FR2627589A1 - Procede immunoenzymometrique selectif pour le dosage de lipoproteines contenant de l'apob ou un fragment de celle-ci, anticorps monoclonaux anti-lp(a) et application au diagnostic de l'atherosclerose - Google Patents
Procede immunoenzymometrique selectif pour le dosage de lipoproteines contenant de l'apob ou un fragment de celle-ci, anticorps monoclonaux anti-lp(a) et application au diagnostic de l'atherosclerose Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention est relative à un procédé immunoenzymométrique sélectif pour le dosage de particules lipoprotéiques contenant de l'apoprotéine B (apoB) ou un fragment de celle-ci, à des anticorps monoclonaux anti-Lp(a) et à l'application de ce procédé au diagnostic de l'athérosclérose. Le procédé de dosage est caractérisé en ce que lesdites lipoprotéines, éventuellement présentes sous forme de particules, sont mises en présence de deux anticorps, à savoir d'un premier anticorps, qui est un anticorps monoclonal qui capture l'apoprotéine(a) [apo(a)] présente dans la lipoprotéine et d'un deuxième anticorps qui est un anticorps conjugué à une enzyme appropriée de détection et de dosage de ladite apo(a), ou dans le cas où les lipoprotéines sont présentes sous forme de particules, de l'apoB, ladite détection étant révélée par le développement d'une réaction colorée en présence d'un substrat de ladite enzyme.
Description
La présente invention est relative à un procédé lmmunoenzymométrlque sélectif pour le dosage de particules lipoprotéiques contenant de l'apoprotéine B (apoB) ou un fragment de celle-ci, à des anticorps monoclonaux anti
Lp(a) et à l'application de ce procédé au diagnostic de 1 'athérosclérose.
Lp(a) et à l'application de ce procédé au diagnostic de 1 'athérosclérose.
Les maladies cardio-vasculaires ischémiques constituent la première cause de mortalité dans les pays industrialisés. L'athérosclérose en est la principale affection. C'est une maladie générale et multifactorielle qui est accompagnée de deux complications graves, l'infarctus du myocarde et l'atteinte des artères cérébrales.
De nombreuses études épidémiologiques et génétiques ont montré le rôle important des lipides transportés par les lipoprotéines dans la pathogénèse de cette grave affection. En effet, il est aujourd'hui parfaitement démontré que les dyslipoprotéinémies constituent le facteur de risque majeur.
La recherche de marqueurs de risque biologiques de l'athérosclérose a fait l'objet d'importants travaux.
Ainsi de nombreuses méthodes immunochimiques adaptées au dosage des apolipoprotéines, ont permis d'attribuer à certaines d'entre elles (apoA-I et B principalement), un pouvoir discriminant plus important que celui obtenu par un dosage classique des lipides (cholestérol et triglycérides).
La lipoprotéine(a) ou Lp(a) est une lipoprotéine particulière qui fait partie des particules athérogènes. Découverte par Berg en 1966 (Acta Path. Hicrobiol.
Scand., 1963, 59, 368 - 382), sa composition exacte a donné lieu pendant de nombreuses années à des résultats contre versés. Elle a été considérée dans un premier temps comme un polymorphisme des LDL, notamment par sa composition en apoB. Actuellement, on connaît mieux cette lipoprotéine. Sa copule protéique est composée d'une apoB liée par un ou plusieurs pont disulfures à une ou deux glycoprotéines spécifiques (apo(a)) dont la structure primaire a été récemment déterminée. Sa composition lipidique est très proche de celle des LDL. Bon nombre de ses aspects : génétiques, métaboliques et pathologiques commencent à être mieux connus, mais son rôle et sa fonction dans l'-organisme demeurent encore obscurs.
La Lp(a) se compose uniquement de l'apoprotéine B-100 (apo B-100) liée à l'apoprotéine (a) (apo(a)) tandis que la particule Lp(a) correspond à la lipoprotéine complète telle qu'elle circule dans le sang, à savoir un noyau central constitué de lipides hydrophobes (esters de cholestérol (CE) et glycérides (G)) et en surface les phospholipides (PL), le cholestérol libre (CL) et les apoprotéines. L'apoprotéine B-lOO -est commune aux
LDL (Low Density Lipoproteins) et à la Lp(a) l'apoprotéine (a) a une structure proche de celle du plasminogène.
LDL (Low Density Lipoproteins) et à la Lp(a) l'apoprotéine (a) a une structure proche de celle du plasminogène.
Ces faits expliquent que jusqu'à présent, les techniques immunochimiques développées pour l'analyse quantitative et qualitative de la lipoprotéine(a), qui étaient basées sur l'utilisation d'anticorps polyclonaux hétérogènes, présentaient des réactions immunologiques croisées avec l'apoB ainsi qu'avec le plasminogène comme cela a été démontré récemment.
De plus, ces méthodes ne permettent de doser que la Lp(a) et non pas la particule complète de Lp(a).
Un certain nombre de méthodes de recherche et de dosage de la Lp(a) ont été proposées.
Parmi les méthodes non-immunologiques de séparation de la Lp(a) proposées dans l'Art antérieur, l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide donne les meilleurs résultats, toutefois, la sensibilité de cette méthode est faible et ne permet que la détection de concentration élevée en Lp(a).
Parmi les méthodes de recherches immunologiques, la technique d'immunodiffusion selon Ouchterlony (PROG. ALLERGY, 1958, 5, 1) dans laquelle l'antigène et l'anticorps diffusent dans un gel d'agarose pour former un arc de précipitation, est essentiellement une technique de dépistage, de même que la technique d'immunoélectrophorèse qui en est une variante et que la méthode d'immunoélectrosynérèse.
Les méthodes de dosage immunologiques spécifiques proposées, immunodiffusion radiale selon MANCINI (Immunochem., 1965, 2, 235), électroimmunodiffusion selon
LAURELL (Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1972, 29S, 124), immunonéphélométrie, radioimmunologie, utilisent des anticorps polyclonaux qui sont hétérogènes de par leur origine et qui, par surcroît, requièrent la mise en oeuvre de processus préliminaires d'adsorption pour éliminer la réactivité croisée avec l'apoB, comme mentionnée plus haut.
LAURELL (Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1972, 29S, 124), immunonéphélométrie, radioimmunologie, utilisent des anticorps polyclonaux qui sont hétérogènes de par leur origine et qui, par surcroît, requièrent la mise en oeuvre de processus préliminaires d'adsorption pour éliminer la réactivité croisée avec l'apoB, comme mentionnée plus haut.
La Demanderesse a mis au point une première méthode de dosage de la lipoprotéine(a) par une méthode d'immunolatex. Cette technique permet d'éviter certains inconvénients de l'immunonéphélométrie et de l'électroimmunodiffusion tout en présentant une grande rapidité d!exécution, une haute sensibilité et une importante économie de réactifs.
Toutefois, cette méthode présente également des réactions croisées et ne permet de doser que la Lp(a) et non pas les particules de Lp(a).
Une technique de dosage immunoenzymologique utilisant un anticorps anti-Lp(a) a également été proposée (cf. DUVIC et Coll. J. LIPID. RETS. 1985, 26, 540). Il s'agit d'une méthode compétitive qui consiste à immobiliser l'antigène sur un support solide et à mettre en compétition cet antigène et l'antigène du sérum avec un anticorps monoclonal LHLP-1. Toutefois, l'inconvénient majeur de cette méthode est qu'il est- nécessaire de pouvoir disposer de
Lp(a) pure ; or, cette lipoprotéine est difficile à puri fier et présente une certaine instabilité à l'état pur, ce qui a conduit à abandonner ce type de dosage.
Lp(a) pure ; or, cette lipoprotéine est difficile à puri fier et présente une certaine instabilité à l'état pur, ce qui a conduit à abandonner ce type de dosage.
La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à un procédé de dosage immunoenzymométrique spécifique de la particule Lp(a), qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les procédés proposés dans l'Art antérieur, notamment en ce qu'il ne présente pas de réactions croisées avec d'autres molécules ou substances contenant de l'apoB, et en ce qu'il dose la particule Lp(a) complète.
La présente invention a pour objet une méthode de dosage immunoenzymométrique de type non compétitif, pour la détermination sélective de la concentration en lipoprotéines dans un fluide biologique, par les techniques sandwich ou bi-site, lesdites lipoprotéines contenant comme apoprotéines au moins une apoprotéine B (apoB) ou un fragment de celle-ci, caractérisée en ce que lesdites lipoprotéines, éventuellement présentes sous forme de particules, sont mises en présence de deux anticorps, à savoir d'un premier anticorps, qui est un anticorps monoclonal qui capture l'apoprotéine(a) (apo(a)) présente dans la lipoprotéine et d'un deuxième anticorps qui est un anticorps conjugué à une enzyme appropriée de détection et de dosage de ladite apo(a), ou, dans le cas où les lipoprotéines sont présentes sous forme de particules, de l'apoB, ladite détection étant révélée par le développement d'une réaction colorée en présence d'un substrat de ladite enzyme.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de l'invention, le premier anticorps est un anticorps monoclonal anti-Lp(a) immobilisé sur un apport solide approprié.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'anticorps monoclonal anti-Lp(a) est un anticorps monoclonal anti-apo(a).
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le support solide est choisi dans le groupe qui comprend notamment des plaques de microtitration, des billes.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de l'invention, le deuxième anticorps est un anticorps anti-apoB.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, ledit anticorps anti-apoB est un anticorps polyclonal.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, ledit anticorps anti-apoB est un anticorps monoclonal seul ou en mélange avec d'autres anticorps monoclonaux anti-apoB.
Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux de l'invention, le deuxième anticorps est un anticorps monoclonal anti-Lp(a).
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'anticorps monoclonal anti-Lp(a) est un anticorps monoclonal anti-apo(a).
La présente invention a également pour objet des anticorps anti-Lp(a), caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des anticorps monoclonaux anti-Lp(a).
Selon un mode de réalisation avantageux, lesdits anticorps monoclonaux sont spécifiques de l'apoprotéine(a) (apo(a)).
Selon un autre mode de réalisation avantageux de la présente invention, lesdits anticorps monoclonaux sont obtenus par clonage d'hybridomes résultant de la fusion de cellules myélomateuses appropriées et de cellules spléniques murines immunisées par un antigène constitué par une Lp(a) d'origine humaine7 en mettant en oeuvre une technique de clonage appropriée.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, les anticorps monoclonaux sont des immunoglobulines de type IgGl.
La présente invention a, de plus, pour objet un procédé de dépistage de l'athérosclérose, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter et doser des lipoprotéines, éventuellement sous forme de particules, comprenant au moins une apoB ou un fragment de celle-ci, dans un fluide biologique, à l'aide de deux anticorps, à savoir d'un premier anticorps anti-Lp(a) conforme à l'invention, immobilisé sur un support solide et d'un deuxième anticorps approprié, conjugué à une enzyme appropriée, choisi dans le groupe qui comprend les anticorps polyclonaux anti-apoB, des mélanges d'anticorps monoclonaux anti-apoB et les anticorps monoclonaux anti-Lp(a) conformes à l'invention, en mettant en présence ledit fluide biologique avec lesdits anticorps, auxquels se lient les lipoprotéines(a), éventuellement sous forme de particules de Lp(a), présentes dans l'échantillon, de fluide biologique à contrôler, conformément à la méthode de dosage immunoenzymométrique de l'invention, la lecture du résultat étant révélée par tous moyens appropriés et notamment par EIA.
La présente invention a, en outre, pour objet un kit, ou coffret, ou ensemble coordonné, pret à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé de dépistage de l'athérosclérose, caractérisé en ce qu'il comprend
- des doses appropriées d'un premier anticorps monoclonal spécifique de la Lp(a) humaine conforme à l'invention
- des doses appropriées d'un second anticorps approprié couplé à un système enzymatique approprié
- une quantité appropriée de substrat approprié, du système enzymatique, additionnée d'une quantité appropriée de peroxyde d'hydrogène
- un sérum standard
- des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection
- des plaques de microtitration en polystyrène.
- des doses appropriées d'un premier anticorps monoclonal spécifique de la Lp(a) humaine conforme à l'invention
- des doses appropriées d'un second anticorps approprié couplé à un système enzymatique approprié
- une quantité appropriée de substrat approprié, du système enzymatique, additionnée d'une quantité appropriée de peroxyde d'hydrogène
- un sérum standard
- des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection
- des plaques de microtitration en polystyrène.
Selon un mode de réalisation du kit conforme à la présente invention, le premier anticorps est immobilisé sur lesdites plaques de microtitration.
Selon un autre mode de réalisation du kit conforme à la présente invention, le deuxième anticorps est un anticorps polyclonal anti-apoB marqué à la peroxydase.
Selon encore un autre mode de réalisation du kit conforme à la présente invention, le deuxième anticorps est un anticorps monoclonal anti-apoB ou un mélange d'anticorps monoclonaux anti-apoB, marqué à la peroxydase.
Selon un autre mode de réalisation du kit conforme à la présente invention, le deuxième anticorps est un anticorps monoclonal anti-apo(a) marqué à la peroxydase.
Selon un autre mode de réalisation du kit conforme à la présente invention, le système de révélation comprend de l'0-phénylènediamine associée à du peroxyde d'hydrogène.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Exemple 1 : Isolement et Purification des particules de Lp(a).
Une fraction riche en Lp(a) est isolée à partir d'un pool de plasma Lp(a)+ par ultracentrifugation, le plasma étant ajusté à une densité comprise entre 1,06 1,12 Kg/l par du bromure de potassium solide, puis centrifugé deux fois 24 heures à 100 OOOxg et à 4 C dans une ultracentrifugeuse Beckman L8-70 ayec un rotor 50 Ti.
Pour la purification, une colonne de Sépharose
CL 6B de dimension 100 x 2,6 cm est utilisée.
CL 6B de dimension 100 x 2,6 cm est utilisée.
Après étalonnage à l'aide d'un kit de masse moléculaire, on procède à la purification.
La solution tampon d'élution est composée de
Tris 0,1 M, NaCl 0,15 M, Nao EDTA 1mM, pH 8,2.
Tris 0,1 M, NaCl 0,15 M, Nao EDTA 1mM, pH 8,2.
afin d'éliminer le sérum de veau foetal. Ces souris ont été auparavant déprimées du point de vue immunitaire par injection de pristane, afin d'éliminer le risque de rejet.
Les cellules hybrides développent une ascite chez les souris ; ce liquide d'ascite est riche en anticorps monoclonaux.
La seconde méthode est plus adaptée pour une production en masse. Dans une première étape, on développe par injection sous-cutanée de 2 à 3.106 cellules, une tumeur dans un délai de 15 jours. Cette tumeur est le siège d'une multiplication cellulaire très importante. Après prélèvement, la tumeur est broyée, les cellules sont lavées par du milieu Dulbecco puis injectées par voie intra-péritonéale à des souris Balb/c non "pristanisées". Une tumeur peut permettre l'injection de 8à 10 souris. Une autre souris étant dans le même temps injectée par voie souscutanée afin d'entretenir le cycle de production.
Dans les deux méthodes, le liquide d'ascite est recueilli puis centrifugé à 3000 tr/mn (10 mn), seul le surnageant est recueilli. L'addition de 10-4 M de PMSF permet d'inhiber l'action de protéases. Le stockage s'effectue à -20'C. Pour chaque clone K01, K06, K07 et KO9 un volume important de liquide d'ascite a été récupéré.
3 ) Purification des anticorps monoclonaux
- Précipitation au sulfate d'ammonium
Les ascites sont additionnées d'une solution de sulfate d'ammonium à 50 % (P/V).
- Précipitation au sulfate d'ammonium
Les ascites sont additionnées d'une solution de sulfate d'ammonium à 50 % (P/V).
Deux précipitations successives sont effectuées. Une partie de l'albumine ainsi que l'hémoglobine sont ainsi éliminés. Le dernier précipité est repris dans un volume minimum de solution de chlorure de sodium 0,15 M et dialysé une nuit contre la même solution.
- Purification sur colonne d'affinité
La seconde étape est la purification proprement dite des IgG par chromatographie sur protéine A-Sépharose.
La seconde étape est la purification proprement dite des IgG par chromatographie sur protéine A-Sépharose.
Une quantité optimale de protéines ressolubilisées est
Une vingtaine de puits de culture ont ainsi été détectés. Trois puits présentant une sécrétion d'immunoglobulines dirigées uniquement contre les LDL ont également été retenus.
Une vingtaine de puits de culture ont ainsi été détectés. Trois puits présentant une sécrétion d'immunoglobulines dirigées uniquement contre les LDL ont également été retenus.
Les cellules sécrétrices en culture sont mises en suspension, puis un prélèvement est effectué et dilué au 1/10e dans un tube stérile contenant du milieu A. On procède ensuite au comptage a l'aide d'une cellule de Fuchs sur un prélèvement d'une dilution au 1/100e. Le nombre de cellules est ramené à 20 cellules par ml de milieu A. Les cellules sont ensuite réparties dans des bottes de culture de 96 puits contenant des cellules péritonéales de souris (cellules nourricières), préparées 24 à 48 heures auparavant, à raison de 50 pl par puits, soit en théorie 1 cellule par 50 ijl. Les clones positifs anti-Lp(a) sont clonés une seconde fois, voire une troisième fois.Les clones positifs sont ensuite multipliés en masse puis conservés dans l'azote liquide ou mis en production d'ascite.
Sur une vingtaine de puits en culture, produisant des anticorps dirigés contre la Lp(a), seulement 4 clones stables ont pu être obtenus et conservés. Ce sont les clones KO1, K06, K07 et K09. A partir de ces clones, on a procédé à la production de liquide d'ascite et enfin d'anticorps monoclonaux. La classe de chaque anticorps est déterminée par immunodiffusion avec des immunsêrums commer cipaux spécifiques. Les quatres clones produisent des IgG, aisément purifiables par chromatographie sur protéine-A
Sépharose.
Sépharose.
- Production de liquide, d'ascite.
Deux méthodes ont été ûtilisées Les cellules hybrides issues a d'un clone sont injectées intra-péritonéalement chez des souris Balb/C ayant reçu 10 jours auparavant 0,5 ml de pristane ; environ 5.106 cellules hybrides sont injectées par souris. Les cellules sont préalablement lavées par du milieu Dulbecco répétée pour chaque souris 21 jours après, mais avec de l'adjuvant incomplet de Freund et ainsi de suite pendant 4 mois. Les souris sont saignées pour vérifier les réponses immunologiques avant de procéder à l'hybridation cellulaire.
2 ) Obtention des anticorps monoclonaux
- Fusion
La souris répondant contre la Lp(a), ayant subi au préalable une injection intrapéritonéale de rappel au jour J-10, puis une dernière en intra-veineuse au jour J-3 est saignée. L'immunsérum est récupéré. Il sera aliquoté puis congelé afin de servir de témoin positif lors du criblage. La rate de l'animal est prélevée.
- Fusion
La souris répondant contre la Lp(a), ayant subi au préalable une injection intrapéritonéale de rappel au jour J-10, puis une dernière en intra-veineuse au jour J-3 est saignée. L'immunsérum est récupéré. Il sera aliquoté puis congelé afin de servir de témoin positif lors du criblage. La rate de l'animal est prélevée.
La rate, prélevée stérilement sur boite de
Pétri, est dilacérée. Les cellules spléniques obtenues sont fusionnées avec des cellules myélomateuses SP2/0, au moyen de PEG-DMSO, selon le protocole décrit par Kohler et
Milstein.
Pétri, est dilacérée. Les cellules spléniques obtenues sont fusionnées avec des cellules myélomateuses SP2/0, au moyen de PEG-DMSO, selon le protocole décrit par Kohler et
Milstein.
Les proportions cellules spléniques/cellules myélomateuses sont de 10.
Après élimination du PEG, la totalité des cellules est reprise dans du milieu sélectif HAT, et répartie dans des boîtes de culture de 96 puits, à raison de 25 000 cellules par puits dans deux gouttes de milieu HAT. Les boîtes sont mises à l'étuve à 37'C en atmosphère humide et en présence de 5 % de dioxyde de carbone.
Les cellules sont cultivées en présence de milieu sélectif HAT, puis après 15 jours en présence de milieu HT, puis finalement en présence de milieu A, jusqu'à disparition des cellules myélomatoeuses non hybridées. Les puits sont testés par une technique de criblage immunoenzymatique.
- Clonage
Les puits positifs sont clonés par dilution limite.
Les puits positifs sont clonés par dilution limite.
80 mg d'une fraction enrichie en Lp(a) par ultracentrifugation sont déposés.
L'élution est menée à + 4'C avec un débit de 8 ml/h au delà de 24 heures. La collecte s'effectue par fractions de 5 ml.
On filtre à travers un filtre millipore 0,22 pm. Sur la figure 1, on a en abscisse le volume d'élution en ml et en ordonnée la densité optique à 280 nm ; trois pics sont obtenus.
Le pic 1 donne des arcs de précipitation contre des antisérums anti-Lp(a) et anti-apoB, le pic 2 uniquement contre l'antisérum anti-apoB (LDL) et le pic 3 contre l'antiapoAI (HDL). 11 mg de Lp(a) pure sont obtenus.
Exemple 2 : Préparation des anticorps monoclo naux anti-apo(a)
A. Purification de l'apo(a).
A. Purification de l'apo(a).
Une fraction de la Lp(a) enrichie conformément à l'exemple 1 est traitée comme suit
On clive la Lp(a) au niveau des ponts disulfures, dans un tampon Tris 10 mM NaCl 0,05- M Na2 EDTA lmM et NaN 0,02 % pH 7,6 par addition de dithiothreitol (DTT) sous forme solide et de manière à obtenir une concentration finale de 10 mM.
On clive la Lp(a) au niveau des ponts disulfures, dans un tampon Tris 10 mM NaCl 0,05- M Na2 EDTA lmM et NaN 0,02 % pH 7,6 par addition de dithiothreitol (DTT) sous forme solide et de manière à obtenir une concentration finale de 10 mM.
Les solutions obtenues sont incubées à 37; C pendant trois jours et dialysées pendant une nuit à 4 C contre le même tampon sans DTT.
La solution est alors chromatographiée sur une colonne héparine sépharose (Pharmacia). Deux pics sont élués, le premier pic correspond à l'apo(a) ; le deuxième pic est une particule LDL-like.
B. Production des anticorps monoclonaux anti
Lp(a).
Lp(a).
1') Immunisation
Des souris mâles Balb/C sont immunisées par injection intrapéritonéale de 100 jig de Lp(a) mélangés à 300 pl d'adjuvant complet de Freund. Cette injection est déposée sur une colonne équilibrée par une solution tampon de phosphate de sodium 0,10 M pH 8, puis incubée au minimum 30 mn à température ambiante. La colonne est ensuite lavée avec la solution tampon d'équilibre puis éluée avec une solution tampon citrate-citrique de sodium 0,1 M pH 3.
Des souris mâles Balb/C sont immunisées par injection intrapéritonéale de 100 jig de Lp(a) mélangés à 300 pl d'adjuvant complet de Freund. Cette injection est déposée sur une colonne équilibrée par une solution tampon de phosphate de sodium 0,10 M pH 8, puis incubée au minimum 30 mn à température ambiante. La colonne est ensuite lavée avec la solution tampon d'équilibre puis éluée avec une solution tampon citrate-citrique de sodium 0,1 M pH 3.
Toutes les classes d'IgG sont éluées. L'éluat est immédiatement neutralisé par une solution 1 M de phosphate dipotassique (K2HPO4). La colonne est rééquilibrée par le tampon initial. La fraction d'IgG est dialysée contre une solution de PBS 0,1 M pH 7,2 avant stockage à -20'C.
Les anticorps monoclonaux subissent un test rapide de spécificité par la technique ELISA contre l'apo(a), la Lp(a), les LDL et les HDL, puis sont caractérisés et utilisés pour le dosage immunoenzymatique de la particule Lp(a).
Le tableau suivant montre le contrôle de spécificité des anticorps monoclonaux anti-Lp(a) par Elisa directe
<tb> <SEP> D.O. <SEP> 492 <SEP> nm
<tb> <SEP> I!I4\AcM <SEP> KO1 <SEP> K06 <SEP> K07 <SEP> K09
<tb> <SEP> Ag
<tb> Apo(a) <SEP> 1,0 <SEP> 1,1 <SEP> 0,9 <SEP> 1,1
<tb> Lp(a) <SEP> 1,1 <SEP> 1,5 <SEP> 1,0 <SEP> 1,4
<tb> LDL <SEP> O <SEP> O <SEP> 0 <SEP> O
<tb> HDL <SEP> O <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
Exemple 3 : Préparation des anticorps polyclo naux anti-apoB
Ces anticorps sont préparés chez le lapin, et la fraction IgG est purifiée par précipitation au sulfate de sodium suivie d'une chromatographie d'affinité.
<tb> <SEP> I!I4\AcM <SEP> KO1 <SEP> K06 <SEP> K07 <SEP> K09
<tb> <SEP> Ag
<tb> Apo(a) <SEP> 1,0 <SEP> 1,1 <SEP> 0,9 <SEP> 1,1
<tb> Lp(a) <SEP> 1,1 <SEP> 1,5 <SEP> 1,0 <SEP> 1,4
<tb> LDL <SEP> O <SEP> O <SEP> 0 <SEP> O
<tb> HDL <SEP> O <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
Exemple 3 : Préparation des anticorps polyclo naux anti-apoB
Ces anticorps sont préparés chez le lapin, et la fraction IgG est purifiée par précipitation au sulfate de sodium suivie d'une chromatographie d'affinité.
Les anticorps polyclonaux anti-apoB purifiés sont couplés avec de la peroxydase de manière à former un conjugué.
Exemple 4 : Dosage immuno-enzymologique sélectif de la particule Lp(a), le premier anticorps étant un anticorps anti-apo(a) monoclonal K07 et le deuxième anticorps étant un anticorps polyclonal anti-apoB.
Le dosage immunoenzymologique selon l'invention utilise la technique sandwich décrite dans le Brevet
Hybritech n 24 87983 du 3 aoQt 1981.
Hybritech n 24 87983 du 3 aoQt 1981.
- Courbe d'étalonnage.
Le standard primaire correspond à des particules de Lp(a) conformes à l'exemple 1, exprimant des antigènes apo(a) et apoB (figure 2), il est utilisé pour étalonner un sérum standard du commerce. La zone linéaire de dosage de la courbe standard s'étand de 0,75 à 7,15 mg/l.
La figure 2 représente la courbe d'étalonnage des particules de Lp(a) purifiées et comporte en abscisse la concentration en particules de Lp(a) en pg/ml et en ordonnée l'absorbance à 492 nm.
- Dosage proprement dit
des plaques de microtitration en polystyrène (Costar 3590) sont enduites la veille au soir, à température ambiante, avec 0,1 ml d'un anticorps monoclonal anti
Lp(a) conforme à l'exemple 2 (anticorps monoclonal K 07), à une concentration 25 pl/ml dans 0,1 M de PBS
le sérum standard est dilué de manière à ce que la concentration en particules de Lp(a) soit comprise entre 0,11 et 7,15 mg/ml et les échantillons de plasma à doser sont dilués au 20ème, au 75ème et au 200ème
les plaques sont rincées 4 fois avec du PBS, avant d'additionner 100 pl d'échantillon ou de standard sur les parois7 l'incubation étant alors poursuivie à 37C pendant 90 mn
après un rinçage, 0,1 ml de conjugué (antiapoB/peroxydase à 1 mg/ml) dilué au 3 000ème dans du PBS
BSA à 1 %, est ajouté et incubé à 37 C pendant 90 minutes
les parois sont à nouveau rincées avec du
PBS, puis 0,1 ml d'une solution d'un substrat de la peroxydase (O-phénylènediamine 3 mg/ml et H202 concentré 0,64 pl/ml dans un tampon citrate-phosphate, pH 5,6), qui au bout de 30 mn, à l'obscurité, développe une réaction colorée. La réaction est interrompue par l'addition de 0,1 ml de HCl 1 N et l'absorbance est déterminée à 492 nm.
des plaques de microtitration en polystyrène (Costar 3590) sont enduites la veille au soir, à température ambiante, avec 0,1 ml d'un anticorps monoclonal anti
Lp(a) conforme à l'exemple 2 (anticorps monoclonal K 07), à une concentration 25 pl/ml dans 0,1 M de PBS
le sérum standard est dilué de manière à ce que la concentration en particules de Lp(a) soit comprise entre 0,11 et 7,15 mg/ml et les échantillons de plasma à doser sont dilués au 20ème, au 75ème et au 200ème
les plaques sont rincées 4 fois avec du PBS, avant d'additionner 100 pl d'échantillon ou de standard sur les parois7 l'incubation étant alors poursuivie à 37C pendant 90 mn
après un rinçage, 0,1 ml de conjugué (antiapoB/peroxydase à 1 mg/ml) dilué au 3 000ème dans du PBS
BSA à 1 %, est ajouté et incubé à 37 C pendant 90 minutes
les parois sont à nouveau rincées avec du
PBS, puis 0,1 ml d'une solution d'un substrat de la peroxydase (O-phénylènediamine 3 mg/ml et H202 concentré 0,64 pl/ml dans un tampon citrate-phosphate, pH 5,6), qui au bout de 30 mn, à l'obscurité, développe une réaction colorée. La réaction est interrompue par l'addition de 0,1 ml de HCl 1 N et l'absorbance est déterminée à 492 nm.
Exemple 5 : Dosage immunenzymologique sélectif de la Lp(a), le premier anticorps étant un anticorps antiapo(a) monoclonal K07, le deuxième anticorps étant un anticorps monoclonal anti-apo(a) K09.
- Courbe d'étalonnage
elle est réalisée comme dans l'exemple 4.
elle est réalisée comme dans l'exemple 4.
- Dosage proprement dit
Des plaques de microtitration en polystyrène (Costar 3590) sont enduites la veille au soir, à température ambiante, avec 100 pl d'anticorps anti-apo(a) monoclonal K07 conforme à l'exemple 2, à 25 pg/ml dans du P.B.S.
Des plaques de microtitration en polystyrène (Costar 3590) sont enduites la veille au soir, à température ambiante, avec 100 pl d'anticorps anti-apo(a) monoclonal K07 conforme à l'exemple 2, à 25 pg/ml dans du P.B.S.
Les parois des plaques sont rincées 4 fois avec du P.B.S.
Le sérum standard est dilué de manière à ce que la concentration en particules de Lp(a) soit comprise entre 0,11 et 7,25 mg/l et les échantillons de plasma à doser sont dilués 20, 75 et 100 fois.
100 pl d'échantillon ou de standard sont additionnés sur les parois et incubés à 37 'C pendant 90 minutes.
Après lavage, 100 pu de conjugué (anti-apo(a)
K09 marqué à la peroxydase à 1,2 mg/ml) dilué 5 000 fois dans du PBS-BSA 1 %, est ajouté et incubé à 37*C pendant 90 minutes.
K09 marqué à la peroxydase à 1,2 mg/ml) dilué 5 000 fois dans du PBS-BSA 1 %, est ajouté et incubé à 37*C pendant 90 minutes.
Les parois sont à nouveaux rinces avec du
P.B.S., puis 100 pl d'une solution d'un substrat de la peroxydase, préparée extemporanément (O-phenylénediamine sous forme de dihydrochlorure à 3 mg/ml dans 0,1 M d'un tampon citrate-phosphate pH 5,6 et H202 concentré à 0,64 pl/ml), qui au bout de 30 minutes, à l'obscurité, développe une réaction colorée. La réaction est interrompue par l'addition de 0,1 ml de HC1 1 N et l'absorbance est déter- minée à 492 nm.
P.B.S., puis 100 pl d'une solution d'un substrat de la peroxydase, préparée extemporanément (O-phenylénediamine sous forme de dihydrochlorure à 3 mg/ml dans 0,1 M d'un tampon citrate-phosphate pH 5,6 et H202 concentré à 0,64 pl/ml), qui au bout de 30 minutes, à l'obscurité, développe une réaction colorée. La réaction est interrompue par l'addition de 0,1 ml de HC1 1 N et l'absorbance est déter- minée à 492 nm.
La spécificité du procédé conforme à l'invention a été établie en mesurant différentes dilution de particules Lp(a), des échantillons de plasma, de l'apo(a) et du plasminogène, et en comparant des courbes obtenues avec la courbe de référence du sérum standard.
La figure 3A, qui correspond au dosage des particules de Lp(a) avec K07 et anti apoB, montre que ni l'apo(a) libre ni le plasminogène ne sont détectables ; sur cette figure 3A, on a en abscisse les dilutions et en ordonnées les absorbances à 492 nm.
La figure 3B, qui correspond au dosage de la
Lp(a) avec K07 et K09 montre que le plasminogène n'est pas détectable.
Lp(a) avec K07 et K09 montre que le plasminogène n'est pas détectable.
Les différentes courbes représentent le sérum standard à 0,725 g/l
les particules de Lp(a) purifiées à 0,6 g/l
l'apo(a) à 0,3 g/l
et le plasminogène à 0,75 g/l
les particules de Lp(a) purifiées à 0,6 g/l
l'apo(a) à 0,3 g/l
et le plasminogène à 0,75 g/l
Le procédé conforme à l'invention présente donc une spécificité vis-à-vis des particules de Lp(a).
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite, ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.
Claims (1)
1) Procédé de dosage immunoenzymométrique de type non compétitif, pour la détermination sélective de la concentration en lipoprotéines dans un fluide biologique, par les techniques sandwich ou bi-site, lesdites lipoprotétines contenant comme apoprotéines au moins une apoprotéine B (apoB) ou un fragment de celle-ci, caractérisée en ce que lesdites lipoprotéines, éventuellement présentes sous forme de particules, sont mises en présence de deux anticorps, à savoir d'fun premier anticorps, qui est un anticorps monoclonal qui capture l'apoprotéine(a) (apo(a)) présente dans la lipoprotéine et d'un deuxième anticorps qui est un anticorps conjugué à une enzyme appropriée de détection et de dosage de ladite apo(a), ou dans le cas où les lipoprotéines sont présentes sous forme de particules, de l'apoB, ladite détection étant révélée par le développement d'une réaction colorée en présence d'un substrat de ladite enzyme.
2B) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le premier anticorps est un anticorps monoclonal anti-Lp(a) immobilisé sur un support solide approprié.
3 ) ) Procédé selon la revendication 2, caracté- risé en ce que l'anticorps monoclonal anti-Lp(a) est un anticorps monoclonal anti-apo(a).
4 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisé en ce-que le support solide est choisi dans le groupe qui comprend notamment des plaques de microtitration, des billes.
5 ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le deuxième anticorps est un anticorps antiapoB.
8 ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le deuxième anticorps est un anticorps monoclonal anti-Lp(a).
7 ) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit anticorps anti-apoB est un anticorps monoclonal seul ou en mélange avec d'autres anticorps monoclonaux anti-apoB
6F) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit anticorps anti-apoB est un anticorps polyclonal
9*) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal anti-Lp(a) est un anticorps monoclonal anti-apo(a).
10') Anticorps anti-Lp(a), caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des anticorps monoclonaux anti Lp(a).
11') Anticorps selon la revendication 10, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des anticorps monoclonaux spécifiques de l'apoprotéine(a) (apo(a)).
12') Anticorps selon l'une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisés en ce que lesdits anticorps monoclonaux sont obtenus par clonage d'hybridomes résultant de la fusion de cellules myélomateuses appropriées et de cellules spléniques murines immunisées par un antigène constitué par une Lp(a) d'origine humaine, en mettant en oeuvre une technique de clonage appropriée.
13-) Anticorps selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisés en ce que lesdits anticorps monoclonaux sont des immunoglobulines de type IgGi.
14-) Procédé de dépistage de l'athérosclérose, caractérisé en ce qu'il consiste à détecter et doser des lipoprotéines, éventuellement sous forme de particules, comprenant au moins une apoB ou un fragment de celle-ci, dans un fluide biologique, à l'aide de deux anticorps, à savoir d'un premier anticorps anti-Lp(a) selon les revendications 10 à 13, immobilisé sur un support solide et d'un deuxième anticorps approprié, conjugué à une enzyme appropriée, choisi dans le groupe qui comprend les anticorps polyclonaux antî-apoB, des mélanges d'anticorps monoclonaux anti-apoB et-les anticorps monoclonaux anti-Lp(a) selon les revendications 10 à 13, en mettant en présence ledit fluide biologique avec lesdits anticorps, auxquels se lient les lipoprotéines(a), éventuellement sous forme de particules de Lp(a), présentes dans l'échantillon de fluide biologique à contrôler, conformément à la méthode de dosage immunoen- zymométrique selon les revendications 1 à 9, la lecture du résultat étant révélée par tous moyens appropriés et notamment par EIA.
- des plaques de microtitration en polystyrène.
- des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection ;
- un sérum standard
- une quantité appropriée de substrat approprié, du système enzymatique, additionnée d'une quantité appropriée de peroxyde d'hydrogène
- des doses appropriées d'un second anticorps approprié couplé à un système enzymatique approprié
- des doses appropriées d'un premier anticorps monoclonal spécifique de la Lp(a) humaine selon les revendications 10 à 13
15 ) Kit, ou coffret, ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé de dépistage de l'athérosclérose selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend
16-) Kit selon la revendication 15, caractérisé en ce que le premier anticorps est immobilisé sur lesdites plaques de microtitration.
17-) Kit selon l'une quelconque des revendications 15 et 16, caractérisé en ce que le deuxième anticorps est un anticorps polyclonal anti-apoB marqué à la peroxydase.
18.") Kit selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisé en ce que le deuxième anticorps est un anticorps monoclonal anti-apoB ou un mélange d'anticorps monoclonaux anti-apoB, marqué à la peroxydase.
199) Kit selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, caractérisé en ce que le deuxième anticorps est un anticorps monoclonal anti-apo(a) marqué à la peroxydase.
20') Kit selon l'une quelconque des revendications 15 à 19, caractérisé en ce que le système de révélation comprend de l'O-phénylènediamine associée à du peroxyde d'hydrogène.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8802214A FR2627589B1 (fr) | 1988-02-24 | 1988-02-24 | Procede immunoenzymometrique selectif pour le dosage de lipoproteines contenant de l'apob ou un fragment de celle-ci, anticorps monoclonaux anti-lp(a) et application au diagnostic de l'atherosclerose |
| ES89400142T ES2073448T3 (es) | 1988-01-19 | 1989-01-18 | Procedimiento inmunometrico para la dosificacion de particulas de lipoproteina, anticuerpos monoclonales anti-lp(a) y aplicacion al diagnostico de la aterosclerosis. |
| EP89400142A EP0327418B1 (fr) | 1988-01-19 | 1989-01-18 | Procédé immunométrique pour le dosage de particules de lipoprotéine, anticorps monoclonaux anti-Lp(a) et application au diagnostic de l'athérosclérose |
| DE68922126T DE68922126T2 (de) | 1988-01-19 | 1989-01-18 | Immunometrisches Verfahren zum Nachweis von Lipoprotein-Teilchen, anti-Lp(a) Monoklonale Antikörper und ihre Anwendung zur Diagnose von Atherosklerose. |
| AT89400142T ATE121197T1 (de) | 1988-01-19 | 1989-01-18 | Immunometrisches verfahren zum nachweis von lipoprotein-teilchen, anti-lp(a) monoklonale antikörper und ihre anwendung zur diagnose von atherosklerose. |
| JP1011746A JPH026755A (ja) | 1988-01-19 | 1989-01-19 | リポ蛋白粒子の免疫学的測定方法，抗Ｌｐ（ａ）モノクロナル抗体，およびそれらのアテローム性動脈硬化症の診断における使用 |
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| FR8802214A FR2627589B1 (fr) | 1988-02-24 | 1988-02-24 | Procede immunoenzymometrique selectif pour le dosage de lipoproteines contenant de l'apob ou un fragment de celle-ci, anticorps monoclonaux anti-lp(a) et application au diagnostic de l'atherosclerose |
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| Publication Number | Publication Date |
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| FR2627589A1 true FR2627589A1 (fr) | 1989-08-25 |
| FR2627589B1 FR2627589B1 (fr) | 1995-06-09 |
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986005493A1 (fr) * | 1985-03-11 | 1986-09-25 | Scripps Clinic And Research Foundation | Analyse diagnostique de depistage d'apolipoproteines associees a des lipoproteines plasmatiques de haute densite |
| WO1987002137A1 (fr) * | 1985-09-27 | 1987-04-09 | Pharmacia Ab | Procedes d'analyses pour detecter des lipoproteines et des apolipoproteines |
-
1988
- 1988-02-24 FR FR8802214A patent/FR2627589B1/fr not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| WO1986005493A1 (fr) * | 1985-03-11 | 1986-09-25 | Scripps Clinic And Research Foundation | Analyse diagnostique de depistage d'apolipoproteines associees a des lipoproteines plasmatiques de haute densite |
| WO1987002137A1 (fr) * | 1985-09-27 | 1987-04-09 | Pharmacia Ab | Procedes d'analyses pour detecter des lipoproteines et des apolipoproteines |
Non-Patent Citations (4)
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| CHEMICAL ABSTRACTS * |
| DATAHOST ORBIT: DATABASE ANALYTICA * |
| DATAHOST ORBIT; DATABASE ANALYTICA * |
| THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY * |
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| FR2627589B1 (fr) | 1995-06-09 |
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