JPH0875702A

JPH0875702A - 部分固定式ゲル充填電気泳動カラムおよびそれを用いる分析装置

Info

Publication number: JPH0875702A
Application number: JP6209556A
Authority: JP
Inventors: Katsuhiko Murakami; 勝彦村上; Hideki Kanbara; 秀記神原; Takashi Anazawa; 隆穴沢; Satoshi Takahashi; 智高橋
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1994-09-02
Filing date: 1994-09-02
Publication date: 1996-03-22

Abstract

(57)【要約】【構成】ゲル充填電気泳動装置のゲルキャピラリカラム
において、ゲル固定のための化学反応処理を、ゲルを保
持する担体とゲルが接触する面のうち、一部分のみに施
したもの。【効果】キャピラリがシラン処理されていない部分のゲ
ルは、壁に固定されていないので、ゲル重合に伴う体積
収縮の時に、ゲルの移動によって他の場所からゲルが補
給され、気泡が発生しない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＤＮＡ，ＲＮＡ又は蛋
白質などの分離分析装置に係り、特にゲル充填カラムお
よびそれを用いた電気泳動による分析装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡ，ＲＮＡ等の分析技術は、遺伝子
解析や遺伝子診断を含む医学的，生物学の分野において
の基礎技術として重要である。特に最近では、ゲノム解
析計画に関連して、高速，高スループットの電気泳動装
置の開発がなされている。

【０００３】蛍光標識された試料を、電気泳動により分
子量分離し分析する電気泳動法としては、従来では２枚
のガラス板（縦３０cm〜５０cm，横１５cm〜２０cm）の
間に厚さ０.２mm〜０.３mmのポリアクリルアミド製ゲル
を挟んだ媒体、いわゆる、スラブゲルを用いる方法がよ
く使われているが、最近ではゲルを充填した溶融石英キ
ャピラリ（以下、簡単のためゲルキャピラリと言う）を
使用した、高速泳動が可能なゲルキャピラリ電気泳動が
注目されている（アナリティカルケミストリー，第６２
巻，９００頁(１９９０年)(Analytical Chemistry Vol
62 P.900(1990)))。

【０００４】通常、キャピラリ電気泳動装置では一本の
キャピラリ管を用いその下端近傍で検出する。キャピラ
リ外表面全体は、ポリイミドによってコーティングされ
ているので、キャピラリの試料検出部分のポリイミドの
コーティングを除去してガラスが露出した窓を作り、そ
の窓の部分で蛍光吸収度を測定することによって検出す
る。あるいは、その窓の部分を光照射して試料にあらか
じめ付加しておいた蛍光体を励起し、蛍光体から発せら
れる蛍光を検出することによって、試料の検出を行う。
しかし、この方法はキャピラリが１本のため一度に扱え
る試料が一つと少ない、という難点があった。

【０００５】そこで最近、キャピラリ複数本をアレー化
して多くの試料を同時に分析する装置が開発されている
（ネイチャー，第３６１巻，５６５−５６６頁，１９９
３年（Nature, Vol 361 P.565−566，1993))。この装置
では、試料がキャピラリ内のゲルによって分子量分離さ
れながら通った後、試料がゲルキャピラリ中から緩衝液
中に溶出する。このとき、キャピラリの出口付近の緩衝
液中の場所を光照射して蛍光を検出することによって、
試料を検出するものである。

【０００６】ゲルキャピラリを用いた電気泳動では、ゲ
ルをキャピラリに固定するため、ゲルキャピラリを作製
するときに、キャピラリ内側全面にシラン処理を行う。
シラン処理とは、この場合ゲルとキャピラリのガラス表
面を化学的に結合する処理である。これによりキャピラ
リ内のゲルが安定化し、くりかえし使用が可能となる。
シラン処理を行わずに、同じゲルキャピラリを何度も使
用するとゲルが変性し、分離能力が低下するため、次第
に使えなくなる。しかし、シラン処理を行うと、アクリ
ルアミドのポリマとキャピラリ内側のガラス表面が、化
学的に結合するので、ゲルとキャピラリが固定され、電
気浸透流によるゲルの移動、あるいは温度変化によるゲ
ルの体積変化が抑制されるという効果がある。そのた
め、シラン処理は、ゲルキャピラリの使用可能な回数を
増やすので、ゲルキャピラリ電気泳動において、一般的
に行われている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】シラン処理を行ったキ
ャピラリ内に、アクリルアミドモノマ水溶液（例えば、
５％Ｔ (Total monomer concentration) ，５％Ｃ (Cro
ss linking material concentration)のゲル濃度）を充
填して重合させると、モノマ水溶液の時の体積のほうが
重合した時のゲルの体積よりも僅かに大きいので、重合
後、ゲルキャピラリ内に「気泡」と呼ばれるゲルのない
負圧の空間ができることがしばしばある。気泡の発生が
確認されたとき、その大きさは、キャピラリの内径程度
（例えば、内径１００μｍのキャピラリに対しては、気
泡の直径が２０μｍから１００μｍ）であり、その個数
は、約５０cm長のキャピラリ一本に対して数個から数十
個である。

【０００８】気泡が存在すると、電圧をかけたときに、
気泡周辺の電気抵抗が大きいために、発熱量が増し、温
度が上昇するので、ゲルが破壊されて、泳動ができなく
なってしまう。キャピラリのシラン処理をしないと、気
泡の発生が抑制されるが、上記のようなゲルから試料を
抜き出して計測するタイプのキャピラリアレー式電気泳
動装置（ネイチャー，第３６１巻，５６５−５６６頁）
では、泳動中にゲルがキャピラリから抜け出て計測障害
を起こすので使えない。ゲルが抜け出ると、分離が悪く
なり、蛍光を励起する光が散乱して、精密な検出が出来
なくなる。ゲルが抜け出る原因は、電気浸透流や、ゲル
の発熱による膨張である。

【０００９】本発明の目的は、ゲルがキャピラリから抜
け出ないゲルキャピラリを作製することと同時に、ゲル
重合時の気泡発生を防止することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、キャピラリ内
のシラン処理をする場所を、ゲルとキャピラリの接する
面すべてではなく、キャピラリの片側末端（例えば、試
料検出側の末端）の一部分に限定することを特徴とす
る。これによって、ゲル重合時の体積収縮に伴って生じ
る気泡生成場所への、ゲルの供給を容易にすることがで
き、気泡の発生を回避でき、かつゲルをキャピラリ内に
固定することができる。

【００１１】

【作用】ゲルが重合する時、ゲルの体積収縮が起こる。
従来のように、キャピラリの全面をシラン処理している
場合、キャピラリ壁付近に位置するゲルは、シラン処理
によって壁にしっかり固定されている。このため、キャ
ピラリ壁付近のゲルが、キャピラリ中心部に位置するゲ
ルを引っ張る形になる。その結果、中心部に位置するゲ
ルは、ゲルの体積収縮時の力によって引き裂かれ、そこ
に気泡が生じる。これは、カラムの形状が円柱であるこ
とが一つの原因である。従来のように平板に挟まれた形
であれば、ゲルが収縮しても、ガラス板の間隔が縮むの
で気泡が発生しない。しかし、キャピラリのように円柱
であれば、ゲルの体積収縮に伴ってカラムの容積を変え
るというようなことは出来ないので、気泡発生は避けら
れなかった。これは、カラムの形状が角柱であっても同
様である。

【００１２】しかし、本発明のように、キャピラリの片
側一部分しかシラン処理していない場合、シラン処理し
ない部分では、ゲルがキャピラリ内壁に固定されてない
ので、ゲルが全体にキャピラリの壁にそって、キャピラ
リ円筒軸方向にスライドすることが可能になる。ゲルが
収縮しようとすると、ゲルは全体的に収縮することがで
き、収縮した体積分は、キャピラリの外からゲルが補充
されるので、気泡が出来にくくなる。また、シラン処理
した部分では、処理をした面積（すなわち、ゲルがキャ
ピラリ壁に固定される面積）が従来よりも小さいので、
ゲルの体積変化による歪みが少ない。この歪みは、シラ
ン処理していない部分のゲルによって補われる。このた
め、気泡の発生を回避することが容易になっている。

【００１３】従来技術の説明中、キャピラリの末端から
試料を抜き出して蛍光検出する装置について言及した
が、この装置構成では、シラン処理を全くしなければ、
電気泳動の最中にキャピラリからゲルの一部が出てくる
ことがある。ところが本発明では、検出側の末端にシラ
ン処理を施すことによって、ゲルがキャピラリから抜け
出さないようになっているので、上記のような問題がな
い。本発明は、シラン処理などのように、ゲルをキャピ
ラリに固定しておく処理を必要とするようなゲルキャピ
ラリの作製に、特に有効である。

【００１４】

【実施例】図１は、本発明の一実施例による部分シラン
処理中のキャピラリの図である。本発明を実現するため
のキャピラリは、表１の処理手順に従って内面処理され
る。ゲルを充填するフューズドシリカキャピラリは、内
径１００μｍ，外径２００μｍのものを５０cm長毎に切
断する。これを４本ずつ束ねて片端(Bundle端８)にシリ
ンジにつなげるための三方活栓１をとりつけ、シリコン
ゴムなどの接着剤で固める。

【００１５】次いで、キャピラリ２の内面をシラン処理
する。まず、１ＭのＮａＯＨ水溶液にキャピラリ２の一
方の端（シラン処理側）をつける。ＮａＯＨ水溶液は、
表面張力によってキャピラリ２の中に入っていく。１０
cmほど溶液が入ったところで、キャピラリ２をＮａＯＨ
水溶液から出し、液の侵入を止める。溶液を入れる長さ
は、シラン処理の時間や温度にもよるが、測定時にゲル
が抜け出ない範囲内で、これより長くしても短くしても
よい。

【００１６】本例では、測定直前に５cmほどキャピラリ
２を切断するので、測定中ゲルを保持する部分の長さは
約５cmになる。キャピラリ２の内面とＮａＯＨ水溶液を
１０分間反応させた後、フィルタ(０.２μｍ）でろ過し
たDouble Distilled Water（ＤＤＷ)を、シラン処理側
の反対側(Bundle端８）から入れ、キャピラリ２の容積
の１０倍量流して洗浄する。その後、Bundle端８からエ
タノールをキャピラリ２の容積の１０倍量流す。

【００１７】次に、溶液の侵入を容易にするため、１２
０℃で２０分間熱処理し、キャピラリ２の内部を乾燥さ
せる。この時、キャピラリ２の内面は、エタノールが残
っているため、水の場合よりも速く乾燥して都合がよ
い。そして，キャピラリ２のシラン処理側を１％γ−Ｍ
ＡＰＳのエタノール溶液（シラン処理液）５につけてキ
ャピラリ２の端（シラン処理側）から約１０cmの長さに
相当するシラン処理部分４にシラン処理液を入れる。１
０分間反応させた後、フィルタ(０.２μｍ）でろ過した
ＤＤＷ（キャピラリ容積の１０倍量）をBundle端８から
注入して洗浄し、最後はキャピラリ２の内部をＤＤＷで
満たす。キャピラリ２は、この状態のまま室温で保存し
てよい。

【００１８】

【表１】

【００１９】キャピラリ２に充填するアクリルアミド溶
液の作製方法は次のとおりである。ウレア８.４ｇ, １
０×ＴＢＥストック溶液(８９０ｍＭ Tris,８９０ｍＭ
boricacid，２５ｍＭ EDTA，ｐＨ８.３）２ｍｌと、冷
暗所で保存しておいた５０％アクリルアミド水溶液，
２.５％ビスアクリルアミド水溶液を所定のゲル濃度と
なるように適量を混合し、フィルタ(０.２μｍ）でろ過
したＤＤＷを加えながら２０ｍｌに調整することによ
り、ゲル濃度の異なる７Ｍウレア，１×ＴＢＥのバッフ
ァ溶液を調製する。

【００２０】次に、溶液をフィルタ(０.２μｍ）でろ過
し、超音波で15分から30分よく脱気する。空気が全く出
なくなったところで、脱気を止め、溶液を５分間から１
０分間氷冷した後、重合開始剤として１０％ペルオキソ
硫酸アンモニウム，重合促進剤としてＮ，Ｎ，Ｎ′，
Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミンをそれぞれ５０μ
ｌ（０.０２５％），５μｌ（０.０２５％）加え、よく
混ぜた後、シリンジに吸引し，三方活栓１を介してキャ
ピラリ２に注入する。このとき、アクリルアミド溶液を
キャピラリ２に直接吸引して入れる方法も、考えられ
る。キャピラリ２の中に、重合中のアクリルアミド溶液
をキャピラリ２の容積の１０倍量流したら、そのまま室
温で一晩放置する。ゲルキャピラリ２は、試料の泳動前
に３.５kＶ（１００Ｖ／cm）で３０分から１時間予備泳
動を行い、両端を切断して３５cmとして用いる。

【００２１】上記の例において、末端部のシラン処理の
最中、ＭＡＰＳが蒸発し、キャピラリ２の空洞部６を拡
散することによって、キャピラリ２の中央部分がシラン
処理される可能性がある。したがって、反応温度につい
ては上記実施例の室温でなく、これを摂氏０度から１５
度の間に下げて、空気中へのＭＡＰＳ拡散を抑制するこ
とも考えられる。空気中拡散の抑制は、ＭＡＰＳ溶液の
ＭＡＰＳ濃度を下げることによっても（例えば、実施例
の１％でなく、０.１％から０.５％の間のうすい濃度に
することによっても）実現できる。あるいは、蒸留水な
どの親水性の溶液であらかじめキャピラリ２内を満たし
ておき、その後、シラン処理部分４にＭＡＰＳ溶液を吸
い入れることによって、末端シラン処理を行うことも考
えられる。

【００２２】本実施例では、四本一束にしたキャピラリ
２の内面処理方法およびゲル充填方法を示したが、キャ
ピラリ２が何本であっても、同様の方法でゲルキャピラ
リ２が作製できる。ゲルの担体となるキャピラリ２は、
円柱形のものでなくても、例えば角柱形のものでも本発
明の効果がある。

【００２３】

【発明の効果】装置の構成上の理由や、再利用時の安定
性を高めるなどの理由で、キャピラリとキャピラリ内の
ゲルを固定する必要がある場合、キャピラリ内面にシラ
ン処理などの化学処理を行う必要があるが、これには気
泡発生という問題が伴う。本発明によって、この問題を
回避してゲルキャピラリを作製することができる。本発
明では、全くシラン処理をしない場合と違って、ゲルキ
ャピラリを数回使用することができる。本発明は、シー
スフローを用いてゲルキャピラリ外部に試料を誘導し、
蛍光検出する装置に対して、特に有効である。

【図面の簡単な説明】

【図１】部分シラン処理中のキャピラリの説明図。

【符号の説明】

１…三方活栓、２…キャピラリ、３…非シラン処理部
分、４…シラン処理部分、５…１％γ−ＭＡＰＳのエタ
ノール溶液、６…空洞部分、７…容器。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者高橋智東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地株式会社日立製作所中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ゲルをカラムに固定させるため、ゲルを保
持するカラムとゲルが接触する部分の一部分に、化学反
応処理を施したことを特徴とするゲル充填カラム。
【請求項２】請求項１において、前記カラムの材質が、
溶融石英であって、ゲルとカラムの固定のための化学処
理がシラン処理であるゲル充填カラム。
【請求項３】請求項２において、前記シラン処理の溶剤
が、γ−メタアクリルオキシプロピルトリメトキシ
シラン（ＭＡＰＳ）であるか、またはトリクロロメチル
シランであるゲル充填カラム。
【請求項４】請求項１，２または３において、前記カラ
ムが硬質の担体であって、カラム内のゲルの形状が円
柱、または角柱であるゲル充填カラム。
【請求項５】請求項１，２，３または４において、ゲル
とカラムを固定する化学反応処理が、カラムの試料注入
側末端部分のみであるゲル充填カラム。
【請求項６】請求項１，２，３または４において、ゲル
とカラムを固定する化学反応処理が、カラムの試料検出
側末端部分のみであるゲル充填カラム。
【請求項７】試料の検出手段が、カラムの外側に試料を
抜き出してさらに緩衝液によるシースフローを用いた手
段であることを特徴とする請求項１から６のいずれか１
項に記載のゲル充填カラムを含む分析装置。
【請求項８】請求項１〜６のいずれか１項記載のゲル充
填カラム及び光学的検出手段を含む分析装置。