NL194562C - Capillaire gels gevormd door ruimtelijke progressieve polymerisatie waarbij gebruik wordt gemaakt van een bewegende initiator. - Google Patents

Description

1 194562

Capillaire gels gevormd door ruimtelijke progressieve polymerisatie waarbij gebruik wordt gemaakt van een bewegende initiator

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het verkrijgen van een met gel gevulde capillaire 5 kolom voor gebruik in capillaire elektroforese.

Eén van de meest belangrijke recente ontwikkelingen in de technologie van analytische technieken voor biologische mengsels is de techniek van capillaire elektroforese.

Capillairen vertonen bepaalde voordelen in de scheiding van dergelijke moleculen of kleine peptides, eiwitten en nucleïnezuren, omdat ze gebruikt kunnen worden om extreem kleine monsters te analyseren 10 met geschikte on-line spectroscopische detectie, en zij staan het gebruik van hoge voltages toe waarbij scheidingen worden bereikt met een relatief hoge snelheid.

Het gebruik van een gel als het scheidingsmedium in het capillair combineert de voordelen van capillaire elektroforese met de bekende mogelijkheden van de gel-elektroforese. Als gevolg van hun unieke geometrie vormen capillairen echter een aparte uitdaging, in het bijzonder bij de bereiding van de gei in het capillair.

15 Een lastige factor is de moeilijkheid van het verkrijgen van een uniforme gelconsistentie en concentratie in het hele capillair. Deze twee factoren zijn belangrijk bij het verkrijgen van resolutie van de verbinding en de reproduceerbaarheid, en vormen daardoor belangrijke overwegingen in het bereiken van een optimaal gebruik van de techniek, in het bijzonder met capillairen met een erg kleine diameter. Dit is moeilijk te bereiken met gels in capillairen, omdat het krimpen van de gel, wat een inherent gevolg is van de 20 polymerisatiereactie, leidt tot het ontstaan van gaten in de gel, in het bijzonder van beivormige open ruimtes, in het algemeen van microscope afmetingen, hetwelk leidt tot afwijkingen in de gel-uniformiteit. Dergelijke discontinuïteiten leiden tot stroomval en verstoringen van de toegepaste elektrische veldgradiënt, gedurende elektroforese, die op hun beurt het rendement, de betrouwbaarheid en de reproduceerbaarheid van de scheiding verminderen.

25 In het verleden zijn technieken voorgesteld om dit probleem te verhelpen. Zo beschrijft EP-A-0.159.694 een werkwijze voor het sturen van de polymerisatie van elektroforese-gelen. In deze bekende werkwijze worden monomeren in een waterige oplossing gepolymeriseerd, zonder dat initiatoren worden toegepast. De polymerisatie van de monomeren wordt geïnitieerd door toepassing van ioniserende straling.

US-A-4.865.706 beschrijft een microcapillaire kolom voor hoge prestatie elektroforese. Deze kolom wordt 30 vervaardigd door een bïfunctioneel reagens covalent te binden aan de binnenzijde van de kolom. Vervolgens wordt een mengsel van een monomeer, een vemettingsmidde) en een polymerisatiekatalysator in aanraking gebracht met het bifunctionele reagens.

Deze bekende technieken vragen om gebruik van materialen, apparaten of methodes, die in het algemeen niet worden gebruikt in samenhang met capillairen, gelbereiding of elektroforese en die tot 35 variërende resultaten leiden. De onderhavige uitvinding komt tegemoet aan deze behoefte, in een eenvoudige, efficiënte, reproduceerbare en betrouwbare manier.

Gevonden is, dat gel gevulde capillairen die de discontinuïteiten, die gewoonlijk optreden tijdens het gelvormingsproces niet vertonen, verkregen kunnen worden door een elektrisch veld te gebruiken, op een manier die analoog is aan de elektroforese-procedure, een geladen polymerisatie-initiator in één einde van 40 het capillair in te leiden en deze continu langs de lengte van het capillair te voeren totdat deze het volledige interne volume van het capillair heeft doordrongen, waarbij het capillair vooraf gevuld was met een vloeibare oplossing van alle gelvormende materialen met uitzondering van de initiator. Derhalve betreft de uitvinding een werkwijze zoals in de aanhef omschreven, welke werkwijze de volgende stappen omvat: (a) het vullen van een capillaire buis, die een eerste en tweede uiteinde bezit, met een oplossing van 45 gelvormend materiaal dat een gelvormende polymerisatiereactie kan ondergaan, wanneer deze in aanraking wordt gebracht met een polymerisatie-initiator; (b) het dompelen van het eerste uiteinde van de capillaire buis in een eerste elektrode-oplossing, waarin de polymerisatie-initiator in een vorm is opgelost, die migratie kan ondergaan wanneer deze wordt blootgesteld aan een elektrisch veld, en het dompelen van het tweede uiteinde van de capillaire buis in een tweede 50 elektrode-oplossing, en (c) het aanleggen van een elektrische potentiaal tussen de eerste en de tweede elektrode-oplossing door de capillaire buis, bij omstandigheden die hoofdzakelijk vrij zijn van elektro-osmotische stroming, om migratie te verkrijgen van de polymerisatie-initiator in de capillaire buis, geleid door een front van de polymirisatie-initiator die van het eerste uiteinde met een vooraf vastgestelde lineaire snelheid door de capillaire buis naar 55 het tweede uiteinde beweegt, waardoor de polymerisatiereactie langs dit front plaatsvindt.

De initiator die de buis binnenkomt, wordt geleid door een front dat longitudinaal door het capillair beweegt met een langzame, in hoofdzaak lineaire snelheid in de axiale richting. De polymerisatie van de gel 194562 2 op elk punt in het capillair begint wanneer het front voor het eerst dat punt passeert, en gaat door tot voltooiing door continue blootstelling aan de passerende initiator.

In deze beschrijving refereert de term "front" aan een scheidingslijn die het deel van de inhoud van het capillair waarin de initiator aanwezig is scheidt van dat deel waarin deze hoofdzakelijk aanwezig is. Hoewel 5 de scheidingslijn in de meeste gevallen een perfect scherpe grens is, kan het verbreden of vervagen van het grensvlak geminimaliseerd worden door een geschikte controlering van de migratie-omstandigheden op dezelfde manier als bij elektroforetische scheidingen. De plaats van het grensvlak wordt in het algemeen gedefinieerd door het feit dat de polymerisatie plaatsvindt aan de initiatorkant en niet plaatsvindt aan de andere kant.

10 Het krimpen van de gelmaterialen dat plaatsvindt tengevolge van de polymerisatiereactie wordt hoofdzakelijk, indien niet geheel, beperkt tot de plaats die direct achter het verschuivende initiatorfront ligt, door de tot dan toe ongepolymeriseerde vloeistof achteruit in een unidirectionele wijze te voeren en op deze manier op effectieve wijze de spanning in het gel-bevattende deel, evenals de neiging tot het vormen van onregelmatigheden of discontinuïteiten in de gel die gevormd is, te verminderen. De procedure wordt 15 uitgevoerd onder omstandigheden die het gelvormende materiaal in het capillair hoofdzakelijk vrijhouden van elektro-osmotische stroming. Verder werkt, in de voorkeursuitvoeringen, een van de componenten van het gelvormende mengsel, die een lading draagt tegenovergesteld aan die van de initiator, als een counter-ion, gedurende de initiatorinvoering, waarbij deze het capillair van het andere einde binnenkomt als een middel om de hoeveelheid van die verbinding langs het gehele capillair gedurende de duur van de 20 polymerisatie gelijk te houden.

Verdere eigenschappen, aspecten, en uitvoeringsvormen van de uitvinding zullen duidelijk worden uit de beschrijving die volgt.

Figuur 1 is een schematische voorstelling die een uitvoeringsvorm van de uitvinding weergeeft, waarin 25 een capillaire buis, gevuld met gelvormend materiaal, gereed is gemaakt voor het inleiden van de polymerisatie-initiator in één einde door het aanbrengen van een elektrische potentiaal, figuur 2 is een signaal van een detector van een capillaire gel-elektroforetische scheiding van eiwitten in onbehandelde muize-urine door gebruik te maken van een gel-gevuld capillair, behandeld volgens de uitvinding, 30 figuren 3a en 3b zijn signalen van een detector van een capillaire gel-elektroforetische scheiding van oligosacchariden, waarbij ook een gel-gevuld capillair gebruikt wordt behandeld volgens de uitvinding, figuur 4 is een signaal van een detector van een capillaire gel-elektroforetische scheiding van oligonucleotides, waarbij ook een gel-gevuld capillair wordt gebruikt, behandeld volgens de uitvinding.

35 Verschillende gels worden gebruikt in gel-elektroforese, en zijn toepasbaar in de onderhavige uitvinding, waarbij de keuze van gel niet kritisch is voor de uitvinding. De belangrijkste gels zijn echter polyacrylamide-gels, met het oog op de bekende toepasbaarheid van dit materiaal voor de grootte-scheiding van geladen macromoleculen zoals eiwitten en nucleïnezuren, evenals van kleine eiwitten. Mengsels van polyacrylamide met andere gelmaterialen zoals agarose zijn ook van belang.

40 Het gelvormende materiaal omvat in het algemeen een verknopingsmiddel. Een grote verscheidenheid van verknopingsmiddelen zijn bekend en geschikt voor gebruik in de context van deze uitvinding. Voorbeelden van verknopingsmiddelen die gebruikt kunnen worden in acrylamidepolymerisatie zijn N,N' -methyleen-bisacrylamide, N,N' - (1,2-dihydroxyethyleen) bisacrylamide, Ν,Ν'-dialyllwijnsteenzuurdiamide, N,N'-cystaminebisacylamide, en N-acryloly-tris (hydroxymethyl) aminomethaan.

45 Een geprefereerd verknopingsmiddel is N,N'-methyleenbisacrylamide.

De concentraties van gelmonomeer en verknopingsmiddel zijn niet kritisch en kunnen aanzienlijk variëren. De geschikte of optimale keuze in elk afzonderlijk geval zal afhangen van de samenstelling van de mengsels die gescheiden moeten worden door de uiteindelijke gel, evenals van de afmetingen van het capillair en de omstandigheden onder welke de scheiding uitgevoerd moet worden. In de meeste gevallen 50 zullen de beste resultaten verkregen worden door gebruik te maken van waterige oplossingen van gelvormende materialen waarin de concentratie van het gelvormende monomeer en het verknopingsmiddel gecombineerd variëren van ongeveer 0,05-20 gew.%, bij voorkeur van ongeveer 2-8 gew.%. Op dezelfde manier zal de hoeveelheid verknopingsmiddel ten opzichte van de combinatie van gelvormend monomeer en verknopingsmiddel in de meeste gevallen variëren van ongeveer 0,5-20 gew.%, bij voorkeur van 55 ongeveer 2-6 gew.%. De gecombineerde concentratie van monomeer en verknopingsmiddel is de variabele waar meestal naar wordt verwezen in de literatuur als ”T”, terwijl de verhouding van verknopingsmiddel tot het totaal de variabele is waarnaar wordt verwezen als ”C”.

3 194562

De polymerisatie wordt in het algemeen uitgevoerd in aanwezigheid van een polymerisatiekatalysator, welke in het geval van polyacrylamidevorming een basische katalysator is.

De base die werkelijk gebruikt wordt is niet kritisch, en elk van de basen die bekend zijn als polymerisatiekatalysatoren kan gebruikt worden. Belangrijke voorbeelden voor polyacrylamide zijn amineba-5 sen zoals Ν,Ν,Ν',Ν' -tetramethylethyleendiamine, B-dimethylaminopropionitril en triëthanolamine. De voorkeur hebben Ν,Ν,Ν',Ν' -tetramethylethyleendiamine (’TEMED” of ’’TMEDA”) en triëthanolamine. De hoeveelheid base kan ook variëren, hoewel in de meeste gevallen de base in het algemeen gebruikt wordt in een concentratie die varieert van ongeveer 0,01-1 M, bij voorkeur van ongeveer 0,03-0,3 M.

De polymerisatie-initiator die in het capillair wordt geleid door een mobilisatie onder de invloed van het 10 elektrische veld, kan elk geladen molecuul zijn dat de polymerisatiereactie kan initiëren. Noch de chemische aard noch het mechanisme van de initiator zijn kritisch. In de meeste gevallen zal de initiator echter een vrije radicaal-initiator zijn. Voorkeurs vrije radicaal-initiatoren zijn peroxiden, persulfaten en azocomponenten. Voorbeelden zijn benzoylperoxide, tert-butylperoxide, tertbutylhydroperoxide, tert-butylhydroperoxide, tertbutylperbenzoaat, cumylperoxide, acetylperoxide, lauroylperoxide, 2,2'-azobisisobutyronitril, fenyl-15 azotrifenylmethaan en persulfaten zoals kaliumpersulfaat en ammoniumpersulfaat. De voorkeur hebben, in het bijzonder in waterige systemen, de persulfaten, in het bijzonder ammoniumpersulfaat.

Volgens de uitvinding wordt de initiator weggelaten uit de componenten van het gelvormende materiaal in de capillaire buis voor het instellen van het elektrische veld, en wordt in plaats daarvan in oplossing gehouden in een reservoir. In het reservoir is een open eind van het capillair ondergedompeld en ook een 20 elektrode. De tegen elektrode en het andere eind van het capillair zijn gedompeld in een tweede reservoir. De concentratie van de initiator in het eerste reservoir is niet kritisch en kan over een breed gebied variëren. In de meeste toepassingen, in het bij zonder die waarin de initiator het persulfaation is, worden de beste resultaten verkregen met een concentratie die varieert van ongeveer 0,03 tot 2,0 M, bij voorkeur in het traject tot voorkeur van 0,1 tot 1,0 M.

25 Negatief geladen initiatoren zoals persulfaation worden in het kathodevat gebracht. Een positief geladen tegen-ion zal overeenkomstig in het anodevat gebracht worden voor een beweging in de tegengestelde richting. Terwijl de aard en identiteit van het tegen-ion niet kritisch zijn voor de uitvinding, zal het tegen-ion in de voorkeursuitvoeringsvormen dezelfde base zijn als katalyator ingesloten in de gelvormende oplossing die zich in het capillair bevindt.

30 Derhalve wordt, wanneer de base in het capillair beweegt onder invloed van het elektrische veld in de richting tegengesteld aan die van de initiator, de uitgeputte base vervangen door de base die voortdurend vanuit het anodevat wordt ingevoerd. De concentratie van base in het anodevat zal in het algemeen hoger zijn dan de concentratie van base die oorspronkelijk in het capillair wordt geplaatst, hoewel de actuele concentratie niet kritisch is en over een breed gebied kan variëren. In voorkeursuitvoeringsvormen zal de 35 concentratie van base in het anodevat variëren van ongeveer 0,1-10 M, met de meeste voorkeur van ongeveer 0,3-3 M.

Zoals boven aangegeven, wordt de gelvormingsprocedure uitgevoerd bij condities waarin in hoofdzaak geen elektrisch-osmostische stroming of drijvende kracht optreedt. Derhalve wordt ofwel het capillair zelf of de vloeistof die in het binnenste ervan zit op zodanige wijze gekozen of behandeld dat er weinig of geen 40 elektrokinetisch potentiaal aanwezig is. Dit wordt bereikt via werkwijzen die bekend zijn aan de vakman.

Deze methodes volgen in het algemeen één of twee benaderingswijzen. De eerste is de chemische binding van een neutraal materiaal aan het binnenste oppervlak van het capillair om oppervlaktelading en adsorptieplaatsen te elimineren. De tweede heeft betrekking op het aanpassen van de pH van de buffer en ionsterkte met als doel het reduceren of elimineren van het elektrokinetische effect.

45 De eerste benaderingswijze verdient de voorkeur voor de onderhavige uitvinding. Verschillende neutrale materialen en werkwijzen voor het binden van dergelijke metalen aan het capillaire oppervlak kunnen gebruikt worden. Voor silicabevattende oppervlaktes, zijn voorbeelden het binden van gylcol-bevattende materialen, het binden van lineaire polymeren zoals methylcellulose en niet-verknoopt polyacrylamide door een organosilaan reagens, het toepassen van een poly (vinylpyrolidinon)-bevattende bedekking, die ook 50 eventueel wordt uitgevoerd door middel van een organosilaan reagens, en het gebruik van polyethyleen-glycol. Veel van deze bedekkingstechnieken zijn beschreven in de literatuur en zijn bekend bij de vakman.

De chemische samenstelling en structuur van het capillair zelf is niet kritisch, en kan over een breed gebied variëren.

Geprefereerde capillairen zijn gemaakt van silica-bevattende materialen, zoals glas, gesmolten silica en 55 kwarts. Gesmolten silica is in het bijzonder geschikt als gevolg van zijn wij de beschikbaarheid en aangetoonde eigenschappen.

De afmetingen van het capillair kunnen ook over een breed gebied variëren. In de meeste gevallen zal 194562 4 het capillair een wending in diameter hebben variërend van ongeveer 5-250 microns, bij voorkeur in het traject tot van 20 tot 100 micron. Op dezelfde manier zal de lengte van het capillair in de meeste gevallen variëren van ongeveer 5-500 cm, bij voorkeur van ongeveer 10-100 cm.

Het elektrische veld wordt aangebracht langs het capillair door conventionele technieken. De werkwijze is 5 in het bijzonder zeer goed aangepast aan dergelijke technieken zoals gebruikt worden in de elektroforeti-sche scheiding. Dit heeft in het algemeen betrekking op het inbrengen van de twee einden van het capillair in oplossing en in de reservoirs, waarbij elk verder één van beide elektrodes bevat. De elektrische potentiaal wordt dan aangebracht tussen de elektrodes vanuit een conventionele energiebron. Een toelichting voor deze opzet is figuur 1 gegeven, die de capillaire buis 11 toont met zijn twee open einden 12,13 die in 10 afzonderlijke elektrodereservoirs 14, 15 zijn gedompeld met de elektrodes 16, 17, die daar ook in zijn gedompeld. Energie wordt toegevoerd aan de elektrodes door een energiebron 18.

Als typisch voorbeeld bevat het kathodereservoir 14 persulfaation, en het anodereservoir 15 triëthanolam-moniumion, terwijl het capillair, voor het aanbrengen van de elektrische potentiaal, gevuld wordt met een mengsel van acrylamide, N,N' -methyleenbisacrylamide, en triëthanolaminehydrochloride.

15 De grootte van de elektrische potentiaal is niet kritisch. De voornaamste ovenweging zal het vermijden van een overmatige Joule-verwarming zijn die optreedt in het capillair tengevolge van de stroom. Terwijl de Joule-verwarming verminderd kan worden door koelen via de capillaire wanden, zal het in de meeste gevallen niet praktisch zijn om de buitenkant van de capillaire oppervlakte met een vloeibaar koelmedium in contact te brengen. Dienovereenkomstig wordt de Joule-verwarming in het algemeen gecontroleerd door het 20 voltage te begrenzen. In de meeste gevallen zal de potentiaal zich bevinden in het traject van ongeveer 0,5 tot 20 V per cm capillaire lengte, bij voorkeur in het traject van 1,0 tot 10 V per cm capillaire lengte.

Het is ook van belang dat de potentiaal laag genoeg is om te voorzien in een langzame en gelijkmatige beweging van het initiatorfront door het binnenste van het capillair, op een manier die ervoor zorgt dat het front zo wordt gehouden dat een zo scherp mogelijke toename van initiatorconcentratie als mogelijk is, 25 optreedt. Het doel hiervan is zo goed als mogelijk te verzekeren dat de polymerisatie snel optreedt in relatie tot de lineaire snelheid van het front, waarbij alle vloeistofbeweging die het gevolg is van het krimpen van de niet gepolymeriseerde delen beperkt wordt tot de voorkant van het front. De optimale potentiaal en daarmee de frontsnelheid zal variëren per systeem, waaronder het type geimonomeer en verknopingsmiddel en hun concentraties. In de meeste gevallen zullen de beste resultaten verkregen worden met een front dat 30 beweegt met een lineaire snelheid van ongeveer 0,003-0,3 cm/min, bij voorkeur van ongeveer 0,01-0,1 cm/min.

Wanneer de gel gevormd is met de gewenste graad van polymerisatie, heeft het de voorkeur om alle niet gepolymeriseerde componenten die gebruikt worden voor de gelvorming, zoals de initiator en de katalysator, uit de gel te verwijderen. Dit wordt snel bereikt door de oplossingen in de elektrodereservoirs te vervangen 35 door de achtergrondelektrolyt die gebruikt wordt in de hiernavolgende elektroforetische scheiding. Dit zal afhankelijk van de scheiding die men wil uitvoeren variëren, maar de procedure is standaard en toepasbaar voor al dergelijke elektrolyten. Een spanning wordt toegepast om het elektrolyt door de gel te laten stromen waarbij de initiator en katalysator worden verwijderd.

Nogmaals, de belangrijkste overweging is het vermijden van een overmatige Joule-verwarming die zou 40 kunnen leiden tot een uiteenvallen van de gel. Het instellen van het evenwicht kan bekeken worden door een on-line detector zoals een UV detector, die een gestabiliseerde basislijn zal laten zien wanneer al de bewegende fronten het capillair hebben verlaten.

Capillaire gels die gevormd in overeenstemming met deze uitvinding zijn bruikbaar voor het uitvoeren van een grote verscheidenheid aan scheidingen, waaronder die welke eerder uitgevoerd werden in capillaire 45 buizen en die welke uitgevoerd werden in gel-media. Dergelijke scheidingen omvatten, scheidingen van eiwitten, peptides, oligonucleotides en oligosaccharides.

Het volgende voorbeeld is als illustratie bedoeld

Voorbeelden 50 A. Capillaire bedekking

Een 40-cm lange capillaire buis van gesmolten silica (50 pm interne diameter, 187 pm externe diameter, Polymicro Technologies, Phoenix, Arizona, U.S.A.) werd achtereenvolgens gespoeld met 1 M NaOH en gedestilleerd water, elk gedurende 30 minuten. Het capillair werd gevuld met een oplossing bereid uit 4 pl 55 y-methacryloxypropyltrimethoxysilaan in 1 ml van 6 mM azijnzuur. Na ten minste 1 uur, werd het capillair gedurende enkele minuten gespoeld met gedestilleerd water, en daarna geleegd. Het capillair werd daarna gevuld met een ontluchte oplossing van 2,5% acrylamide bevattend 0,1% ammoniumpersulfaat en 0,1% 5 194562 Ν,Ν,Ν',Ν' -tetramethylethyleendiamine (TEMED). Na 30 minuten werd het capillair gedurende 5 minuten gespoeld met gedestilleerd water en daarna geleegd.

B. Gelvorming 5 Het beklede capillair werd gevuld met een mengsel bevattend 5,8% acrylamide (T = 6%), 0,18% Ν,Ν'-methyleenbisacrylamide (C = 3%), en 100 mM triëthanolaminehydrochloride. Eén eind van het capillair werd geplaatst in een flesje dat 10% ammoniumpersulfaat en een platinadraadelektrode bevatte. Het andere eind van het capillair werd geplaatst in een flesje met 25% triëthanolamine en een tweede platinadraadelektrode. De elektrodes werden verbonden met een laag-voltage gelijkstroom energiebron met de eerste 10 elektrode als de anode en de tweede als de kathode, en een potentiaal van 160 V (d.w.z., 4 V/cm) werd toegepast gedurende 8-15 uur.

De kathode- en anodeflesjes werden daarna vervangen door flesjes die de achtergrondbuffer bevatten, die gebruikt zou worden bij de elektroforetische scheiding, waarbij de buffer bevat 100 mM tris (hydroxymethyl) aminomethaan, 200 mM 2-(N-morfolino)-ethaansulfonzuur en 1% natriumdodecylsulfaat. Een hoog 15 voltage (500 V) werd daarna gedurende 5 uur toegepast, gevolgd door een stapsgewijze toename in het voltage op een dergelijke manier dat de Joule-verwarming die gevormd werd in het capillair de 0,5 mW/cm niet overschreed. Deze equilibrering met de achtergrondbuffer werd voortgezet totdat de stroom zich stabiliseerde bij een constant voltage en een online variabele golflengte UV-absorptiedetector (UVIDEC 100 IV, Jasco, Tokyo, Japan), die was bevestigd aan een deel van het capillair waarvan de polymere bedekking 20 verwijderd was, op een plaats ongeveer 15 cm van een einde, een gestabiliseerde basislijn gaf waarmee werd aangegeven dat al de bewegende grenslijnen voorbij waren gekomen.

C. Gebruik van een gel-gevuld capillair bij de scheiding van eiwitten

Elektroferese van een monster van onbehandelde muizeurine werd uitgevoerd in een 35 cm lengte van het 25 gel-gevulde capillair van Sectie B uit het voorbeeld. De lengte van het capillair tot de detector was 20 cm, en de detector die beschreven is in Sectie B werd gebruikt. Het achtergrondelektrolyt was identiek aan dat zoals boven beschreven, met 0,1-1,0% natriumdodecylsulfaat. Monsters werden door elektromigratie ingevoerd gedurende 5-60 seconden bij 100 V/cm. Het resulterende detectorsignaal wordt getoond in figuur 2, welke in overeenstemming is met analyses die op een andere manier gegenereerd zijn uit het 30 monster van dezelfde bron.

D. Gebruik van gel-gevuld capillair bij de scheiding van oligosaccharides

Een op analoge wijze verkregen capillair werd gebruikt bij de scheiding van oligosaccharides. Het capillair had een interne diameter van 100 pm en een lengte van 27 cm, waarvan 19 cm de effectieve lengte was.

35 De gelmaterialen en polymerisatiewerkwijze waren dezelfde als die beschreven in de Secties A en B, en de uiteindelijke gel werd gekarakteriseerd door T = 10%, C = 3%. De buffer was 0,1 M Tris/0,25 M boraat/7 M ureum bij pH = 8,33.

Het eerste monster dat gescheiden werd,bestond uit een mengsel van het volgende : 1. glucose 40 2. maltose 3. maltotriose 4. maltotetraose 5. maltopentaose 6. maltohexaose 45 7. maltoheptaose.

Elke soort werd via reductie geamineerd en vóór de scheiding gelabeld met een aminoselectief fluorogeen middel, om detectie door middel van laser-geïnduceerde fluorescentie mogelijk te maken. Injectie werd uitgevoerd door elektromigratie bij 3 kV gedurende 10 seconden. Voor de scheiding was het toegepaste voltage 7 kV (264 V/cm) bij 18 μΑ. Het resulterende detectorsignaal wordt getoond in figuur 3a, 50 waarbij de pieken geïdentificeerd 2ijn door middel van de nummers zoals hierboven vermeld.

Het tweede monster dat gescheiden werd bestond uit een mengsel welk gevormd werd uit de partiële hydrolyse van het polysaccharidemaltodextrose (Dextrine 15), op dezelfde manier geamineerd en gelabeld als de oligosaccharides uit het eerste voorbeeld. Injectie werd uitgevoerd door elektromigratie bij 5 kV gedurende 30 seconden en de scheiding werd uitgevoerd met een toegepast voltage van 7 kV (264 V/cm) 55 bij 18 μΑ. Het resulterende detectorsignaal wordt getoond in figuur 3b, waarin de pieken genummerd zijn om de gevonden oligomeren voor te stellen.

Claims (10)

194562 6 E. Gebruik van gel-gevuld capillair bij de scheiding van oligonucleotides. Nog een capillair, ook op analoge manier vervaardigd, werd gebruikt voor de scheiding van een polynucleo-tidemengsel bestaande uit pd (Α)^.^ en pd (A)40^0. Het capillair had een wendige in diameter van 75 pm en een lengte van 27 cm, waarvan 20 cm de effectieve lengte was. De gelmaterialen en polymerisatie-5 werkwijze waren dezelfde als die welke beschreven zijn in de secties A en B, en de uiteindelijke gel werd gekarakteriseerd door T = 10%, C = 5%. De buffer was 0,1 M Tris-boraat/7 M ureum bij pH = 8,1, en het toegepaste voltage was 7,5 kV, 3 pA. De resultaten worden getoond in figuur 4, waarin getoond wordt dat duidelijke scheidingen bereikt werden. 10

1. Werkwijze voor het verkrijgen van een met gel gevulde capillaire kolom voor gebruik in capillaire 15 elektroforese, welke werkwijze de volgende stappen omvat: (a) het vullen van een capillaire buis, die een eerste en tweede uiteinde bezit, met een oplossing van gelvormend materiaal dat een gelvormende polymerisatiereactie kan ondergaan, wanneer deze in aanraking wordt gebracht met een polymerisatie-initiator; (b) het dompelen van het eerste uiteinde van de capillaire buis in een eerste elektrode-oplossing, waarin 20 de polymerisatie-initiator in een vorm is opgelost, die migratie kan ondergaan wanneer deze wordt blootgesteld aan een elektrisch veld, en het dompelen van het tweede uiteinde van de capillaire buis in een tweede elektrode-oplossing, en (c) het aanleggen van een elektrische potentiaal tussen de eerste en de tweede elektrode-oplossing door de capillaire buis, bij omstandigheden die hoofdzakelijk vrij zijn van elektro-osmotische stroming, om 25 migratie te verkrijgen van de polymerisatie-initiator in de capillaire buis, geleid door een front van de polymerisatie-initiator die van het eerste uiteinde met een vooraf vastgestelde lineaire snelheid door de capillaire buis naar het tweede uiteinde beweegt, waardoor de polymerisatiereactie langs dit front plaatsvindt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de polymerisatie-initiator een vrije radicaal-initiator is.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, waarin de vrije radicaal-initiator een persulfaation is, en de concentratie van het persulfaation in de eerste elektrode-oplossing het traject van 0,1 tot 1,0 M ligt.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin het gelvormend materiaal bestaat uit een acrylamidemonomeer, een verknopingsmiddel en een base, en waarin de tweede elektrode-oplossing een oplossing van genoemde base is.

5. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de capillaire buis een gesmolten silica-capillair is, waarvan de wendige oppervlakte bekleed is met een elektroosmose-onderdrukkende stof.

6. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de capillaire buis een wendige diameter in het traject van 20 tot 100 micron heeft.

7. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de elektrische potentiaal van stap (c) varieert van 1,0 tot 10 V per 40 cm lengte van de capillaire buis.

8. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de voorafbepaalde lineaire snelheid van stap (c) varieert van 0,01 tot 0,1 cm/min.

9. Werkwijze volgens conclusie 4, waarin de base een amine is.

10. Werkwijze volgens conclusie 4, waarin de base een amine is gekozen uit de groep die bestaat uit 45 Ν,Ν,Ν',Ν'-tetramethylethyleendiamine, B-dimethylaminopropionitril en triëthanolamine. Hierbij 4 bladen tekening