FR2676449A1 - Procede pour recuperer la peroxydase de soja. - Google Patents

Abstract

Procédé pour récupérer une solution de peroxydase de soja à partir de graines de soja ou de gousses de soja. Ce procédé consiste à former un homogénat de graines ou de gousses de soja dans l'eau, à ajuster le pH de cet homogénat à une valeur alcaline et à enlever les particules de l'homogénat pour récupérer ainsi une solution de la peroxydase dans l'eau. On peut facultativement enlever les particules les plus grosses de cet homogénat avant l'ajustement du pH. On peut également, après préparation de l'homogénat, le congeler, puis le décongeler et séparer ensuite les particules de l'homogénat pour obtenir un extrait contenant la peroxydase.

Description

Procédé pour récupérer la peroxydase de soja
La Demande US numéro de série 599 584, correspondant à la
Demande de Brevet Européen 91-309652.5, décrit des procédés pour utiliser la peroxydase de soja (SBP) et des peroxydases en provenance d'un certain nombre d'autres sources végétales dans divers procédés d'oxydation biocatalytique, y compris la préparation de résines phénoliques. Il est proposé d'utiliser la peroxydase de soja dans le traitement biologique des eaux usées et dans des essais immunologiques. Dans la plupart de ces procédés, on utilisait précédemment la peroxydase de raifort. La peroxydase de raifort (HRP) est coûteuse et relativement instable par comparaison avec la peroxydase de soja.Compte tenu de la valeur accrue de la peroxydase de soja obtenue, au moins partiellement, grâce aux enseignements des Demandes précitées, il existe un besoin pour des procédés plus efficaces de récupération de cette enzyme.

Le Brevet US 3 947 324 décrit un procédé pour récolter HRP, dans lequel un extrait de racine de raifort est réglé à un pH de 6 à 9 et traité avec des ions zinc.

La présente invention concerne un procédé amélioré pour récupérer l'enzyme peroxydase de soja d'extraits de plantes et plus particulièrement des gousses de soja. De façon caractéristique, lorsqu'on recueille des peroxydases à partir de gousses de soja et d'autres plantes, on prépare un homogénat aqueux à partir de cette(ces) portion(s) de la plante riche(s) en peroxydase , la peroxydase est extraite de la plante dans l'eau, les particules sont enlevées de l'homogênat par centrifugation ou autres techniques de sédimentation ou de séparation, et on récupère une solution aqueuse de la peroxydase.La séparation de l'homogénat peut être difficile et longue, mais il est important d'arriver à une bonne séparation, car, si elles ne sont pas enlevées, les particules végétales colmatent les membranes utilisées pour l'ultrafiltration et transportent des microorganismes dégradant l'enzyme, telles que des bactéries, des levures et des champignons, qui réduisent la durée de stockage de la peroxydase.

Selon l'invention, on a trouvé que, en réglant le pH de l'homogénat à une valeur alcaline et en soumettant facultativement l'homogénat à certains traitements thermiques, des particules peuvent être aisément séparées et on peut obtenir une solution claire de peroxydase ayant une forte activité spécifique.

Une manifestation de l'invention est un procédé pour récupérer l'enzyme peroxydase des graines de soja, procédé qui comporte les stades suivants : préparer un homogénat à partir de graines de soja ou de gousses de soja entières dans l'eau, ajuster le pH de l'homogénat à un pH alcalin, enlever pratiquement les particules de l'homogénat et récupérer une solution aqueuse de cette peroxydase.

Selon une autre réalisation de l'invention, l'homogénat peut être chauffé pour faciliter l'enlèvement des particules végétales.

Selon une autre réalisation de l'invention, après ajustement du pH et/ou chauffage de l'homogénat, ce dernier peut être centrifugé et ensuite refroidi ou congelé pour enlever ultérieurement les particules.

On a également trouvé que l'addition d'un sel à l'homogénat facilite et améliore l'enlèvement des particules.

L'invention comporte également un procédé comprenant les stades suivants : préparer un homogénat d'une partie de plante contenant de la peroxydase dans l'eau, congeler cet homogénat, décongeler l'homogénat congelé et séparer les particules de l'homogénat pour obtenir un extrait contenant cette peroxydase.

Comme premier stade du procédé, on prépare un homogénat aqueux de la portion de la plante contenant la peroxydase (par exemple la gousse). La concentration des gousses de soja dans l'eau utilisée pour préparer l'homogénat est de façon caractéristique voisine de 10%, mais elle peut être comprise entre environ 1 et 30% en poids. L'homogénat peut être préparé par broyage, mélange ou meulage. Une technique efficace utilise un émulsifiant. La vitesse et le temps de l'émulsification varient en fonction de la concentration, de la réalisation de l'appareil d'émulsification et d'autres facteurs. De façon générale, l'émulsification continue jusqu'à l'obtention d'une dimension de particules inférieure ou égale à environ 500 /)m m (mesh 30). Un appareil émulsifiant utilisé dans la présente invention est un appareil d'émulsification Ross type 100L.L'utilisation de cet équipement à sa vitesse maximale (13000 tpm) pendant environ 30 secondes est nécessaire pour homogénéiser les gousses. Dans des procédés commerciaux, on peut utiliser des appareils d'émulsification en continu ou par lots du commerce.

Après homogénéisation des gousses, l'homogénat est de préférence filtré pour retirer les particules les plus grosses. Ceci peut être effectué en faisant passer l'homogénat à travers une gaze ou un tamis de 500 Fm de maille . Le but de ce stade est de retirer de l'homogénat les particules qui sont relativement aisées à enlever sans alourdir l'enlèvement en aval des particules plus petites et plus difficiles à enlever. Si l'émulsîfication produit une dispersion de particules relativement fine, il peut être inutile de filtrer les particules les plus grosses et on peut omettre ce stade du procédé.

On a trouvé que l'enlèvement des particules était facilité et amélioré si on utilisait une combinaison de pH et de traitement thermique.

Selon une réalisation, le pH de l'homogénat est rendu alcalin et est de préférence compris entre environ 9 et 13, et notamment entre environ 10 et 13. On peut utiliser l'un quelconque de toute une variété d'agents alcalins connus pour ajuster le pH à une valeur alcaline, par exemple une solution à 50% d'hydroxyde de sodium, une solution à 10% d'hydroxyde de calcium, ou des tampons tels que le carbonate de sodium.

Selon une autre réalisation de l'invention, l'homogénat peut être chauffé à environ 30 à 70"C et être maintenu à cette température pendant au moins 1 mn, et jusqu'à environ 5 heures.

Ce traitement peut également être utilisé en combinaison avec l'ajustement du pH.

Selon une autre réalisation de l'invention, la séparation et la clarification de l'homogénat sont améliorées en refroidissant, et en congelant facultativement l'homogénat et en laissant celui-ci se réchauffer à la température ambiante. De façon générale, ce traitement est effectué après centrifugation comme moyen pour effectuer une sédimentation additionnelle. L'homogénat peut être refroidi à environ 4 à 0 C, et maintenu à cette température pendant environ 10 à 60 mn. En refroidissant l'homogénat, il peut être souhaitable de congeler l'homogénat en un solide ou un semi-solide, comme décrit dans la Demande US en instance et généralement cédée numéro de série 07/699905. Pour congeler l'homogénat, des températures de l'ordre de -20 à -5 C sont généralement nécessaires.La température varie avec la concentration, des homogénats plus concentrés exigeant des températures plus basses que des homogénats moins concentrés. Il est généralement inutile de congeler l'homogénat jusqu'à le rendre solide.

La concentration en sel est également efficace pour améliorer la sédimentation et la clarification. Ce traitement peut être utilisé en combinaison avec l'ajustement du pH et/ou le traitement thermique déjà décrits. L'extrait de gousses de soja est clarifié immédiatement par centrifugation lorsque le pH est 8 et la concentration en sel est accrue jusqu'à 50 mM avec le chlorure de trishydroxyméthyl ammonium. Sans le sel, des temps de sédimentation plus longs et un pH plus élevé sont générale ment nécessaires. Des exemples de sels utiles dans l'invention sont le chlorure de potassium (KCl), le chlorure de sodium (NaCl), le sulfate de sodium (Na2SO4), le sulfate d'ammonium ((NH4)2SO4). Généralement, le sel est utilisé en une quantité d'environ 10 mM à 5 M en fonction de sa force ionique.

Les traitements précédents, à savoir ajustement du pH, traitement thermique ou addition de sel, peuvent être effectués avant ou après des traitements tels que la centrifugation, qui enlèvent les particules végétales et d'autres impuretés. Il est généralement souhaitable d'effectuer l'ajustement du pH ou le traitement thermique avant la centrifugation, mais il est également efficace de centrifuger, d'enlever l'extrait, de chauffer l'extrait ou d'ajuster son pH comme décrit ci-dessus, puis de laisser reposer l'extrait pendant 1 à 2 heures, ce sur quoi d'autres particules et impuretés peuvent se déposer de la solution de peroxydase.

Les particules peuvent être enlevées par des techniques conventionnelles, à savoir filtration (sur papier, sur manche, etc.), centrifugation, décantation, etc. Des conditions de centrifugation caractéristiques sont 900 Xg ou 1500 Xg pendant 15 mn.

Le traitement thermique décrit ci-dessus peut être employé dans un procédé comportant la séquence de stades suivante : (1) homogénéisation, (2) enlèvement des grandes particules (facultatif), (3) traitement thermique et (4) centrifugation ou autres procédés d'enlèvement des particules; ou bien la séquence de stades suivante : (1) homogénéisation, (2) enlèvement des grandes particules (facultatif), (3) centrifugation, (4) traitement thermique et (5) sédimentation supplémentaire. Un autre procédé peut comporter la séquence de stades suivante : (1) homogénéisation, (2) enlèvement des grandes particules (facultatif), (3) traitement thermique, (4) centrifugation, (5) refroidissement de 1 'homogénat, (6) sédimentation supplémentaire.L'un quelconque des procédés précités peut être modifié pour comporter en outre une addition de sel et/ou un ajustement de pH en combinaison avec le traitement thermique.

L'ajustement du pH peut être incorporé dans des procédés qui comportent la séquence de stades suivante : (1) homogénéisation, (2) enlèvement des grandes particules (facultatif), (3) ajustement du pH, (4) centrifugation ou autres opérations d'enlèvement de particules, (5) sédimentation supplémentaire facultative; ou la séquence de stades suivante : (1) homogénéisation, (2) enlèvement des grandes particules, (3) centrifugation ou autres opérations d'enlèvement des particules, (4) ajustement du pH et (5) sédimentation supplémentaire. Le traitement thermique peut être conduit en combinaison avec l'ajustement du pH, mais, après centrifugation ou autres opérations d'enlèvement de particules pour améliorer la sédimentation ultérieure.Comme le traitement thermique, le traitement par un sel peut également être effectué en même temps que l'ajustement du pH ou après celui-ci, ou après centrifugation et avant une opération supplémentaire de sédimentation.

En variante, llhomogénat filtré peut être congelé directement.

Dans certains cas de travail expérimental décrits ici, l'homogénat est dilué à 10 à 80% de sa concentration d'origine. Ceci est fait pour permettre une mesure plus précise des vitesses de sédimentation et n'est pas un aspect nécessaire de l'invention.

Pour congeler l'homogénat, des températures de l'ordre de -20 à -5"C sont nécessaires. La température varie avec la concentration, des homogénats plus concentrés exigeant des températures plus basses que des homogénats moins concentrés. On préfère congeler l'homogénat jusqu'à obtenir un solide dur. Des expériences ont été faites dans lesquelles l'homogênat est congelé jusqu'à un état semi-dur, avec un moins bon rendement.

Pour décongeler l'homogénat congelé, ce dernier peut être chauffé ou bien on le laisse simplement reposer à température ambiante. Toutefois, si l'on chauffe, on doit prendre soin de ne pas chauffer localement à des températures dénaturant la peroxydase, car celle-ci est une protéine.

Lors de la décongélation de l'homogénat, les particules se déposent aisément. On peut alors enlever les particules par des techniques conventionnelles, y compris filtration (sur papier, sur manche , etc.), centrifugation, décantation, etc.

Quel que soit le procédé utilisé pour récupérer la solution de peroxydase, il peut être souhaitable de traiter encore la solution qui a été récupérée selon l'invention pour enlever davantage d'impuretés par des procédés bien connus tels qu'ultrafiltration, microfiltration, échange d'ions, etc.

L'enzyme elle-même peut être récupérée de la solution par des techniques de précipitation par solvants, en utilisant des fixatifs de protéines tels que l'acide tannique et des détergents tels qu'il est décrit dans la Demande de Brevet Européen 91 309652.5 ou par lyophilisation.

Diverses modifications peuvent être apportées au procédé pour améliorer la récupération de l'enzyme. Comme indiqué dans la
Demande de Brevet Européen 91 309652.5, les rendements sont améliorés lorsque les gousses de soja sont préalablement traitées dans du toluène. Pour améliorer la séparation, on peut utiliser certains agents tels que polyéthylèneimine, alcool de polyvinyle, polyvinyl pyrrolidone, chlorure de calcium et sulfate d'ammonium, qui se conduisent comme des agents de floculation ou sensiblement comme eux.

L'invention est particulièrement utile pour recueillir la peroxydase de soja, car celle-ci présente une stabilité inattendue sur une large plage de pH, par exemple de 1,5 à 12.

La peroxydase de soja est stable pour un pH 8 et 80"C. Elle ne perd essentiellement aucune activité lorsqu'elle est maintenue dans ces conditions pendant 2 heures, tandis que la peroxydase de raifort perd toute activité en 30 mn.

Des niveaux importants de matière particulaire fusionnent lors du chauffage et se déposent des extraits de peroxydase de soja à 80"C pendant 1 heure et par centrifugation. On pense que cette augmentation de l'activité est due à un enlèvement de protéines ayant une charge nette, neutre ou basique, pour un pH 7,5. De même, dans des conditions alcalines, les particules fusionnent rapidement. Un extrait témoin a une activité spécifique de 50 unités par mg de protéine , mais, après ajustement du pH à 11 avec une solution à 50% de NaOH et après avoir laissé les particules se déposer toute une nuit, la solution résultante a une activité spécifique de 66 unités par mg de protéine
La stabilité inhabituelle de la peroxydase de soja la rend utile pour de nombreuses applications.La peroxydase de soja présente une demi-vie de 1 à 2 heures à un pH 8 et 90"C. D'autres peroxydases, telles que la peroxydase de raifort, perdent leur activité trop rapidement pour qu'on puisse la mesurer. La peroxydase de soja augmente les vitesses de réaction de 8 fois lorsqu'on augmente la température de 20 à 60"C, et cette vitesse est conservée dans des solvants tels que de l'alcool à 60%, qui sont connus pour dénaturer HRP et d'autres protéines.

L'invention va être illustrée plus en détail par les exemples suivants
EXEMPLE 1
On obtient à l'état sec des gousses de graines de soja broyées au moyen d'un appareil de traitement de graines de soja et on les lave. L'eau de lavage est conservée comme extrait et utilisée en tant que témoin. L'extrait témoin (non traité) a une activité spécifique de 50 unités par mg de protéine
On homogénéise 200 g de gousses broyées humides avec un appareil d'émulsification à tête de stator Ross type 100L (13000 tpm) dans 500 ml d'eau du robinet et elles sont filtrées sur un tamis à mailles de 75 sium. Le pH est ajusté de 4,6 à 11 avec une solution d'hydroxyde de sodium à 50% et on laisse déposer les particules toute une nuit. La solution résultante a une activité spécifique de 66 unités par mg de protéine , ce qui est une augmentation de 30% par rapport au témoin.Il n'y a aucune perte de l'activité totale.

EXEMPLE 2
Une suspension opaque épaisse de gousses de graines de soja broyées (dimension de particules : 75 j m) est ajustée à un pH 11 avec une solution d'hydroxyde de sodium à 50% et on la laisse se déposer toute une nuit. Les particules se séparent aisément pour obtenir une solution transparente à la centrifugation. Un homogénat non traité ne se clarifie pas à la centrifugation. La solution transparente obtenue est à la fois de couleur plus claire et a environ une activité spécifique double de celle obtenue de l'eau de lavage brute des gousses broyées.

EXEMPLE 3
Des gousses de graines de soja sont obtenues à l'état sec par un appareil de traitement de graines de soja. 50 g de gousses entières sont homogénéisés avec un appareil d'émulsification
Ross, modèle 100L (13000 tpm) pendant 30 secondes dans 500 ml d'eau du robinet. Ce procédé émulsifie l'échantillon et extrait la peroxydase d'enzymes soluble. Le rendement de l'enzyme est 265 unités/gramme de gousses sèches, sur la base d'un essai au pyrogallol (Simga Chemical Company, Peroxidase Bulletin).

L'extrait de gousses de graines de soja est dilué en plusieurs fractions à différents pourcentages de la concentration de départ dans l'eau : 10%, 20%, 40%, 60% et 80%. Une portion de chaque dilution est placée dans le congélateur (-20"C), une autre portion est stockée dans le réfrigérateur (5"C). Après 2 heures, les échantillons sont transférés à la température ambiante et on détermine leurs compositions spectrophotométrique, enzymatique et chimique. Les échantillons stockés dans le congélateur sont complètement congelés et décongelés avant analyse à la température ambiante (23"C).

Une analyse spectrophotométrique de l'absorbance contre l'eau, de 1100 nm à 200 nm, fut effectuée sur les échantillons après traitement. On observe une absorbance plus élevée pour toutes les longueurs d'ondes avec l'extrait réfrigéré par comparaison avec l'extrait traité congelé et décongelé.

Une longueur d'onde dans la région visible fut choisie pour mesurer la vitesse de sédimentation des particules (700 nm) sur la base des spectres d'absorbance. La vitesse de sédimentation des particules est comparée en utilisant un extrait dilué à 10% de la concentration d'origine. Les valeurs d'absorbance réelles sont enregistrées chaque 1000 secondes et sont tracées. Les essais sont effectués avec un bain d'eau en circulation, à 23 'C, fixé sur la jaquette des cellules du spectrophotomètre. Les résultats montrent que l'absorbance chute jusqu'à une valeur égale à environ la moitié de l'extrait stocké au réfrigérateur avec le traitement de congélation/décongélation (à 10% de la concentration d'extrait d'origine) en 90 mn.Ce résultat montre une concentration de particules nettement inférieure et une augmentation de la vitesse de sédimentation des particules dans l'échantillon réchauffé, même pour la plus grande dilution d'échantillons essayée.

La différence dans les concentrations de particules entre les extraits traités et témoin est mesurée simultanément en plaçant l'échantillon traité congelé/décongelé dans la cellule de référence d'un spectrophotomètre à deux rayons et l'extrait témoin stocké au réfrigérateur dans la cellule d'essai. Le pourcentage de transmittance est mesuré comme étant la différence de ces échantillons pour cinq longueurs d'onde pour chaque dilution. Les résultats sont indiqués sur le Tableau 1.

Tableau 1
Comparaison des pourcentages de transmittance
Pourcent de la concentration Longueurs d'ondes (nm)
d'origine 1100 900 700 500 400
10 85 77 63 47 37
20 42 30 18 918 7t8
40 10 5 3 1,8 2,0
60 2t6 lut5 0t9 0r8 1t7
80 1,2 Ot8 Or5 074 0,8 100 077 05 0t3 3 0f3 0,3
Les résultats du Tableau 1 montrent que, pour toutes les concentrations essayées et pour une large plage de longueurs d'ondes depuis le proche infrarouge jusqu'au proche ultraviolet, l'échantillon stocké au réfrigérateur transmet de 15 à 99,7% moins de lumière que les extraits traités par congélationdécongélation, ce qui confirme la concentration de particules beaucoup plus faible dans les échantillons traités. L'absorbance est également mesurée à ces longueurs d'ondes et la même tendance est confirmée.

Chacun des échantillons traités et témoin est analysé en ce qui concerne les activités de protéines, d'hydrates de carbone et de peroxydase par des méthodes standards après 24 heures de sédimentation. Cette analyse est effectuée pour confirmer le renforcement de la qualité de la peroxydase due au traitement de congélation-décongélation. Ces résultats sont résumés sur le
Tableau 2.

Tableau 2
Composition des extraits de gousses de soja
après 24 heures de sédimentation
Pourcent de concentration Unités de Protéine Hydrate de carbone
F = congelé-décongelé peroxydase/ml mg/ml mg/ml
R = réfrigéré
10-F 1,16 0,079 0,633
10-R 1,43 0,196 1,154
20-F 3113 0,094 1,976
20-R 3712 0,455 2,11
40-F 7,38 0,164 3i33
40-R 8,56 0,648 3,71
60-F 11r76 0r136
60-R 15,10 0,674 5,80
80-F 17,97 0,169 4,83
80-R 20,93 2,238 8,57
100-F 23,0 0,292 5,70
100-R 26,5 2,557 8,97
Les résultats du Tableau 2 montrent que le cycle de congélationdécongélation conduit à une perte minimale, s'il y en a une, d'activité de la peroxydase, une légère diminution dans les hydrates de carbone totaux et une perte notable de protéine totale . Les résultats du Tableau 2 confirment les tendances indiquées sur le Tableau 1. L'effet du traitement de congéla- tion-décongélation est plus grand pour des concentrations d'extraits plus élevées.

La valeur du traitement de congélation-décongélation peut être montrée par le rapport de l'activité de la peroxydase aux protéines totales (activité spécifique). Une peroxydase fortement enrichie a une activité spécifique élevée, qui est une mesure de la pureté de l'enzyme. L'activité spécifique est calculée à partir du Tableau 2 pour chaque échantillon et le taux de purification est déterminé comme étant le rapport des activités spécifiques de l'échantillon traité à l'échantillon non traité. Les résultats sont indiqués sur le Tableau 3.

Tableau 3
Purification de la peroxydase de soja
Pourcent de la Activité Rapport de
concentration
d'origine spécifique purification
10-F 14,7 2,0
10-R 7,3
20-F 33,3 4,8
20-R 6,9
40-F 45 3,4
40-R 13t2
60-F 86,5
60-R 10,6
80-F 106
80-R 9,4 1174
100-F 78t8 7,6
100-R 1073
Les résultats du Tableau 3 montrent que l'enrichissement en peroxydase augmente de 2 à 11 fois avec l'augmentation de la concentration d'extraits.

L'analyse des échantillons traités, comparée aux témoins, montre que la contamination par les particules peut être rapidement enlevée (2 heures) par un cycle de congélation-décongélation et sédimentation par gravité. Le traitement donne une peroxydase très enrichie, qui convient pour être traitée par ultrafiltration et qui n'entraîne que peu d'interférences ou de contaminations dans les réactions de polymérisation phénolique.

EXEMPLE 4
On prépare un extrait de gousses de soja comme dans l'exemple 1.

Cet échantillon est une forme concentrée de l'extrait préparé sans autre dilution. Des quantités aliquotes (3 ml chacune) sont refroidies à diverses températures selon le Tableau 4 pour déterminer l'effet de la congélation sur la séparation. Après incubation, les échantillons sont équilibrés à la température ambiante (23"C) pendant 1 heure, centrifugés à 1500 Xg pendant 8 mn et le pourcentage de transmittance à 700 nm est déterminé dans un spectrophotomètre enregistreur à double rayon Uv- visibles Shimadzu, contre de l'eau, à 23 C.

Tableau 4
Température Durée de pré-incubation Condition de 9b de transmittance à la
OC (en heures) ltéchantillon température ambiante
-15 2 solide 89
-5 0,16 semi-solide 14
0 4 liquide 0,8
5 4 liquide 0,9
Les résultats du Tableau 4 montrent que l'enlèvement des particules, indiqué par le pourcentage de transmittance, est plus efficace lorsque l'échantillon a été complètement congelé.

L'état concentré congèle à des températures inférieures à 00C, du fait d'un taux élevé d'impuretés dissoutes. Un échantillon plus dilué congèle aisément.

EXEMPLE 5
Le dépôt des particules dans des échantillons décongelés d'un extrait dilué fut étudié en utilisant le changement d'absorbance pour une longueur d'onde visible de 700 nm. A cette valeur, l'absorbance de lumière est principalement due à la concentration des particules, selon la loi de Beers-Lambert. L'absorbance à 700 nm est directement fonction de la concentration en particules. L'expérience est conduite comme suit
Un extrait de soja est dilué cinq fois avec de l'eau à la température ambiante. 3 ml d'extrait dilué sont placés dans une cuvette de spectrophotomètre et on détermine l'absorbance contre l'eau à 700 nm en augmentant la durée et la température.On utilise un support de cuvette à jaquette, fixé sur un bain d'eau en circulation à température constante de Haake (4,5 litres = 1 gallon) susceptible d'un contrôle de température à l'intérieur de la plage prévue pour l'expérimentation (-15 à +25"C). Les cuvettes d'échantillon et de référence sont refroidies à une température constante pendant que l'on contrôle l'absorbance à 700 nm pendant 10 mn, puis la température est augmentée à un gradient constant de 2,5"C/mn jusqu'à la température de 25"C. L'absorbance ne change pas de façon significative pendant les 10 mn initiales d'équilibrage à température constante. La diminution d'absorbance, indiquant une concentration de particules plus faible due à la sédimentation, est enregistrée toutes les 100 secondes pendant l'augmentation de température jusqu'à 25"C.

Les résultats indiquent qu'un traitement préalable entre -15 et -5"C est approprié pour obtenir la précipitation des particules, pour autant que l'échantillon congèle. Un traitement à 00C et au-dessus ne convient pas pour une séparation efficace des particules pour la concentration essayée.

Ayant ainsi décrit l'invention en détail et en se référant à des réalisations préférées de celle-ci, on voit que des modifications et des variantes sont possibles, sans s'écarter du domaine de l'invention défini dans les revendications jointes.

Claims (22)

Revendications

1.- Procédé pour récupérer une solution d'enzyme peroxydase de soja dans de l'eau à partir de plantes, caractérisé en ce qu'il consiste à - former un homogénat de graines de soja ou de gousses de soja dans de l'eau, - ajuster le pH de cet homogénat à un pH alcalin, et - enlever les particules de l'homogénat, et récupérer ainsi une solution de cette peroxydase dans l'eau.

2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'homogénat est un homogénat de gousses de soja.

3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le pH alcalin est compris entre environ 9 et 13.

4.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comporte le stade additionnel consistant à enlever de l'homogê- nat les plus grosses particules avant d'ajuster le pH.

5.- Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ces plus grosses particules sont plus grosses qu'environ 200 Sm.

6.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le stade d'ajustement du pH consiste à ajouter à l'homogénat une solution d'hydroxyde de sodium.

7.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le stade d'ajustement du pH consiste à ajouter à l'homogénat une solution tampon de carbonate de sodium.

8.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le pH est comprise entre environ 10 et 13.

9.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le stade d'ajustement du pH consiste à soumettre en plus cet homogénat à un traitement thermique.

10.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ce traitement thermique consiste à chauffer l'homogénat à une température comprise entre environ 30 et 70"C.

11.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comporte le stade additionnel consistant à refroidir l'homogénat à une température d'environ 0 à 50C après enlèvement des particules.

12.- Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'homogénat est congelé à un état solide ou semi-solide.

13.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le stade d'ajustement du pH consiste en outre à augmenter la concentration de sel de l'homogénat.

14.- Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la concentration de sel est augmentée d'environ 0,5 M à 5 M.

15.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le stade d'enlèvement des particules consiste à soumettre l'homogénat à une centrifugation.

16.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte le stade additionnel consistant à soumettre cette solution à ultrafiltration après le stade d'enlèvement des particules.

17.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à former un homogénat de graines de soja ou de gousses de soja dans l'eau, à enlever de cet homogénat les particules ayant une dimension de particules supérieure à environ 200 ex, à ajuster le pH de cet homogénat à une valeur alcaline et à centrifuger l'homogénat pour enlever pratiquement toutes les particules résiduelles.

18.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à former un homogénat de graines de soja ou de gousses de soja dans l'eau, à enlever de cet homogénat les particules ayant une dimension de particules supérieure à environ 200 à centrifuger l'homogénat pour enlever pratiquement toutes les particules résiduelles, à ajuster le pH de cet homogénat à une valeur alcaline et à séparer les particules additionnelles de cet homogénat.

19.- Procédé pour récupérer une solution d'enzyme peroxydase de soja dans l'eau, caractérisé en ce qu'il consiste à former un homogénat de graines de soja ou de gousses de soja dans l'eau, à chauffer cet homogénat et à enlever les particules de cet homogénat, ce qui permet de récupérer une solution de cette peroxydase dans l'eau.

20.- Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que cet homogénat est un homogénat de gousses de soja et que le traitement thermique consiste à chauffer cet homogénat à 30 à 70"C jusqu'à 5 heures.

21.- Procédé pour récupérer la peroxydase de gousses de graines de soja, caractérisé en ce qu'il consiste à préparer un homogénat de gousses de graines de soja contenant de la peroxydase dans l'eau, à congeler cet homogénat, à décongeler cet homogénat congelé et à séparer les particules de cet homogénat pour obtenir un extrait contenant la peroxydase.

22.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'homogénat est préparé en émulsifiant les gousses dans l'eau à une concentration d'environ 1 à 30% en poids.