WO2007003756A2 - Utilisation de polymeres reactifs pour moduler et controler les flux electrocinetiques dans un dispositif micro- ou nanofluidique - Google Patents

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Françoise Vinet
Anne-Marie Gue
Daniel Esteve
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Commissariat A L'energie Atomique
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Definitions

  • the present invention relates to the field of microfluidics and in particular to that of electrophoresis on a micro- or nanofluidic device.
  • It relates more particularly to the use of a reactive polymer coating capable of undergoing phase separation under the influence of external stimulation, to modulate electrokinetic flows (electroosmotic and electrophoretic flow during electrophoresis, for example) in a micro device. or nanofluidic, a method for varying the electrokinetic flows within such a device by implementing said coating, as well as micro- or nanofluidic devices comprising at least one channel or a capillary whose internal surface is covered at least partly by such a coating.
  • electrophoresis When performing electrophoresis, the movement and subsequent separation of charged objects is caused by the application of an electric field. Originally, electrophoresis was performed on non-convective media such as porous paper or polyacrylamide or agarose gels.
  • Capillary electrophoresis is an analytical method of separating charged or neutral molecules under the influence of an electric field inside a capillary.
  • An evolution of this technique is to perform the microchip separation, which drastically speeds up the analysis time and reduces it to a few seconds.
  • K "1 is the length or thickness of the electrical double layer (also known as the Debye length) and ⁇ z is the surface charge (or zeta potential)
  • the Debye length is the largest scale of length in the field of electrokinetics.It is inversely proportional to the square root of the concentration of electrolyte within the solution (K "1 ⁇ c " I / 2 )
  • K '1 is of the order of a few nanometers in standard physiological buffers and can reach values up to 1 ⁇ m in pure water at pH 7.
  • the electrophoretic mobility becomes independent of the size of the charged molecules in the case of larger molecules (K '1 "R) because the electric force and the friction force are both proportional to the size of the molecules.
  • uniformly charged large molecules such as, for example, oligonucleotides larger than 15 mers, DNA, uniformly charged proteins, and polysaccharides migrate in electric fields at non-dependent rates. of their size.
  • D the molecular diffusion coefficient
  • t the time.
  • electrophoretic flow a movement of the electrophoretic solution (aqueous solution of electrolytes) is also observed. This movement is called the electroosmotic flow (FEO) (or in English “Electro-Osmotic Flow”: EOF or "plug-like flow”).
  • FEO electroosmotic flow
  • EOF electroosmotic flow
  • This EOF is characterized by a flat velocity profile and a dispersion of the purely diffusive sample.
  • an electrolyte is adjacent to on the surface, this surface can be charged via the ionization of the chemical groups covalently bonded to said surface (for example, glass surfaces which produce SiOH-type surface groups and which release protons in the presence of water) or via adsorbed ions.
  • K 1 ( ⁇ b ⁇ 0 k B T / 2cz 2 e 2 ) 1/2 (eq 6) in which, C is the electrolyte concentration, Z is the charge of the electrolyte ions and e is the charge of an electron.
  • the local electric field that is tangent to the channel surface generates a force in the fluid mass, the said force inducing shear and generating a movement of the liquid inside the canal.
  • This movement of liquid is called electroosmosis.
  • the electroosmotic flow velocity is zero on the surface • of the channel and increases near the electric double layer and becomes constant beyond this double layer.
  • the speed of the electroosmotic flow is proportional to the intensity of the electric field and to the surface potential (zeta potential) and inversely proportional to the viscosity of the liquid within the double electric layer; it does not depend on the diameter of the channel as long as the diameter d is much larger than the thickness of the electric double layer (J "K). Obviously, this applies to most microfluidic systems in which the diameter of the channels or capillaries is usually of the order of one micron while the thickness of the Debye layer is of the order of one nanometer.
  • capillary or microchip electrophoresis has a number of significant disadvantages.
  • it is very sensitive to both the chemistry of the solution and the chemistry of the surface of the capillary or microchip. This often leads to flux changes during the analysis that compromise reproducibility and quantification.
  • uncontrolled and unexpected changes in the electroosmotic flow can lead to the failure of the method.
  • electroosmosis is therefore an important task, especially during electrophoretic separations, insofar as the magnitude and direction of the electroosmotic flow affect the eigenmobility of the analytes in the system.
  • the electroosmotic flow is indeed influenced by the presence of the Debye layer present at the solid / liquid interface and is dependent on the physicochemical properties of the surface and the electrolyte composition.
  • Water is the solvent usually used in capillary electrophoresis (CE).
  • CE capillary electrophoresis
  • the electroosmotic flow (FEO) in silica glass capillaries is directed to the cathode and the magnitude depends on the pH of the buffer and its concentration. It is possible to vary the FEO by adding surfactants to the electrolyte. However, this approach has a number of disadvantages in that it requires changes in the composition of the aqueous solution of electrolytes that are not always allowed, nor reversible; it is also difficult to implement dynamically during the analysis.
  • One of the most effective ways to vary the FEO in micro- or nanofluidic systems, and particularly in capillary electrophoresis devices, is the chemical modification of the surface of the capillaries by the application of appropriate surface coatings.
  • Coatings of a chemical nature often consist of hydrophilic, neutral or charged polymer brushes.
  • a coating consisting of neutral polymer brushes is generally employed.
  • Such polymer brushes significantly increase the viscosity of the solution in the electrical double layer and hydrodynamically couple this electrical double layer with the rest of the solution.
  • Nashabed W. and El Rassi Z. disclose the preparation of silica glass capillaries having hydroxylated polyether functions attached to the inner surface of the walls and their use for separation. proteins by EC.
  • the hydrophilic coatings consist of two layers: an underlayer of glyceropropylpolysiloxane (covalently bonded to the inner surface of the capillary) and a polyether type surface layer.
  • the capillary wall is coated with polysiloxane polyether chains covalently attached to the inner surface of the capillary. The authors indicate that these coatings reduce the adsorption of solutes on the walls, while being stable and with separative properties, thus leading to reliable and reproducible results.
  • epoxy polymers covalently bound to the silica via a glycerylpropylsilane arm (coating limiting the interactions with the proteins by steric hindrance due to the presence of the silanol groups);
  • crosslinked polyvinylmethylsiloxanediols then coated with a linear polyacrylamide layer attached via double bonds to the siloxanediol; the polyacrylamide being finally crosslinked with formaldehyde (static neutral coating);
  • polyvinyl alcohols making it possible to produce permanent coatings which are stable over a wide pH range and which can be used for the separation of glycoproteins; homopolymers simply adsorbed on the internal surfaces of the capillaries such as PVA, polydimethylacrylamide (PDMA), polyethylene oxides (PEO) and polyvinylpyrrolidone (PVP) and leading to polymer layers with a fractal structure; the best performing polymer for removing the OEM is PDMA (Madabhushi R.S., Electrophoresis, 1998, 19, 224-230). All of these polymers nevertheless have the disadvantage of leading to passive coatings, that is to say for which it is not possible to vary the properties under the action of external stimulation.
  • reactive polymer brushes may for example be obtained from poly (N-isopropyl acrylamide) type polymers (PNIPAM) which undergo a phase transition (ball-cell) to their lowest critical solution temperature (LCST), which is about 32 ° C ⁇ 1 to 2 ° C pure in water (Heskins, M. et al, J Macromol, Sci., Chem., 1968, A2, 1441 and Schild, HG, Polym Sci Prog, 1992, 17, 163).
  • LCST lowest critical solution temperature
  • the surfaces coated with such a polymer have temperature-dependent properties such as wettability and coating thickness.
  • PNIPAM-containing copolymer-modified silica beads have been used as a stationary phase for controlled temperature liquid chromatographic separations (Kanazawa, H. et al., Anal Chem., 1996, 68, 100-105). ). Magnetic particles functionalized with PNIPAM were used in controlled adsorption and desorption experiments of proteins (Elaissari A.
  • the term "regulation" means any increase, decrease or disappearance of the electrokinetic flows, from the static and dynamic, spatial and temporal point of view.
  • the inventors have, in particular, surprisingly found that under certain conditions, the grafting of a coating on at least a portion of the internal surface of a channel of variable geometry or of a capillary of a micro- or nanofluidic device , makes it possible to respond to this technical problem when said coating is obtained from flexible polymers capable of undergoing phase separation in aqueous solution (reversible separation: ball-cell transition).
  • the present invention therefore firstly relates to the use of a reactive polymer coating, grafted onto at least a portion of the internal surface of a channel or capillary of a micro-or nanofluidic device containing at least one solution.
  • aqueous electrolyte composition said surface comprising electrically charged chemical groups forming a double electrical layer at the liquid-solid interface, said coating having the following characteristics: a) it consists of a layer of flexible polymers capable of undergoing separation phase (ball-cell transition) in aqueous solution under the influence of external stimulation of a physical or chemical nature, b) the polymers are grafted covalently on said surface by only one of their ends, to modulate, reversibly, and control the electrokinetic flows within said device by varying the viscosity of the aqueous solution of electrolytes only within the electrical double layer under the influence of external activation of a chemical or physical nature.
  • the thickness of the layer of polymers constituting the grafted coating can vary due to a phase separation (ball-cell transition). polymers that become more or less soluble in the aqueous solution of electrolytes.
  • the change in thickness of the polymer coating varies the viscosity of the solution of the electrical double layer present at the liquid-solid interface of the micro- or nanofluidic device but does not vary the viscosity of the aqueous electrolyte solution outside. from this area. This viscosity change of the solution near the internal surface only (of the order of a few nanometers) thus makes it possible to significantly vary the electrokinetic properties of the device or those of the charged molecules.
  • a decrease in the viscosity of the aqueous electrolyte solution present within the electrical double layer located at the liquid-solid interface of the micro- or nanofluidic device causes an increase in the electrokinetic flow.
  • the polymers are said to be "activated", the thickness of the polymer coating is less than the thickness of the electrical double layer present at the liquid-solid interface of the micro- or nanofluidic device, thus leading to an increase in the electrokinetic flow.
  • an increase in the viscosity of the aqueous electrolyte solution present within the electrical double layer located at the liquid-solid interface of the micro- or nanofluidic device causes a decrease in the electrokinetic flow.
  • the polymers are said to be "inactivated", the thickness of the polymer coating is greater than the thickness of the electrical double layer present at the liquid-solid interface of the micro- or nanofluidic device, thus leading to a decrease in electroosmotic flow.
  • grafted onto at least a portion of the inner surface means that the grafting of the polymers may be carried out on an inner surface having an area less than or equal to the total area of the inner surface of the capillary.
  • the thickness of the electric double layer present at the interface of the electrophoresis device is generally between about 0.1 nm and 1 ⁇ m, preferably between about 0.5 and 10 nm and even more preferentially. between 1 and 5 nm approximately.
  • the inner surface of the device may be flat, concave or micro- or nanostructured and may consist of any solid material whose surface may be functionalized with ionizable chemical groups in aqueous solution.
  • any solid material whose surface may be functionalized with ionizable chemical groups in aqueous solution.
  • materials there may be mentioned glass, quartz, silica and polymeric materials such as plastics.
  • the channel of the device may have a variable geometry.
  • the channel and the capillary have dimensions such that their smaller width or diameter is greater than the thickness of the electric double layer. This dimension is preferably less than about 1 mm, more preferably less than or equal to about 0.5 mm and even more preferably less than or equal to about 0.1 mm.
  • the chemical groups present on the internal surface of the channel or the capillary are electrically charged because they are chosen from ionizable chemical groups in the presence of an aqueous solution.
  • silanol groups when the inner surface is a hydrated silica oxide, quartz or glass; primary, secondary or tertiary amines; sulphate, sulphonate, phosphonate and carboxylic groups. It is the presence of these charged groups on the internal surface of the device which leads to the formation of the electrical double layer at the liquid-solid interface.
  • the polymers that can be used according to the invention are grafted covalently onto the inner surface of said channel or said capillary, preferably via chemical groups chosen from silanol (-Si-OH) and vinyl (CH-CH 2 ) groups. , carboxyl (-COOH), amino (-NH 2 ), epoxy (-CH- (O) CH 2 ), oxyamine (-O-NH 2 ), thiol (-SH), halide (-Br or -Cl), etc.
  • the inner surface of the channel or the capillary can be modified by at least two types of chemical groups of different nature.
  • the first type of chemical groups can be used for the covalent grafting of the polymers constituting the reactive coating
  • the second type of chemical groups can be used to electrically charge the inner surface of the channel or the capillary and possibly to fix molecules such as probe molecules of biological nature that are not sensitive to chemical or physical activation that will be used to activate the polymer coating.
  • the probe molecules become accessible for the target molecules possibly present in the aqueous electrolyte solution, whereas they are not accessible when the reactive polymers are not activated.
  • the graft density of the polymer chains constituting the reactive coating is less than the density of the surface chemical groups, and this, whatever their nature. In this case, chemical groups remain free after the grafting of the polymer coating.
  • the polymers that can be used in accordance with the invention respond to external stimulation by phase separation.
  • the thickness of the reactive polymer coating is greater than that of the electrical double layer.
  • the viscosity of the aqueous electrolyte solution in the double electric layer is greater than that of the aqueous electrolyte solution outside this double layer and tends to infinity.
  • the electrokinetic flow of the aqueous electrolyte solution electrokinetic flow of the aqueous electrolyte solution (electroosmotic flow) tends to zero.
  • the thickness of the polymer coating is lower than that of the electrical double layer (polymers in globular conformation).
  • the viscosity of the aqueous electrolyte solution within the electrical double layer is equal to or substantially equal to that of the aqueous electrolyte solution outside this double layer.
  • the electroosmotic flow of the aqueous electrolyte solution is different from zero and proportional to the surface potential (zeta potential).
  • the graft density of the polymers forming the coating is such that the distance separating the anchoring points of two polymer chains on said surface is greater than, equal to or less than the radius of gyration of said chains.
  • the grafting density of the polymers is such that the polymers are in the form of a discontinuous and heterogeneous coating when the polymers are in the collapsed state ("activated" polymers) and form holes allowing the surface charges to be exposed to the aqueous solution of electrolytes.
  • a polymer is said to be "flexible” when the theoretical length of its chain L is greater than its remanent length.
  • the polymers that can form the coating that can be used according to the invention can be linear or branched. They are preferably chosen from linear polymers.
  • the polymers that can be used according to the invention can be classified according to the nature of the activation to which they are conformationally sensitive (chemical: pH, ionic strength for example or physical: light, temperature, magnetic field). or electric).
  • the polymer coating consists of polymers chosen from polymers sensitive to external activation of a physical nature.
  • polymers sensitive to temperature variations that is to say whose solubility, and therefore the three-dimensional conformation, vary as a function of temperature variations.
  • the polymer brushes constituting the reagent coating that can be used according to the invention are in a hydrated state and swollen in an aqueous solution when the temperature of said solution is less than.
  • LCST and become hydrophobic and collapse when the temperature of the solution is higher than the LCST.
  • polymers sensitive to physical activation mention may also be made of polymers sensitive to light irradiation.
  • polymers sensitive to light irradiation include especially polymers comprising an azobenzene unit, among which may be mentioned for example copolymers of N-isopropylacrylamide and N- (4- (phenylazo) -phenyl) -acrylamide, copolymers of dimethylacrylamide and phenylazophenylacrylate.
  • the polymer brushes constituting the reactive coating used according to the invention are in a hydrated state and swollen in aqueous solution when they are not activated by light and become hydrophobic and collapse after light irradiation.
  • the polymer coating consists of polymers sensitive to external activation of a chemical nature such as a pH variation. It is thus possible to obtain a polymer coating consisting of neutral polymers in the form of a brush of swollen and hydrophilic polymers at acidic pH (or conversely at basic pH) while the coating collapses and becomes hydrophobic at pH basic (or conversely at acidic pH).
  • Such coatings can be obtained from hydrophilic monomers of 2-hydroxyethyl methacrylate and monomers having ionizable chemical groups in aqueous solution such as acrylic groups.
  • the polymer coating can be synthesized in situ or ex situ according to the polymerization and grafting techniques well known to those skilled in the art.
  • the reactive polymer coating that may be used according to the invention may, for example, be prepared in situ, by bringing the surface to be coated into contact with a solution containing the monomers corresponding to the polymers that it is desired to obtain, and then by in situ polymerization according to the techniques conventional polymerization commonly used by those skilled in the art, said surface naturally comprising, or having previously been functionalized by, chemical groups capable of binding covalently to one end of the monomers.
  • the polymer coating can also be prepared from polymers already formed, that is to say previously synthesized ex situ, in which case the internal surface of the capillary is brought into contact with a solution of polymers already formed in order to allow their grafting. covalent on the inner surface having naturally or, having been previously functionalized by, chemical groups capable of bonding with only one end of the polymer chains.
  • a second object of the present invention is a method for reversibly varying and controlling electrokinetic flows within a micro- or nanofluidic device comprising at least one channel or at least one capillary capable of containing an aqueous solution.
  • electrolytes characterized in that it comprises at least the following steps: i) forming a reactive polymer coating on at least a portion of the inner surface of said channel or said capillary, said surface having electrically charged chemical groups forming an electrical double layer at the liquid-solid interface, said coating being as defined above, ii) increasing and / or decreasing the viscosity of the aqueous electrolyte solution only within the electrical double layer by activating and / or inactivating said coating by applying external stimulation of a physical or chemical nature.
  • step ii) is an activation step.
  • the polymer coating is preferably made of polymers sensitive to temperature variations and the activation is carried out by heating the aqueous electrolyte solution to a temperature above the LCST of the polymers constituting the coating.
  • the reactive coating consists of PNIPAM polymers and the activation is carried out by heating the aqueous electrolyte solution to a temperature slightly above about 32 ° C., preferably at a temperature between 35 and 50 ° C.
  • step ii) is an inactivation step.
  • the polymer coating is preferably made of polymers sensitive to temperature variations and the inactivation is carried out by cooling the aqueous electrolyte solution to a temperature below the LCST of the polymers constituting the coating.
  • the reactive coating consists of PNIPAM polymers and the inactivation is carried out by cooling the electrophoretic solution at a temperature slightly below 32 ° C., preferably at a temperature of between 15 and 30 ° C.
  • a last object of the invention is a micro- or nanofluidic device characterized in that it comprises at least one channel or at least one capillary of which at least a part of the internal surface is electrically charged and covered with a reactive polymer coating as previously described.
  • a particularly preferred micro- or nanofluidic device according to the invention is a device in which the reactive coating consists of polymers sensitive to external stimulation of a physical nature, and in particular to temperature variations, such as PNIPAM-type polymers.
  • the micro- or nanofluidic device according to the invention is preferably equipped with means for reversibly varying and controlling, locally or globally, the temperature of an aqueous solution.
  • electrolyte present inside the channel or the capillary (means of heating and / or cooling).
  • the channel or the capillary of the micro- or nanofluidic device according to the invention may for example be connected to at least two reservoirs which contain an aqueous solution of electrolytes, said solutions being identical or different from a reservoir. to the other, as well as electrodes for applying an electrical potential through the channel or the capillary.
  • the channel or the capillary of the device according to the invention can be connected at one of its ends to a reservoir containing an aqueous solution of electrolytes and at the other end to a mass spectrometer.
  • the channel or capillary may be part of a micro- or nanofluidic device comprising a plurality of reservoirs containing aqueous solutions of electrolytes identical to or different from each other and a plurality of electrodes.
  • the invention also comprises other arrangements which will emerge from the description which follows, which refers to examples of preparation of silica glass capillaries whose inner surface comprises a reactive polymer coating according to the invention.
  • invention as well as in appended Figures 1 to 5, in which:
  • Figure 1 represents the speed of the electroosmotic flow expressed in cmW.s. as a function of the temperature expressed in 0 C, in a silica glass capillary whose inner surface comprises a PNIPAM-based polymer coating;
  • FIG. 2 is a schematic representation of a micro- or nanofluidic device according to the invention.
  • This device consists of a furnace 1 provided with a high voltage supply 2 connected to two electrodes of plates 4 each immersed in a plastic reservoir 6 filled with a buffer solution, said platinum electrodes 4 being connected to the power supply. 2 via high voltage cables 5; the two tanks are connected to each other by a silica glass capillary 3, each end of which is immersed in an aqueous solution of electrolytes contained in the tanks 6.
  • the inner surface of the capillary 3 is covered with a PNIPAM-type polymer coating;
  • FIG. 3 represents the infrared (IR) spectrum of a PNIPAM-based polymer coating grafted onto a silica surface on which the absorbance expressed in arbitrary units is a function of the wavelength expressed in cm -1 ;
  • FIG. 4 represents the evolution of the advance contact contact angle of water as a function of temperature on a grafted surface with a silane layer (open triangles) and on a grafted surface with a polymer coating based on PNIPAM (filled diamonds);
  • FIG. 5 represents the speed of the electroosmotic flow expressed in cm 2 / Vs as a function of the temperature expressed in ° C., in an untreated silica glass capillary (solid diamonds), in a silica glass capillary whose surface internal comprises a polyacrylamide polymer coating (solid squares) and in a silica glass capillary whose inner surface comprises a polymer coating based on PNIPAM (solid triangles).
  • EXAMPLE 1 PREPARATION OF A SILICA GLASS CAPILLARY COMPRISING AN INTERNAL SURFACE COVERED WITH A POLYMERIC COATING OF THE PNIPAM TYPE
  • This example as well as FIG. 1, relate to the application of a PNIPAM-type polymer coating on the inner surface of a silica glass electrophoresis capillary (capillary sold by Polymicro Technology, L.LC. .) with an internal diameter of 100 ⁇ m and an external diameter of 365 ⁇ m, as well as its use to vary the viscosity of an aqueous electrolyte solution within the electrical double layer by external stimulation and thus control the electroosmotic flow.
  • PNIPAM-type polymer coating on the inner surface of a silica glass electrophoresis capillary (capillary sold by Polymicro Technology, L.LC. .) with an internal diameter of 100 ⁇ m and an external diameter of 365 ⁇ m, as well as its use to vary the viscosity of an aqueous electrolyte solution within the electrical double layer by external stimulation and thus control the electroosmotic flow.
  • the polymer coating was synthesized from monomers of N-isopropylacrylamide (NIPAM) sold under the reference 415324 by Sigma-Aldrich.
  • NIPAM N-isopropylacrylamide
  • the capillary was washed with sodium hydroxide solution (0.2M) for 2 hours, then with hydrochloric acid (0.2 M) for 2 hours also and finally with deionized water (sold under the trademark MiIiQ by the company Millipore) for 30 minutes.
  • the capillary was then dried in an oven at a temperature of 80 ° C for 2 hours, rinsed with ethanol for 30 minutes and then with trichlorethylene for 30 minutes.
  • the inner surface of the capillary was then silanized with a 10% (w / v: w / v) solution of 3- (trimethoxysilyl) propyl methacrylate (sold as M6514 by Sigma-Aldrich) in trichlorethylene for 2 hours.
  • NIPAM sodium metabisulfite
  • the electroosmotic flow in the capillary thus obtained was measured on an electrophoresis apparatus capillary sold under the trade name P / ACE MDQ® by the company Beckmam-Coulter.
  • Acetone has been used as a neutral marker for the measurement of electroosmotic flow; this compound can be detected by UV absorbance at a wavelength of 280 nm.
  • the total length of the capillary in the device P / ACE MDQ ® was 33 cm and the distance between the injection point and the detection point was 20 cm.
  • the electroosmotic flow was measured according to the method known as the "three-peak method" (Williams, BA, Vigh, G., Anal Chem, 1996, 68, 1174-1180), for temperatures below 30 ° C. 3 peaks method is usually used to measure weak electroosmotic flow. To measure the electroosmotic flow at temperatures above 30 ° C, a single peak method was used, ie by measuring the acetone marker migration time between the injection point and the point detection for a given electrical intensity.
  • This example relates to the control of the electroosmotic flow in a microfluidic device according to the invention comprising a silica glass capillary (capillary sold by Polymicro Technology, L.LC., internal diameter: 76 ⁇ m, external diameter of 365 ⁇ m). length 6 cm) thanks to the use of polymeric coatings on the inner surface of the capillary that allow to vary the viscosity of the solution within the electrical double layer after external activation.
  • a silica glass capillary capillary sold by Polymicro Technology, L.LC., internal diameter: 76 ⁇ m, external diameter of 365 ⁇ m). length 6 cm
  • the capillary was washed with sodium hydroxide solution (0.5 M) for 2 hours, then hydrochloric acid (0.5 M) for 2 hours, deionized water for 30 minutes and finally ethanol for 30 minutes. minutes.
  • the capillary was then dried in an oven at a temperature of 80 ° C. for 2 hours and then rinsed with ethanol for 30 minutes.
  • the inner surface of the capillary was then silanized for 2 hours with an ethanol solution containing 10% w / v (0.4 M) of 3- (trimethoxysilyl) propyl methacrylate and 10% w / v (0.45 M).
  • 3-aminopropyltriethoxysilane sold under the reference 09324 by Sigma-Aldrich.
  • the capillary was washed with ethanol (30 minutes) and dried in an oven at a temperature of 0 ° C for 30 minutes. 5 ml of a 5% w / v (0.44 M) NIPAM solution in deionized water was then prepared and saturated with nitrogen for 3 hours.
  • NIPAM N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine
  • this device consists of a furnace 1 sold under the trade name Salvis-Lab ® VACUCENTER by the company Salvis (Switzerland) equipped with a high voltage power supply 2 sold under the reference HVS448 3000D by the LabSmith company connected to two platinum electrodes 4 sold by the company GoodFellow (USA) each immersed in a plastic reservoir 6 of the Eppendorf type with a capacity of 1.5 ml and filled with a buffer solution, said platinum electrodes being connected to the power supply 2 by means of high voltage cables 5; the two tanks are interconnected by a silica glass capillary 3 having an inner diameter of 76 ⁇ m, an outer diameter of 365 ⁇ m and a length of 5 cm (Polymicro Technology LLC, USA), each end of which plunges into the buffer solution contained in the tanks 6.
  • the capillary 3, the buffer solution tanks 6 and the electrodes 4 were enclosed in the oven 1 in order to be able to work at given temperatures (at 60 ° C. and at 20 ° C.).
  • the inlet buffer tank was filled with a weakly concentrated citric acid buffer (25 mM) whose pH was adjusted to 3 with sodium hydroxide, while the outlet buffer tank and the capillary 3 were filled with a buffer highly concentrated citric acid (50 mM) whose pH was adjusted to 3 with sodium hydroxide.
  • the inner wall of the capillary 3 was found positively charged at this pH given the presence of 3-aminopropyl triethoxy silane grafted to the surface.
  • ⁇ E o x / tE (eq.8) in which X is the length of the capillary in cm, t is the time of replacement of the highly concentrated citric acid solution (50 mM) with the weakly concentrated citric acid solution (25 mM) in the capillary and E is the intensity of the electric fields.
  • a silica surface (1.5 ⁇ 7.5 cm) was covered with a PNIPAM polymer coating according to the protocol described above in Example 2, step 1).
  • IR Infra-Red
  • a spectrometer sold under the trade name Equinox® IFS 55 FT-IR by Bruker Optics Inc. (USA, Billerica, MA), adapted to the laboratory.
  • This spectrometer makes it possible to record IR spectra in multi-internal reflection (MIR).
  • MIR multi-internal reflection
  • the spectrum obtained is represented in the appended FIG. 3, in which the absorbance (in arbitrary units) is expressed as a function of the wavelength (in cm -1 ).
  • EXAMPLE 4 PREPARATION OF GLASS PLATES COMPRISING A SURFACE COVERED WITH A POLYMERIC COATING OF PNIPAM
  • the surface of a glass plate (dimension 1 ⁇ 2 cm) of a coating of PNIPAM was coated according to the protocol described above in Example 2, step 1).
  • the glass plate was washed with ethanol (30 minutes) and oven dried at a temperature of 110 ° C for 30 minutes.
  • a drop of water was deposited on each of the glass plates thus prepared and dynamic contact angle measurements were performed using a device for manually depositing the drops and measuring the contact angles. sold under the trade name DIGIDROP® by GBX (France).
  • the purpose of this example is to compare the variations of the electroosmotic flows in several capillaries:
  • Capillary A control capillary, non-functionalized
  • - Capillary B capillary whose inner surface is covered with a coating of polyacrylamide type
  • Capillary C capillary according to the invention, that is to say whose inner surface is covered with a polymer coating of PNIPAM.
  • PNIPAM polymer coating of PNIPAM
  • these capillaries were washed with a 0.2 M sodium hydroxide solution for 30 minutes and then with a 0.2 M hydrochloric acid solution for 30 minutes and finally with deionized water (sold under the trade name MiIiQ by the company Millipore) also for 30 minutes.
  • the capillaries were then dried in an oven at a temperature of 80 ° C. for 2 hours and then rinsed with ethanol for 30 minutes.
  • Capillary A did not undergo any additional treatment.
  • the internal surface of the capillary C was then silanized and covered with a PNIPAM coating according to the protocol described above in Example 2, step 1.
  • the inner surface of the capillary B was silanized and coated with a polyacrylamide coating according to the same protocol as that used for the capillary C, but using acrylamide in place of the NIPAM.
  • the measurements of the speed of the electroosmotic flow in the capillaries A, B and C were carried out according to the method described above in Example 2 (2- Measurement of the electroosmotic flow).
  • capillary A the speed of the electroosmotic flow increases linearly as a function of temperature.
  • capillary B which does not conform to the present invention because it has a polyacrylamide-type coating, no variation in the electroosmotic flow is observed as a function of temperature, the flow being non-existent.
  • the capillary C according to the present invention, that is to say having a PNIPAM internal coating, it is found that the electroosmotic flow is non-existent up to a temperature of approximately 30 ° C., and that from this point, the rise in temperature causes a very rapid increase in the electroosmotic flow.
  • the presence of the PNIPAM polymer coating on the inner wall of the capillary C makes it possible to block and then to vary the electroosmotic flow, which is not possible in the capillaries A and B not forming part of the invention.

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Abstract

La présente Invention se rapporte au domaine de la microfluidique et en particulier à celui de l'électrophorèse sur dispositif micro- ou nanofluidique. Elle concerne plus particulièrement l'utilisation d'un revêtement polymère réactif apte àà subir une séparation de phase sous l'influence d'une stimulation externe de nature chimique ou physique, pour moduler les flux électrocinétiques (flux électroosmotique et électrophorétique pendant une électrophorèse par exemple) dans un dispositif miniature micro- ou nanofluidique, une méthode pour faire varier les flux électrocinétiques au sein d'un tel dispositif en mettant en œuvre ledit revêtement, ainsi que les dispositifs micro ou nanofluidiques comportant au moins un canal ou un capillaire dont la surface interne est recouverte au moins en partie par un tel revêtement.

Description

UTILISATION DE POLYMERES REACTIFS POUR MODULER ET CONTROLER LES FLUX ELECTROCINETIQUES DANS UN DISPOSITIF
MICRO- OU NANOFLUIDIQÛE
La présente Invention se rapporte au domaine de la microfluidique et en particulier à celui de l'électrophorèse sur dispositif micro- ou nanofluidique.
Elle concerne plus particulièrement l'utilisation d'un revêtement polymère réactif apte à subir une séparation de phase sous l'influence d'une stimulation externe, pour moduler les flux électrocinétiques (flux électroosmotique et électrophorétique pendant une électrophorèse par exemple) dans un dispositif micro- ou nanofluidique, une méthode pour faire varier les flux électrocinétiques au sein d'un tel dispositif en mettant en œuvre ledit revêtement, ainsi que les dispositifs micro- ou nanofluidiques comportant au moins un canal ou un capillaire dont la surface interne est recouverte au moins en partie par un tel revêtement.
Lors de la réalisation d'électrophorèses, le mouvement et la séparation subséquente d'objets chargés est provoquée par l'application d'un champ électrique. A l'origine, les électrophorèses étaient réalisées sur des supports non convectifs tels que du papier poreux ou bien des gels de polyacrylamide ou d'agarose.
Plus récemment, cette technique de séparation puissante a adopté de nouvelles géométries qui ont conduit à la création de l'électrophorèse capillaire ou sur micropuces (Grossman, P.D. et al, "Capillary Electrophoresis, Theory and Practice",
1992, Académie Press, San Diego).
L'électrophorèse capillaire est une méthode analytique de séparation de molécules chargées ou neutres sous l'influence d'un champ électrique à l'intérieur d'un capillaire. Une évolution de cette technique est de réaliser la séparation sur micropuce ("microchip"), ce qui permet d'accélérer drastiquement les temps d'analyse et de les réduire à quelques secondes. Lorsque des objets chargés, tels que des biomolécules, sont dissous dans des solutions salines, la concentration en ions près de la surface desdits objets chargés, c'est-à-dire à l'interface liquide-solide, est perturbée
(attraction des contre-ions vers la surface et répulsion des co-ions). Les contre-ions se trouvant très proches des molécules chargées s'adsorbent à leur surface et forment ce qu'il est convenu d'appeler une couche de Stern. Cette couche est statique par nature et son épaisseur, également connue sous le nom de longueur de Bjerrum (IB) répond à l'équation (eq. 1) suivante :
1B = e2 / 4πεbε0kBT (eq. 1) dans laquelle e est la charge d'un électron, So est la permittivité du vide, Sb est la constante diélectrique du liquide, kβ est la constante de Boltzman et T est la température absolue. Plus loin de la surface, les contre-ions, bien qu'encore attirés par la surface, sont plus mobiles et forment ce qu'il est convenu d'appeler une couche diffuse. L'équilibre entre l'ordonnancement des forces électrostatiques et la répartition aléatoire des forces thermiques conduit à la formation d'une double couche électrique (également connue sous le nom de couche de Debye-Hϋckle) au-delà de laquelle la charge de l'objet est neutralisée. La chute de la charge de surface ( ψ) est décrite, pour les objets faiblement chargés, par l'équation (eq. 2) suivante (équation de Debye- Huckle) :
Figure imgf000003_0001
dans laquelle K"1 est la longueur ou l'épaisseur de la double couche électrique (également connue sous le nom de longueur Debye) et ψz est la charge de surface (ou potentiel zêta). La longueur Debye est la plus importante échelle de longueur dans le domaine de l'électrocinétique. Elle est inversement proportionnelle à la racine carrée de la concentration en électrolyte au sein de la solution (K"1 ≈ c"I/2). K'1 est de l'ordre de quelques nanomètres dans les tampons physiologiques standards et peut atteindre des valeurs allant jusqu'à 1 μm dans l'eau pure à pH 7.
Lorsqu'un champ électrique (E) est appliqué à une solution saline, renfermant des molécules chargées (avec une charge g et un diamètre R), la force électrique agit sur les molécules chargées, qui vont migrer vers l'électrode de charge opposée (flux électrophorétique). La vélocité totale (v) des molécules chargées est proportionnelle à la force électrique appliquée et inversement proportionnelle aux forces de frictions entre les molécules chargées et les contre-ions solvatés. Etant donné que la solution est chargée uniquement à l'endroit de la double couche électrique (en dehors de cette double couche électrique, la solution électrophorétique est neutre), toutes les forces de friction se dissipent dans cette région. Par conséquent, l'épaisseur de la double couche électrique influence de manière importante la vélocité des molécules chargées.
Pour les petites molécules (K"1 » R), la mobilité électrophorétique (μej) est calculée par l'équation (eq. 3) suivante : μei = v/E = q/6πηR (eq. 3) dans laquelle η est la viscosité de la solution aqueuse d'électrolytes.
De façon contraire, la mobilité électrophorétique devient indépendante de la taille des molécules chargées dans le cas de molécules de taille supérieure (K'1 « R) car la force électrique et la force de friction sont toutes deux proportionnelles à la taille des molécules. Dans ce cas, la mobilité électrophorétique est calculée par l'équation (eq. 4) suivante : μel = εbεoψz/η (eq. 4)
Par conséquent, les molécules de grosse taille uniformément chargées, telles que par exemple les oligonucléotides de plus de 15 mers, l'ADN, les protéines chargées de façon uniforme et les polysaccharides, migrent, dans les champs électriques à des vitesses qui ne dépendent pas de leur taille.
Par ailleurs, la dispersion (σ2) de l'échantillon dans la solution d'électrophorèse est gouvernée par une simple diffusion et peut être calculée par l'équation (eq. 5) suivante : σ2 = 2Dt (eq. 5) dans laquelle D est le coefficient de diffusion moléculaire et t est le temps. Il doit en particulier être noté que lorsque la conductivité de la zone dans laquelle l'échantillon a été injecté est très différente de la conductivité de la solution tampon utilisée, la dispersion de l'échantillon est alors gouvernée par ce que l'on appelle la dispersion électrocinétique qui est différente de la simple diffusion. Cette dispersion électrocinétique est caractérisée par des pics d'échantillons asymétriques.
Pendant l'électrophorèse, on observe également un mouvement de la solution électrophorétique (solution aqueuse d'électrolytes). Ce mouvement s'appelle le flux électroosmotique (FEO) (ou en anglais "Electro-Osmotic Flow" : EOF ou "plug-like flow"). Cet EOF est caractérisé par un profil de vélocité plat et une dispersion de l'échantillon purement diffusive. Lorsque qu'un électrolyte est adjacent à la surface, cette surface peut être chargée par l'intermédiaire de l'ionisation des groupements chimiques liés de façon covalente sur ladite surface (cas par exemple des surfaces de verres qui produisent des groupements de surface de type SiOH et qui relarguent des protons en présence d'eau) ou par l'intermédiaire d'ions adsorbés. Dans les deux cas, les surfaces se retrouvent chargées alors que la concentration en ions près de la surface se retrouve perturbée, i.e. les contre-ions sont attirés vers la surface et les co-ions en sont repoussés. Comme dans le cas des molécules chargées en solutions salines décrit ci-dessus, la charge de surface conduit à la formation d'une double couche électrique d'une certaine épaisseur, également appelée épaisseur de Debye, K"1, pouvant être calculée selon l'équation (eq. 6) suivante :
K 1 = (εbε0kBT/2cz2e2)1/2 (eq. 6) dans laquelle, C est la concentration en électrolytes, Z est la charge des ions de l'électrolyte et e est la charge d'un électron. Pour les solutions diluées (Sb - 78,49), à
25°C, cette équation peut être exprimée comme suit (eq. 7) : K 1 = 0.304 z C"1/2 (eq. 7) dans laquelle C est la concentration totale en électrolytes exprimée en mol/1 et K est exprimé en nm.
Lorsqu'un champ électrique Eext est appliqué dans un canal ou dans un capillaire, comme c'est le cas par exemple au cours d'une électrophorèse, il s'établit une force électrique qui agit sur la charge de volume dans la couche de Debye constituée d'un excès de contre-ions solvatés. En dehors de cette région, le liquide est électriquement neutre et la force du champ électrique appliqué aux ions s'annule.
Cependant, étant donné qu'il existe une force de champ dans la double couche électrique, le champ électrique local qui est tangent à la surface du canal génère une force s'exerçant dans la masse du fluide, ladite force induisant un cisaillement et générant un mouvement du liquide à l'intérieur du canal. Ce mouvement de liquide est appelé électroosmose. La vitesse du flux électroosmotique est égale à zéro à la surface • du canal et augmente à proximité de la double couche électrique et devient constante au delà de cette double couche. La vitesse du flux électroosmotique est proportionnelle à l'intensité du champ électrique et au potentiel de surface (potentiel zêta) et inversement proportionnelle à la viscosité du liquide au sein de la double couche électrique ; elle ne dépend pas du diamètre du canal aussi longtemps que le diamètre d est beaucoup plus grand que l'épaisseur de la double couche électrique (J » K ). Bien évident, ceci s'applique à la plupart des systèmes microfluidiques dans lesquels le diamètre des canaux ou des capillaires est habituellement de l'ordre du micron alors que l'épaisseur de la couche de Debye est de l'ordre du nanomètre.
Cependant, l'électrophorèse capillaire ou sur micropuce comporte un certain nombre d'inconvénients non négligeables. Elle est en particulier très sensible à la fois à la chimie de la solution et à la chimie de la surface du capillaire ou de la micropuce. Ceci a souvent pour conséquence de conduire à des changements de flux au cours de l'analyse qui compromettent la reproductibilité et la quantification. Dans le cas des méthodes analytiques nécessitant la réalisation de plusieurs étapes intégrées au sein d'un même dispositif micro- ou nanofluidique, des changements incontrôlés et inattendus du flux électroosmotique peuvent conduire à l'échec de la méthode.
Il est donc nécessaire de pouvoir réguler de façon très précise le flux électroosmotique au sein de dispositifs analytiques micro- ou nanofluidiques pour en compenser les variations non désirées et en particulier pour empêcher sa réduction.
Le contrôle de l'électroosmose est donc une tache importante, notamment lors de séparations électrophorétiques, dans la mesure où la magnitude et la direction du flux électroosmotique affectent la mobilité propre des analytes dans le système. Ainsi que cela a amplement été expliqué précédemment, le flux électroosmotique est en effet influencé par la présence de la couche de Debye présente à l'interface solide/liquide et est dépendant des propriétés physico-chimiques de la surface et de la composition en électrolytes. L'eau est le solvant habituellement utilisé en électrophorèse capillaire (EC). Les caractéristiques du flux électroosmotique dans les capillaires en verre de silice habituellement utilisés dans ces systèmes aqueux sont bien connues. Le flux électroosmotique (FEO) dans les capillaires en verre de silice est dirigé vers la cathode et la magnitude dépend du pH du tampon et de sa concentration. Il est possible de faire varier le FEO par addition de tensioactifs pour l'électrolyte. Cependant, cette approche présente un certain nombre d'inconvénients dans la mesure où elle nécessite des changements de la composition du de la solution aqueuse d'électrolytes qui ne sont pas toujours permis, ni réversibles ; elle est également difficile à mettre en œuvre de façon dynamique au cours de l'analyse. Une des manières les plus efficaces pour faire varier le FEO dans les systèmes micro- ou nanofluidiques, et en particulier dans les dispositifs d'électrophorèse capillaire, est la modification chimique de la surface des capillaires par l'application de revêtements de surface appropriés. De nombreux rapports font en effet état d'une moindre réduction du flux électroosmotique ainsi que d'une diminution de l'adsorption des solutés sur les parois internes des capillaires grâce à l'utilisation de divers revêtements de surface de nature chimique. Les revêtements de nature chimique sont souvent constitués de brosses de polymères hydrophiles, neutres ou chargés. Pour éliminer le FEO en EC, on emploie généralement un revêtement constitué de brosses de polymères neutres. De telles brosses de polymères augmente de façon significative la viscosité de la solution dans la double couche électrique et couple de façon hydrodynamique cette double couche électrique avec le reste de la solution.
C'est ainsi qu'il a déjà été proposé, pour diminuer le FEO, d'utiliser un polyacrylamide linéaire non réticulé lié aux parois du capillaire par l'intermédiaire d'un réactif de type organosiloxane (Hjertén S., J. Chromatogr., 1985, 347, 191-198). Cependant, les brosses de polymères employées et étudiées par cet auteur sont passives et ne répondent pas à des stimulations externes telles que la lumière, la température ou le pH.
Toujours dans la même ligne, d'autres auteurs ont préconisé l'emploi de brosses de polymères pour diminuer le FEO. Par exemple, Bruin G.J.M. et al. (J. Chromatogr., 1989, 471, 429-436) ont utilisé des revêtements fins à base de polyéthylèneglycol (PEG) de façon à diminuer, de façon partielle, le FEO et pour minimiser l'adsorption des protéines sur les parois des capillaires. Ils indiquent cependant qu'un tel revêtement ne permet pas de supprimer totalement le FEO ni l'adsorption des protéines, notamment lorsque l'EC est réalisée à de hautes valeurs de pH (pH > 5).
Nashabed W. et El Rassi Z. (J. Chromatogr. A, 1991, 559, 367-383) décrivent la préparation de capillaires de verre de silice comportant des fonctions polyéther hydroxylées liées à la surface interne des parois et leur utilisation pour la séparation des protéines par EC. Selon une première approche les revêtements hydrophiles sont constitués de deux couches : une sous-couche de glycéropropylpolysiloxane (liée de façon covalente à la surface interne du capillaire) et une couche de surface de type polyéther. Selon une seconde approche, la paroi du capillaire est revêtue avec des chaînes de polyéther polysiloxane attachées de façon covalente à la surface interne du capillaire. Les auteurs indiquent que ces revêtements permettent de réduire l'adsorption des solutés sur les parois, tout en étant stables et dotés de propriétés séparatives, conduisant ainsi à des résultats fiables et reproductibles.
D'autres auteurs ont préconisé de modifier la surface interne des capillaires par des revêtements polymères passifs obtenus à partir :
- de polymères époxy liés de façon covalente à la silice par l'intermédiaire d'un bras glycérylpropylsilane (revêtement limitant les interactions avec les protéines par encombrement stérique dû à la présence des groupements silanol) ;
- de polyvinylméthylsiloxanediols réticulés puis recouverts d'une couche de polyacrylamide linéaire fixée par l 'intermédiaire de doubles liaisons sur le siloxanediol ; le polyacrylamide étant finalement réticulé avec du formaldéhyde (revêtement neutre statique) ;
- de polyvinylalcools (PVA) permettant de réaliser des revêtements permanents, stables sur une large gamme de pH et utilisables pour la séparation des glycoprotéines ; - d'homopolymères simplement adsorbés sur les surfaces internes des capillaires tels que le PVA, le polydiméthylacrylamide (PDMA), les polyéthylèneoxydes (PEO) et la polyvinylpyrrolidone (PVP) et conduisant à des couches polymères à structure fractale ; le polymère le plus performant pour éliminer le FEO étant le PDMA (Madabhushi R.S., Electrophoresis, 1998, 19, 224-230). L'ensemble de ces polymères présente néanmoins l'inconvénient de conduire à des revêtements passifs, c'est-à-dire pour lesquels il n'est pas possible de faire varier les propriétés sous l'action d'une stimulation externe.
Depuis plusieurs années, différents types de surfaces greffées par des brosses de polymères réactifs, c'est-à-dire capables de réagir et de se modifier en réponse à un stimulus externe, ont été étudiés. Ces brosses de polymères réactifs peuvent par exemple être obtenues à partir de polymères de type poly (N-isopropyl acrylamide) (PNIPAM) qui subissent une transition de phase (pelote-globule) à leur température de solution critique la plus basse (en anglais "lower critical solution température" : LCST) qui est de 32 °C ± 1 à 2 °C environ à l'état pur dans l'eau (Heskins, M. et al, J. Macromol. Sci. Chem., 1968, A2, 1441 et Schild, H.G., Prog. Polym. Sci, 1992, 17, 163). De ce fait, les surfaces revêtues par un tel polymère ont des propriétés dépendantes de la température telles que la mouillabilité et l'épaisseur du revêtement. Il a cependant été démontré que le comportement des PNIPAM greffés sur des surfaces en fonction de la température (en particulier la séparation de phase) est sensiblement différent du comportement de ces mêmes polymères en solutions. Les polymères greffés sont souvent allongés lorsque la densité de greffage est suffisamment élevée.Les .surfaces modifiées par un revêtement à base de PNIPAM ont été utilisées pour des applications variées. Par exemple, des billes de silice modifiées par un copolymère contenant du PNIPAM ont été utilisées comme phase stationnaire pour des séparations chromatographiques en phase liquide à température régulée (Kanazawa, H. et al, Anal. Chem., 1996, 68, 100-105). Des particules magnétiques fonctionnalisées par du PNIPAM ont été utilisées dans des expériences d'adsorption et de désorption contrôlées de protéines (Elaissari A. et al, Magnetism and Magnetic Materials, 2001, 225, 151-155). Des surfaces planes comportant des polymères de type PNIPAM greffés ont également été utilisées comme support de culture cellulaire (Aoki T. et al, J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 1995, 7, 539-550) et en ingénierie tissulaire (Yamamoto M. et al, Tissue Eng., 2001, 7, 473-480).
Il n'existe cependant à ce jour aucun dispositif micro- ou nanofluidique dans lequel il est possible de faire varier et de contrôler le flux électrocinétique de façon simple et réversible.
C'est donc afin de remédier à l'ensemble des inconvénients des dispositifs micro- et nanofluidiques actuellement disponibles et de pourvoir à une solution technique permettant de réguler facilement, rapidement, et de façon réversible les flux électrocinétiques pendant la réalisation d'une analyse dans un dispositif micro- ou nanofluidique que les Inventeurs ont mis au point ce qui fait l'objet de la présente Invention. Au sens de la présente Invention, on entend par "régulation", toute augmentation, diminution ou disparition des flux électrocinétiques, du point de vue statique et dynamique, spatial et temporel. Les Inventeurs ont en particulier constaté, de façon surprenante que dans certaines conditions, le greffage d'un revêtement sur au moins une partie de la surface interne d'un canal de géométrie variable ou d'un capillaire d'un dispositif micro- ou nanofluidique, permet de répondre à ce problème technique lorsque ledit revêtement est obtenu à partir de polymères flexibles aptes à subir une séparation de phase en solution aqueuse (séparation réversible : transition pelote-globule).
Cette solution technique est à la base de la présente Invention.
La présente Invention a donc pour premier objet l'utilisation d'un revêtement polymère réactif, greffé sur au moins une partie de la surface interne d'un canal ou d'un capillaire d'un dispositif micro- ou nanofluidique contenant au moins une solution aqueuse d'électrolytes, ladite surface comportant des groupements chimiques chargés électriquement formant une double couche électrique à l'interface liquide-solide, ledit revêtement ayant les caractéristiques suivantes : a) il est constitué d'une couche de polymères flexibles aptes à subir une séparation de phase (transition pelote-globule) en solution aqueuse sous l'influence d'une stimulation externe de nature physique ou chimique, b) les polymères sont greffés de façon covalente sur ladite surface par l'une seulement de leurs extrémités, pour moduler, de façon réversible, et contrôler les flux électrocinétiques au sein dudit dispositif par variation de la viscosité de la solution aqueuse d'électrolytes uniquement au sein de la double couche électrique sous l'influence d'une activation externe de nature chimique ou physique.
Les Inventeurs ont en effet démontré que sous l'influence d'une activation externe de nature chimique ou physique, l'épaisseur de la couche de polymères constituant le revêtement greffé peut varier en raison d'une séparation de phase (transition pelote-globule) des polymères qui deviennent plus ou moins solubles dans la solution aqueuse d'électrolytes. Le changement d'épaisseur du revêtement polymère fait varier la viscosité de la solution de la double couche électrique présente à l'interface liquide-solide du dispositif micro- ou nanofluidique mais ne fait pas varier la viscosité de la solution aqueuse d'électrolytes en dehors de cette zone. Ce changement de viscosité de la solution à proximité de la surface interne uniquement (de l'ordre de quelques nanomètres) permet ainsi de faire varier de façon significative les propriétés électrocinétiques du dispositif ou celles des molécules chargées.
En particulier, une diminution de la viscosité de la solution aqueuse d'électrolytes présente au sein de la double couche électrique située à l'interface liquide-solide du dispositif micro- ou nanofluidique (faible solubilité des polymères) entraîne une augmentation du flux électrocinétique. Dans ce cas, les polymères sont dits "activés", l'épaisseur du revêtement polymère est inférieure à l'épaisseur de la double couche électrique présente à l'interface liquide-solide du dispositif micro- ou nanofluidique, conduisant ainsi à une augmentation du flux électrocinétique. Inversement, une augmentation de la viscosité de la solution aqueuse d'électrolyte présente au sein de la double couche électrique située à l'interface liquide-solide du dispositif micro- ou nanofluidique (grande solubilité des polymères conduisant à un revêtement polymère sous la forme d'une brosse de polymères gonflés) entraîne une diminution du flux électrocinétique. Dans ce cas, les polymères sont dits "inactivés", l'épaisseur du revêtement polymère est supérieure à l'épaisseur de la double couche électrique présente à l'interface liquide-solide du dispositif micro- ou nanofluidique, conduisant ainsi à une diminution du flux électroosmotique.
Au sens de la présente Invention, "greffé sur au moins une partie de la surface interne" signifie que le greffage des polymères peut être réalisé sur une surface interne ayant une superficie inférieure ou égale à la superficie totale de la surface interne du capillaire.
Selon l'Invention, l'épaisseur de la double couche électrique présente à l'interface du dispositif d'électrophorèse est généralement comprise entre 0,1 nm et 1 μm environ, de préférence entre 0,5 et 10 nm environ et encore plus préférentiellement entre 1 et 5 nm environ.
La surface interne du dispositif peut être plane, concave ou micro- ou nanostructurée et peut être constituée de tout matériau solide dont la surface peut être fonctionnalisée par des groupements chimiques ionisables en solution aqueuse. Parmi de tels matériaux, on peut notamment citer le verre, le quartz, la silice et les matériaux polymères tels que les plastiques.
Le canal du dispositif peut avoir une géométrie variable. Selon une* forme de réalisation préférée de l'Invention, le canal et le capillaire ont des dimensions telles que leur plus petite largeur ou leur diamètre sont supérieurs à l'épaisseur de la double couche électrique. Cette dimension est de préférence inférieure à 1 mm environ, plus préférentiellement inférieure ou égal à 0,5 mm environ et encore plus préférentiellement inférieur ou égal à 0,1 mm environ. Les groupements chimiques présents à la surface interne du canal ou du capillaire sont chargés électriquement car ils sont choisis parmi les groupements chimiques ionisables en présence d'une solution aqueuse. Parmi de tels groupements, on peut notamment citer les groupements silanol (-Si-OH) lorsque la surface interne est un oxyde de silice hydraté, du quartz ou du verre ; les aminés primaires, secondaires ou tertiaires ; les groupements sulfate, sulfonate, phosphonate et carboxylique. C'est la présence de ces groupements chargés sur la surface interne du dispositif qui conduit à la formation de la double couche électrique à l'interface liquide-solide.
Les polymères utilisables selon l'Invention sont greffés de façon covalente sur la surface interne dudit canal ou dudit capillaire, de préférence par l'intermédiaire de groupements chimiques choisis parmi les groupements silanol (-Si-OH), vinyle (CH-CH2), carboxyle (-COOH), amino (-NH2), époxy (-CH-(O)CH2), oxyamine (-0-NH2), thiol (-SH), halogénure (-Br ou -Cl), etc.
Selon une forme de réalisation particulière de l'Invention, la surface interne du canal ou du capillaire peut être modifiée par au moins deux types de groupements chimiques de nature différente. Dans un tel cas, le premier type de groupements chimiques peut être utilisé pour le greffage covalent des polymères constituant le revêtement réactif, alors que le deuxième type de groupements chimiques peut servir à charger électriquement la surface interne du canal ou du capillaire et éventuellement à fixer des molécules telles que des molécules sondes de nature biologique qui ne sont pas sensibles à l'activation chimique ou physique qui sera utilisée pour activer le revêtement polymère. Dans ce cas, lorsque les polymères sont activés et adoptent une conformation en globule, les molécules sondes deviennent accessibles pour les molécules cibles éventuellement présentes dans la solution aqueuse d'électrolytes alors qu'elles ne le sont pas lorsque les polymères réactifs ne sont pas activés puisqu'elles sont, en quelque sorte, masquées dans l'épaisseur du revêtement polymère (brosse de polymères). Selon une autre forme de réalisation de l'Invention, la densité de greffage des chaînes de polymère constituant le revêtement réactif est inférieure à la densité des groupements chimiques de surface, et ce, quelle que soit leur nature. Dans ce cas, des groupements chimiques restent libres après le greffage du revêtement polymère.
Ainsi que cela a été expliqué précédemment, les polymères utilisables conformément à l'Invention répondent à une stimulation externe par une séparation de phase. Ainsi, lorsque les polymères sont inactivés, l'épaisseur du revêtement polymère réactif est supérieure à celle de la double couche électrique. Dans ce cas, la viscosité de la solution aqueuse d'électrolytes au sein de la double couche électrique est supérieure à celle de la solution aqueuse d'électrolyte en dehors de cette double couche et tend vers l'infini. Dans ces conditions, lorsqu'un champ électrique est appliqué au dispositif, le- flux électrocinétique de la solution aqueuse d'électrolytes (flux électroosmotique) tend vers zéro. Inversement, lorsque les polymères sont activés, l'épaisseur du revêtement polymère est inférieure à celle de la double couche électrique (polymères en conformation globulaire). Dans ce cas, la viscosité de la solution aqueuse d'électrolytes au sein de la double couche électrique est égale ou sensiblement égale à celle de la solution aqueuse d'électrolytes en dehors de cette double couche. Dans ces conditions, lorsqu'un champ électrique est appliqué au dispositif, le flux électroosmotique de la solution aqueuse d'électrolytes est différent de zéro et proportionnel au potentiel de surface (potentiel zêta).
Selon l'Invention, la densité de greffage des polymères formant le revêtement est telle que la distance séparant les points d'ancrage de deux chaînes polymère sur ladite surface est supérieure, égale ou inférieure au rayon de giration desdites chaînes.
Selon une forme de réalisation particulière de l'Invention, la densité de greffage des polymère est telle que les polymères se présentent sous la forme d'un revêtement discontinu et hétérogène lorsque les polymères sont à l'état effondré (polymères "activés") et forment des trous permettant aux charges de surface d'être exposées à la solution aqueuse d'électrolytes. Au sens de la présente Invention, un polymère est dit "flexible" lorsque la longueur théorique de sa chaîne L est supérieure à sa longueur rémanente.
Les polymères pouvant former le revêtement utilisable selon l'Invention peuvent être linéaires ou ramifiés. Ils sont de préférence choisis parmi les polymères linéaires.
Les polymères utilisables conformément à l'Invention peuvent être classés en fonction de la nature de l'activation à laquelle ils sont sensibles d'un point de vue conformationnel (chimique : pH, force ionique par exemple ou physique : lumière, température, champ magnétique ou électrique). Selon une première forme de réalisation de l'Invention, le revêtement polymère est constitué de polymères choisis parmi les polymères sensibles à une activation externe de nature physique.
Parmi de tels polymères, on peut premièrement citer les polymères sensibles aux variations de température, c'est-à-dire dont la solubilité, et par conséquent la conformation tridimensionnelle, varient en fonction des variations de température. Au sein de cette famille de polymères, figurent notamment les polymères de type acrylamide et méthacrylamide dans lesquels on peut facilement faire varier Ia LCST en fonction de la nature des groupements alkyles et parmi lesquels on peut citer le poly(N-zsopropyl acrylamide) PNIPAM ayant une LCST de 320C environ, le poly(N,N'-méthylpropylacrylamide) de LCST = H0C environ, le poly(N-propylacrylamide) de LCST = 220C environ, le poly(N,N'-méthyléthylacrylarnide) de LCST = 57°C environ, le poly(N-propyl- méthacrylamide) de LCST = 28°C environ, le poly(N,N'-/s0propylméthacrylamide) de LCST = 45°C environ ; les copolymères résultant de la copolymérisation de monomères choisis parmi le N-isopropyl acrylamide, le N,N'-méthylpropyl- acrylamide, le N-propylacrylamide, le N,N'-méthyléthylacrylamide, le N-propyl- méthacrylamide et le N,N'-isopropylméthacrylamide ; les copolymères résultant de la copolymérisation d'un monomères choisi parmi le N-isopropyl acrylamide, le N,N'-méthylpropylacrylamide, le N-propylacrylamide, le N,N'-méthyléthyl- acrylamide, le N-propylméthacrylamide et le N,N'-isopropylméthacrylamide et d'un monomère non sensible aux variations externes de nature chimique ou physique choisi parmi l'acrylamide, le N,N-diméthylacrylamide, l'acide acrylique et les monomères de type acrylamide ; et les copolymères blocs d'oxyde de polyéthylène, d'oxyde de polypropylène et de méthylcellulose (Heskins M. et al, Macromol. Sci.-Chem. A2, 1968, 1441 ; Taylor L. D. et al, J. Polym. ScL: Polym. Chem. Ed. 1975, 13, 2551- 2570. ; Schield, H.G., Prog. Polym. Sci., 1992, 17, 163-249. ; Freitag, R. et al, M. J. Polym. Sci.: Part A: Polym. Chem., 1994, 32, 3019-3030. ; Mao, H. et al, J. Am. Chem. Soc, 2003, 125, 2850-2851).
Ainsi, les brosses de polymères constituant le revêtement réactif utilisable selon l'Invention se trouvent dans un état hydraté et gonflé en solution aqueuse lorsque la température de ladite solution est inférieure à la. LCST et deviennent hydrophobes et s'effondrent quand la température de la solution est supérieure à la LCST.
Parmi les polymères sensibles à une activation physique, on peut également citer les polymères sensibles à une irradiation lumineuse. Au sein de cette famille figurent notamment les polymères comprenant un motif azobenzène parmi lesquels ont peut par exemple citer les copolymères de N-isopropylacrylamide et de N-(4-(phénylazo)-phényl)-acrylamide, les copolymères de diméthylacrylamide et de phénylazophénylacrylate. Ainsi, les brosses de polymères constituant le revêtement réactif utilisable selon l'Invention se trouvent dans un état hydraté et gonflé en solution aqueuse lorsqu'elles ne sont pas activées par la lumière et deviennent hydrophobes et s'effondrent après une irradiation lumineuse.
Selon une deuxième forme de réalisation de l'Invention, le revêtement polymère est constitué de polymères sensibles à une activation externe de nature chimique telle qu'une variation de pH. Il est ainsi possible d'obtenir un revêtement polymère constitué de polymères neutres se présentant sous la forme d'une brosse de polymères gonflés et hydrophiles à pH acide (ou inversement à pH basique) alors que le revêtement s'effondre et devient hydrophobe à pH basique (ou inversement à pH acide). De tels revêtements peuvent être obtenus à partir de monomères hydrophiles de 2-hydroxyéthyl méthacrylate et de monomères possédant des groupements chimiques ionisables en solution aqueuse tels que des groupements acryliques.
Le revêtement polymère peut être synthétisé in situ ou ex situ selon les techniques de polymérisation et de greffage bien connues de l'homme du métier. Le revêtement polymère réactif utilisable selon l'Invention peut par exemple être préparé in situ, par mise en contact de la surface à revêtir avec une solution renfermant les monomères correspondant aux polymères que l'on souhaite obtenir, puis par polymérisation in situ selon les techniques de polymérisation classiques utilisées couramment par l'homme du métier, ladite surface comportant naturellement, ou ayant été préalablement fonctionnalisée par, des groupements chimiques aptes à se lier de façon covalente à une extrémité des monomères. Le revêtement polymère peut également être préparé à partir de polymères déjà formés, c'est-à-dire préalablement synthétisés ex situ, auquel cas, la surface interne du capillaire est mise en contact avec une solution de polymères déjà formés afin de permettre leur greffage covalent sur la surface interne comportant naturellement ou, ayant été préalablement fonctionnalisée par, des groupements chimiques aptes à se lier avec une extrémité seulement des chaînes polymères.
Grâce à l'utilisation du revêtement polymère réactif qui vient d'être décrite ci-dessus, il est donc possible de faire varier, de façon réversible, la viscosité de la solution aqueuse d'électrolytes au sein d'une double couche électrique d'un dispositif micro- ou nanofluidique et ainsi de contrôler les flux électrocinétiques.
Ainsi, un deuxième objet de la présente Invention est une méthode pour faire varier de façon réversible et contrôler les flux électrocinétiques au sein d'un dispositif micro- ou nanofluidique comprenant au moins un canal ou au moins un capillaire apte à contenir une solution aqueuse d'électrolytes, caractérisée par le fait qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : i) la formation d'un revêtement polymère réactif sur au moins une partie de la surface interne dudit canal ou dudit capillaire, ladite surface comportant des groupements chimiques chargés électriquement formant une double couche électrique à l'interface liquide-solide, ledit revêtement étant tel que défini précédemment, ii) l'augmentation et/ou la diminution de la viscosité de la solution aqueuse d'électrolytes uniquement au sein de la double couche électrique par activation et/ou inactivation dudit revêtement par application d'une stimulation externe de nature physique ou chimique. Selon une première forme de réalisation, il s'agit d'une méthode pour augmenter les flux électrocinétiques et l'étape ii) est une étape d'activation. Dans ce cas, le revêtement polymère est de préférence constitué de polymères sensibles aux variations de température et l'activation est réalisée par chauffage de la solution aqueuse d'électrolytes à une température supérieure à la LCST des polymères constituant le revêtement. Selon une forme de réalisation tout particulièrement préférée de l'Invention, le revêtement réactif est constitué de polymères de PNIPAM et l'activation est réalisée par chauffage de la solution aqueuse d'électrolytes à une température légèrement supérieure à environ 320C, de préférence à une température comprise entre 35 et 50°C environ.
Selon une deuxième forme de réalisation de la présente Invention, il s'agit d'une méthode pour diminuer les flux électrocinétiques et l'étape ii) est une étape d'inactivation. Dans ce cas, le revêtement polymère est de préférence constitué de polymères sensibles aux variations de température et l'inactivation est réalisée par refroidissement de la solution aqueuse d'électrolytes à une température inférieure à la LCST des polymères constituant le revêtement. Selon une forme de réalisation tout particulièrement préférée de l'Invention, le revêtement réactif est constitué de polymères de PNIPAM et l'inactivation est réalisée par refroidissement de la solution électrophorétique à une température légèrement inférieure à 32°C, de préférence à une température comprise entre 15 et 30°C environ.
Enfin, un dernier objet de l'Invention est un dispositif micro- ou nanofluidique caractérisé par le fait qu'il comprend au moins un canal ou au moins un capillaire dont au moins une partie de la surface interne est chargée électriquement et recouverte d'un revêtement polymère réactif tel que décrit précédemment. Un dispositif micro- ou nanofluidique particulièrement préféré selon l'Invention est un dispositif dans lequel le revêtement réactif est constitué de polymères sensibles à une stimulation externe de nature physique, et en particulier aux variations de température, tels que les polymères de type PNIPAM.
Ainsi, le dispositif micro- ou nanofluidique conforme à l'Invention est de préférence équipé de moyens permettant de faire varier de façon réversible et de contrôler, localement ou globalement, la température d'une solution aqueuse d'électrolytes présente à l'intérieur du canal ou du capillaire (moyens de chauffage et/ou de refroidissement).
De manière usuelle, le canal ou le capillaire du dispositif micro- ou nanofluidique conforme à l'Invention peut par exemple être connecté à au moins deux réservoirs qui contiennent une solution aqueuse d'électrolytes, lesdites solutions pouvant être identiques ou différentes d'un réservoir à l'autre, ainsi qu'à des électrodes permettant d'appliquer un potentiel électrique à travers le canal ou le capillaire. Egalement de manière usuelle, le canal ou le capillaire du dispositif conforme à l'Invention peut être connecté à une de ses extrémités à un réservoir renfermant une solution aqueuse d'électrolytes et à l'autre extrémité, à un spectromètre de masse.
Enfin le canal ou capillaire peut faire partie d'un dispositif micro- ou nanofluidique comprenant une pluralité de réservoirs renfermant des solutions aqueuses d'électrolytes identiques ou différentes les unes des autres et une pluralité d'électrodes.
Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation de capillaires en verre de silice dont la surface interne comporte un revêtement polymère réactif selon l'Invention, ainsi qu'aux figures 1 à 5 annexées dans lesquelles :
- la figure 1 représente la vitesse du flux électroosmotique exprimée en cmW.s. en fonction de la température exprimée en 0C, dans un capillaire en verre de silice dont la surface interne comporte un revêtement polymère à base de PNIPAM ;
- la figure 2 est une représentation schématique d'un dispositif micro- ou nanofluidique conforme à l'Invention. Ce dispositif est constitué d'un four 1 muni d'une alimentation haute tension 2 reliée à deux électrodes de platines 4 chacune plongée dans un réservoir en plastique 6 rempli d'une solution tampon, lesdites électrodes de platine 4 étant reliées à l'alimentation 2 par l'intermédiaire de câbles haute tension 5 ; les deux réservoirs sont connectés entre eux par un capillaire en verre de silice 3 dont chacune des extrémités plonge dans une solution aqueuse d'électrolytes contenue dans les réservoirs 6. La surface interne du capillaire 3 est recouverte d'un revêtement polymère de type PNIPAM ; - la figure 3 représente le spectre Infra Rouge (IR) d'un revêtement polymère à base de PNIPAM greffé sur une surface de silice sur lequel l'absorbance exprimée en unités arbitraires est fonction de la longueur d'onde exprimée en cm"1 ;
- la figure 4 représente l'évolution de l'angle de contact d'avancement (en anglais "Advancing contact angle") de l'eau en fonction de la température sur une surface greffée avec une couche de silane (triangles vides) et sur une surface greffé avec un revêtement polymère à base de PNIPAM (losanges pleins) ;
- la figure 5 représente la vitesse du flux électroosmotique exprimée en cm2/V.s. en fonction de la température exprimée en °C, dans un capillaire en verre de silice non traité (losanges pleins), dans un capillaire en verre de silice dont la surface interne comporte un revêtement polymère polyacrylamide (carrés pleins) et dans un capillaire en verre de silice dont la surface interne comporte un revêtement polymère à base de PNIPAM (triangles pleins). EXEMPLE 1 : PREPARATION D'UN CAPILLAIRE EN VERRE DE SILICE COMPORTANT UNE SURFACE INTERNE RECOUVERTE D'UN REVETEMENT POLYMERE DE TYPE PNIPAM
Cet exemple, ainsi que la figure 1, sont relatifs à l'application d'un revêtement polymère de type PNIPAM sur la surface interne d'un capillaire d'électrophorèse en verre de silice (capillaire vendu par la société Polymicro Technology, L.LC.) d'un diamètre interne de 100 μm et d'un diamètre externe de 365 μm, ainsi qu'à son utilisation pour faire varier la viscosité d'une solution aqueuse d'électrolytes au sein de la double couche électrique par stimulation externe et ainsi contrôler le flux électroosmotique. 1) Préparation du capillaire : formation du revêtement polymère
Le revêtement polymère a été synthétisé à partir de monomères de N-isopropylacrylamide (NIPAM) vendu sous la référence 415324 par la société Sigma-Aldrich. Le capillaire a été lavé par une solution de soude (0,2M ) pendant 2 heures, puis d'acide chlorhydrique (0,2 M) pendant 2 heures également et enfin d'eau désionisée (vendue sous la dénomination commerciale MiIiQ par la société Millipore) pendant 30 minutes. Le capillaire a ensuite été séché en étuve à une température de 80°C pendant 2 heures, rincé à l'éthanol pendant 30 minutes puis au trichloroéthylène pendant 30 minutes.
La surface interne du capillaire a ensuite été silanisée avec une solution à 10 % (poids/volume : p/v) de 3-(triméthoxysilyl)propyl méthacrylate (vendu sous la référence M6514 par la société Sigma- Aldrich) dans le trichloroéthylène, pendant 2 heures.
Après la silanisation, le capillaire a été lavé avec du trichloroéthylène (30 minutes), de l'éthanol (30 minutes) et de l'eau désionisée. 10 ml d'une solution de NIPAM à 10 % p/v (0,88 M) dans l'eau désionisée a ensuite été préparée et saturée à l'azote pendant 3 heures. La polymérisation radicalaire du NIPAM a été initiée par un couple red/ox constitué de métabisulfite de sodium (NaMBS) (vendu sous la référence S1516 par la société
Sigma- Aldrich) et de persulfate d'ammonium (APS) (vendu sous la référence 431532 par la société Sigma- Aldrich). Pour ce faire, 1,11 mg de NaMBS dans 110 μl d'eau désionisée (rapport de concentration [NIPAM]/[NaMBS] ≈ 0,00065) et 2,21 mg d'APS dans 110 μl d'eau désionisée (rapport de concentration [NIPAM]/[APS] =
0,001) ont été ajoutés à la solution de monomères. Le mélange a été soigneusement agité puis rapidement injecté dans le capillaire. La polymérisation a été effectuée pendant 3 heures à une température de 250C. La viscosité de la solution a augmenté au cours de la réaction de polymérisation indiquant la formation de polymères en solution.
Le capillaire a ensuite été lavé à l'eau désionisée à l'issue de la réaction de polymérisation. 2) Mesure du flux électroosmotique
Le flux électroosmotique dans le capillaire ainsi obtenu, c'est-à-dire dont la surface interne a été revêtue d'un revêtement polymère de type PNIPAM selon l'étape 1) ci-dessus, a été mesuré sur un appareil d'électrophorèse capillaire vendu sous la dénomination commerciale P/ACE MDQ ® par la société Beckmam-Coulter. L'acétone a été utilisé à titre de marqueur neutre pour la mesure du flux électroosmotique ; ce composé pouvant être détecté par absorbance UV à une longueur d'onde de 280 nm. La longueur totale du capillaire dans l'appareil P/ACE MDQ ® était de 33 cm et la distance entre le point d'injection et le point de détection de 20 cm. Le flux électroosmotique a été mesuré selon la méthode appelée "méthode des trois pics" (Williams, B. A., Vigh, G., Anal. Chem., 1996, 68, 1174-1180), pour les températures inférieures à 3O0C. La méthode des 3 pics est habituellement utilisée pour mesurer les faibles flux électroosmotiques. Pour mesurer le flux électroosmotique à des températures supérieures à 30 °C, une méthode à un seul pic a été utilisée, c'est-à-dire par la mesure du temps de migration du marqueur acétone entre le point d'injection et le point de détection pour une intensité électrique donnée.
La vitesse du flux électroosmotique μEo, exprimée en cmW.s, a été calculée en appliquant l'équation suivante : μEo= x/t.E dans laquelle x est la distance entre le point d'injection et le point de détection (ici 20 cm) ; t est le temps de migration et E est l'intensité du champ électrique. Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 1 annexée sur laquelle la vitesse du flux électroosmotique exprimée en cmW.s est fonction de la température exprimée en °C.
Ces résultats montrent que le flux électroosmotique est relativement constant jusqu'à la température d'environ 30°C alors qu'au dessus de cette température, la mobilité électroosmotique augmente rapidement. Le rapport entre la mobilité électroosmotique à basse température (environ 20°C) et à haute température (environ 400C) est de l'ordre de 3. Ces résultats démontrent que la présence du revêtement polymère sur la paroi interne du capillaire permet de faire varier la viscosité de la solution aqueuse d'électrolytes au sein de la double couche électrique en fonction de la température, afin de moduler le flux électroosmotique.
EXEMPLE 2 : PREPARATION DE CAPILLAIRES EN VERRE DE SILICE COMPORTANT UNE SURFACE INTERNE RECOUVERTE D'UN REVETEMENT POLYMERE
Cet exemple est relatif au contrôle du flux électroosmotique dans un dispositif microfluidique conforme à l'Invention comportant un capillaire en verre de silice (capillaire vendu par la société Polymicro Technology, L.LC. ; diamètre interne : 76 μm ; diamètre externe de 365 μm ; longueur 6 cm) grâce à l'utilisation de revêtements polymères sur la surface interne du capillaire qui permettent de faire varier la viscosité de la solution au sein de la double couche électrique après activation externe.
1) Préparation du capillaire : formation du revêtement polymère Le revêtement polymère a été synthétisé à partir des mêmes monomères de N-isopropylacrylamide (NIPAM) que ceux utilisés ci-dessus à l'exemple 1. Dans cet exemple, et sauf indications contraires, les réactifs utilisés sont les mêmes que ceux utilisés ci-dessus à l'exemple 1.
Le capillaire a été lavé par une solution de soude (0,5 M) pendant 2 heures, puis d'acide chlorhydrique (0,5 M) pendant 2 heures également, d'eau désionisée pendant 30 minutes et enfin d'éthanol pendant 30 minutes.
Le capillaire a ensuite été séché en étuve à une température de 80°C pendant 2 heures puis rincé à l'éthanol pendant 30 minutes.
La surface interne du capillaire a ensuite été silanisée pendant 2 heures avec une solution d'éthanol renfermant 10 % p/v (0,4 M) de 3-(triméthoxysilyl)propyl méthacrylate et 10 % p/v (0,45 M) de 3-aminopropyl- triéthoxy silane (vendu sous la référence 09324 par la société Sigma- Aldrich).
Après la silanisation, le capillaire a été lavé avec de l'éthanol (30 minutes) et séché à l'étuve à une température de HO0C pendant 30 minutes. 5 ml d'une solution de NIPAM à 5 % p/v (0,44 M) dans l'eau désionisée a ensuite été préparée et saturée à l'azote pendant 3 heures.
La polymérisation radicalaire du NIPAM a été initiée par un mélange d'APS et de N,N,N',N'-tetraméthyléthylènediamine (TEMED). Pour ce faire,
25 mg d'APS (5 mg/ml) et 5 μl de TEMED (1 μl/ml) ont été ajoutés à la solution de monomères. Les concentrations finales en APS et en TEMED au sein de la solution de monomères étaient respectivement de 22 mM et de 6,7 mM. Le mélange a été soigneusement agité puis rapidement injecté dans le capillaire. La polymérisation a été effectuée pendant 3 heures à une température de 250C. La viscosité de la solution a augmenté au cours de la réaction de polymérisation indiquant la formation de polymères en solution.
Le capillaire a ensuite été lavé à l'eau désionisée à l'issue de la réaction de polymérisation. 2) Mesure du flux électroosmotique
Le flux électroosmotique dans le capillaire ainsi obtenu, c'est-à-dire dont la surface interne a été revêtue d'un revêtement polymère de type PNIPAM selon l'étape 1) ci-dessus, a été mesuré sur un dispositif microfluidique tel que représenté de façon schématique sur la figure 2 annexée.
Sur cette figure, on peut voir que ce dispositif est constitué d'un four 1 vendu sous la dénomination commerciale Salvis-Lab ® VACUCENTER par la société Salvis (Suisse) muni d'une alimentation haute tension 2 vendue sous la référence HVS448 3000D par la société LabSmith reliée à deux électrodes de platines 4 vendues par la société GoodFellow (USA) chacune plongée dans un réservoir en plastique 6 de type Eppendorf d'une contenance de 1,5 ml et rempli d'une solution tampon, lesdites électrodes de platine étant reliées à l'alimentation 2 par l'intermédiaire de câbles hautes tension 5 ; les deux réservoirs sont connectés entre eux par un capillaire en verre de silice 3 ayant un diamètre interne de 76 μm, un diamètre externe de 365 μm et une longueur de 5 cm (société Polymicro Technology L.L.C., USA) dont chacune des extrémités plonge dans la solution tampon contenue dans les réservoirs 6.
Le capillaire 3, les réservoirs de solution tampon 6 et les électrodes 4 ont été enfermés dans le four 1 afin de pouvoir travailler à des températures données (à 60°C et à 20°C). Le réservoir tampon d'entrée a été rempli avec un tampon acide citrique faiblement concentré (25 mM) dont le pH a été ajusté à 3 avec de la soude, alors que le réservoir tampon de sortie et le capillaire 3 ont été remplis avec un tampon acide citrique fortement concentré (50 mM) dont le pH a été ajusté à 3 avec de la soude. La paroi interne du capillaire 3 s'est retrouvée chargée positivement à ce pH compte tenu de la présence du 3-aminopropl-triéthoxy silane greffé à la surface. L'application d'un potentiel positif (200 V/ cm de capillaire) au réservoir tampon d'entrée a créé un flux électroosmotique, permettant au tampon faiblement concentré d'être pompé dans le capillaire 3. L'intensité du courant électrique a diminué régulièrement jusqu'à ce que le capillaire 3 soit totalement rempli avec le tampon faiblement concentré. Le temps nécessaire au remplacement, dans le capillaire 3, du tampon fortement concentré par le tampon faiblement concentré a été mesuré et la vitesse du flux électroosmotique en fonction de la température (à 6O0C et à 20°C) a été calculée en utilisant l'équation (eq. 8) suivante : μEo = x / t.E (eq. 8) dans laquelle X est la longueur du capillaire en cm, t est le temps de remplacement de la solution d'acide citrique fortement concentré (50 mM) par la solution d'acide citrique faiblement concentré (25 mM) dans le capillaire et E est l'intensité du champs électrique.
A titre de contrôle, la même expérience a été réalisée à 600C avec un capillaire ne comportant pas de revêtement polymère. La vitesse du flux électroosmotique mesurée à 600C était de 0,78 ±
0,04.10"5 Cm2Vs, alors qu'elle était de 0,14 ± 0,02.10"5 Cm2Vs à 20°C. Ces résultats montrent que la mobilité du flux électroosmotique a été augmentée d'un facteur 5,6 environ lorsque la température du tampon devient supérieure à la LCST des polymères constituant le revêtement de la paroi interne du capillaire. La mesure effectuée sur le capillaire contrôle (sans revêtement PNIPAM) à 600C donne une mobilité du flux électroosmotique égale à 2,18 ± 0,04.10"5 Cm2Vs. Par conséquent, la mobilité du flux électroosmotiqiie dans le capillaire contrôle (sans revêtement PNIPAM) était environ 2,8 fois plus élevée que celle mesurée à 600C dans le capillaire comportant le revêtement polymère PNIPAM. Sans vouloir être lié à une quelconque théorie, ce résultat est peut être dû à un blindage des charges de surface par les chaînes de PNIPAM effondrées.
EXEMPLE 3 : PREPARATION D'UNE SURFACE A BASE DE SILICE RECOUVERTE D'UN REVETEMENT POLYMERE DE PNIPAM
Une surface de silice (1,5 x 7,5 cm) a été recouverte d'un revêtement polymère PNIPAM selon le protocole décrit ci-dessus à l'exemple 2, étape 1).
Le spectre Infra-Rouge (IR) de la surface ainsi obtenue a été mesuré avec un spectromètre vendu sous la dénomination commerciale Equinox® IFS 55 FT- IR par la société Bruker Optics Inc. (USA, Billerica, MA), adapté au laboratoire. Ce spectromètre permet d'enregistrer des spectres IR en réflexion multi-interne (MIR). Le spectre obtenu est représenté sur la figure 3 annexée sur laquelle l'absorbance (en unités arbitraires) est exprimée en fonction de la longueur d'onde (en cm"1). EXEMPLE 4 : PREPARATION DE PLAQUES EN VERRE COMPORTANT UNE SURFACE RECOUVERTE D'UN REVETEMENT POLYMERE DE PNIPAM
Dans cet exemple, on a revêtu la surface d'une plaque en verre (dimension 1 x 2 cm) d'un revêtement de PNIPAM selon le protocole décrit ci-dessus à l'exemple 2, étape 1).
A titre comparatif, la surface d'une plaque de verre identique a été simplement silanisée pendant 2 heures avec une solution de trichloroéthylène renfermant 10 % p/v (0,4 M) de 3-(triméthoxysilyl)propyl méthacrylate (vendue sous la référence 64210 par la société Sigma- Aldrich).
Après la silanisation, la plaque de verre a été lavée avec de l'éthanol (30 minutes) et séchée à l'étuve à une température de 110°C pendant 30 minutes.
Une goutte d'eau a été déposée sur chacune des plaques de verre ainsi préparées et des mesures des angles de contact dynamiques ont été effectuées à l'aide d'un appareil permettant de déposer les gouttes de façon manuelle et de mesurer les angles de contact, vendu sous la dénomination commerciale DIGIDROP® par la société GBX (France).
Les mesures obtenues sur chacune des surfaces sont représentées sur la figure 4 annexée sur laquelle l'évolution de l'angle de contact d'avancement (en °) est exprimée en fonction de la température (en 0C) : surface uniquement silanisée (triangle vides) et surface avec revêtement PNIPAM (losanges pleins).
Ces résultats montrent que sur la surface de verre uniquement silanisée, l'angle de contact d'avancement de la goutte d'eau reste constant malgré l'élévation de la température alors que sur la surface comportant le revêtement PNIPAM conforme à l'Invention, cet angle varie en fonction de la température.
EXEMPLE 5 : PREPARATION DE CAPILLAIRES EN VERRE DE SILICE COMPORTANT UNE SURFACE RECOUVERTE D'UN REVETEMENT POLYMERE DE TYPE PNIPAM
Le but de cet exemple est de comparer les variations des flux électroosmotiques dans plusieurs capillaires :
- Capillaire A : capillaire témoin, non fonctionnalisé ; - Capillaire B : capillaire dont la surface interne est recouverte d'un revêtement de type polyacrylamide ;
- Capillaire C : capillaire conforme à l'Invention, c'est-à-dire dont la surface interne est recouverte d'un revêtement polymère de PNIPAM. Dans cet exemple, on a utilisé les mêmes capillaires d'électrophorèse en verre de silice que ceux décrits à l'exemple 2 ci-dessus.
Avant leur utilisation, ces capillaires ont été lavés avec une solution de soude 0,2 M pendant 30 minutes puis avec une solution d'acide chlorhydrique 0,2 M pendant 30 minutes et enfin par de l'eau désionisée (vendue sous la dénomination commerciale MiIiQ par la société Millipore) pendant également 30 minutes.
Les capillaires ont ensuite été séchés en étuve à une température de 800C pendant 2 heures, puis rincés à l'éthanol pendant 30 minutes.
Le capillaire A n'a subi aucun traitement supplémentaire. La surface interne du capillaire C a ensuite été silanisée et recouverte d'un revêtement PNIPAM selon le protocole décrit ci-dessus à l'exemple 2, étape 1.
La surface interne du capillaire B a été silanisée et recouverte d'un revêtement polyacrylamide selon le même protocole que celui utilisé pour le capillaire C, mais en utilisant de l'acrylamide à la place du NIPAM. Les mesures de la vitesse du flux électroosmotique dans les capillaires A, B et C ont été effectuées selon la méthode décrite ci-dessus à l'exemple 2 (2- Mesure du flux électroosmotique).
Les résultats obtenus sont reportés sur la figure 5 annexée sur laquelle la vitesse du flux électroosmotique exprimée en cm2/ V. s est fonction de la température exprimée en 0C : capillaire A : losanges pleins, capillaire B : carrés pleins, Capillaire C : triangles pleins.
On constate que dans le capillaire A, la vitesse du flux électroosmotique augmente de façon linéaire en fonction de la température. Dans le capillaire B, non-conforme à la présente Invention car comportant un revêtement de type polyacrylamide, on n'observe aucune variation du flux électroosmotique en fonction de la température, le flux étant inexistant. Par contre, dans le capillaire C, conforme à la présente Invention, c'est-à-dire comportant un revêtement interne PNIPAM, on constate que le flux électroosmotique est inexistant jusqu'à une température d'environ 300C, et qu'à partir de ce point, l'élévation de la température entraîne une augmentation très rapide du flux électroosmotique. La présence du revêtement polymère PNIPAM sur la paroi interne du capillaire C permet de bloquer puis de faire varier le flux électroosmotique, ce qui n'est pas possible dans les capillaires A et B ne faisant pas partie de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un revêtement polymère réactif, greffé sur au moins une partie de la surface interne d'un canal ou d'un capillaire d'un dispositif micro- ou nanofluidique contenant au moins une solution aqueuse d'électrolytes, ladite surface comportant des groupements chimiques chargés électriquement formant une double couche électrique à l'interface liquide-solide, ledit revêtement ayant les caractéristiques suivantes : a) il est constitué d'une couche de polymères flexibles aptes à subir une séparation de phase (transition pelote-globule) en solution aqueuse sous l'influence d'une stimulation externe de nature physique ou chimique, b) les polymères sont greffés de façon covalente sur ladite surface par l'une seulement de leurs extrémités, pour moduler, de façon réversible, et contrôler les flux électrocinétiques au sein dudit dispositif par variation de la viscosité de la solution aqueuse d'électrolytes uniquement au sein de la double couche électrique sous l'influence d'une activation externe de nature chimique ou physique.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que l'épaisseur de la double couche électrique présente à l'interface du dispositif d'électrophorèse est comprise entre 0,1 nm et 1 μm.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée par le fait que la surface interne est choisie parmi le verre, le quartz, la silice et les matériaux polymères.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que le canal et le capillaire ont des dimensions telles que leur plus petite largeur ou leur diamètre sont supérieurs à l'épaisseur de la double couche électrique.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que les groupements chimiques sont choisis parmi les groupements silanol lorsque la surface interne est un oxyde de silice hydraté, du quartz ou du verre ; les aminés primaires, secondaires ou tertiaires, les groupements sulfate, sulfonate, phosphonate et carboxylique.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que les polymères sont greffés de façon covalente sur la surface interne dudit canal ou dudit capillaire par l'intermédiaire de groupements chimiques choisis parmi les groupements silanol, vinyle, carboxyle, amino, époxy, oxy aminé, thiol et halogénure.
7. Utilisation selon les revendications 5 et 6, caractérisée par le fait que la surface interne du canal ou du capillaire est modifiée par au moins deux types de groupements chimiques de nature différente.
8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que les polymères sont inactivés et que l'épaisseur du revêtement polymère réactif est supérieure à celle de la double couche électrique.
9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée par le fait que lorsqu'un champ électrique est appliqué au dispositif, le flux électrocinétique de la solution aqueuse d'électrolytes tend vers zéro.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée par le fait que les polymères sont activés et que l'épaisseur du revêtement polymère est inférieure à celle de la double couche électrique.
11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée par le fait que lorsqu'un champ électrique est appliqué au dispositif, le flux électrocinétique de la solution aqueuse d'électrolytes est différent de zéro et proportionnel au potentiel de surface.
12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que la densité de greffage des polymères est telle que les polymères se présentent sous la forme d'un revêtement discontinu et hétérogène lorsque les polymères sont à l'état effondré et forment des trous permettant aux charges de surface d'être exposées à la solution aqueuse d'électrolytes.
13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que le revêtement polymère est constitué de polymères sensibles aux variations de température et choisis parmi le poly(N-isopropyl acrylamide), le poly(N,N'-méthylpropylacrylamide), le poly(N-propylacrylamide), le poly(N,N'-méthyléthylacrylamide), le ρoly(N-propylméthacrylamide), le poly(N,N'-isopropylméthacrylamide) ; les copolymères résultant de la copolymérisation de monomères choisis parmi le N-isopropyl acrylamide, le N,N'-méthylpropylacrylamide, le N-propylacrylamide, le N,N'-méthyléthylacrylamide, le N-propylméthacrylamide et le N,N'-isopropyl- méthacrylamide ; les copolymères résultant de la copolymérisation d'un monomères choisi parmi le N-isopropyl acrylamide, le N,N'-méthylpropylacrylamide, le N-propylacrylamide, le N,N'-méthyléthylacrylamide, le N-propylméthacrylamide et le N,N'-isopropylméthacrylamide et d'un monomère non sensible aux variations externes de nature chimique ou physique choisi parmi l'acrylamide, le N,N-diméthylacrylamide, l'acide acrylique et les monomères de type acrylamides ; et les copolymères blocs d'oxyde de polyéthylène, d'oxyde de polypropylène et de méthylcellulose.
14. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée par le fait que le revêtement polymère est constitué de polymères sensibles à une irradiation lumineuse, comprenant un motif azobenzène, et choisis parmi les copolymères de N-isopropylacrylamide et de N-(4-(phénylazo)-phényl)- acrylamide et les copolymères de diméthylacrylamide et de phénylazophénylacrylate.
15. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée par le fait que le revêtement polymère est constitué de polymères sensibles à une variation de pH et choisis parmi les polymères obtenus à partir de monomères hydrophiles de 2-hydroxyéthyl méthacrylate et de monomères acryliques.
16. Méthode pour faire varier de façon réversible et contrôler les flux électrocinétiques au sein d'un dispositif micro- ou nanofluidique comprenant au moins un canal ou au moins un capillaire apte à contenir une solution aqueuse d'électrolytes, caractérisée par le fait qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : i) la formation d'un revêtement polymère réactif sur au moins une partie de la surface interne dudit canal ou dudit capillaire, ladite surface comportant des groupements chimiques chargés électriquement formant une double couche électrique à l'interface liquide-solide, ledit revêtement étant tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 15 ; ii) l'augmentation et/ou la diminution de la viscosité de la solution aqueuse d'électrolytes uniquement au sein de la double couche électrique par activation et/ou inactivation dudit revêtement par application d'une stimulation externe de nature physique ou chimique.
17. Méthode selon la revendication 16, caractérisée par le fait qu'il s'agit d'une méthode pour augmenter les flux électrocinétiques et que l'étape ii) est une étape d'activation.
18. Méthode selon la revendication 17, caractérisée par le fait que le revêtement est constitué de polymères sensibles aux variations de température et que l'activation est réalisée par chauffage de la solution aqueuse d'électrolytes à une température supérieure à la LCST des polymères constituant le revêtement.
19. Méthode selon la revendication 16, caractérisée par le fait qu'il s'agit d'une méthode pour diminuer les flux électrocinétiques et que l'étape ii) est une étape d'inactivation.
20. Méthode selon la revendication 19, caractérisée par le fait que le revêtement est constitué de polymères sensibles aux variations de température et l'inactivation est réalisée par refroidissement de la solution aqueuse d'électrolytes à une température inférieure à la LCST des polymères constituant le revêtement.
21. Dispositif micro- ou nanofluidique, caractérisé par le fait qu'il comprend au moins un canal ou au moins un capillaire dont au moins une partie de la surface interne est chargée électriquement et recouverte d'un revêtement polymère réactif tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 15.
22. Dispositif selon la revendication 21, caractérisé par le fait que le revêtement polymère réactif est constitué de polymères sensibles aux variations de température et qu'il est équipé de moyens permettant de faire varier de façon réversible et de contrôler, localement ou globalement, la température d'une solution aqueuse d'électrolytes présente à l'intérieur dudit canal ou dudit capillaire.
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