FR2657150A1 - Systeme et procede pour la cryopreservation de cellules. - Google Patents
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Abstract
Le système (10) utilise un réfrigérant pré refroidi emmagasiné dans un réservoir de réfrigérant (14) qui est pompé à un taux contrôlé dans un récipient à échantillon (12). Il permet d'obtenir un taux contrôlé de refroidissement de l'échantillon et le contrôle de la formation des cristaux dans celui-ci. Le réservoir à réfrigérant (14) est étanche et le réfrigérant est pompé du réservoir à échantillon (12) vers le réservoir à réfrigérant (14) de sorte que la chaleur de la pompe ne pénètre pas dans le récipient à échantillon (12). Un agitateur magnétique (30,31,32) est contrôlé de façon à obtenir une température uniforme dans le récipient à échantillon (12) ou mis hors service pour permettre une stratification de température. Application à la cryopréservation d'échantillons de cellules biologiques.
Description
2657150 '
La présente invention se rapporte aux techniques de cryopréservation d'un échantillon de cellules biologiques.
La préservation d'échantillons de cellules vi-
vantes est un domaine très important de la science Il est essentiel pour la préservation à long terme, entre autres, d'échantillons tissulaires, de sperme et d'ovules fécondés (zygotes) Le refroidissement d'échantillons de cellules à des températures cryogéniques et alors le maintien des échantillons à des températures cryogéniques est utilisé de façon typique pour la préservation Le refroidissement doit
être contrôlé avec soin pour réduire la dimension des cris-
taux de sorte que ces derniers ne puissent atteindre des
dimensions qui sont susceptibles d'endommager les cellules.
Au cours du refroidissement, la température varie de la température ambiante à environ -40 à -50 e C et est critique
pour la formation des cristaux Un contrôle précis du re-
froidissement dans cette zone de température est essentiel à la viabilité de l'échantillon La zone de températures la plus critique est comprise entre environ 00 C et quelques degrés en-dessous de -8 'C Dans cette zone, un échantillon
libère de la chaleur de fusion au cours du refroidissement.
Ainsi, dans cette zone, la quantité de chaleur qui doit être extraite pour maintenir un gradient de refroidissement programmé augmente de façon sensible Il en résulte que le taux d'extraction de chaleur nécessite un contrôle précis si l'on veut maintenir un taux de refroidissement désiré pendant cette zone de température Une fois l'échantillon
refroidi en-dessous d'une température d'environ -40 ou -
50 C, la formation de cristaux ne présente plus de problème
et ainsi un contrôle moins précis du taux de refroidisse-
ment est permis.
Les paramètres de refroidissement pour diffé-
rentes lignes de cellules peuvent différer entre eux.
Ainsi, les programmes de refroidissement (température, vi-
tesse et durées) pour différentes lignes de cellules peu-
vent également être différents.
Actuellement, deux façons pour obtenir le refroidissement des cellules sont utilisées Le refroidissement au moyen d'un gaz liquéfié (normalement de l'azote liquide) et un refroidissement par réfrigération mécanique. Lorsqu'on utilise de l'azote liquide, il est
possible d'obtenir un gradient de température très élevé.
Par exemple, un taux de refroidissement initial qui peut atteindre 800 C par minute est possible L'échantillon est usuellement plongé dans un récipient contenant de l'azote liquide Cependant il en résulte un taux de refroidissement important, et ce taux de refroidissement ne peut pas être contrôlé Egalement, l'azote liquide présente un problème
de manipulation.
Un meilleur contrôle du refroidissement est ob-
tenu en utilisant la vapeur d'un gaz liquéfié (azote li-
quide) L'échantillon à refroidir est placé dans un réci-
pient avec l'azote liquide, mais sans contact physique avec le liquide On utilise la vapeur froide qui provient de
l'azote liquide pour réaliser le refroidissement Ce pro-
cédé présente l'inconvénient de la capacité thermique
faible du gaz Il en résulte qu'il est difficile de mainte-
nir des taux de refroidissement et des températures uni-
formes dans un échantillon.
Le refroidissement mécanique utilise un groupe de réfrigération qui emploie des bobines de fluide réfrigérant qui sont disposées sur les parois d'un récipient contenant l'échantillon Un moyen de transfert de chaleur, comme par exemple de l'éthanol disposé dans le récipient contenant l'échantillon favorise le transfert de
chaleur de l'échantillon aux bobines de fluide réfrigérant.
Cette technique ne nécessite pas l'utilisation d'azote liquide et peut fournir un refroidissement qui peut descendre jusqu'à au moins -80 C Cependant, le gradient de température qui peut être obtenu par réfrigération mécanique est limité à environ 2-3 degrés Celsius par minute Pour de nombreux échantillons biologiques, ce taux de refroidissement n'est pas suffisant pour empêcher la formation de cristaux atteignant des dimensions susceptibles d'endommager les cellules dans la zone de températures critiques supérieures à -400 C. Un objet de la présente invention est de proposer un refroidissement contrôlé d'un échantillon avec
la possibilité d'obtenir un gradient de température élevé.
Un autre objet de l'invention est de proposer un système de refroidissement contrôlé qui ne nécessite pas
la manipulation de gaz liquéfié.
En bref, un système de préservation de cellules utilise un agent réfrigérant pré-refroidi, emmagasiné dans
un réservoir de réfrigérant qui est pompé à un taux déter-
miné vers un récipient contenant un échantillon Ceci per-
met l'obtention d'un taux contrôlé de refroidissement de l'échantillon et le contrôle de la formation des cristaux
dans l'échantillon.
Selon un mode de réalisation de l'invention, il
est prévu un système pour refroidir un échantillon compre-
nant: un fluide réfrigérant, un récipient pour échantil-
lon, un réservoir de réfrigérant, un réfrigérant dans le récipient pour échantillon et le réservoir de réfrigérant,
des moyens pour faire circuler le réfrigérant entre le ré-
cipient contenant l'échantillon et le réservoir de réfrigé-
rant, des moyens pour refroidir le réfrigérant dans le ré-
servoir de réfrigérant et des moyens pour contrôler les
moyens prévus pour faire circuler le fluide de façon à ob-
tenir un taux prédéterminé de refroidissement de l'échan-
tillon dans le récipient à échantillon.
Selon une caractéristique de l'invention, il est proposé un procédé pour obtenir un refroidissement contrôlé d'un échantillon qui comporte le fait de placer un échantillon à refroidir dans un récipient à échantillon, à refroidir un réfrigérant dans un réservoir de réfrigérant, à faire circuler le réfrigérant à travers le réservoir de réfrigérant et le récipient contenant l'échantillon avec un taux de pompage tel que l'on obtienne le refroidissement de l'échantillon à un taux de refroidissement prédéterminé, et à dimensionner le réservoir de réfrigérant pour fournir une
capacité calorifique suffisante pour obtenir le refroidis-
sement au taux prédéterminé.
Ce qui précède et d'autres objets, caractéris-
tiques et avantages de la présente invention apparaîtront à
la lecture de la description qui va suivre et se réfère aux
dessins annexés dans lesquels les mêmes chiffres de
référence désignent les mêmes éléments.
La figure 1 est un schéma-bloc du système de la
présente invention.
La figure 2 est un dessin schématique d'un mode
de réalisation du système de la présente invention.
On peut voir sur la figure 1, désigné en 10, un schéma-bloc d'un système de cryopréservation de cellules selon un mode de réalisation de l'invention Un récipient d'échantillon 12 prévu pour recevoir un échantillon qu'il y
a lieu de refroidir, est placé en communication avec un ré-
servoir de fluide réfrigérant 14 qui contient le réfrigé-
rant pré-refroidi Le réfrigérant est pré-refroidi par un système de réfrigération 16 qui se trouve en communication
avec le réservoir de réfrigérant 14 Le réservoir de réfri-
gérant 14 est un réservoir étanche rempli de réfrigérant.
Le réfrigérant est pompé par la pompe 18 à partir d'un em-
placement qui se trouve au voisinage du sommet du récipient d'échantillon 12 vers le réservoir de réfrigérant 14 Etant donné que le réservoir de réfrigérant 14 est étanche et scellé, l'entrée de réfrigérant au sommet de celui-ci contraint le fluide réfrigérant pré-refroidi à circuler de la base du réservoir de réfrigérant 14 vers le récipient d'échantillon 12 Le fluide réfrigérant échange alors de la chaleur avec le contenu du récipient d'échantillon 12 La
température initiale et la capacité calorifique du réfrigé-
rant dans le réservoir de réfrigérant 14 et le taux avec lequel la pompe 18 fait circuler le réfrigérant déterminent le taux de refroidissement d'un échantillon se trouvant dans le récipient à échantillon 12 Cela signifie que si la pompe 18 est arrêtée, le refroidissement de l'échantillon
dans le récipient à échantillon 12 est limité par la tempé-
rature et la capacité thermique d'un moyen de transfert de chaleur existant dans le récipient à échantillon 12 Si la
pompe 18 fonctionne à grande vitesse, sensiblement la tota-
lité de la capacité thermique du réservoir de réfrigérant 14 est disponible pour refroidir l'échantillon Pour des vitesses intermédiaires de la pompe 18 des taux intermé-
diaires de refroidissement sont obtenus La vitesse de pom-
page de la pompe 18 est contrôlée par un contrôleur 20.
Il y a lieu de noter que la pompe 18 pompe du
fluide réfrigérant d'un emplacement situé au sommet du ré-
cipient d'échantillon 12 Le fluide réfrigérant est solli-
cité vers le récipient à échantillon 12 au voisinage de son fond Cela présente un certain nombre d'avantages Tout d'abord, la chaleur due au frottement engendré par la pompe 18 est transférée au réservoir de réfrigérant 14 plutôt que de l'être vers le récipient à échantillon 12 Egalement, le
fait d'extraire le fluide réfrigérant du sommet du réci-
pient à échantillon 12 et de faire pénétrer du fluide ré-
frigérant fraîchement refroidi à la base du récipient à échantillon 12 permet l'obtention d'une stratification de la température du fluide réfrigérant dans le récipient à
échantillon 12 comme cela sera décrit plus loin.
Si l'on considère maintenant la figure 2, le système de préservation de cellules 10 comporte un fluide
réfrigérant 24 qui se trouve dans un récipient à échantil-
lon 12 Le réservoir de réfrigérant 14 est rempli au moyen du réfrigérant 24 lequel est pré-refroidi par le système de réfrigération 16 Tout réfrigérant convenable peut être
utilisé dans le système de la présente invention Le réfri-
gérant doit être d'un type qui reste fluide pour la tempé-
rature la plus basse rencontrée dans l'appareil et doit être favorable pour un échantillon placé dans celui-ci Des exemples de réfrigérants convenables comportent l'éthanol et l'huile de silicone Un réservoir d'échantillon 26, contenant un échantillon qu'il y a lieu de refroidir, est placé dans le récipient à échantillon 12 Le réservoir
d'échantillon 26 est entouré par le réfrigérant 24 qui as-
sure le refroidissement Le taux de refroidissement est contrôlé en faisant varier la vitesse de la pompe 18 qui, à
son tour, est contrôlée par le contrôleur 20.
Comme cela est bien connu, en outre d'un échan-
tillon, le réservoir d'échantillon 26 peut également conte-
nir un fluide cryo-protecteur Etant donné que l'utilisa- tion d'un fluide cryo-protecteur est classique, il n'est
pas nécessaire de s'étendre sur ce sujet.
Pour assurer un échange de chaleur efficace entre un échantillon qui se trouve dans le réservoir d'échantillon 26 et le fluide réfrigérant 24, du fluide réfrigérant pré-refroidi 24 est fourni au récipient d'échantillon 12 par l'intermédiaire d'une tuyauterie
d'admission 34 disposée à la base du récipient à échantil-
lon 12 Le fluide réfrigérant, chauffé par contact avec le réservoir d'échantillon 26 sort du récipient à échantillon 12 par l'intermédiaire d'une tuyauterie de sortie 36 disposée au sommet du récipient à échantillon 12 De façon à fournir une température uniforme à l'intérieur du volume de fluide réfrigérant 24, un agitateur magnétique 30 est
disposé à l'intérieur du récipient à échantillon 12 L'agi-
tateur magnétique 30 est une masse ferromagnétique qui peut être libre à l'intérieur du récipient à échantillon 12 ou peut être maintenue par un palier destiné à guider sa rotation Un aimant permanent 31, disposé à l'extérieur du
récipient 12, est entraîné en rotation par un moteur d'agi-
tateur 32 Le couplage magnétique entre l'aimant permanent 31 situé à l'extérieur du récipient à échantillon 12 et le matériau ferromagnétique constituant l'agitateur magnétique situé à l'intérieur du récipient à échantillon 12 entraîne en rotation l'agitateur magnétique 30 de façon à ce que soit obtenue une température sensiblement uniforme
du fluide réfrigérant 24 à l'intérieur du récipient.
Le contrôleur 20 assure le contrôle du taux suivant lequel le fluide réfrigérant pré-refroidi 24 est fourni au récipient à échantillon 12 En conséquence, si l'on désire augmenter le taux de refroidissement dans le récipient à échantillon 12, la vitesse de pompage de la pompe 18 se trouve augmentée Ceci permet l'obtention d'un taux de refroidissement désiré quelconque De plus, le taux
de refroidissement peut être ajusté pour différents échan-
tillons ou peut être ajusté pour différents taux à diffé-
rentes étapes de refroidissement d'un échantillon particu-
lier. Il y a lieu de noter que l'agitateur magnétique
maintient une température sensiblement uniforme du ré-
frigérant 24 à l'intérieur du récipient à échantillon 12 A un certain point du programme de refroidissement, il peut être désirable d'arrêter l'agitateur magnétique 30 de façon à obtenir un refroidissement maximum d'un échantillon Ceci permet l'établissement d'une stratification de température dans le récipient à échantillon 12 Cela signifie que du fluide réfrigérant plus froid 24 pénétrant au voisinage de la base du récipient à échantillon 12 est admis à déplacer du fluide réfrigérant plus chaud qui se trouve au-dessus de lui de telle sorte que le réservoir à échantillon 26 se
trouve immergé dans un fluide réfrigérant 24 à une tempéra-
ture sensiblement correspondant à celle à laquelle il
quitte le réservoir de fluide réfrigérant 14.
Le contrôleur 20 peut fonctionner en boucle ou-
verte Cela signifie qu'il peut fonctionner sans réaction l'informant de la température effectivement atteinte au voisinage du réservoir d'échantillon 26 Dans un mode de réalisation à boucle ouverte, le contrôleur 20 comporte un microprocesseur qui contrôle la vitesse de pompage de la pompe 18 suivant un programme de temps prédéterminé Le programme est susceptible d'être choisi par l'opérateur en fonction du type ou de la dimension de l'échantillon qui se
trouve dans le réservoir à échantillon 26 Selon une va-
riante, un contrôle à boucle fermée peut être obtenu en utilisant, par exemple, une sonde de température classique 38. Une autre technique à réaction qui peut être utilisée à la place ou en supplément à la sonde de température 38 comporte le fait de prévoir un réservoir d'échantillon factice 46 comportant une sonde de température (non représentée) Les signaux provenant de la sonde de température qui se trouve dans le réservoir à échantillon factice 46 sont envoyés au contrôleur 20 Le réservoir d'échantillon factice 46 contient de préférence des matériaux ayant une capacité en température et en chaleur qui ressemble à celle du réservoir à échantillon 26 Ainsi, la température à l'intérieur du réservoir à échantillon factice 46 peut être considérée comme suivant de façon fidèle la température dans le réservoir à
échantillon 26.
Il est également envisagé selon l'invention
qu'une sonde de température (non représentée) peut être in-
sérée dans le réservoir à échantillon 26 pour mesurer di-
rectement la température dans ce dernier.
Le récipient à échantillon 12 comporte de préférence une couche isolante 40 autour de sa surface externe de façon à réduire les pertes calorifiques De même, le réservoir de fluide réfrigérant 14 comporte une couche isolante 42 sur sa surface extérieure Des bobines de refroidissement 44 sont disposées autour de l'extérieur du réservoir à fluide réfrigérant 14 en-dessous de l'isolant 42 Selon une variante, des bobines de refroidissement 44 peuvent être disposées à l'intérieur du réservoir à fluide réfrigérant 14 soit fixées sur sa surface interne ou suspendues à l'intérieur du fluide
réfrigérant 24.
La dimension du réservoir à réfrigérant 14, la
dimension du récipient à échantillon 12, la capacité de re-
froidissement du système de réfrigération 16, la quantité et le taux d'extraction de chaleur à partir du réservoir à échantillon 26 et le débit du système de cryopréservation
de cellules 10 sont des paramètres interactifs La tempéra-
ture du fluide réfrigérant 24 dans le réservoir de réfrigé-
rant 14 doit rester suffisamment basse pendant la durée de la fin d'un cycle de refroidissement pour atteindre le taux de refroidissement désiré Ainsi, la quantité initiale de fluide réfrigérant 24 dans le réservoir de réfrigérant 14
et sa température initiale doivent être telles que le ré-
frigérant 24 dans le réservoir de réfrigérant 14 a une ca-
pacité calorifique suffisante pour absorber toute la cha-
leur nécessaire à partir de l'échantillon qui se trouve dans le réservoir 26 pour réduire la température de l'échantillon à la valeur désirée et pour réaliser ceci à la vitesse de refroidissement désirée. Le débit (nombre d'échantillons refroidis par heure) est limité par la capacité de refroidissement du système de réfrigération 16 En fonctionnement normal, le
système de réfrigération 16 fonctionne de façon continue.
Au cours du refroidissement d'un échantillon, la tempéra-
ture du fluide réfrigérant 24 dans le réservoir de réfrigé-
rant 14 s'élève étant donné que le système de réfrigération 16 n'est pas capable d'extraire la chaleur aussi vite que nécessaire pour atteindre le taux de refroidissement désiré de l'échantillon Après le refroidissement d'un ou plusieurs échantillons, la température du réfrigérant 24 dans le réservoir de réfrigérant 14 peut s'élever à une valeur pour laquelle le refroidissement efficace d'un échantillon supplémentaire n'est pas possible Un cycle de refroidissement est alors nécessaire pour réduire la température du fluide réfrigérant dans le réservoir à réfrigérant 14 à une valeur permettant le refroidissement
de nouveaux échantillons.
En combinaison, les dimensions du réservoir de
fluide réfrigérant 14, les dimensions du récipient à échan-
tillon 12, le contrôle de pompage de la pompe 18, la capa-
cité de refroidissement du système de réfrigération 16 et
le débit d'échantillons sont des paramètres interactifs.
Une fois ces paramètres interactifs compris et une fois le système de cryopréservation de cellules 10 créé en conformité avec ceux-ci, le refroidissement contrôlé d'un échantillon pour une vitesse quelconque désirée est possible sans que l'on rencontre les inconvénients du
fluide réfrigérant qui consiste en de l'azote liquide.
L'homme de l'art comprendra que l'aimant perma-
nent 31 est simplement symbolique en tant que dispositif pour produire un champ magnétique tournant permettant le déplacement de l'agitateur magnétique 30 à l'intérieur du
récipient à échantillon 12 D'autres techniques pour en-
traîner magnétiquement l'agitateur magnétique 30 doivent être considérées comme faisant partie de l'invention Par
exemple, un ensemble de bobines magnétiques (non représen-
tées) peuvent être utilisées à la place de l'aimant perma- nent 31 et du moteur d'agitateur 32 Le contrôleur 20 peut
fournir des signaux dans le but d'exciter aes bobines ma-
gnétiques de façon à fournir un champ magnétique mobile
sous l'influence duquel l'agitateur magnétique se déplace.
De préférence, un champ magnétique tournant est prévu Ceci
ne doit pas être considéré comme excluant un champ magné-
tique alterné dans certaines applications particulières.
La précision du contrôle au cours du refroidissement peut être favorisée par le fait qu'on utilise en plus la possibilité d'un contrôle de chaleur au cours de certaines étapes du processus De plus, il peut être désirable d'augmenter la température du fluide réfrigérant 24 dans le récipient à échantillon 12 à la fin du refroidissement d'un échantillon lors de la préparation de la mise en place de l'échantillon suivant Un moyen de chauffage électrique 48 est prévu de façon optionnelle à l'intérieur du récipient à échantillon 12 à cet effet Le moyen de chauffage électrique 48 peut être contrôlé manuellement mais il est de préférence contrôlé par le
contrôleur 20.
La présence du moyen de chauffage électrique 48
permet également à l'appareil d'être utilisé pour le ré-
chauffage contrôlé des échantillons.
il
Claims (10)
1 Système ( 10) pour refroidir un échantillon caractérisé en ce qu'il comporte: un récipient d'échantillon ( 12); un réservoir de fluide réfrigérant ( 14); un fluide réfrigérant dans ledit récipient à
échantillon ( 12) et dans ledit réservoir à fluide réfrigé-
rant ( 14); des moyens ( 18) pour faire circuler ledit fluide réfrigérant entre ledit récipient à échantillon ( 12) et ledit réservoir à fluide réfrigérant ( 14); des moyens ( 16,44) pour réfrigérer ledit fluide réfrigérant ( 24) dans ledit réservoir de fluide réfrigérant ( 14); et des moyens ( 20) pour contrôler lesdits moyens
( 18) assurant la circulation pour obtenir un taux prédéter-
miné de refroidissement dudit échantillon dans ledit réci-
pient à échantillon ( 12).
2 Système selon la revendication 1, comprenant
en outre des moyens ( 30,31,32) pour agiter ledit réfrigé-
rant ( 24) dans ledit récipient à échantillon ( 12) de sorte qu'une température sensiblement uniforme soit maintenue
dans ce dernier récipient.
3 Système selon la revendication 2, dans lequel lesdits moyens d'agitation comportent: un agitateur magnétique ( 30) dans ledit récipient à échantillon ( 12); des moyens ( 31,32) pour produire un champ magnétique mobile dans ledit récipient à échantillon ( 12); et ledit agitateur magnétique ( 30) et lesdits moyens de déplacement du champ magnétique ( 31,32) étant
couplés magnétiquement de sorte que ledit agitateur magné-
tique ( 30) se déplace à l'intérieur dudit réservoir à
échantillon ( 12) pour agiter ledit réfrigérant dans ce der-
nier.
4 Système selon l'une quelconque des
revendications précédentes, dans lequel lesdits moyens pour
assurer la circulation ( 18) comportent une pompe ( 18); ledit réservoir de réfrigérant ( 14) étant étanche; ladite pompe ( 18) étant connectée de façon à pomper ledit réfrigérant ( 24) à partir dudit récipient à échantillon ( 12) vers ledit réservoir à réfrigérant ( 14) de
sorte que la pression engendrée dans ledit réservoir de ré-
frigérant ( 14) est susceptible de solliciter ledit réfrigé-
rant à partir dudit réservoir de réfrigérant vers ledit ré-
cipient à échantillon ( 12).
Système selon l'une quelconque des
revendications précédentes comportant en outre un
contrôleur ( 20) qui contrôle au moins lesdits moyens ( 18) pour assurer la circulation à une vitesse susceptible de permettre d'obtenir un taux prédéterminé de refroidissement. 6 Système selon la revendication 5, dans
lequel ledit taux peut être zéro.
7 Système selon l'une quelconque des
revendications précédentes, dans lequel lesdits moyens pour
assurer le contrôle comportent en outre: des moyens ( 38,46) pour détecter la température dans ledit récipient à échantillon ( 12), ledit contrôleur ( 20) contrôlant la vitesse de pompage de ladite pompe ( 18)
en réponse à ladite température.
8 Système selon l'une quelconque des
revendications précédentes comportant en outre des moyens
de chauffage ( 48) dans ledit récipient du fluide
réfrigérant ( 12).
9 Système selon la revendication 4, dans lequel ladite pompe à réfrigérant ( 18) est susceptible de pomper ledit réfrigérant ( 24) d'une partie supérieure dudit réservoir à réfrigérant ( 14) vers ledit récipient à échantillon ( 14) au voisinage d'une extrémité située à la base de celui-ci de sorte que ledit réservoir de réfrigérant ( 14) lorsque l'on effectue un pompage de réfrigérant ( 24) à travers celui-ci produit une pression susceptible de solliciter le réfrigérant à partir dudit réservoir à réfrigérant ( 14) vers ledit récipient à
échantillon ( 12).
Procédé pour assurer d'une façon contrôlée le refroidissement d'un échantillon caractérisé en ce qu'il consiste: à placer l'échantillon dans un réservoir à échantillon ( 12); à refroidir un réfrigérant ( 24) dans un réservoir ( 14)% à faire circuler ledit réfrigérant ( 24) à travers ledit réservoir de réfrigérant et ledit récipient à échantillon ( 12) avec un taux de pompage susceptible de refroidir ledit échantillon à un taux de refroidissement prédéterminée; à dimensionner ledit réservoir de réfrigérant ( 14) pour fournir une capacité calorifique suffisante pour
obtenir ledit refroidissement audit taux prédéterminé.
11 Procédé selon la revendication 10, dans le-
quel l'étape qui consiste à faire circuler le réfrigérant comporte le fait de faire entrer ledit réfrigérant dans une
partie inférieure dudit récipient à échantillon ( 12).
12 Procédé selon l'une des revendications 10
ou 11, comportant en outre l'étape qui consiste à agiter ledit réfrigérant dans ledit récipient ( 12) pour obtenir
une température sensiblement uniforme dans ce dernier.
13 Procédé selon l'une quelconque des
revendications 10 à 12, comportant l'étape qui consiste à
ajouter de la chaleur audit réfrigérant ( 24) dans ledit récipient à échantillon ( 12) dans le but d'augmenter la température dudit réfrigérant ( 24) dans ledit réservoir à échantillon ( 14) à une valeur convenable pour commencer le
refroidissement d'un nouvel échantillon.
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