un ou de plusieurs nucléotides et/ou
- modification d'un ou de plusieurs nucléotides, sous réserve que l'enchaînement ainsi formé soit capable d'hybrider avec la même séquence d'ARN ou d'ADN que l'enchaînement correspondant non modifié, et que les séquences d'acides aminés, codées par ces acides nucléiques, conservent les propriétés biochimiques et biologiques indiquées ci-dessus.
Les acides nucléiques (16) et (19) peuvent également être caractérisés par la carte de restriction qui fait l'objet de la figure 7.
Les acides nucléiques (17) et (20) peuvent également être caractérisés par la carte de restriction qui fait l'objet de la figure 8.
Les acides nucléiques (18) et (21) peuvent également être caractérisés par la carte de restriction qui fait l'objet de la figure 9.
Ces cartes de restriction ne sauraient être interprétées comme ayant un caractère limitatif pour identifier les acides nucléiques comportant respectivement l'enchaînement indiqué précédemment.
Des acides nucléiques équivalents pourraient également etre définis par une carte de restriction ayant une communauté avec les cartes de restriction définies précédemment d'au moins 50 Ó des sites de restriction, situés dans le même ordre.
L'invention vise également les sondes utilisées pour caractériser les acides nucléiques décrits précédemment.
Ces sondes sont définies par leur capacité à s'hybrider avec les susdits acides nucléiques ou leurs séquences complémentaires dans les conditions d'hybridation suivantes
- pour les sondes susceptibles de s'hybrider avec les acides nucléiques (2), (3), (4), (5), (7), (8), (9), (10), (12), (13), (14) et (15) ou leurs séquences complémentaires les conditions d'hybridation sont les suivantes hybridation proprement dite : 60 C, 5X 5SC, 5X Denhardt, 0,1 Ó SDS, 100 pg/ml d ADN de sperme de saumon lavage : 60'C, 2X SSC, 0,1 Ó SDS, 30 mn
- pour les sondes susceptibles de s'hybrider avec les acides nucléiques ou les séquences complémentaires (1), (6) et (11) les conditions d'hybridation sont les suivantes hybridation proprement dite : 45-C, 5X SSC, 5X Denhardt, 0,1 % SDS, 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon 1 lavage : température ambiante, 2X.SSC, 0,1 % SDS, 30 mn, 2 lavage : 45 C, 2X SSC, 0,1 Ó SDS, 30 mn.
- pour les sondes susceptibles de s'hybrider avec les acides nucléiques (2), (3), (4), (5), (7), (8), (9), (10), (12), (13), (14) et (15) ou leurs séquences complémentaires les conditions d'hybridation sont les suivantes hybridation proprement dite : 60 C, 5X 5SC, 5X Denhardt, 0,1 Ó SDS, 100 pg/ml d ADN de sperme de saumon lavage : 60'C, 2X SSC, 0,1 Ó SDS, 30 mn
- pour les sondes susceptibles de s'hybrider avec les acides nucléiques ou les séquences complémentaires (1), (6) et (11) les conditions d'hybridation sont les suivantes hybridation proprement dite : 45-C, 5X SSC, 5X Denhardt, 0,1 % SDS, 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon 1 lavage : température ambiante, 2X.SSC, 0,1 % SDS, 30 mn, 2 lavage : 45 C, 2X SSC, 0,1 Ó SDS, 30 mn.
Comme sonde oligonucléotidique pour identifier les séquences d'acides nucléiques de l'invention, on peut par exemple utiliser la sonde constituée par la séquence oligonucléotique suivante
GAA ATC CTG GAT ACT GCA GGG ACA GAG CAA TTT ou la séquence complémentaire correspondante.
GAA ATC CTG GAT ACT GCA GGG ACA GAG CAA TTT ou la séquence complémentaire correspondante.
Pour identifier les acides nucléiques (16) et (19) de l'invention, on peut, par exemple, utiliser comme sonde la séquence d'oligonucléotides délimitée par les nucléotides correspondant aux nucléotides situés aux positions 493 et 605 de la figure 1, ou la séquence complémentaire correspondante.
Pour identifier les acides nucléiques (17) et (20) de l'invention, on peut, par exemple, utiliser comme sonde la séquence d'oligonucléotides délimitée par les nucléotides correspondant aux nucléotides situés aux positions 504 et 838 de la figure 2, ou la séquence complémentaire correspondante.
Pour identifier les acides nucléiques (18) et (21) de l'invention, on peut, par exemple, utiliser comme sonde la séquence d'oligonucléotides délimitée par les nucléotides correspondant aux nucléotides situés aux positions 451 et 558 de la figure 3, ou la séquence complémentaire correspondante.
L'invention se rapporte également à un acide nucléique recombinant caractérisé en ce qu'il contient un acide nucléique tel que décrit plus haut, inséré dans un acide nucléique hétérologue vis-à-vis du susdit fragment.
L'acide nucléique hétérologue ci-dessus peut consister en un acide nucléique ou un fragment d'acide nucléique appartenant à une bactérie ou encore à une cellule eucaryote, ladite bactérie ou ladite cellule eucaryote étant choisie en tant que système d'expression d'un des fragments d'ADN décrit précédemment.
Un autre acide nucléique hétérologue convenable pour la réalisation de l'invention peut également consister en un plasmide ou un phage.
L'invention concerne en outre un vecteur recombinant, en particulier pour le clonage et/ou l'expression d'un acide nucléique selon l'invention, ledit vecteur étant notamment du type plasmide ou phage, caractérisé en ce qu'il contient un acide nucléique recombinant comme défini ci-dessus, contenant le susdit acide nucléique en l'un des sites non essentiels pour sa réplication.
Ce vecteur recombinant peut ainsi être formé par l'ADN hétérologue précédent dans la mesure où celui-ci constitue un système autonome de réplication.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le vecteur recombinant ci-dessus est un vecteur d'expression contenant en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, des éléments nécessaires pour promouvoir l'expression, dans un hôte cellulaire, d'un acide nucléique codant pour une séquence d'acides aminés de l'invention, un promoteur compatible avec ledit hôte cellulaire, en particulier un promoteur inductible, et éventuellement une séquence signal et/ou une séquence d'ancrage.
Le choix du promoteur, de la séquence signal et de la séquence d'ancrage est déterminé en fonction de la nature du système d'expression choisi. Un vecteur recombinant particulier approprié à l'expression des séquences d'acides aminés selon l'invention dans E.
Coli, qui comprend, en un site non essentiel pour sa réplication
- les éléments permettant son insertion dans
E.Coli,
- les éléments permettant l'expression de l'acide nucléique inséré dans le vecteur par E.Coli,
- et éventuellement les éléments permettant l'exportation du produit résultant de l'expression du susdit acide nucléique.
- les éléments permettant son insertion dans
E.Coli,
- les éléments permettant l'expression de l'acide nucléique inséré dans le vecteur par E.Coli,
- et éventuellement les éléments permettant l'exportation du produit résultant de l'expression du susdit acide nucléique.
Un autre vecteur recombinant est caractérisé en ce qu'il contient les éléments permettant d'insérer un acide nucléique, décrit plus haut, dans une levure et l'expression de cet acide nucléique dans cette levure.
D'autres cellules eucaryotes pourront être choisies pour insérer le vecteur recombinant contenant l'acide nucléique de l'invention, ce choix étant orienté par la capacité de ladite cellule eucaryote à organiser l'expression dudit acide nucléique.
L'invention se rapporte encore aux hôtes cellulaires transformés par un vecteur recombinant tels que ceux décrits plus haut, lequel vecteur est capable de se répliquer dans ledit microorganisme.
Un premier hôte cellulaire préféré est constitué par E.coli transformé par un vecteur recombinant tel que décrit précédemment.
Un autre hote cellulaire préféré est une levure transformée par un vecteur recombinant. La levure généralement utilisée est Saccharomyces Cerevisiae.
D'autres hôtes cellulaires peuvent encore être mis en oeuvre.
L'invention vise naturellement le produit d'expression de chacun des microorganismes transformés par l'un des vecteurs recombinants décrits dans les pages précédentes.
L'invention vise également un procédé de préparation des nouveaux peptides sus-mentionnés par synthèse qui comprend soit l'addition étape par étape des résidus peptidiques choisis, avec l'addition ou l'élimination de groupes protecteurs quelconques des fonctions amino et carboxyles, ou addition de résidus peptidiques choisis afin de produire des fragments suivis d'une condensation desdits fragments en une séquence en acides aminés appropriée, avec addition ou élimination des groupes protecteurs choisis.
L'invention vise également un procédé de préparation d'une séquence d'acides aminés conforme à la description ci-dessus, caractérisé en ce que
- on cultive, dans un milieu de culture approprié, un hôte cellulaire préalablement transformé par un vecteur approprié contenant un acide nucléique précédemment défini,
- on récupère à partir du susdit milieu de culture la séquence d'acides aminés produite par ledit microorganisme transformé, après lyse de la membrane cellulaire de ce dernier.
- on cultive, dans un milieu de culture approprié, un hôte cellulaire préalablement transformé par un vecteur approprié contenant un acide nucléique précédemment défini,
- on récupère à partir du susdit milieu de culture la séquence d'acides aminés produite par ledit microorganisme transformé, après lyse de la membrane cellulaire de ce dernier.
Le procédé de préparation d'une séquence d'acides aminés déterminée peut être en particulier caractérisé par la mise en culture de E.coli transformée par un vecteur recombinant décrit plus haut et par l'arrêt de la culture en fin de phase exponentielle de croissance dudit E.coli, et récupération de la séquence d'acides aminés déterminée à partir du milieu de culture exempt des autres protéines et enzymes exocellulaires susceptibles d'être secrétées par E.coli.
Le procédé de préparation d'une séquence d'acides aminés déterminée peut encore être appliqué à une levure transformée par un vecteur recombinant tel que décrit plus haut cette levure étant placée en culture dans un milieu approprié et ladite culture étant arrêtée en fin de phase exponentielle de croissance de la levure utilisée.
L'invention se rapporte également à des anti- corps dirigés contre les séquences d'acides aminés ci-dessus. En particulier, l'invention vise des anticorps monoclonaux.
De tels anticorps monoclonaux peuvent être produits par la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-après.
Dans un premier -temps, on inocule une des séquences d'acides aminés ci-dessus à un animal choisi, dont les lymphocytes B sont alors capables de produire des anticorps contre cette séquence en acides aminés.
ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses "immortelles" pour donner lieu à des hybridomes. A partir du mélange hétérogène de cellules ainsi obtenu, on réalise alors une sélection des cellules capables de produire un anticorps particulier et de se multiplier indéfiniment.
Chaque hybridome est multiplié sous forme de clone, chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis des séquences d'acides aminés de l'invention pourront être testées par exemple sur colonne d'affinité.
L'invention concerne également une méthode de dépistage in vitro des séquences d'acides aminés susmentionnées, à partir d'un prélèvement biologique susceptible de les contenir. Une telle méthode de dépistage selon l'invention, peut être réalisée soit à l'aide des anticorps monoclonaux sus-mentionnés, soit à l'aide des sondes oligunucléotidiques décrites ci-dessus.
Le prélèvement biologique sus-mentionné est effectué soit dans des tissus fluides, tels que le sang r soit dans des organes, ce dernier type de prélèvement pemettant notamment d'obtenir des coupes fines de tissus sur lesquelles les anticorps sus-mentionnés sont ultérieurement fixés.
La méthode de dépistage selon l'invention, procédant par l'intermédiaire des anticorps sus-mentionnés comprend notamment les étapes suivantes - la mise en contact d'au moins un des anticorps reconnaissant spécifiquement une séquence d'acides aminés de l'invention, avec le susdit prélèvement biologique - la détection à l'aide de tout moyen approprié des éventuels complexes immunologiques formés entre les séquences d'acides aminés et les anticorps sus-mentionnes.
Avantageusement, les anticorps utilisés pour la mise en oeuvre d'un tel procédé sont marqués notamment de manière enzymatique ou radio-active.
Une telle méthode selon l'invention peut notamment être réalisée suivant la méthode ELISA (enzyme linked sorbent assay) qui comprend les étapes suivantes - fixation d'une quantité prédéterminée d'anticorps marqués à l'aide d'un marqueur enzymatique sur un support solide, tel qu'un puits d'une microplaque - addition du prélèvement biologique (sous forme liquide) sur ledit support - incubation pendant un temps suffisant pour permettre la réaction immunologique entre lesdits anticorps et les séquences en acides aminés sus-mentionnées - addition d'un substrat spécifique de l'activité enzymatique libérée lors de la réaction immunologique précédente - détection, à l'aide de tout moyen approprié, de la dégradation du substrat par l'enzyme ; et - corrélation de la quantité d'enzymes libérées à la quantité de séquences d'acides aminés présentes.
Selon un autre mode de réalisation de la méthode de dépistage de l'invention, les anticorps sus-mentionnés ne sont pas marqués et la détection des complexes immunologiques formés entre les séquences en acides aminés et lesdits anticorps est réalisée à l'aide d'une immunoglobuline marquée reconnaissant lesdits complexes.
La méthode de dépistage selon l'invention peut également être réalisée par une technique immuno-enzymatique suivant un mécanisme de compétition entre les séquences d'acides aminés susceptibles d'être contenues dans le prélèvement biologique, et des quantités prédéterminées de ces mêmes séquences d'acides aminés, vis-àvis des anticorps sus-mentionnés. Dans ce dernier cas, les séquences d'acides aminés de l'invention en quantité prédéterminée sont avantageusement marquées à l'aide d'un marqueur enzymatique.
L'invention ne se limite nullement aux modes de réalisation décrits ci-dessus pour le dépistage ln vitro des séquences d'acides aminés de l'invention, ce dépistage pouvant etre réalisé à l'aide de toute autre méthode immunologique, notamment immunoenzymatique actuellement connue.
L'invention concerne également une méthode de dépistage in vitro des séquences d'acides aminés de l'invention réalisée à partir d'un prélèvement biologique susceptible de contenir des acides nucléiques codant pour lesdites séquences d'acides aminés, caractérisée en ce qu'elle comprend - la mise en contact d'au moins une des sondes oligonucléotidiques décrites ci-dessus avec le susdit prélèvement biologique - la détection à l'aide de tout moyen approprié des éventuels complexes d'hybridation formés entre les sondes et les acides nucléiques sus-mentionnés.
Le prélèvement biologique sus-mentionné est, préalablement à la mise en oeuvre du dépistage, traité de manière à ce que les cellules qu'il contient soient lysées, et en ce que le matériel génomique contenu dans lesdites cellules soit fragmenté à l'aide d'enzymes de restriction du type EcoRI, BamHI etc.
Avantageusement, les sondes oligonucléotidiques sont marquées à l'aide d'un marqueur enzymatique ou radio-actif. Ces sondes sont placées sur un support approprié, notamment sur un filtre de nitrocellulose ou autre, par exemple nylon, sur lequel est ensuite additionné le prélèvement biologique traité comme il l'a été indiqué ci-dessus.
L'invention a également pour objet une méthode de diagnostic in vitro de maladies corrélées à des teneurs en séquences d'acides aminés de l'invention situées à l'extérieur du domaine délimité par les valeurs extrêmes correspondant généralement à l'état physiologique d'un individu sain, par-mise en oeuvre d'une des méthodes de dépistage in vitro sus-mentionnées.
La présence de faibles quantités, voire l'absence totale, des séquences d'acides aminés de l'invention dans les prélèvements biologiques testés, ou au contraire la surexpression desdites séquences dans les cellules du prélèvement, témoigne d'un déséquilibre probable entre les facteurs anti-oncogéniques et oncogéniques de ces cellules, et ce en faveur de ces derniers, risquant de déclencher une pathologie cancéreuse, notamment par perte d'inhibition de contact entre les cellules du tissu ou de l'organe à partir duquel le prélèvement a été effectué.
L'invention a également pour objet des nécessaires ou kits pour la mise en oeuvre des méthodes de dépistage in vitro sus-mentionnées.
A titre d'exemple, de tels kits comprennent notamment - une quantité déterminée d'au moins un des anticorps monoclonaux sus-mentionnés susceptibles de donner lieu à une réaction immunologique spécifique avec une des séquences d'acides aminés de l'invention ; - avantageusement, un milieu approprié à la formation d'une réaction immunologique entre les séquences d'acides aminés et les anticorps sus-mentionnés, - avantageusement, des réactifs permettant la détection des complexes immunologiques produits lors de la réaction immunologique sus-mentionnée.
Dans le cadre de la mise en oeuvre d'une méthode de dépistage in vitro utilisant des sondes oligonucléotidiques, les kits utilisés comprennent par exemple - une quantité déterminée d'au moins une des sondes oligonucléotidiques sus-mentionnées susceptibles de donner lieu à une réaction d'hybridation avec un des acides nucléiques sus-mentionnés codant pour les séquences d'acides aminés de l'invention, - avantageusement un milieu approprié à la formation d'une réaction d'hybridation entre les acides nucléiques et les sondes sus-mentionnées - avantageusement, des réactifs permettant la détection des complexes d'hybridation produits lors de la réaction d hybridation sus-mentionnée.
Les séquences d'acides aminés selon 1 'inven- tion présentent d'intéressantes propriétés revertantes.
Pour mettre en évidence ces propriétés, on procède de la façon suivante
- on insère une des séquences nucléotidiques RAP lA, RAP lB ou RAP2 normale et mutée dans un vecteur d'expression eucaryote avec un promoteur fort tel que
LTR,
- on effectue des transfections à l'aide du susdit vecteur sur des cellules qui ont été préalablement transformées par le gène RAS,
- on co-transfecte ces cellules avec le gène
RAP1A ou RAP1B ou RAP2 et un gène de résistance à un antibiotique, de préférence la néomycine, comme marqueur de sélection,
- on fait exprimer RAF1A ou RAPlB ou RAP2 dans ces cellules et on peut observer la reversion phenotypique,
- on isole les cellules qui ont un phenotype normal revertant, on les analyse et on constate l'expression du gène RAP1A ou RAP1B ou RAP2 (d'une part en ARN et d'autre part en protéines) directement responsables de la reversion.
- on insère une des séquences nucléotidiques RAP lA, RAP lB ou RAP2 normale et mutée dans un vecteur d'expression eucaryote avec un promoteur fort tel que
LTR,
- on effectue des transfections à l'aide du susdit vecteur sur des cellules qui ont été préalablement transformées par le gène RAS,
- on co-transfecte ces cellules avec le gène
RAP1A ou RAP1B ou RAP2 et un gène de résistance à un antibiotique, de préférence la néomycine, comme marqueur de sélection,
- on fait exprimer RAF1A ou RAPlB ou RAP2 dans ces cellules et on peut observer la reversion phenotypique,
- on isole les cellules qui ont un phenotype normal revertant, on les analyse et on constate l'expression du gène RAP1A ou RAP1B ou RAP2 (d'une part en ARN et d'autre part en protéines) directement responsables de la reversion.
Ceci prouve l'action antioncogène des gènes
RAP1A, RAP1B et RAP2 contre le gène RAS.
RAP1A, RAP1B et RAP2 contre le gène RAS.
Les séquences d'acides aminés de l'invention présentant les propriétés de reversion indiquées ci-dessus peuvent etre utilisées pour le traitement thérapeutique de maladies liées aux gènes RAS oncogènes ou de maladies dans lesquelles le gène RAP est mis en cause, soit par mutation, soit par mauvaise expression dans certaines cellules.
Pour ce faire, on introduit le gène qui code pour l'une des séquences d'acides aminés de l'invention dans un vecteur d'expression, lequel doit être compatible avec les cellules vers lesquelles on veut les diriger et dont les promoteurs doivent être également compatibles avec lesdites cellules.
On cible ensuite le vecteur pour qu'il aille se fixer dans les cellules visées, afin que celles-ci le phagocytent et qu'il soit libéré et exprimé dans lesdites cellules.
EXEMPLE 1 : CLONAGE ET SEOUENCAGE DES ACIDES NUCLEIOUES
RAP1A ET RAP2 1) Isolement des clones humains d'ADNc homologues au gène Dras-3 de la drosophile
On utilise une banque d'ADNc construite dans agit10 à partir d'ARNm de cellules de lymphocytes B humains (lignée Raji) et criblée sous des conditions d'hybridation faiblement stringentes (définies ci-après dans le paragraphe intitulé "Matériels et méthodes") avec l'insert complet d'ADN Dras-3 de la drosophile.
RAP1A ET RAP2 1) Isolement des clones humains d'ADNc homologues au gène Dras-3 de la drosophile
On utilise une banque d'ADNc construite dans agit10 à partir d'ARNm de cellules de lymphocytes B humains (lignée Raji) et criblée sous des conditions d'hybridation faiblement stringentes (définies ci-après dans le paragraphe intitulé "Matériels et méthodes") avec l'insert complet d'ADN Dras-3 de la drosophile.
On isole 15 phages à partir de 100 000 phages recombinants. Les inserts EcoRI sont purifiés, soumis à des réactions d'hybridation croisée les uns vis-à-vis des autres sous des conditions fortement stringentes (définies ci-après dans la paragraphe intitulé "Matériels et méthodes") et sont partiellement séquencés. On peut ainsi identifier deux catégories de clones, 14 dérivant d'un même gène et un quinzième dérivant d'un autre gène voisin
On désigne par RAP1A le clone de la première famille et par RAP2 l'unique clone de la seconde famille.
On désigne par RAP1A le clone de la première famille et par RAP2 l'unique clone de la seconde famille.
De l'ADN génomique humain originaire de placenta a été hydrolysé par les enzymes de restriction suivantes BamHI, EcorI et HindIII, et les colonnes
A,B,C,D,E et F correspondent respectivement à : colonne A : BamHI colonne B : BamHI + EcoRI colonne C : BamHI + HindIII colonne D : HindîlI colonne E : HondîlI + EcoRI colonne F : EcoRI puis hybridé avec les inserts EcoRI respectivement de l'ADNc des clones RAP1A et RAP2.
A,B,C,D,E et F correspondent respectivement à : colonne A : BamHI colonne B : BamHI + EcoRI colonne C : BamHI + HindIII colonne D : HindîlI colonne E : HondîlI + EcoRI colonne F : EcoRI puis hybridé avec les inserts EcoRI respectivement de l'ADNc des clones RAP1A et RAP2.
La figure 4 montre le profil d'hybridation des gènes cellulaires RAPINA (1) et RAP2 (2).
La taille des fragments déterminés par le marqueur A d'HindIII est porté à gauche en kilo paires de base.
2) Séquence nucléotidique des ADNc de RAP1A et RAP2
On détermine la séquence nucléotidique des inserts de 1 450 paires de base et 980 paires de base des ADNc respectivement de RAP1A et RAP2.
On détermine la séquence nucléotidique des inserts de 1 450 paires de base et 980 paires de base des ADNc respectivement de RAP1A et RAP2.
Les séquences d'amino acides codées par ces clones sont respectivement repésentées sur les figures 1 et 3.
Sur les figures 1 et 3, on a également représenté les séquences d'acides nucléiques codant respectivement pour RAP1A et RAP2.
Les protéines RAP1A et RAP2 consistent respectivement en des séquences peptidiques de 184 et 183 amino acides, y compris la methionine initiale, et ont un poids moléculaire respectif de 20 900 et 20 700d.
3) Homologies entre les protéines RAP1A et RAP2 et les proteines Dras-3, K-ras, ral et R-ras
Les homologies entre d'une part la protéine
RAP1 et, d'autre part, la protéine Dras-3 de la drosophile et les protéines K-ras, ral et R-ras sont respectivement de 66,5 t., 53 %, 44 % et 41 %.
Les homologies entre d'une part la protéine
RAP1 et, d'autre part, la protéine Dras-3 de la drosophile et les protéines K-ras, ral et R-ras sont respectivement de 66,5 t., 53 %, 44 % et 41 %.
En ce qui concerne la région la plus conservée des protéines ras, de l'amino acide 1 à 84, les pourcentages sont de 78,5 % pour la protéine Dras-3 de la drosophile, 59,5 % pour K-ras, 56 % pour ral et 63 % pour R-ras.
Une comparaison globale cellulaire pour la protéine rap2 conduit à une homologie de 48 % avec
Dras-3 de la drosophile, 46 % avec K-ras, 38 % avec ral et 37 S avec R-ras.
Dras-3 de la drosophile, 46 % avec K-ras, 38 % avec ral et 37 S avec R-ras.
Lorsqu'on ne considère que les 84 premiers amino acides ces pourcentages sont de 63 pour Dras-3, 52
K-ras et ral, 56 % pour R-ras.
K-ras et ral, 56 % pour R-ras.
On a représenté sur la figure 5 les alignements des protéines RAPINA et RAP2 avec la protéine humaine K-ras (exon 4B) et la protéine Dras-3 de la drosophile. La numérotation de référence est celle de la protéine K-ras.
Sur cette figure 5 les régions de fixation du
GTP sont encadrées. La région de l'effecteur est soulignée par 1 trait continu et la région- d'attachement à la membrane intracellulaire est soulignée en pointillés.
GTP sont encadrées. La région de l'effecteur est soulignée par 1 trait continu et la région- d'attachement à la membrane intracellulaire est soulignée en pointillés.
Quatre domaines impliqués dans le site de liaison aux nucléotides à guanine des protéines ras (Barbacid, M. (1987) Annual Review of Biochemistry, 56, 779-827) et correspondant aux séquences d'amino acides 10 à 17, 57 à 63, 113 à t20 et 143 à 147 sont hautement conservés parmi les protéines rap, K-ras et Dras-3.
Les protéines RAP lA et RAP2 comme la protéine
Dras-3 ont une threonine en position 61 à la place d'une glutamine présente dans toutes les protéines ras et les protéines voisines des protéines ras, non oncogènes, connues à ce jour.
Dras-3 ont une threonine en position 61 à la place d'une glutamine présente dans toutes les protéines ras et les protéines voisines des protéines ras, non oncogènes, connues à ce jour.
Le domaine des résidus 32 à 42, pour les protéines ras - qui correspond au domaine impliqué dans l'interaction avec un effecteur - est identique dans la protéine RAPINA et ras, et diffère d'un amino acide dans la protéine RAP2 par rapport à la protéine ras.
La région C-Terminale des protéines ras est caractérisée par la séquence Cys -A-A-X, dans laquelle A est un amino acide aliphatique et X l'amino acide
C-Terminal (Powers et al., (1984) Cell, 36, 607-612).
C-Terminal (Powers et al., (1984) Cell, 36, 607-612).
Cette séquence est nécessaire pour la liaison lipidique posttraductionnelle et l'ancrage dans la membrane du plasma (Fujiyama et al. (1986) Proc. Natl. Acad. SQci.
USA, 83, 1266-1270).
5) Transcription des gènes RAP1A et RAP2
La transcription des gènes RAPINA et RAP2 est effectuée par transfert d'ARN sur membrane après électrophorèse sur gel selon la technique désignée par "Northern Blot". Les conditions utilisées pour le "Northern Blot" sont rappelées ci-après dans le paragraphe intitulé "Matériels et méthodes".
La transcription des gènes RAPINA et RAP2 est effectuée par transfert d'ARN sur membrane après électrophorèse sur gel selon la technique désignée par "Northern Blot". Les conditions utilisées pour le "Northern Blot" sont rappelées ci-après dans le paragraphe intitulé "Matériels et méthodes".
Avec une sonde provenant de RAP1, on met en évidence trois séquences d'ARN (c'est-à-dire trois transcripts) respectivement de 1 600, 2 700 et 5 400 nucléotides.
Avec une sonde provenant de RAP2, on met en évidence trois séquences d'ARN, respectivement de 2 200, 2 500 et 4 600 nucléotides.
La sonde provenant de RAPINA est un polynucléotide délimité par le fragment PstI-BglII de la séquence (19.) et dont la première extrémité, correspondant à la restriction par PstI, est représentée sur la figure 7, et la deuxième extrémité correspondant à la restriction par BglII, se trouve 520 paires de base à droite de la première extrémité.
La sonde provenant de RAP2 est un polynucléotide délimité par le fragment HindII-PstI de la séquence 21 et dont la première extrémité correspondant à la restriction par HindII est représentée sur la figure 9 et la deuxième extrémité, correspondant à la restriction par PstI, est située 340 paires de base à droite de la première extrémité.
On a représenté sur la figure 6, l'étude des transcripts de RAP1A (colonne 1) et de RAP2 (colonne 2) après électrophorèse et transfert d'ARNm polyA+ extrait de lymphocytes humains. La taille des différents ARN est mentionnée sur la gauche en kilobase.
6) Matériels et méthodes : clonage et séquençage des
ADNc de RAP1A et RAP2
Pour identifier les ADNc de RAP, on a criblé une banque humaine #gt10 avec un insert d'EcoRI de 700 paires de base du clone d'ADNc Dras-3 de la drosophile (Schetjer et al., (1985) EMBO J., 4, 407-412). On a effectué l'hybridation dans des conditions faiblement stringentes : à savoir hybridation à 60*C dans 5 x SSC, 5 x Denhardt, 0,1 % SDS, 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon. Le dernier lavage est effectué dans 2 x SSC et 0,1 % SDS à 60 C pendant environ 15 mn.
ADNc de RAP1A et RAP2
Pour identifier les ADNc de RAP, on a criblé une banque humaine #gt10 avec un insert d'EcoRI de 700 paires de base du clone d'ADNc Dras-3 de la drosophile (Schetjer et al., (1985) EMBO J., 4, 407-412). On a effectué l'hybridation dans des conditions faiblement stringentes : à savoir hybridation à 60*C dans 5 x SSC, 5 x Denhardt, 0,1 % SDS, 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon. Le dernier lavage est effectué dans 2 x SSC et 0,1 % SDS à 60 C pendant environ 15 mn.
Les conditions fortement stringentes utilisées pour l'hybridation croisée des inserts EcoRI sont les suivantes
on effectue l'hybridation dans les conditions suivantes : 5 x SSC, 5 x Denhardt, 0,1 % SDS et 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon à 65 C.
on effectue l'hybridation dans les conditions suivantes : 5 x SSC, 5 x Denhardt, 0,1 % SDS et 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon à 65 C.
Le lavage est effectué de 0,1 b SSC et 0,1 t.
SDS à 65 C pendant 30 mn.
La séquence nucléotidique de l'insert complet d'EcoRI des clones RAP1A et RAP2 est déterminée en utilisant les vecteurs M13 par la méthode de terminaison de chaîne dideoxy (Messing, J. (1983) Methods Enzymol., 101, 20-78).
7) Analyse Northern et Southern Blot
La technique désignée par "Southern Blot" est effectuée comme décrit dans l'article de Southern, E.
La technique désignée par "Southern Blot" est effectuée comme décrit dans l'article de Southern, E.
(1975) J. Mol. Biol., 98, 503. 10 g d'ADN placentaire humain digéré avec des endonucléases de restriction sont soumis & une électrophorèse sur un gel d'agarose à 0,8 a, transférés sur filtre de nitrocellulose et hybridés avec l'insert de EcoRI de chacun des clones RAP1A et
RAP2.
RAP2.
On effectue l'hybridation dans les conditions suivantes : 5 x SSC, 5 x Denhardt, 0,1 % SDS et 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon à 65"C.
Le lavage est effectué & l'aide de 0,1 t. SSC et 0,1 % SDS à 65 C pendant 30 mn.
En ce qui concerne la technique désignée par "Northern Blot" pour déterminer les séquences d'ARN, on prépare des ARN cytoplasmiques à partir de lymphocytes périphériques du sang (Perry et al., (1972) BBA, 262, 220-226).
On fractionne 5 pg d'ADN-polyA+ sur des gels de formaldéhyde et d'agarose à 1 %, avant le transfert sur des membranes de nylon (commercialisées sous le nom de Pall), et on hybride les filtres avec les sondes provenant de RAP1 et de RAP2, définies précédemment.
Toutes les sondes sont marquées avec 32P par la technique d'initiation au hasard (Amersham) pour obtenir une activité d'environ 3 x 108 CPM/g. On effectue les hybridations dans de la formamide à 50 % à 42"C selon la méthode décrite dans l'article de
Maniatis et al., (1982) Molecular cloning, Cold Spring
Harbor Laboratory.
Maniatis et al., (1982) Molecular cloning, Cold Spring
Harbor Laboratory.
EXEMPLE 2 : CLONAGE ET SEOUENCAGE DE RAP1B
On utilise l'insert du cDNA de RAP1A pour cribler une banque de cDNA humaine préparée dans #gt10.
On utilise l'insert du cDNA de RAP1A pour cribler une banque de cDNA humaine préparée dans #gt10.
L'insert RAP1A est marqué au 32P et permet d'identifier un phage dont l'insert (de 2100 pb), après sous-clonage, est séquencé.
La séquence d'acides nucléiques et la séquence d'acides aminés codée par cet acide nucléique sont représentées sur la figure 2.
La recherche d'homologie d'une part entre cette séquence d'acides aminés et les protéines RAP1A et
RAP2, montre que cette séquence d'acides aminés a une homologie de 95 z par rapport à RAP1A-et 61 % par rapport à RAP2.
RAP2, montre que cette séquence d'acides aminés a une homologie de 95 z par rapport à RAP1A-et 61 % par rapport à RAP2.
Cette séquence d'acides aminés sera par la suite désignée par RAP1B. Elle présente un poids moléculaire de 20 800 d.
EXEMPLE 3 : PRODUCTION DE LA PROTEINE RAP1A DANS UN
VECTEUR D'EXPRESSION BACTERIEN
a) On sous-clone- l'ADNc de RAPINA en vue de son amplification, dans le vecteur PUC8, au site EcoRI.
VECTEUR D'EXPRESSION BACTERIEN
a) On sous-clone- l'ADNc de RAPINA en vue de son amplification, dans le vecteur PUC8, au site EcoRI.
Après culture, on extrait l'ADNc et on le soumet à l'enzyme de restriction Bgl2, puis à EcoRI, et on récupère ainsi un fragment d'ADN qui correspond à la région complète codant pour la protéine RAP1A.
Le fragment EcoRI/Bgl2 est cloné dans le phage
M13 MP11 aux sites BamHI et EcoRI, ce qui permet, après culture du phage, de récupérer l'ADN simple brin.
M13 MP11 aux sites BamHI et EcoRI, ce qui permet, après culture du phage, de récupérer l'ADN simple brin.
On effectue une mutagénèse dirigée en utilisant un oligonucléotide de synthèse de séquence suivante
CAGATCACATATGCGTGAGTAC et on introduit ainsi un site NDE1 en amont de l'ATG correspondant à l'initiation de la protéine RAP1A.
CAGATCACATATGCGTGAGTAC et on introduit ainsi un site NDE1 en amont de l'ATG correspondant à l'initiation de la protéine RAP1A.
On prépare ensuite des recombinants de M13MP11. Pour ce faire, on coupe par l'enzyme de restriction NDE1 l'ADN double brin de Ml3MPîl et on répare le site NDE1 à l'aide de l'enzyme de Klenow.
On coupe ensuite par l'enzyme de restriction
HindIII. Le fragment ainsi obtenu est alors lié au vecteur M13MP11 coupé par EcoRI-HindIII, le site EcoRI du susdit vecteur ayant été réparé par l'enzyme de
Klenow avant libation.
HindIII. Le fragment ainsi obtenu est alors lié au vecteur M13MP11 coupé par EcoRI-HindIII, le site EcoRI du susdit vecteur ayant été réparé par l'enzyme de
Klenow avant libation.
On effectue une mutagénèse dirigée en utilisant l'oligonucléotide de synthèse de séquence suivante CCAGTGAATTCTATOCOTGAG
Cet oligonucléotide permet d'insérer un C au site de ligation de M13MP11 et de RAP1A et reconstituer ainsi un site EcoRI. On obtient ainsi le phage Ml3MPlî contenant la séquence RAPIA. L'insert RAP1A pourra être isolé en coupant le phage aux sites EcoRI et HindIII.
Cet oligonucléotide permet d'insérer un C au site de ligation de M13MP11 et de RAP1A et reconstituer ainsi un site EcoRI. On obtient ainsi le phage Ml3MPlî contenant la séquence RAPIA. L'insert RAP1A pourra être isolé en coupant le phage aux sites EcoRI et HindIII.
b) On prépare ensuite de l'ADN double brin de
M13MP11. On coupe par EcoRI et HindIII pour préparer l'insert RAP1A en vue du clonage dans un vecteur d'expression bactérien.
M13MP11. On coupe par EcoRI et HindIII pour préparer l'insert RAP1A en vue du clonage dans un vecteur d'expression bactérien.
On utilise par exemple comme vecteur d'expression celui qui est décrit dans l'article Tucker et al., EMBO J., vol. 5, 6, p. 1351-1358 (1986). Plus précisément, le vecteur utilisé est le vecteur ptac-cHras.
Le vecteur ptac-Hcras peut etre obtenu à partir du vecteur pKM-tacI selon la construction décrite dans le susdit article de Tucker. Quant au vecteur pKM-tacI, il peut être obtenu selon la construction décrite dans l'article de Hermann A. De Boer et al. r
PNAS, vol. 80, p 21-25, janvier 1983.
PNAS, vol. 80, p 21-25, janvier 1983.
Le vecteur ptac-Hcras est soumis à l'enzyme de restriction HindIII, puis à EcoRI, de façon partielle afin de garder un fragment d'environ 300 paires de base
EcoRI-EcoRI qui contient le promoteur tac inductible.
EcoRI-EcoRI qui contient le promoteur tac inductible.
On On insert dans le vecteur ainsi préparé, le fragment EcoRI-HindIII de RAP1A et on effectue une ligation. A l'aide du vecteur obtenu, on transforme ensuite la souche de E. coli connu sous la désignation de PRI#M15.
c) On procède ensuite à l'expression de la protéine RAP1A de la façon suivante.
A partir d'une culture qui dure environ 12 heures, on fait un ensemencement avec 1/100e du milieu de culture et on laisse pousser environ 3 heures en induisant ultérieurement environ 12 heures avec de l'IPTO, à une concentration de 50 pM.
On récupère ensuite la protéine RAPIA exprimée par la souche de E. coli selon des techniques classiques. Cette protéine se présente sous forme soluble.
EXEMPLE 4 : PRODUCTION DE LA PROTEINE RAP1A MUTEE EN
POSITION 61 DANS UN VECTEUR D'EXPRESSION
On procède comme indiqué au paragraphe a) de l'exemple 3 c'est-à-dire jusqu'à l'obtention d'un phage M13MP11 contenant la séquence RAP1A clonées aux sites
EcoRI et HindIII.
POSITION 61 DANS UN VECTEUR D'EXPRESSION
On procède comme indiqué au paragraphe a) de l'exemple 3 c'est-à-dire jusqu'à l'obtention d'un phage M13MP11 contenant la séquence RAP1A clonées aux sites
EcoRI et HindIII.
L'ADN simple brin du phage M13MP11 est préparé par mutagénèse dirigée en utilisant les oligonucléotides de synthèse suivants
GAT-ACT-GCA-GGG-CAA-GAG (A) (pour transformer la threonine "61" en glutamine)
GAT-ACT-GCA-GGG-GTA-GAG (B) (pour transformer la threonine "61" en valine)
On introduit ainsi en position 61, une glutamine à la place de la threonine dans le cadre de l'oligonucléotide (A) et une valine à la place de la threonine dans le cadre de l'oligonucléotide (B).
GAT-ACT-GCA-GGG-CAA-GAG (A) (pour transformer la threonine "61" en glutamine)
GAT-ACT-GCA-GGG-GTA-GAG (B) (pour transformer la threonine "61" en valine)
On introduit ainsi en position 61, une glutamine à la place de la threonine dans le cadre de l'oligonucléotide (A) et une valine à la place de la threonine dans le cadre de l'oligonucléotide (B).
Les ADN double brin respectifs de chacune des deux séquences RAP1A modifiées comme indiqué ci-dessus sont alors préparés, puis coupés par les enzymes EcoRI et HindIII, puis cloné dans le vecteur d'expression comme indiqué au paragraphe b) de l'exemple 3.
L'obtention des deux protéines modifiées est effectuée suivant le paragraphe c) de l'exemple 3.
Claims (30)
1. Séquence d'acides aminés caractérisée en ce qu'elle contient-l'un au moins des enchainements d'acides aminés suivants
MREYKLVVL (I) ALTVQFVQGIFVEKYDPTIEDSYRKQVEVDCQQCMLEIL (II) QFTAMRDLYMKNGQGFALVYSITAQSTFNDLQDLREQILRVKDTEDVPM (III)
EDERVVGKEQGQNLARQWCNCAFL (IV)
SKINVNEIFYDLVRQINRKTPVEKKKPKKKSCLLL (V) MREYKLVVL (VI)
ALTVQFVQGIFVEKYDPTIEDSYRKQVEVDAQQCMLEIL (VII)
QFTAMRDLYMKNGQGFALVYSITAQSTFNDLQDLREQILRVKDTDDVPMI(VIII) EDERVVOKEQOQNLARQWNNCAFL (IX)
SKINVNEIFYDLVRQINRKTPVPGKARKKSSCQLL (X)
MREYKVVVL (XI)
ALTVQFVTGTFIEKYDPTIEDFYRKEIEVDSSPSVLEIL (XII)
QFASMRDLYIKNGQGFILVYSLVNQQSFQDIKPMRDQIIRVKRYEKVPVI(XIII) ESEREVSSSEGRALAEEWGCPFM (XIV) SKTMVDELFAE IVRQMNYAAQPDKDDPCCSACNI Q (XV)
2. Séquence d'acides aminés selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient les cinq enchaînements d'acides aminés I, II, III, IV, et V, définis à la revendication 1.
3. Séquence d'acides aminés selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient les cinq enchaînements d'acides aminés VI, VII, VIII, IX, et X, définis à la revendication 1.
4. Séquence d'acides aminés selon la revendication 1r caractérisée en ce qu'elle contient les cinq enchaînements d'acides aminés XI, XII, XIII, XIV, et XV, définis à la revendication 1.
5. Séquence d'acides aminés, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient l'enchaînement d'acides aminés XVI, représenté sur la figure 1 ou est constituée par cet enchaînement d'acides aminés.
6. Séquence d'acides aminés, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient l'enchainement d'acides aminés XVI représenté sur la figure 2, ou est constituée par cet enchaînement d'acides aminés.
7. Séquence d'acides aminés, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient l'enchaî- nement d'acides aminés XVIII représenté sur la figure 3, ou est constituée par cet enchaînement d'acides aminés.
8. Séquence d'acides aminés caractérisée en ce qu'elle contient l'un au moins des enchaînements d'acides aminés codés par les enchaînements nucléotidiques suivants
ATG CGT GAG TAC AAG CTA GTG GTC CTT (1)
GCT CTG ACA GTT CAG TTT GTT CAG GGA ATT TTT GTT GAA AAA
TAT GAC CCA ACG ATA GAA GAT TCC TAC AGA AAG CAA GTT GAA
GTC GAT TGC CAA CAG TGT ATG CTC GAA ATC CTG (2)
CAA TTT ACA GCA ATG AGG GAT TTG TAT ATG AAG AAC OGC CAA
GGT TTT GCA CTA GTA TAT TCT ATT ACA GCT CAG TCC ACG TTT
AAC GAC TTA CAG GAC CTG AGG GAA CAG-ATT TTA CGG GTT AAG
GAC ACG GAA GAT GTT CCA ATG ATT (3) OAA GAT GAG CGA GTA GTT GGC AAA GAG CAG GGC CAG AAT TTA
GCA AGA CAG TGG TGT AAC TGT GCC TTT TTA (4)
TCA AAG ATC AAT GTT AAT GAG ATA TTT TAT GAC CTG GTC AGA
CAG ATA AAT AGG AAA ACA CCA GTG GAA AAG AAG AAG CCT AAA
AAG AAA TCA TGT CTG CTG CTC (5)
ATG CGT GAG TAT AAG CTA GTC GTT CTT (6)
GCT TTG ACT GTA CAA TTT GTT CAA GGA ATT TTT GTA GAA AAA
TAC GAT CCT ACG ATA GAA GAT TCT TAT AGA AAG CAA GTT GAA
GTA GAT GCA CAA CAG TGT ATG CTT GAA ATC TTG (7)
CAA TTT ACA GCA ATG AGG GAT TTA TAC ATG AAA AAT GGA CAA
GGA TTT GCA TTA GTT TAT TCC ATC ACA GCA CAG TCC ACA TTT
AAC GAT TTA CAA GAC CTG AGA GAA CAG ATT CTT CGA GTT AAA
GAC ACT GAT GAT GTT CCA ATG ATT (8)
GAA GAT GAA AGA GTT GTA GGG AAG GAA CAA GGT CAA AAT CTA
GCA AGA CAA TGG AAC AAC TGT GCA TTC TTA (9)
TCA AAA ATA AAT GTT AAT GAG ATC TTT TAT GAC CTA GTG CGG
CAA ATT AAC AGA AAA ACT CCA GTG CCT GGG AAG GCT CGC AAA
AAG TCA TCA TGT CAG CTG CTT (10)
ATG CGC GAG TAC AAA GTG GTG GTG CTG (11)
GCC CTG ACC GTG CAG TTC GTG ACC GGC ACC TTC ATC GAG AAA
TAC GAC CCC ACC ATC GAG GAC TTC TAC CGC AAG GAG ATC GAG
GTG GAT TCG TCG CCG TCG GTG CTG GAG ATC CTG (12)
CAG TTC GCG TCC ATG CGG GAC CTG TAC ATC AAG AAC GGC CAG
GGC TTC ATC CTC GTC TAC AGC CTC GTC AAC CAG CAG AGC TTC
CAG GAC ATC AAG CCC ATG CGG GAC CAG ATC ATC CGC GTG AAG
CGG TAT GAG AAA GTG CCA GTC ATC (13)
GAA AGT GAG AGA GAA GTA TCG TCC AGC GAA GGC AGA GCC CTT
GCT GAA GAG TGG GGC TGC CCC TTT ATG (14)
AGT AAA ACA ATG GTG GAC GAA CTC TTT GCA GAA ATT GTG AGG
CAG ATG AAC TAT GCT GCT CAG CCT GAC AAA GAT GAC CCA TGC
TGT TCT GCA TGT AAC ATA CAA (15)
9. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il contient l'un au moins des enchaînements de nucléotides codant pour les séquences d'acides aminés selon les revendications 1 à 7.
50. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il contient l'un au moins des enchaînements de nucléotides suivants
ATG CGT GAG TAC AAG CTA GTG GTC CTT (1)
GCT CTG ACA GTT CAG TTT GTT CAG GGA ATT TTT GTT GAA AAA
TAT GAC CCA ACG ATA GAA GAT TCC TAC AGA AAG CAA GTT GAA
GTC GAT TGC CAA CAG TGT ATG CTC GAA ATC CTG (2)
CAA TTT ACA GCA ATG AGG GAT TTG TAT ATG AAG AAC GGC CAA
GGT TTT CTA GTA TAT TCT ATT ACA GCT CAG TCC ACT TTT
AAC GAC TTA CAG GAC CTG AGG GAA CAG ATT TTA CGG GTT AAG
GAC ACG GAA GAT GTT CCA ATG ATT / (3)
GAA GAT GAG CGA GTA GTT GGC AAA GAG CAG GGC CAG AAT TTA
GCA AGA CAG TGG TGT AAC TGT GCC TTT TTA (4)
TCA AAG ATC AAT GTT AAT GAG ATA TTT TAT GAC CTG GTC AGA
CAG ATA AAT AGG AAA ACA CCA GTG GAA AAG AAG AAG CCT AAA
AAG AAA TCA TGT CTG CTG CTC (5)
ATG CGT GAG TAT AAG CTA GTC GTT CTT (6)
GCT TTG ACT GTA CAA TTT GTT CAA GGA ATT TTT GTA GAA AAA
TAC GAT CCT ACG ATA GAA GAT TCT TAT AGA AAG CAA GTT GAA
GTA GAT GCA CAA CAG TGT ATG CTT GAA ATC TTG (7)
CAA TTT ACA GCA ATG AGG GAT TTA TAC ATG AAA AAT GGA CAA
GGA TTT GCA TTA GTT TAT TCC ATC ACA GCA CAG TCC ACA TTT
AAC GAT TTA CAA GAC CTG AGA GAA CAG ATT CTT CGA GTT AAA
GAC ACT GAT GAT GTT CCA ATG ATT (8)
GAA GAT GAA AGA GTT GTA GGG AAG GAA CAA GGT CAA AAT CTA
GCA AGA CAA TGG AAC AAC TGT OCA TTC TTA (9)
TCA AAA ATA AAT GTT AAT GAG ATC TTT TAT GAC CTA GTG CGG
CAA ATT AAC AGA AAA ACT CCA GTG CCT GGG AAG GCT CGC AAA
AAG TCA TCA TGT CAG CTG CTT (10)
ATG CGC GAG TAC AAA GTG GTG GTG CTG (11)
GCC CTG ACC GTG CAS TTC GTG ACC GGC ACC TTC ATC GAG AAA
TAC GAC CCC ACC ATC GAG GAC TTC TAC CGC AAG GAG ATC GAG
GTG GAT TCG TCG CCG TCG GTG CTG GAG ATC CTG (12)
CAG TTC GCG TCC ATG CGG GAC CTG TAC ATC AAG AAC GGC CAG
GGC TTC ATC CTC GTC TAC AGC CTC GTC AAC CAG CAG AGC TTC
CAG GAC ATC AAG CCC ATG CGG GAC CAG ATC ATC CGC GTG AAG
CGG TAT GAG AAA GTG CCA GTC ATC (13)
GAA AGT GAG AGA GAA GTA TCG TCC AGC GAA GGC AGA GCC CTT
GCT GAA GAG TGG GGC TGC CCC TTT ATG (14)
AGT AAA ACA ATG GTG GAC GAA CTC TTT GCA GAA ATT GTG AGG
CAG ATG AAC TAT GCT GCT CAG CCT GAC AAA GAT GAC CCA TGC
TGT TCT GCA TGT AAC ATA CAA (15)
11. Acide nucléique selon la revendications 10, caractérisé en ce qu'il contient les cinq enchaînements de nucléotides (1), (2), (3), (4) et (5), définis à la revendication 10.
12. Acide nucléique selon la revendications 10, caractérisé en ce qu'il contient les cinq enchainements de nucléotides (6), (7), (8)-, (9) et (10), définis à la revendication 10.
13. Acide nucléique selon la revendications 10, caractérisé en ce qu'il contient les cinq enchaînements de nucléotides (11), (12), (13), (14) et (15), définis à la revendication 10.
14. Acide nucléique selon la revendications 10, caractérisé en ce qu'il contient l'enchaînement de nucléotides (16), délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 43 et 594 de la figure 1, ou contient l'enchaînement de nucléotides (19) délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 1 et 605 de la figure 1.
15. Acide nucléique selon la revendications 10, caractérisé en ce qu'il contient l'enchaînement de nucléotides (17), délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 54 et 605 de la figure 2, ou contient l'en chainement de nucléotides (20) délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 1 et 838 de la figure 2.
16. Acide nucléique selon la revendications 10, caractérisé en ce qu'il contient l'enchaînement de nucléotides (18), délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 4 et 552 de la figure 3, ou comprend l'enchaînement de nucléotides (21) délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 1 et 558 de la figure 3.
17. Acide nucléique recombinant caractérisé en ce qu'il contient l'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 9 à 16, inséré dans un acide nucléique hétérologue vis-à-vis du susdit fragment.
18. Vecteur recombinant en particulier pour le clonage et/ou l'expression particulièrement du plasmide, cosmide ou phage, caractérisé en ce qu'il contient un acide nucléique recombinant selon la revendication 17 contenant le susdit acide nucléique en un des sites non essentiels pour sa réplication.
19. Vecteur recombinant selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il contient en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication des éléments nécessaires pour promouvoir l'expression d'une séquence d'acides aminés selon les revendications 1 à 8, dans un hôte cellulaire, et éventuellement un promoteur compatible avec ledit hôte cellulaire, en particulier un promoteur inductible, et éventuellement une séquence signal et/ou une séquence d'ancrage.
20. Vecteur recombinant selon la revendication 19, en ce qu'il contient
- les éléments permettant son insertion dans
E. Coli,
- les éléments permettant l'expression par E.
Coli de cet acide nucléique selon les revendications 9 à 17, inséré dans le vecteur, et
- les éléments permettant l'exportation du produit résultant de l'expression du susdit acide nu nucléique
21. Hôte cellulaire transformé par un vecteur recombinant selon l'une des quelconque des revendications 18 à 20, capable de se répliquer dans ledit hôte cellulaire.
22. Hôte cellulaire selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il s'agit de E. Coli transformé par le vecteur selon la revendication 20.
23. Anticorps, notamment monoclonal, caractérisé en ce qu'il est dirigé contre une séquence d'acides aminés selon l'une quelconques des revendications 1 à 8.
24. Sonde nucléotidique caractérisée en ce qu'elle hybride avec l'un des acides nucléiques selon les revendications 9 à 17, ou avec leurs séquences complémentaires dans les conditions d'hybridation suivantes
- pour les sondes susceptibles de s'hybrider avec les acides nucléiques (2), (3), (4), (5)., (7), (8), (9), (10), (12), (13), (14) et (15) ou leurs séquences complémentaires les conditions d'hybridation sont les suivantes hybridation proprement dite : 60-C, 5X SSC, 5X Denhardt, 0,1 s SDS, 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon lavage :: 60-C, 2X SSC, 0,1 Ó SDS, 30 mn
- pour les sondes susceptibles de s'hybrider avec les acides nucléiques ou les séquences complémentaires (1), (6) et (11) les conditions d'hybridation sont les suivantes hybridation proprement dite : 45"C, 5X SSC, 5X Denhardt, 0,1 Ó SDS, 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon 1. lavage : température ambiante, 2X SSC, 0,1 Ó SDS, 30 mn, 2- lavage : 45 C, 2X SSC, 0,1 SDS, 30 mn.
25. Méthode de dépistage in vitro des séquences d'acides aminés selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans un prélèvement biologique susceptible de les contenir, caractérisé en ce qu'elle comprend - la mise en contact d'au moins un des anticorps selon la revendication 23, avec le susdit prélèvement biologique - la détection à l'aide de tout moyen approprié des éventuels complexes immunologiques formés entre les séquences d'acides aminés et les anticorps sus-mentionnés.
26. Méthode de dépistage in vitro des séquences d'acides aminés selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans un prélèvement biologique susceptible de contenir des acides nucléiques codant pour lesdites séquences d'acides aminés, caractérisée en ce qu'elle comprend - la mise en contact d'au moins une des sondes oligonucléotidiques selon la revendication 24, avec le susdit prélèvement biologique préalablement traité - la détection à l'aide de tout moyen approprié des éventuels complexes d'hybridation formés entre les sondes et les acides nucléiques sus-mentionnés.
27. Méthode de dépistage in vitro selon la revendication 25 ou 26, appliquée au diagnostic in vitro de maladies corrélées à des teneurs en séquences d'acides aminés, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, situées à l'extérieur du domaine délimité par les valeurs extrêmes correspondant généralement à l'état physiologique d'un individu sain.
28. Nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de dépistage in vitro selon les revendications 25 et 27 comprenant - une quantité déterminée d'au moins un des anticorps selon la revendication 23 susceptibles de donnier lieu à une réaction immunologique avec une des séquences d'acides aminés à détecter selon les revendications 1 à 8 - avantageusement, un milieu approprié à la formation d'une réaction immunologique entre les séquences d'acides aminés et les anticorps sus-mentionnés - avantageusement des réactifs permettant la détection des complexes immunologiques entre les séquences d'acides aminés et les anticorps produits lors de la susdite réaction immunologique.
29. Nécesssaire ou kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de dépistage in vitro selon la revendication 26 et 27 comprenant - une quantité déterminée d'au moins une des sondes oligonucléotidiques selon la revendication 24, susceptibles de donner lieu à une réaction d'hybridation avec un des acides nucléiques codant pour une séquence d'acides aminés à détecter selon les revendications 1 à 8 - avantageusement un milieu approprié à la formation d'une réaction d'.hybridation entre les acides nucléiques et les sondes sus-mentionnés - avantageusement, des réactifs permettant la détection des complexes d'hybridation produits de la susdite réaction d'hybridation.
30. Procédé de préparation d'une séquence d'acides aminés selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que
- on cultive dans un milieu de culture approprié un hôte cellulaire préalablement transformé par un vecteur approprié contenant un acide nucléique selon l'une des revendications 9 à 17,
- et on récupère à partir du susdit milieu de culture la séquence d'acides aminés produite par ledit hôte cellulaire- transformé, après lyse de la membrane cellulaire de cet hôte cellulaire.
31. Procédé de préparation d'une séquence d'acides aminés déterminée caractérisé par la mise en culture de E. Coli contenant un vecteur recombinant selon la revendication 20 et par l'arrêt de la culture en fin de phase exponentielle de croissance dudit E.
Coli, et récupération de la séquence d'acides aminés déterminée à partir du milieu de culture exempt des autres protéines et enzymes exocellulaires susceptibles d'être secretés par E. Coli.
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