FR2668604A1 - Procede pour preparer une colonne capillaire, emplie d'un gel forme par polymerisation progressant dans l'espace a l'aide d'un amorceur migrant. - Google Patents

Abstract

Procédé pour préparer une colonne capillaire, emplie d'un gel formé par polymérisation progressant dans l'espace à l'aide d'un amorceur migrant. Dans un tube capillaire (11), préalablement rempli d'un monomère, d'un agent de réticulation et d'un catalyseur, entre des extrémités (12, 13) plongées dans des réservoirs (14, 15) entourant une électrode (16, 17), on fait passer (avec une source (18) d'énergie) un amorceur chargé pour la polymérisation. La vitesse de déplacement de l'amorceur est assez faible pour maintenir un bord menant net, ce qui provoque une polymérisation progressive d'une extrémité du capillaire vers l'autre. On évite ainsi un retrait et une discontinuité du gel. Application: électro-analyse de petits échantillons par électrophorèse.

Description

La présente invention se situe dans le domaine de

l'électrophorèse sur gel, et elle se concentre plus parti-

culièrement sur l'utilisation de tubes capillaires emplis de gel, pour une électrophorèse en tubes capillaires ("électrophorèse capillaire"). L'un des développements récents les plus importants

dans le domaine des techniques d'analyse de mélanges biolo-

giques consiste en la technique de l'électrophorèse effec-

tuée en tubes capillaires Les tubes capillaires procurent

de nets avantages pour la séparation d'espèces et de com-

posés ou produits comme de petits peptides, de petites protéines et des acides nucléiques, puisqu'on peut utiliser

ces tubes capillaires pour analyser des échantillons extrê-

mement petits avec une détection commode par spectroscopie effectuée directement dans le circuit, et que cela permet d'utiliser des tensions électriques élevées, en réalisant

ainsi des séparations à une vitesse relativement grande.

L'utilisation d'un gel comme milieu de séparation

dans le tube capillaire combine les avantages d'une élec-

trophorèse en tubes capillaires avec les possibilités connues d'une électrophorèse sur gel En raison de leur forme géométrique particulière, cependant, les capillaires soulèvent un net problème, notamment lors de la préparation

du gel dans le tube capillaire Un facteur ennuyeux con-

siste en la difficulté d'obtenir une consistance et une concentration uniformes du gel dans la totalité du tube capillaire Cela est important pour parvenir à réaliser une bonne résolution des constituants et la reproductibilité de l'analyse, et ce sont donc des considérations importantes

pour la réalisation d'une utilisation optimale de la tech-

nique, en particulier quand on utilise des capillaires

ayant une lumière très étroite Cela est difficile à réa-

liser avec des gels dans des tubes capillaires, puisque le retrait du gel, qui constitue un résultat inhérent de la réaction de polymérisation, crée des intervalles dans le gel, notamment des espaces ouverts analogues à des bulles, qui ont généralement les dimensions microscopiques et suscitent des déviations et écarts par rapport à une bonne uniformité du gel De telles discontinuités provoquent une chute de courant électrique et une rupture du gradient de champ électrique appliqué pendant l'électrophorèse, ce qui à son tour diminue l'efficacité ou le rendement, la fia- bilité et la reproductibilité de la séparation. Des techniques ont bien été proposées pour surmonter ou résoudre ce problème, mais elles tendent à exiger des

matières, des matériels, de l'équipement ou des modes opé-

ratoires que l'on n'utilise généralement pas en liaison avec des tubes capillaires, une préparation de gel ou une électrophorèse, et ces techniques donnent des résultats variables La présente invention vise à répondre à cette

nécessité, en offrant une solution simple, efficace, repro-

ductible et fiable.

Pour résumer l'invention, on pourrait dire qu'il vient d'être découvert que l'on peut préparer des tubes

capillaires emplis de gel, ne présentant pas les disconti-

nuités qui apparaissent couramment au cours du procédé de

formation de gel, la préparation étant effectuée en utili-

sant un champ électrique, d'une manière analogue à un mode opératoire d'électrophorèse, pour introduire un amorceur de polymérisation, chargé, à une extrémité du tube capillaire et en le faisant passer continuellement le long du tube capillaire jusqu'à ce que cet amorceur ait traversé la totalité du volume intérieur du tube capillaire, ce tube capillaire ayant été empli au préalable d'une solution liquide de toutes les matières formatrices de gel, à l'exception de l'amorceur L'amorceur pénétrant dans le

tube est dirigé par un front qui se déplace longitudina-

lement dans le tube capillaire à une vitesse linéaire lente

et sensiblement constante en direction axiale La polyméri-

sation du gel en n'importe quel point du tube capillaire commence ainsi lorsque le front passe tout d'abord en ce point, et cette polymérisation se poursuit jusqu'à son

achèvement sous l'effet de l'exposition continue à l'amor-

ceur qui se déplace au-delà de ce point.

On peut donc indiquer que le procédé de l'invention comprend les étapes consistant: (a) à emplir un tube capillaire, ayant des première

et seconde extrémités, d'une solution d'une matière forma-

trice de gel, capable de subir une réaction de polymérisa- tion et de formation de gel lorsque cette matière est placée au contact d'un amorceur de polymérisation; (b) à immerger ladite première extrémité dudit tube

capillaire dans une première solution entourant une élec-

trode, solution dans laquelle ledit amorceur de polymérisa-

tion est dissous sous une forme capable de migration en cas d'exposition à un champ électrique, et à immerger ladite seconde extrémité dudit tube capillaire dans une seconde solution entourant une électrode; et (c) à imposer un potentiel électrique entre lesdites première et seconde solutions entourant des électrodes de part et d'autre du tube capillaire, dans des conditions sensiblement dépourvues d'un écoulement électro-osmotique,

pour provoquer une migration dudit amorceur de polymérisa-

tion pénétrant dans ledit tube capillaire et conduit par un front de cet amorceur de polymérisation, qui se déplace le long du tube capillaire de la première extrémité vers la seconde extrémité à une vitesse linéaire prédéterminée, en provoquant la réalisation de la réaction de polymérisation

le long de ce front.

L'amorceur de polymérisation est avantageusement un

amorceur générateur de radicaux libres.

Dans le présent exposé, le terme "front" désigne une interface qui sépare la partie de l'intérieur du tube capillaire, dans laquelle l'amorceur est présent, de la partie dans laquelle cet amorceur est essentiellement absent Bien que l'interface, dans la plupart des cas, soit inférieure ou ne soit pas exactement une limite parfaite- ment nette, on peut réduire à son minimum un élargissement35 ou un manque de netteté ou un caractère flou de l'interface grâce à une maîtrise appropriée des conditions de migration

dans le même sens que dans le cas des séparations par élec-

trophorèse L'emplacement de l'interface est généralement défini par le fait que la polymérisation se produit du côté comportant l'amorceur et ne se produit pas du côté opposé. Le retrait des matières formatrices de gel, qui se produit par suite de la réaction de polymérisation, est quasi-totalement, sinon même totalement, limité à la région

située immédiatement derrière le front de l'amorceur en déplacement, attirant le liquide non encore polymérisé vers l'arrière, d'une manière unidirectionnelle et en éliminant10 efficacement une contrainte mécanique dans la région conte-

nant du gel ainsi que la tendance à former des irrégula-

rités ou discontinuités dans le gel ainsi formé On conduit le mode opératoire dans des conditions rendant sensiblement dépourvue d'un écoulement électro-osmotique la matière formatrice de gel dans le tube capillaire En outre, dans

des formes préférées de mise en oeuvre, l'un des consti-

tuants du mélange générateur de gel, portant une charge opposée à celle de l'amorceur, sert d'ion antagoniste au cours de l'introduction de l'amorceur, en pénétrant dans le

tube capillaire par l'autre extrémité comme moyen de main-

tenir le niveau ou taux de ce constituant dans la totalité du tube capillaire pendant la durée de l'opération de polymérisation.

D'autres caractéristiques, aspects et modes de réa-

lisation ou d'exécution de l'invention ressortiront de la

description détaillée qui va suivre, faite en regard des

dessins sur lesquels: la figure 1 est une représentation schématique illustrant une forme de mise en oeuvre de l'invention, dans laquelle un tube capillaire, empli d'une matière formatrice de gel, est monté de façon à permettre l'introduction d'un amorceur de polymérisation à une extrémité quand on met l'ensemble du montage sous l'effet d'un potentiel électrique; la figure 2 est un tracé provenant d'un détecteur d'une séparation par électrophorèse, sur un gel de tube capillaire, de protéines présentes dans de l'urine de souris non traitée, séparation effectuée à l'aide d'un tube capillaire rempli de gel et préparé selon la présente invention; les figures 3 a et 3 b représentent des tracés d'un détecteur d'une séparation par électrophorèse, sur gel dans tube capillaire, d'oligosaccharides, cette fois encore en

utilisant un tube capillaire rempli de gel, préparé selon la présente invention; et la figure 4 est un tracé d'un détecteur d'une sépa-

ration, par électrophorèse sur gel dans un tube capillaire, d'oligonucléotides, cette fois encore en utilisant un tube capillaire empli de gel, préparé selon la présente invention. On utilise divers gels dans une électrophorèse sur gel, et il sont applicables à la présente invention, le

choix du gel n'ayant pas un caractère critique ou fondamen-

tal pour l'invention Des gels d'un très grand intérêt, cependant, sont représentés par des gels de polyacrylamide, en raison de la possibilité connue d'appliquer cette manière au fractionnement par taille des macromolécules chargées (comportant une charge électrique), comme des protéines et des acides nucléiques, ainsi que de petits peptides Des mélanges d'un polyacrylamide avec d'autres matières formatrices de gel, comme de la gélose ou agarose,

présentent également de l'intérêt.

La matière formatrice de gel comporte généralement un agent de réticulation On connaît des agents très divers de réticulation et ils conviennent pour servir dans le contexte de la présente invention Des exemples d'agents de réticulation pouvant servir à la polymérisation des

acrylamides sont constitués par le N,N'-méthylènebis-

acrylamide, le N,N'-( 1,2-dihydroxyéthylène)bisacrylamide, le N,N'diallyldiamide de l'acide tartrique, le

N,N'-cystaminebisacrylamide, et le N-acryloyl-tris(hydroxy-

méthyl)aminométhane Un agent préféré de réticulation est

constitué par le N,N'-méthylènebisacrylamide.

Les concentrations du monomère et de l'agent de réticulation formateurs du gel ne sont pas fondamentales,

et elles peuvent varier considérablement Le choix appro-

prié ou optimal, dans un cas particulier quelconque, va dépendre de la composition du mélange que l'on cherche à séparer à l'aide du gel terminé, ainsi que des dimensions du tube capillaire et des conditions dans lesquelles la séparation est à effectuer Dans la plupart des cas, on

obtiendra les meilleurs résultats en utilisant des solu-

tions aqueuses des matières formatrices du gel, dans les-

quelles la concentration du monomère formateur de gel et de l'agent de réticulation constitue, en combinaison, entre environ 0,05 % et environ 20 % en poids, de préférence entre environ 2 % et environ 8 % en poids De même, la proportion de l'agent de réticulation par rapport à la combinaison du monomère formateur de gel et de l'agent de

réticulation se situera dans la plupart des cas entre en-

viron 0,5 % et environ 20 % en poids, de préférence entre

environ 2 % et environ 6 % en poids La concentration com-

binée du monomère et de l'agent de réticulation constitue la variable couramment désignée dans la littérature par le symbole "T", cependant que la proportion de l'agent de réticulation par rapport au total constitue la variable

désignée par "C".

La polymérisation est généralement réalisée en pré-

sence d'un catalyseur de polymérisation qui, dans le cas de la formation d'un polyacrylamide, est un catalyseur basique La base que l'on utilise dans chaque cas n'a pas

une importance fondamentale ou critique, et l'on peut uti-

liser n'importe laquelle des diverses bases connues comme étant des catalyseurs de polymérisation De bons exemples pour l'obtention d'un polyacrylamide sont représentés par

les bases aminées comme la N,N,N',N'-tétraméthyléthylène-

diamine, le P-diméthylaminopropionitrile et la triétha-

nolamine Parmi ces bases, on préfère la N,N,N',N'-tétra-

méthyléthylènediamine ("TMED" ou "TMEDA") et la triétha-

nolamine La quantité de la base peut également varier bien

que, dans la plupart des cas, on utilisera de manière gé-

nérale la base en une concentration comprise entre environ 0,Ol M et environ IM, de préférence-entre environ 0,03 M et environ 0,3 M. L'amorceur de polymérisation, que l'on introduit dans le tube capillaire par sa mobilisation sous l'influence du champ électrique, est constitué par n'importe quelle espèce chargée (comportant une charge

électrique) qui va amorcer la réaction de polymérisation.

Ni la nature chimique ni le mécanisme d'action de l'amor-

ceur ne sont critiques ou fondamentaux ici Dans la plupart des cas, cependant, l'amorceur sera un amorceur générateur de radicaux libres Des amorceurs générateurs de radicaux libres que l'on préfère sont représentés par des peroxydes, des persulfates et des composés azoïques Des exemples en sont le peroxyde de benzoyle, le peroxyde de tertiobutyle,

l'hydroperoxyde de tertiobutyle, le perbenzoate de tertio-

butyle, le peroxyde de cumyle, le peroxyde d'acétyle, le peroxyde de lauroyle, le 2,2 '-azobisisobutyronitrile, le phényl-azo- triphénylméthane et des persulfates, comme le persulfate de potassium et le persulfate d'ammonium Parmi eux, on préfère, notamment dans des systèmes aqueux, les

persulfates et en particulier le persulfate d'ammonium.

Selon l'invention, on ne place pas l'amorceur parmi les constituants de la matière formatrice de gel dans le tube capillaire avant l'imposition du champ électrique, et l'on conserve, au contraire, l'amorceur en solution dans un réservoir Dans ce réservoir sont immergées une extrémité

ouverte du tube capillaire et une électrode La contre-

électrode (ou électrode antagoniste) et l'autre extrémité

du tube capillaire sont immergées dans un second réservoir.

La concentration de l'amorceur dans le premier réservoir n'est pas fondamentale et elle peut largement varier Dans

la plupart des applications, notamment celles dans les-

quelles l'amorceur est l'ion persulfate, on obtient les meilleurs résultats avec une concentration comprise entre environ 0,03 M et environ 2,OM, de préférence comprise entre

environ O,l M et environ l OM.

Des amorceurs à charge négative, comme l'ion per-

sulfate, seront placés dans le récipient cathodique Un ion antagoniste à charge positive sera donc placé dans le réci- pient anodique pour pouvoir migrer dans la direction opposée Si la nature et l'identité de l'ion antagoniste ne sont pas fondamentales pour la présente invention, dans des formes préférées de réalisation, l'ion antagoniste sera la

même base que celle incluse comme catalyseur dans la solu-

tion formatrice de gel occupant le tube capillaire Ainsi, pendant que la base migre dans le tube capillaire sous l'influence du champ électrique dans la direction opposée à celle de l'amorceur, la base qui s'épuise est remplacée par de la base introduite en continu en provenance du récipient anodique La concentration de la base dans le récipient

anodique sera de façon générale supérieure à la concentra-

tion de la base placée initialement dans le tube capil-

laire, bien que la concentration utilisée en fait ne soit pas fondamentale et qu'elle puisse largement varier Dans des formes préférées de réalisation, la concentration de la base dans le récipient anodique se situera entre environ 0,l M et environ l OM, mieux entre environ 0,3 M et environ 3 M. Comme indiqué ci-dessus, on conduit l'opération de formation du gel dans des conditions dans lesquelles il ne se produit pratiquement pas d'écoulement électro- osmotique

ni de cause provoquant un entraînement ou une réaction.

Ainsi, on choisit ou l'on traite le tube capillaire lui-

même, ou l'espèce liquide qui en occupe l'intérieur, de façon qu' il y ait peu ou pas de potentiel électrocinétique présent On y parvient par des méthodes connues de l'homme du métier Ces méthodes suivent généralement l'une des deux

approches fondamentales La première consiste à lier chimi-

quement la matière neutre à la surface intérieure du tube capillaire de façon à éliminer une charge de surface et des sites d'adsorption La seconde méthode implique de faire varier le p H et la force ionique du tampon pour diminuer ou

éliminer l'effet électrocinétique.

On préfère la première approche ou première méthode pour la présente invention On peut utiliser diverses matières neutres et diverses méthodes pour lier de telles matières à la surface du tube capillaire Pour des surfaces contenant de la silice, des exemples sont constitués par la liaison de matières contenant du glycol, la liaison, grâce à un réactif de type organosilane, de polymères linéaires

comme de la méthylcellulose et du polyacrylamide non réti-

culé, l'application d'un revêtement de poly(vinylpyroli-

dinone), ce que l'on effectue éventuellement aussi à l'aide d'un réactif de type organosilane, et l'utilisation de polyéthylèneglycol On trouve dans la littérature une bonne documentation concernant un grand nombre de ces techniques

de revêtement, que l'homme du métier connaît bien.

La composition chimique et la structure du tube capillaire lui-même ne sont pas fondamentales, et elles peuvent largement varier Les tubes capillaires préférés sont ceux réalisés en des matières contenant de la silice, comme du verre, de la silice fondue et du quartz La silice fondue convient particulièrement bien, en raison de sa

large disponibilité et de son bon comportement avéré.

Les dimensions du tube capillaire peuvent aussi varier largement Dans la plupart des cas, le capillaire aura un diamètre interne compris entre environ 5 pm et environ 250 pm, et compris de préférence entre environ pm et environ 100 pm De même, la longueur du tube

capillaire se situera, dans la plupart des cas, entre envi-

ron 5 cm et environ 500 cm et de préférence entre environ

cm et environ 100 cm.

Le champ électrique est imposé au capillaire par des techniques traditionnelles Le procédé est particulièrement bien adapté à des techniques telles que celles utilisées dans la séparation par électrophorèse elle-même Cela implique en général d'immerger les deux extrémités du capillaire dans des solutions retenues dans les réservoirs,

chaque solution contenant en outre l'une des deux élec-

trodes On applique ensuite le potentiel électrique entre les électrodes à partir d'une -source traditionnelle d'énergie Une illustration de cet agencement ou de ce montage est présentée sur la figure 1, qui montre le tube capillaire 11 et ses deux extrémités 12, 13 ouvertes immergées dans des réservoirs 14, 15 séparés entourant une électrode, et dans lesquels les électrodes 16, 17 sont immergées L'énergie est fournie aux électrodes par une source 18 d'énergie Comme exemple typique, le réservoir 14 cathodique contient de l'ion persulfate, et le réservoir 15 anodique contient de l'ion triéthanolammonium, cependant que le tube capillaire, avant le placement sous potentiel électrique, est empli d'un mélange d'acrylamide, de

N,N'-méthylènebisacrylamide et de chlorhydrate de tri-

éthanolamine. L'amplitude du potentiel électrique n'a pas une importance fondamentale La considération principale sera d'éviter que, par suite du passage du courant, apparaisse dans le tube capillaire, un chauffage excessif par effet Joule Si le chauffage par effet Joule peut être diminué

par refroidissement à travers les parois du tube capil-

laire, il ne sera pas pratique ou possible, dans la plupart des cas, d'assurer le contact de la surface extérieure du

tube capillaire avec un milieu liquide à rôle de refroidis-

sement Donc, on règle généralement le chauffage par effet Joule en limitant la tension électrique Dans la plupart

des cas, le potentiel se situera dans la gamme allant d'en-

viron 0,5 V à environ 20 V par centimètre de longueur du

tube capillaire, de préférence entre environ 1,0 V et envi-

ron 10 V par centimètre de longueur du tube capillaire.

On se soucie également du fait que le potentiel soit assez bas pour assurer un mouvement lent et régulier du front de l'amorceur à l'intérieur du tube capillaire, d'une façon favorisant le maintien d'un front correspondant à une augmentation aussi nette que possible de la concentration de l'amorceur Le but de cela consiste à assurer, dans la il plus grande mesure possible, qu'une polymérisation se produise rapidement en référence à la vitesse linéaire du front, en limitant ainsi tout mouvement de fluide dû à un retrait des régions non polymérisées situées en avant du front Le potentiel électrique optimal et, donc, la vitesse de front, vont varier avec le système particulier, ce qui comprend le type de monomère et d'agent de réticulation formateurs du gel et leurs concentrations Dans la plupart des cas, on obtiendra les meilleurs résultats avec un front se déplaçant à une vitesse linéaire d'environ 0,003 cm/min à environ 0,3 cm/min, de préférence à une vitesse comprise

entre environ 0,01 cm/min et environ 0,1 cm/min.

Une fois le gel formé au degré voulu de polymérisa-

tion, il vaut mieux enlever du gel tous les constituants non polymérisés ayant servi à la formation de ce gel, comme l'amorceur et le catalyseur On y parvient facilement en remplaçant, dans les réservoirs entourant une électrode, les solutions par l'électrolyte de fond à utiliser au cours des séparations subséquentes par électrophorèse Cela va varier selon la séparation que l'on envisage d'effectuer, mais le mode opératoire est courant ou normalisé et il est applicable à tous les électrolytes de ce genre Une tension électrique est appliquée pour balayer l'électrolyte dans le gel et enlever ainsi l'amorceur et le catalyseur Une fois encore, la considération primaire ou principale consiste à

éviter un chauffage excessif par effet Joule, qui risque-

rait de provoquer une décomposition du gel Ce mode opéra-

toire de mise en équilibre peut être surveillé par un détecteur placé sur le circuit, tel qu'un détecteur

d'ultraviolets, qui va indiquer une ligne de base stabi-

lisée lorsque toutes les matières initiales mobiles ont

traversé le capillaire.

Les gels formés selon la présente invention dans les

tubes capillaires peuvent servir à effectuer des sépara-

tions très diverses, ce qui comprend celles antérieurement effectuées dans des tubes capillaires et celles effectuées dans des milieux formés par ou comportant des gels De

telles séparations comprennent, sans que cela soit limi-

tatif, des séparations de protéines, de peptides, d'oligo-

nucléotides et d'oligosaccharides.

L'exemple suivant est offert à titre d'illustration et il n'est destiné ni à définir ni à limiter en aucune

façon l'invention.

EXEMPLES

A Revêtement de tube capillaire

On a rincé de la tubulure capillaire en silice fon-

due, d'une longueur de 40 cm (diamètre interne 50 pm; diamètre externe 187 pm; Polymicro Technologies, Phoenix,

Arizona, Etats-Unis d'Amérique), en utilisant successive-

ment une solution 1 M de Na OH et de l'eau distillée, durant minutes à chaque fois On a empli le capillaire d'une

solution préparée à partir de 4 pl deà-méthacryloxypropyl-

triméthoxysilane dans 1 ml d'acide acétique 6 m M Au bout d'une heure au moins, on a rincé durant plusieurs minutes le tube capillaire avec de l'eau distillée, puis on a vidé le tube On a ensuite empli le tube capillaire avec une

solution désaérée contenant 2,5 % d'acrylamide et compor-

tant 0,1 % de persulfate d'ammonium et 0,1 % de N,N,N',N'tétraméthyléthylènediamine (TEMED) Au bout de min, on a rincé durant 5 min le tube capillaire à l'eau

distillée, puis on l'a vidé.

B Formation de gel On a empli le tube capillaire, ainsi revêtu, avec un mélange contenant 5,8 % d'acrylamide (T = 6 %), 0,18 % de

N,N'-méthylènebisacrylamide (C = 3 %) et 100 m M de chlor-

hydrate de triéthanolamine On a placé une extrémité du tube capillaire dans un flacon contenant 10 % de persulfate d'ammonium et une électrode en fil de platine On a placé

l'autre extrémité du tube capillaire dans un flacon conte-

nant 25 % de triéthanolamine et un second fil de platine comme électrode On a relié les électrodes à une source d'énergie continue à faible tension, la première électrode étant l'anode et la seconde électrode étant la cathode, et l'on a appliqué durant huit à quinze heures un potentiel de

V (c'est-à-dire 4 V/cm).

On a ensuite remplacé les flacons cathodique et anodique par des flacons contenant le tampon de base à utiliser dans la séparation par électrophorèse, le tampon comportant 100 m M de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, m M d'acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique et 1 % de dodécylsulfate de sodium On a ensuite appliqué une tension

élevée ( 500 V) durant cinq heures environ, puis on a effec-

tué une augmentation par étapes de la tension, de manière que le chauffage par effet Joule engendré dans le tube capillaire n'excède pas 0,5 m W/cm On a poursuivi cette mise en équilibre avec le tampon de fond jusqu'à ce que le courant se stabilise à une tension électrique constante et qu'un détecteur à absorptance des longueurs d'onde variables dans l'ultraviolet ("UVIDEC 100 IV, Jasco, Tokyo, Japon), monté dans le circuit et qui a été aligné avec un tronçon du tube capillaire dont le revêtement de polymère a été enlevé, situé à environ 15 cm d'une extrémité, donne une ligne de base stabilisée indiquant le passage de toutes

les matières initiales mobiles.

C Utilisation du tube capillaire, empli de gel, dans une séparation de protéines On a effectué, dans une longueur de 35 cm de ce tube capillaire empli de gel de la section B du présent exemple, une électrophorèse d'un échantillon d'urine de souris non traitée La longueur du tube capillaire jusqu'au détecteur était de 20 cm, et l'on a utilisé le détecteur identifié à la section B L'électrolyte de base était identique à celui

décrit ci-dessus, et comportait 0,1 à 1,0 % de dodécyl-

sulfate de sodium On a introduit des échantillons par électromigration durant 5 à 60 S à 100 V/cm Le tracé obtenu à l'aide du détecteur est représenté sur la figure

2, et il concorde avec des analyses effectuées d'une autre-

manière sur l'échantillon provenant de la même source.

D Utilisation d'un tube capillaire, empli de gel, pour séparer des oligosaccharides On a utilisé pour séparer des oligosaccharides un tube capillaire préparé d'une façon analogue Le tube

capillaire avait un diamètre interne de 100 pm et une lon-

gueur de 27 cm, dont 19 cm constituaient la longueur effi-

cace Les matières génératrices du gel et le mode opéra- toire de polymérisation ont été les mêmes que ceux décrits dans les sections A et Bci-dessus, et le gel final se

caractérisait par T = 10 %, C = 3 % Le tampon a été cons-

titué par 0,1 M tris/0,25 M borate/7 M urée à p H 8,33.

Le premier échantillon soumis à séparation a con-

sisté en un mélange des matières suivantes: 1 glucose 2 maltose 3 maltotriose 4 maltotetraose maltopentaose 6 maltohexaose 7 maltoheptaose Chaque espèce a été aminée par voie réductrice et, avant la

séparation, l'espèce a été marquée par un réactif fluoro-

gène sélectif d'une amine, pour permettre la détection par

une fluorescence induite par laser L'injection a été réa-

lisée par électromigration à 3 k V durant 10 s Pour la séparation, la tension électrique appliquée a été de 7 k V

( 264 V/cm) à 18 p A Le tracé ainsi obtenu à l'aide du dé-

tecteur est présenté sur la figure 3 a, o les pics sont

identifiés par les numéros indiqués ci-dessus.

Le second échantillon soumis à séparation a consisté

en un mélange résultant de l'hydrolyse partielle du poly-

saccharide maltodextrose ("Dextrin 15 "'), aminé et marqué de

la même façon que les oligosaccharides du premier échan-

tillon Une injection a été réalisée par électromigration à k V durant 30 s, puis la séparation a été effectuée avec une tension électrique appliquée de 7 k V ( 264 V/cm) à 18 p A Le tracé obtenu ainsi à l'aide du détecteur est

présenté sur la figure 3 B, sur laquelle les pics sont numé-

rotés afin de représenter les oligomères observés.

E Utilisation d'un tube capillaire empli de gel

pour séparer les oligonucléotides.

On a utilisé un autre tube capillaire, préparé éga- lement d'une manière analogue, pour séparer un mélange de polynucléotides consistant en pd(A)25 30 et pd(A)40 _ 60 Le tube capillaire avait un diamètre interne de 75 pm et une longueur de 27 cm, dont 20 cm constituaient la longueur

efficace Les matières génératrices du gel et le mode opé-

ratoire pour la polymérisation ont été les mêmes que ceux décrits dans les sections A et B ci-dessus, et le gel final

se caractérisait par T = 10 %, C = 5 % Le tampon con-

sistait en O,1 M tris-borate/7 M urée à p H = 8,1, et la ten-

sion appliquée était de 7,5 k V, 3 p A. Les résultats obtenus sont représentés sur la figure

4, qui indique que l'on a obtenu des séparations nettes.

Claims (7)

REVENDICATIONS

1 Procédé pour préparer une colonne capillaire emplie de gel, destinée à servir à une électrophorèse en tube capillaire, le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: (a) emplir un tube capillaire, ayant des première et

seconde extrémités, avec une solution d'une matière forma-

trice de gel capable de subir une réaction de polymérisa-

tion avec formation de gel quand elle est placée au contact d'un amorceur de polymérisation; (b) immerger ladite première extrémité dudit tube

capillaire dans une première solution entourant une élec-

trode et dans laquelle ledit amorceur de polymérisation est

dissous sous une forme capable de migrer en cas d'exposi-

tion à un champ électrique, et à immerger ladite seconde extrémité dudit tube capillaire dans une seconde solution entourant une électrode; et (c) à imposer un potentiel électrique entre lesdites première et seconde solutions entourant chacune une

électrode, à travers ledit tube capillaire, dans des condi-

tions essentiellement dépourvues d'un écoulement électro-

osmotique, pour provoquer la migration dudit amorceur de polymérisation dans ledit tube capillaire avec déplacement d'un front de cet amorceur de polymérisation le long de ce tube capillaire, depuis la première extrémité vers la seconde extrémité, à une vitesse linéaire prédéterminée, ce qui provoque la réaction de polymérisation le long de ce front. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en

ce que l'amorceur de polymérisation est un amorceur généra-

teur de radicaux libres.

3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'amorceur de radicaux libres est l'ion persulfate, et en ce que la concentration de l'ion persulfate dans la première solution entourant une électrode se situe entre

environ 0,1 M et environ 1,OM.

4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la matière formatrice de gel est constituée d'un

acrylamide monomère, d'un agent de-réticulation et d'une base, et en ce que la seconde solution entourant une élec- 5 trode est une solution de cette base.

Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le tube capillaire est un tube capillaire en silice fondue, dont la surface interne est revêtue d'une substance

supprimant une électro-osmose.

6 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le tube capillaire a un diamètre interne compris

entre environ 20 p et environ 100 pm.

7 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, à l'étape (c), le potentiel électrique appliqué va d'environ 1,0 à environ 10 V par centimètre de longueur du

tube capillaire.

8 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'à l'étape (c) la vitesse linéaire prédéterminée se

situe entre environ 0,01 et environ 0,1 cm/min.

9 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en

ce que la base est une amine.

Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la base est une amine choisie parmi la

N,N,N',N'-tétraméthyléthylènediamine, le p-diméthylamino-

propionitrile et la triéthanolamine.