FR2606034A1

FR2606034A1 - Nouvelle proteine de surface des cellules basales de l'epiderme, anticorps capables de reconnaitre cette proteine, et leur utilisation, et lignees cellulaires hybrides capables de secreter de tels anticorps

Info

Publication number: FR2606034A1
Application number: FR8615208A
Authority: FR
Inventors: Bruno Bernard; Yves Michel Darmon
Original assignee: Centre International de Recherches Dermatologiques Galderma
Current assignee: Galderma Research and Development SNC
Priority date: 1986-10-31
Filing date: 1986-10-31
Publication date: 1988-05-06
Also published as: JPS63179898A; GB2197871A; DE3736935A1; GB8725462D0; GB2197871B; US5279958A; FR2606034B1

Abstract

PROTEINE CARACTERISEE PAR LE FAIT QU'IL S'AGIT D'UNE PROTEINE NON KERATINIQUE PRESENTE SUR LA FACE APICOLATERALE ET ABSENTE SUR LA FACE BASALE DES CELLULES BASALES DE L'EPIDERME, NOTAMMENT CHEZ L'HOMME, QU'ELLE EST PRESENTE, DE FACON NON POLARISEE, DANS LES CELLULES DE CARCINOMES BASO-CELLULAIRE ET SPINOCELLULAIRE ET ABSENTE DANS LES CELLULES DE MELANOME ET DE NAEVUS; ANTICORPS DIRIGES CONTRE CETTE PROTEINE, LEUR PREPARATION ET LEUR UTILISATION COMME REACTIFS; LIGNEES CELLULAIRES HYBRIDES SECRETANT DE TELS ANTICORPS, ET LEUR PREPARATION.

Description

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La présente invention a pour objet une protéine présente à la surface des cellules basales de l'épiderme humain normal, des anticorps capables de reconnattre un site antigénique de ladite protéine, leur préparation et leur utilisation, notamment comme réactifs d'étude de la différenciation normale ou pathologique des cellules de l'épiderme. On sait que l'épiderme comprend une membrane basale sur laquelle repose une couche de cellules basales prolifératives et des couches suprabasales de cellules en voie de différenciation qui se kératinisent progressivement et finissent par former à la surface de la peau une couche cornée de cellules mortes entièrement kératinisées. Toutes ces cellules se

renouvellent constamment à partir de la couche basale proliférative.

Pour pouvoir étudier les maladies de la peau (par exemple psoriasis, verrues, papillomes, cancers, etc...) il est nécessaire de mieux connaître la différenciation des cellules normales et malignes de l'épiderme, encore

appelées kératinocytes.

Par exemple on ne sait pas actuellement si le psoriasis est causé par une prolifération excessive des cellules de la membrane basale, telle que les cellules n'auraient pas le temps de se différencier (autrement dit, la différenciation s'arrêterait à un certain stade) ou bien s'il est causé par une différenciation des cellules malades autre que celle des cellules normales. Pour procéder à de telles études, il est important de pouvoir

disposer de différents marqueurs de la différenciation des kératinocytes.

La présente invention a pour objet de tels marqueurs, leur

préparation et leur utilisation.

L'invention a notamment pour objet une nouvelle protéine caractérisée par le fait: - qu'il s'agit d'une protéine non kératinique présente sur la face apicolatérale, et absente sur la face basale des cellules basales de l'épiderme, notamment chez l'homme, le singe, le cheval, la vache, la chèvre

et le miniporc, y compris des cellules basales psoriasiques et papillo-

mateuses; - qu'elle est absente de la surface des cellules basales de l'épiderme chez le lapin et la souris; - qu'elle est présente chez l'homme dans les tissus épithéliaux suivants (outre la peau): oesophage, uretère, et, à un degré plus faible, estomac, colon et intestin grêle; - qu'elle est présente, de façon non polarisée, dans les cellules pathologiques suivantes: carcinome basocellulaire, carcinome spinocellulaire, et absente dans les cellules de mélanome et de naevus;

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- et qu'elle est reconnue par l'anticorps sécrété par la lignée cellulaire hybride BC2 déposée le 27 Octobre 1986 à la Collection nationale de microorganismes de l'Institut Pasteur sous le n I-614; ainsi que les analogues de cette protéine, lesdits analogues étant tous fragments et tous peptides synthétiques ou semi-synthétiques contenant des séquences peptidiques présentes sur ladite protéine, ainsi que tous dérivés de ces fragments ou peptides, à condition que ces fragments, peptides

ou dérivés soient reconnus par l'anticorps défini précédemment.

L'invention a également pour objet une protéine telle que définie cidessus qui présente encore une ou plusieurs des caractéristiques suivantes: - il s'agit d'une glycoprotéine; - son poids moléculaire, évalué par électrophorèse sur gel de

polyacrylamide, est de 165000 daltons.

La protéine de l'invention a été isolée et caractérisée, de la façon qui sera décrite ci-après, par préparation de cellules hybrides capables de

sécréter des anticorps caractéristiques des cellules basales de l'épiderme.

Cette protéine est préparée par un procédé principalement caractérisé par le fait que l'on utilise comme produits de départ des kératinocytes, notamment des kératinocytes humains transformés cultivables in vitro, que l'on procède à une lyse des cellules avec un détergent approprié, et que l'on isole ladite protéine selon les méthodes connues de purification des protéines, par exemple une méthode comprenant une étape de chromatographie d'affinité sur un support chromatographique réalisé avec un

anticorps tel que décrit ci-après.

L'invention a également pour objet des anticorps capables de reconnaître un déterminant antigénique d'une protéine définie ci-dessus, qui est présent sur la face apicolatérale de la paroi des cellules basales de l'épiderme, notamment de l'épiderme de l'homme et d'autres mammifères tels que ceux énumérés ci-dessus. Ces anticorps sont soit des anticorps monoclonaux, soit des anticorps polyclonaux purifiés par exemple par immunoadsoption sur la protéine. L'invention s'étend bien entendu aux fragments Fab ou F(ab')2

correspondants obtenus par clivage enzymatique desdits anticorps.

Parmi les anticorps monoclonaux de l'invention, on citera en particulier ceux qui sont sécrétés par la lignée cellulaire hybride mentionnée

précédemment.

L'invention s'étend aux anticorps tels que définis précédemment, modifiés par marquage avec un traceur radioactif, fluorescent ou enzymatique,

obtenu selon les méthodes classiques de préparation de tels anticorps marqués.

Par exemple, le traceur peut être un traceur radioactif obtenu par échange isotopique avec un isotope radioactif de l'iode ou de l'indium. Le

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couplage des anticorps avec un agent traceur radioactif est connu en soi.

Le couplage des anticorps avec un fluorochrome (par exemple isothiocyanate de fluorescéine ou de rhodamine) ou avec une enzyme est également connu. L'enzyme est par exemple une peroxydase ou une phosphatase alcaline. L'activité enzymatique éventuellement présente sur le réactif, après réalisation d'un test, peut être déterminée selon les méthodes connues avec un substrat approprié permettant par exemple une révélation par colorimétrie, par

fluorescence, par luminescence, par potentiométrie, etc...

L'invention s'étend également aux anticorps obtenus selon la technique connue des hybridomes au départ des lymphocytes prélevés sur des animaux immunisés, selon les méthodes usuelles, avec la protéine définie cidessus. L'invention s'étend en outre aux anticorps tels que définis cidessus, marqués ou non, fixés sur un support solide permettant leur utilisation comme agents immunoadsorbants dans des méthodes de chromatographie d'affinité ou comme réactifs dans les méthodes d'analyse fondées sur la réaction antigène-anticorps (techniques radioimmunologiques, techniques

d'immunofluorescence, techniques immunoenzymatiques).

Ledit support solide peut être réalisé avec tout matériau solide, biologique ou synthétique, doué de propriétés adsorbantes ou capable de fixer un agent de couplage. Ces matériaux sont connus et décrits dans la littérature. Parmi les matériaux solides capables de fixer les anticorps par adsorption, on citera par exemple le polystyrène, le polypropylène, les latex, etc... Parmi les matériaux solides utilisables pour fixer les anticorps par covalence à l'aide d'un agent de couplage, on peut citer notamment le dextran, la cellulose, leurs dérivés aminés (diéthylaminoéthyl-cellulose ou

diéthylaminoéthyl-dextran), etc...

Le support solide peut se présenter par exemple sous forme de

disques, de tubes, de baguettes, de billes, ou de plaques de microtitration.

Les agents de couplage permettant de fixer par covalence les anticorps sur le support solide sont des dérivés bifonctionnels tels que des

dialdéhydes, des quinones, etc...

Les anticorps peuvent également être fixés de façon connue sur des

supports solides minéraux.

Pour préparer des 'anticorps monoclonaux, on prépare au préalable des cellules hybrides, et l'invention a aussi pour objet un procédé de préparation de cellules hybrides capables de sécréter un anticorps tel que défini ci-dessus, caractérisé par le fait que l'on immunise un animal avec la protéine définie ci-dessus ou avec des cellules ou des parois cellulaires d'un kératinocyte, notamment humain, que l'on prélève les lymphocytes de l'animal immunisé, que l'on procède, selon les méthodes connues, à une fusion cellulaire avec des lymphocytes cultivables in vitro, et que l'on sélectionne les clones sécrétant des anticorps capables de reconnaître un antigène caractéristique de la face apicolatérale des cellules basales de l'épiderme de l'homme ou autres mammifères tels que ceux énumérés ci-dessus. Le kératinocyte utilisé comme produit de départ est notamment un kératinocyte transformé, par

exemple par le virus SV40.

L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'anticorps monoclonaux par culture des lignées cellulaires hybrides décrites précédemment et séparation des anticorps produits dans le milieu de culture ou

encore dans des ascites.

Si désiré, on fixe lesdits anticorps sur un support selon les méthodes connues et/ou les fait réagir avec un marqueur radioactif,

fluorescent ou enzymatique selon les méthodes connues.

L'invention a également pour objet l'utilisation des anticorps monoclonaux tels que définis ci-dessus comme réactifs dans les techniques

basées sur la réaction antigène-anticorps.

Ces techniques, telles que l'immunofluorescence directe ou indirecte, les techniques immunoenzymatiques, les techniques

radioimmunologiques, etc..., sont connues et ne seront pas décrites ici.

Les anticorps de l'invention peuvent être utilisés en particulier comme réactifs d'étude de la différenciation normale ou pathologique des cellules de l'épiderme. Ils sont utilisables en particulier dans le diagnostic

des maladies dermatologiques, et aussi des maladies des épithéliums internes.

Ils permettent aussi de déterminer la présence de cellules basales susceptibles de constituer des zones cancéreuses et/ou lésionnelles résiduelles, par exemple après traitement chirurgical d'un cancer basocellulaire. Ils sont utilisables dans toutes les techniques d'imagerie médicale

utilisant des anticorps.

Les anticorps de l'invention peuvent aussi être utilisés en cytométrie de flux pour isoler les cellules basales à partir d'une population de cellules dermiques traitées par un agent de dissociation convenable (par

exemple la trypsine).

En outre, les anticorps de l'invention, fixés sur un support solide convenable, sont utilisables dans la réalisation de réactifs pour

chromatographie d'affinité.

Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1 - Obtention d'anticorps monoclonaux 1) Culture des cellules SVK14 On utilise la lignée de kératinocytes humains transformée par le virus SV40, dénommée SV-K14 (Taylor-Papadimitriou et al., Cell Diff. 11, 169, 1982). Cette lignée cellulaire a été déposée à l'ICRF (Imperial Cancer Research Fund, P.O.Box 123, Lincoln's Inn Fields, London WC2A3PX. U.K.) Les cellules de cette lignée ont été cultivées dans un milieu Eagle modifié par Dulbecco contenant 4,5g/1 de glucose et 1,2g/l de bicarbonate de sodium additionné de 10% de sérum foetal de veau dans un étuve humide contenant 5% CO2-95% air à 37 C. Des tests appropriés ont permis de contrôler l'absence de mycoplasmes dans ces cultures. Des études récentes (Bernard et al., Cancer Res. 45, 1707, 1985) ont permis de démontrer que les cellules SVK14 possèdent beaucoup de caractères des kératinocytes basaux et ne sont capables que d'une

différenciation limitée.

2) Immunisation Des souris BALB/c femelles de 8 à 12 semaines ont été immunisées avec 2 x 10 cellules SVK14 par voie intrapéritonéale. Un rappel identique a été fait 3 semaines plus tard. La rate des animaux a été prélevée exactement

3 jours après ce rappel.

3) Culture des cellules de myélome de souris SP2/O On utilise une lignée de cellules SP2/O (Shulman et KMhler, Nature 276, 269, 1978) incapables de survivre dans un milieu contenant de l'azasérine et de l'hypoxanthine (Buttin et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81, 27, 1978). Les cellules sont cultivées dans un milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DME) contenant 4,5g/1 de glucose, 1,2g/1 de bicarbonate de sodium, lmM de pyruvate de sodium, 2mM glutamine, 100U de pénicilline/ml, lig de streptomycine/ml (soit un milieu DME complet), additionné de 10% de sérum foetal de veau décomplémenté (30 minutes à 56 C). Après décongélation, les cellules SP2/O doivent être cultivées à des concentrations de 2 x 104 à 5 x105/ml jusqu'à ce qu'elles aient atteint un temps de doublement de 12 à 15 heures. L'efficacité de clonage est déterminée par dilution limite et doit être proche de 100%. La congélation de ces cellules se fait à une concentration de 5 x 10 à 107/ml dans 95% de sérum de veau foetal et 5% de DMSO. 4) Préparation des cellules SP2/0 Des cellules SP2/O en croissance exponentielle à une concentration de 105 à 2 x 105 cellules par ml sont centrifugées à 800 rpm pendant 5 minutes et resuspendues dans du DME complet sans sérum à une densité de 107 cellules/ml.

Pour réaliser une fusion, il faut 107 cellules de myélome.

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) Préparation des splénocytes On prépare de façon classique les splénocytes des souris immunisées, et on les met en suspension dans un milieu DMEM (Dulbecco's Modified Essential Medium) complet sans sérum. Pour comptage, 50pl de la suspension sont prélevés et mélangés à 50pl de bleu trypan à 0,2% et 400pl de PBS (phosphate buffered saline). Au bout de 30 secondes, un aliquot est disposé dans une cellule de

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Buerker; le nombre de splénocytes total d'une rate est de 10 à 1,6 x 108. Le pourcentage de cellules mortes est inférieur à 20%. La suspension est

centrifugée à 800 rpm pendant 5 minutes et ajustée à 108 cellules viables/ml.

6) Fusion (jour 0) La technique utilisée est dérivée de la technique de "fusion en

masse" de Juy et al. (J. Immunol. 129, 1153, 1982).

Dans un tube de polypropylène de 50ml,107 cellules de myélome (lml) et 4. 107 splénocytes (0,4ml) sont mélangées et centrifugées à 800 rpm (rotations par minute) pendant 5 minutes. Le surnageant est pipetté et on rajoute 1 goutte de DME complet sans sérum au culot qui est ensuite remis en suspension (Galfré et al., Nature 266, 550, 1977). On rajoute au culot 400pI de polyéthylène glycol 1000 (PEG 1000) à 45% dans le DME goutte à goutte pendant 30 secondes en agitant lentement le tube de temps en temps. On laisse agir 3 minutes à température du laboratoire en agitant lentement de temps en temps. On ajoute ensuite 1 ml de DKE complet contenant 10% de sérum foetal de veau (SFV) en 5 minutes (environ 1 goutte toutes les 2 secondes); le tube est incliné et doucement agité. Au terme de ces 5 minutes, 10 à 15ml de milieu complet contenant le sérum foetal de veau est ajouté goutte à goutte rapidement sans agitation. Cette suspension est prélevée avec une pipette de ml et répartie dans une boite de culture de 100mm de diamètre qui est incubée à l'étuve à 37 C pendant 2 à 3 heures. Puis le volume de la suspension est ajusté à 40ml. La suspension est ensuite répartie dans des godets de plaques de culture à 24 trous, à raison de 0,4 ml/godet. On réalise 4 plaques

par fusion.

7) Jour 1 On rajoute 0,4 ml/godet de milieu sélectif milieu DME complet avec

SFV contenant 5 x 10-5M hypoxanthine et 10 -5M azasérine.

8) Jour 3

On opère de façon analogue au jour 1.

Dans ces conditions, des clones d'hybridomes apparaissent entre le

jour 6 et le jour 9.

-7- 9) Repérage des clones produisant des anticorps recherchés Quand les clones recouvrent un tiers de la surface des godets et/ou que le milieu devient jaune-orangé, le surnageant est testé par immunofluorescence indirecte sur cultures de SVK14 et sur coupes d'épidermes selon les techniques décrites par Bernard et al. (Cancer Res. 45, 1707, 1985)

et Bernard et al. (Brit. J. Dermatol. 112, 617, 1985).

) Repiquage des godets sélectionnés Avant que les godets ne soient à moitié pleins, il sont repiqués dans 3 autres godets au total. A ce stade, on réalise d'une part une congélation et d'autre part un sous-cl8nage dans des plaques à 96 trous (1 rangée à 10 cellules/godet, 1 rangée à 5 cellules/godet, 2 rangées à

2 cellules/godet, 2 rangées à 1 cellule/godet, 2 rangées à 0,5 cellule/godet).

Pour le sous-cl6nage on peut aussi réaliser une plaque contenant un milieu composé de 10 à 50% de surnageant de macrophages. Les surnageants des godets positifs sont testés par immunofluorescence indirecte. Deux clones positifs

sont ensuite cultivés.

L'un des deux clones (BC2) a été déposée à la Collection Nationale

de l'Institut Pasteur, sous le numéro indiqué précédemment.

11) Croissance en ascite La croissance d'un hybridome en liquide d'ascite est obtenue après injection intrapéritonéale de 107 cellules issues d'un même cl6ne à des souris

BALB/c de 8 semaines, préalablement sensibilisées par injection intra-

péritonéale de 0,5ml de pristane (le pristane est le 2,6,10,14tétraméthyl pentadécane).

12) Identification de la classe et de la sous-classe d'immuno-

globulines sécrétées La classe des immunoglobulines sécrétées dans le surnageant de myélome a été établie par double diffusion en agar avec des réactifs spécifiques des chaînes lourdes des immunoglobulines (Serotec Ltd., Bicester, Grande-Bretagne).

L'immunoglobuline sécrétée par le clSne BC2 est une IgGl.

EXEMPLE 2 - Identification des antigènes reconnus 1) Cellule SVK14 Des études effectuées par immunofluorescence indirecte ont montré que l'immunoglobuline sécrétée par la cellule BC2 permet un marquage important des cellules SVK14 non fixées, fixées au formaldéhyde, et fixées au

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formaldéhyde en présence de Triton X-100 (isooctyl phénol polyoxyéthyléné à 10

moles d'oxyde d'éthylène).

2) Immunoprécipitation Les cellules SVK14 sont marquées métaboliquement pendant 24heures à 37 C avec de la 35S -méthionine ou du 2-3H -mannose, dans un milieu de culture complet. Le milieu contient 150 pCi de 35S méthionine (New England Nuclear; 400 Ci/mmol) pour 100 pCi de 2- Hmannose (New England Nuclear; Ci/mmol) par ml. Après lavage au PBS, les cellules sont lysées sur la glace et pendant 30 minutes dans un tampon d'extraction composé de PBS sans Ca++ ni Mg++, contenant 1% de Triton X100, 0,5% de déoxycholate de sodium, 0,1% de dodécylsulfate de sodium et 0,2% de NaN3. Ce tampon contient en outre 25 pl de DNAse I (à 2mg/ml) et 5 pl RNAse A (à 5 mg/ml). 10 ml de tampon de lyse sont nécessaires pour lyser des cultures de 175cm2. Les surnageants sont récoltés

et clarifiés par centrifugation à 15.000g pendant 30 minutes à 4 C.

L'immunoprécipitation est réalisée en incubant 500pl d'extrait cellulaire avec

3pl de surnageant de milieu de culture d'hybridome pendant 16heures à 4 C.

Ensuite sont ajoutés 50pl d'immunoglobulines de lapin antiimmunoglobuline de souris (Cappel Laboratories, Cochranville, PA, USA) et l'incubation est prolongée pendant 2heures à 4 C. Les complexes immuns sont ensuite isolés en ajoutant 150pl de protéine A-Sépharose (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suède) dilués dans 500pl de tampon de lyse, en incubant avec agitation pendant 2 heures à 20 C et en centrifugeant à 13. 000g pendant 10 minutes. Après 3 lavages dans le tampon de lyse, le culot est extrait à 100 C en présence de 1% dodécylsulfate de sodium (SDS) et 5% de bêta-mercaptoéthanol et analysé par électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS selon la méthode de Laemmli

(Laemmli, Nature, 277, 680, 1970).

On obtient ainsi la protéine de l'invention, qui présente les

caractéristiques mentionnées ci-dessus.

3) Immunodétection après électrotransfert de protéines La technique utilisée est semblable à celle décrite par Bernard et al. (Cancer Research 45, 1707, 1985). Les cellules SVK14 sont lysées dans du

PBS contenant 1% de dodécylsulfate de sodium et 5% de bêtamercaptoéthanol.

Après grattage des bootes de culture, les extraits sont clarifiés par sonication et chauffage à 100 C pendant 5 minutes. Les protéines cellulaires (60pg dans 20pl) sont ensuite séparées par électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS et transférées sur nitrocellulose suivant la méthode de Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350, 1979). Les bandes protéiques réactives (c'est-à-dire réagissant avec l'anticorps) sont ensuite

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révélées par la technique de coloration à la peroxydase décrite par Glass et

al. (Science 211, 70, 1980).

4) Spécificité tissulaire La spécificité des anticorps présents dans les surnageants de myélome et des liquides d'ascite à été étudiée par immunofluorescence indirecte sur coupes congelées de 4.m d'épaisseur comme décrit par Bernard et al. (Brit. J. Dermatol. 112, 647, 1985). Des tissus épithéliaux d'origines animales variés ont été utilisés afin d'étudier la spécificité d'espèce et différents tissus épithéliaux d'origine humaine ont utilisés pour étudier la spécificité tissulaire. Des tissus pathologiques humains ont aussi été utilisés pour évaluer la valeur diagnostique de la présente invention. Cette étude a porté sur des peaux pathologiques de tumeurs bénignes, tumeurs malignes et dermatoses associées à des anomalies de la prolifération et de la

différenciation kératinocytaire.

) Réactivité des anticorps avec des antigènes de surface cellulaire Lorsqu'en immunofluorescence indirecte sur coupe congelée de peau humaine non pathologique, le marquage apparatt membranaire, cette localisation est confirmée par immunomarquage en microscopie électronique suivant la méthode de Graham et Karnovsky (J. Histochem. Cytochem. 14, 291, 1966), par immunomarquage de cellules en culture, fixées au paraformaldéhyde (PFA) dilué à 3% dans du PBS (Bernard et al. Cancer Res. 45, 1707, 1985), et par immunomarquage sur cellules isolées par trypsination ménagée à partir

d'épiderme humain (Freeman et al., In Vitro 12, 352, 1976).

6) RESULTATS

Ces études ont permis de définir un système antigénique localisé au

niveau des faces apicolatérales de la cellule basale de l'épiderme.

L'anticorps (BC2) capable de reconnaltre cet antigène est sécrété

par la lignée hybride obtenue comme précédemment.

L'anticorps (BC2) identifie une glycoprotéine de 165.000 daltons.

Cette protéine est immunoprécipitée par BC2 à partir d'un extrait cellulaire

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de cellules SVK14 marquées à la S -méthionine et au 2- H -mannose. Les études d'immunofluorescence et de microscopie électronique démontrent la répartition polarisée de cet antigène à la surface des cellules basales de la peau humaine. Cet antigène a été détecté chez l'homme, le singe, le cheval, la vache, la chèvre, le miniporc, mais pas chez le lapin et la souris. Dans tous les cas, la répartition polarisée est observée. Elle est conservée sur les kératinocytes humains après dissociation par la trypsine. Le marquage est - 1o- 2606034 détecté par immunofluorescence indirecte à la surface de cellules SVK14 en culture (i) fixées au paraformaldéhyde et perméabilisées ou non au Triton X-100 (Bernard et al. Cancer Res. 45, 1707, 1985) et (ii) fixées au méthanol à -20 C (ibid.). La répartition de cet antigène n'est pas altérée dans le cas de maladies hyperprolifératives de la peau telles que le psoriasis

ou le papillome.

L'antigène est également présent notamment dans le cas du carcinome

basocellulaire. Il est absent dans les cas de mélanome et de noevus.

Les résultats obtenus sont résumés dans les Tableaux I à III suivants:

TABLEAU I

SPECIFICITE D'ESPECE DE L'ANTICORPS SECRETE PAR LA CELLULE BC2

Espèce testée a) Souris Lapin Miniporc Chèvre Vache Cheval Singe Homme - ++ + -±- + +l a) par immunofluorescence sur sections de peau congelées Hil marquage important ++ marquage moins important + marquable faible marquage absent

TABLEAU II

SPECIFICITE TISSULAIRE CHEZ L'HOMME DE L'ANTICORPS SECRETE PAR BC2

Tissus testés a) Peau Oesophage Uretère Estomac Colon Intestin grêle a) par immunofluorescence sur sections de peau congelées - ll- 2606034

TABLEAU III

PATHOLOGIE CUTANEE: ABSENCE OU PRESENCE DE L'ANTIGENE RECONNU

PAR L'ANTICORPS SECRETE PAR BC2

Mélanome (5)a) Noevus (2) Carcinome Carcinome basocellulaire (4) spinocellulaire (4) - ++ (boyaux) + (boyaux) - (globes cornés)

a) Le chiffre entre parenthèses représente le nombre de cas étudiés.

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Claims

REVENDICATIONS

1. Protéine, caractérisée par le fait: - qu'il s'agit d'une protéine non kératinique présente sur la face apicolatérale, et absente sur la face basale des cellules basales de l'épiderme, notamment chez l'homme, le singe, le cheval, la vache, la chèvre

et le miniporc, y compris des cellules basales psoriasiques et papillo-

mateuses; - qu'elle est absente de la surface des cellules basales de l'épiderme chez le lapin et la souris; - qu'elle est présente chez l'homme dans les tissus épithéliaux suivants (outre la peau): oesophage, uretère, et, à un degré plus faible, estomac, colon et intestin grêle; - qu'elle est présente, de façon non polarisée, dans les cellules pathologiques suivantes: carcinome basocellulaire, carcinome spinocellulaire, et absente dans les cellules de mélanome et de naevus; - et qu'elle est reconnue par l'anticorps sécrété par la lignée cellulaire hybride BC2 déposée le 27 Octobre 1986 à la Collection nationale de microorganismes de l'Institut Pasteur sous le n I-614, ainsi que les analogues de cette protéine, lesdits analogues étant tous fragments et tous peptides synthétiques ou semi-synthétiques contenant des séquences peptidiques présentes sur ladite protéine, ainsi que tous dérivés de ces fragments ou peptides, à condition que ces fragments, peptides ou dérivés soient reconnus

par l'anticorps défini précédemment.

2. Protéine selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'il

s'agit d'une glycoprotéine.

3. Protéine selon l'une quelconque des revendications 1 et 2,

caractérisée par le fait que le poids moléculaire de ladite protéine, évalué

par électrophorèse sur gel de polyacrylamide est de 165.000 daltons.

4. Anticorps caractérisés par le fait qu'ils sont capables de reconnaître un déterminant antigénique d'une protéine telle que définie dans

l'une quelconque des revendications 1 à 3, lesdits anticorps étant soit des

anticorps monoclonaux, soit des anticorps polyclonaux purifiés.

5. Anticorps selon la revendication 4, caractérisés par le fait que

lesdits anticorps sont sécrétés par la lignée cellulaire hybride BC2.

6. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 4 et 5,

caractérisés par le fait que lesdits anticorps sont des anticorps marqués

et/ou fixés sur un support solide.

7. Lignées cellulaires hybrides capables de sécréter un anticorps

tel que défini dans l'une quelconque des revendications 4 et 5.

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8. Procédé de préparation de cellules hybrides telles que définies dans la revendication 7, caractérisé par le fait que l'on immunise un animal avec la protéine telle que définie dans le revendication 1 ou avec des cellules ou des parois cellulaires d'un kératinocyte, notamment humain, que l'on prélève les lymphocytes de l'animal immunisé, que l'on procède, selon les méthodes connues, à une fusion cellulaire avec des lymphocytes cultivables in vitro, et que l'on sélectionne les clones sécrétant des anticorps capables de reconnaître un antigène caractéristique de la face apicolatérale des cellules basales de l'épiderme de l'homme et d'autres mammifères tels

qu'énumérés dans la revendication 1.

9. Procédé de préparation des anticorps tels que définis dans la revendication 4, caractérisé par le fait que l'on cultive une lignée cellulaire hybride telle que définie dans la revendication 7, et que l'on

sépare les anticorps produits.

10. Utilisation des anticorps tels que définis dans l'une quelconque

des revendications 4 à 6, comme réactifs dans les techniques basées sur la

réaction antigène-anticorps.

11. Utilisation selon la revendication 10, dans les techniques d'immunofluorescence, immunoenzymatiques, radioimmunologiques, dans les techniques de cytométrie de flux ou dans les techniques de chromatographie d'affinité.

12. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée par le fait que lesdits anticorps servent de réactifs dans l'étude de la différenciation

normale ou pathologique des cellules de l'épiderme.

13. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée par le fait que lesdits anticorps servent de réactifs pour déterminer la présence ou l'absence de cellules basales après traitement chirurgical d'un cancer basocellulaire.