FR2547981A1 - Milieu de croissance de plante - Google Patents

Abstract

DES MILIEUX DE CROISSANCE DE PLANTE ARTIFICIELS CONVENANT A LA CULTURE EN SUSPENSION DE CELLULES DE PLANT DE TOURNESOL SONT REALISES. ON MET AU POINT DES METHODES D'UTILISATION DES MILIEUX POUR LA CROISSANCE DE CULTURES DE CELLULES EN SUSPENSION PROVENANT DE CELLULES DE PLANT DE TOURNESOL. ON DETERMINE DES METHODES DE SELECTION DE LA TENEUR EN HUILE DE GRAINES DE TOURNESOL PRODUIT PAR DES PLANTS DE TOURNESOL EN UTILISANT LES CARACTERISTIQUES DE CROISSANCE DE CELLULES EN SUSPENSION DE CELLULES DE PLANT DE TOURNESOL.

Description

MILIEU DE CROISSANCE DE PLANTE

L'invention concerne des milieux artificiels de croissance de

plante et des méthodes d'utilisation de ces milieux pour une culture de cellules en suspension et pour la détermination de leur teneur en huile.

L'amélioration des cultures sur le terrain est une tâche qui prend du temps, qui demande beaucoup de travail et nécessite souvent une utilisation importante de terre cultivable précieuse En général, on observe une caractéristiques souhaitable d'une plante cultivée particulière et on la croise avec une autre souche de cette plante, on procède à une auto-fécondation ou à un croisement en retour avec la lignée parentale et ensuite à un croisement en retour avec la lignée parentale pendant de nombreuses générations.

Si les caractéristiques pour lesquelles on démarre un programme de croisement ne se manifestent que dans la graine ou le fruit de la plante mûre, on dépense un maximum de temps et de travail à l'évaluation du candidat d'un programme particulier de croisement ou de reproduction La teneur en huile des graines de tournesol est une caractéristique qui, jusqu'à maintenant, n'a pu être déterminée que par évaluation directe de la teneur en huile de la graine mûre Ainsi, l'évaluation de la teneur en huile des graines candidates dans un programme de reproduction de graines de tournesol par utilisation de méthodes traditionnelles a consommé un maximum de ressources en temps, en travail et en terre.

Une économie maximum de ces ressources pourrait être obtenue s'il était possible de déterminer la teneur en huile des graines de tournesol candidates avant la maturation de la plante De préférence, cette détermination devrait être effectuée très tôt dans le cycle de vie de la plante du tournesol, ne devrait pas nécessiter de terre ou n'en demanderait que très peu et ne nécessiter qu'un minimum de temps.

La demanderesse a trouvé un milieu de base de croissance de plante qui rend possible de cultiver l'hélianthus annuus (H annuus) dans une culture de cellule en suspension Les fruits ou les graines de H annuus sont la source de l'huile de graine de tournesol Ainsi, l'utilité du milieu réside dans son aptitude à permettre la culture de cellules en suspension du H annuus, plante importante pour la production de l'huile, et la manipulation de ces cellules aux fins de l'amélioration de la souche. En outre, la demanderesse a également trouvé que, lorsque l'on cultivait les cellules de tissu de tournesol dans le milieu de suspension, les caractéristiques de croissance des cellules de la culture 10 pourraient être corrélées avec un degré de fiabilité élevée avec la teneur en huile des graines de la plante entière En particulier, on a trouvé que les cultures de cellules en suspension pouvaient être démarrées à partir des segments hypocotylés des pousses de la plante de tournesol En outre, des cultures de cellules en suspension peuvent être 15 démarrées à partir du cal provenant de pratiquement n'importe quels tissus de tournesol, y compris ceux provenant des pousses et des plantes ayant atteint leur croissance complète Ainsi, le milieu peut être employé dans une méthode de détermination de la teneur en huile de lignée prospective de graines de tournesol sans nécessiter le travail, 20 les terres ou le temps qui seraient autrement nécessaires aux essais sur le terrain des plants de tournesol En outre, le méthode de culture de cellules en suspension peut être utilisée pour diminuer le nombre prospectif de lignées de tournesol à tester sur le terrain à un nombre

beaucoup plus faible de lignées ayant une haute probabilité de présenter 25 une teneur en huile élevée.

Il est évident pour le technicien expérimenté dans la culture des tissus végétaux que la méthode de culture en suspension des cellules de plants de tournesol brièvement décrite ci-dessus présente un potentiel élevé de modifications, de croissance et de sélection de cellules 30 uniques de plants de tournesol modifiées génétiquement de diverses

façons, y compris par mutagénèse ou transformations physique et chimique avec une utilisation d'acide désoxyribonucléique (DNA) provenant d'organismes autres que le plant de tournesol.

La figure 1 présente un diagramme de voies qui décrit les possibles 35 associations entre les diverses variables du tournesol.

Seuls les sels minimum du milieu sont basés sur le milieu de sels minéraux décrits par Murashigé et Skoog (milieu MS) Le milieu MS est utilisé de façon typique à la culture des cellules végétales et il est décrit dans Murashige T et Skoog F ( 1962), Physiologia, Plantarium,

/473-90.

Les sels suivants se trouvent typiquement dans le milieu: sulfate de magnésium heptahydraté (Mg 504, 7 H 20), chlorure de calcium dihydraté (Ca C 12, 2 H 20),. nitrate de potassium (KN 03),. nitrate d'ammonium (NH 4 N 03), phosphate de potassium (KH 2 P 04), sulfate de manganèse tétrahydraté (Mn 504, 4 H 20), 10 sulfate de zinc heptahydraté (Znc 504, 7 H 20), sulfate de cuivre pentahydraté (Cu 504, 5 H 20),. chlorure de cobalt hexahydraté (CO C 12, 7 H 20), iodure de potassium (KI), acide borique (H 2 803), oxyde de molybdène et de sodium dihydraté (Na Mb O 4, 2 H 20), sulfate ferreux heptahydraté (Fe 504, 7 H 20),

sel de sodium de l'acide éthylènediaminotétracétique (Na EDTA).

En général, telle qu'elle est utilisée dans la présente invention, la concentration exacte en sels peut varier dans de larges limites sans s'écarter de l'invention Cependant, pour rendre standard la préparation du milieu, les concentrations en sels minimum énumérés ci-dessus sont les suivantes: * Mg SO 4, 7 H 20 * Ca Cl 2, 2 H 20. KN 03. NH 4 NO 3. KH 2 PO 4 * Mn SO 4, 4 H 20 * Zn SO 4, 7 H 20 * Cu SO 4, 5 H 20 * CO C 12, 6 H 20. KI. H 3 B 03. Na 2 Mo O 4, 2 H 20 * Fe SO 4, 7 H 20. Na 2 EDTA 370 milligrammes/l (mg/l) 440 m 9/1 1 900 mg/l 1 650 mg/l mg/l 22,3 mg/l 8,6 mg/l 0,025 mg/l 0,025 mg/l 0,83 mg/l 6,2 mg/l 0,25 mg/l 28,75 mg/l 37,25 mg/l Un certain nombre de vitamines sont ajoutées au milieu en quantités suivantes: inositol jusqu'à et y compris environ 500 mg/1 thiamine H Cl jusqu'à et y compris environ 40 mg/1 acide nicotinique jusqu'à et y compris environ 0,20 mg/Il À pyridoxine H Cl jusqu'à et y compris environ 4 mg/l Les vitamines sont en général présentes en quantité suffisante pour soutenir une croissance vigoureuse de la suspension de cellules de tournesol à faire pousser dans le milieu A l'intérieur de ces interval10 les, on préfère utiliser des concentrations de 100 mg/l d'inositol, mg/1 de thiamine H Cl, 20 mg/1 d'acide nicotinique et 4 mg/1 de

pyridoxine H Cl.

Le milieu contient aussi des hormones végétales Les hormones

végétales que l'on peut utiliser comprennent les auxines et les cytoki15 nines.

Diverses hormones du type des auxines ont été utilisées dans le milieu et sont par exemple: l'acide naphtylacétique (NAA), l'acide indolylbutyrique (IBA), l'acide indolylacétique (IAA) et l'acide 2,4dichlorophénoxyacétique ( 2,4-D) Les auxines ont été utilisées à diverses 20 concentrations dans le milieu et en général, les résultats obtenus

varient en fonction des concentrations des auxines qui ont été essayées.

Les intervalles de concentration poàr les diverses auxines sont les suivants: NAA environ 0,01 à 10 mg/l IBA environ 1 à 10 mg/l IAA environ 1 à 4 mg/1 2,4-D environ 0,01 à 1 mg/1 Diverses hormones du type cytokinine ont été utilisées dans le milieu et se sont par exemple la benzyladénine (BA), la zéatine (Z), le 30 kinétine (K) et la N 6 A 2 isopentyladésine ( 2 i P) Les cytokinines ont aussi été utilisées à diverses concentrations dans le milieu et en général, les résultats obtenus varient selon les concentrations de la cytokinine qui ont été essayées Les intervalles de concentration pour les diverses cytokinines se situent généralement entre environ 0,1 mg/1 35 et environ 10 mg/1 On préfère généralement utiliser BA et K. Outre les composants mentionnés ci- dessus, le milieu contient du sucrose La concentration de sucrose peut varier mais on emploie généralement une quantité suffisante pour permettre une croissance soutenue

des cellules De façon typique, la concentration en sucrose est d'environ 3 % (p/v) soit environ 30 g/l.

Le milieu de suspension de cellules peut aussi comprendre une certaine quantité de lait de noix de coco (Gib Co) en quantité allant jusqu'à 20 % v/v du milieu Le lait de noix de coco est en général

compris à une concentration optimum d'environ 10 % v/v.

Les formulations des divers milieux et leur utilisation seront mieux comprises à partir des exemples suivants qui sont donnés ici pour

illustrer l'invention et non pas pour la limiter.

Dans les exemples suivants, on a utiliser des graines de tournesol de 100 génotypes expérimentaux Les génotypes expérimentaux de tournesol ont leur origine dans divers environnements génétiques et ils ont subi

au moins cinq générations de croisement et de sélection répétée.

Divers traits phénotypiques individuels sont choisis pour être 15 observés et ils sont classés comme indiqué dans le tableau I suivant.

Les critères de pigmentation de plante et de pousse apparaissent dans le tableau ci-dessous La teneur en huile de la graine est expliquée plus en détail dans l'exemple 2 ci-dessous L'induction du cal est déterminée par comparaison visuelle des lignées expérimentales avec des 20 lignées de contrôle de graines de tournesol SS 405 B et 89 B La croissance de la culture en suspension est expliquée plus en détail dans l'exemple 2 cidessous L'induction d'une tumeur est évaluée par germination de graines de chaque individu pendant 7 jours et par injection des pousses avec des cultures d'une nuit de souches 15955, A 208 et C 58 25 d'Agrobacterium tumefaciens (A tumefaciens) Les pousses inoculées sont cultivées pendant 7 jours sous Agrolites et les tumeurs portant un hypocotyle sont excisées et cultivées sur milieu d'agar-agar La dimension des tumeurs est évaluée après une incubation de 7 jours à la lumière Les souches de tournesol déployant une bonne croissance de tumeur présentent des tumeurs de croissance rapide induites par chacune des trois cultures de A tumefaciens Les souches déployant une médiocre croissance de tumeur n'ont de tumeurs induites que par une seule ou par aucune des cultures de A tumefaciens Les souches déployant une croissance intermédiaire présentent des tumeurs de croissance lente induites 35 par chacune des trois cultures de A tumefaciens ou des tumeurs de

croissance rapide induites par deux des trois cultures de A tumefaciens.

La formation de pousses adventives est déterminée par culture de quatre extrémités de pousse de jeunes plantes cultivées à partir de chacune des 100 souches de tournesol sur un milieu de multiplication de pousses pendant 3 semaines sous Agrolites La formation de cinq pousses adventives ou plus est estimée comme étant une bonne formation de pousses Une ou cinq pousses adventives sont considérées comme étant une formation de pousses intermédiaire, lorsqu'il n'y a aucune formation de pousses adventives, ceci est estimé comme étant une mauvaise formation

de pousses.

TABLEAU I

Proportion relative de cultures expérimentales montrant des caractéristiques bonnes (A), intermédiaires (B) et mauvaises (C) dans le domaine de la culture des tissus Nombre d'individus dans les classes 15 Caractère A B C hauteur de plante * 28 54 15 teneur en huile de la graine ** 48 28 21 pigmentation de la jeune plante *** 65 17 15 induction du cal 26 45 26 croissance de la culture en suspension 30 30 37 induction d'une tumeur 10 23 64 génération d'une pousse 7 44 46 * A = nain ou semi-nain, B = moyen, C = grand ** A = hauteur > 40 %, B = intermédiaire 35 à 40 %, C = moins de 35 %

**A = hypocotyle pourpre, B = hypocotyle rose, C hypocotyle vert.

EXEMPLE 1

On fait germer des graines de 100 lignées expérimentales de tournesol de la façon suivante: Le péricarpe ou enveloppe est enlevé des fruits du tournesol Les graines sont enlevées des fruits et on les stérilise pendant 15 minutes dans une lessive à 30 % avec 1 à 2 gouttes de savon de vaisselle Ensuite, on rince à l'eau distillée stérile, les graines sont plantées dans des tubes de contrôle, 2 par tube, dans un milieu à 0,5 % de sucrose, 1 % 35 d'agar-agar et les sels suivants avec les concentrations indiquées: Mg 504, 7 H 20 370 mg/l Ca C 12, 2 H 20 440 mg/l KNO 3 1 900 mg/l NH 4 NO 3 1 650 mg/l KH 2 PO 4 170 mg/l On fait germer les graines dans l'obscurité pendant 4 à 5 jours et ensuite pendant 1 à 2 jours à la lumière Les segments hypocotylés de 2 mm provenant des jeunes pousses ayant germé sont alors placés sur le milieu suivant: Mg 504, 7 H 20 370 mg/ * Ca C 12, 7 H 20 440 mg/l * KNO 3 1 900 mg/1 NH 4 NO 3 1 650 mg/ KH 2 PO 4 170 mg/l * Mn 504, 4 H 20 22,3 mg/l * Zn 504, 7 H 20 8,6 mg/1 Cu SO 4, 5 H 20 0,025 mg/l * Na 2 Mo O 4, 2 H 20 0,25 mg/l COC 12, 6 H 20 0,025 mg/1 * Fe 504, 7 H 20 28,75 mg/1 Na 2 EDTA 37,25 mg/1 À inositol 100 mg/1 thiamine H Cl 40 mg/l acide nicotinique 20 mg/1 pyridoxine H Cl 1 mg/l acide a-naphtylacétique 1 mg/1 benzyladénine 1 mg/1 sucrose 30 g/l H 20 distillée jusqu'à 1 000 ml p H 6,3 agar-agar 6, 0 g Les segments hypocotylés de 2 mm sont cultivés dans l'obscurité pendant 2 semaines Le cal friable est enlevé et il est encore cultivé 30 sur le même milieu Le cal friable peut être maintenu sur le même milieu

pour être utilisé en tant que cultures de cellules en suspension.

Les cultures de cellules en suspension démarrent à partir de chaque cal de la façon suivante: 1,5 à 2,0 g de poids de cal frais sont placés dans un ballon stérile de 50 ml contenant 15 ml d'un milieu ayant 35 la composition suivante: Mg 504, 7 H 20 370 mg/ Ca C 12, 7 H 20 440 mg/1 KN 03 1 900 mg/l 15

NH 4 NO 3

* KH 2 PO 4

* Mn SO 4, 4 H 20 * Zn SO 4, 7 H 20 * Cu SO 4, 5 H 20

* CO C 12, 6 H 20

KI. H 3 B 03 Na 2 Mo O 4, 2 H 20 Fe SO 4, 7 H 20 Na 2 EDTA. inositol thiamine H Cl acide nicotinique pyridoxine HC 1 acide a-naphtylacétique. benzyladénine lait de noix de coco sucrose. H 20 distillée 1 650 mg/1 mg/1 22,3 mg/1 8,6 mg/1 0,025 mg/l 0,025 mg/l 0,83 mg/l 6,2 mg/1 0,25 mg/1 28,75 mg/1 37,25 mg/1 mg/1 mg/1 20 mg/1 1 mg/1 I 1 mg/1 1 mg/1 mg/l g/1 ajoutée pour compléter un volume final de 1 000 ml p H 6,3 agar-agar 6,0 g On fait incuber les cultures pendant 14 jours sur un agitateur rotatif dans une lumière faible d'environ 500 à 1 000 lux à une température d'environ 24 à 28 C La croissance de la culture en suspension est mesurée par ce que l'on appelle "volume de cellules apparent", soit PCV de la façon suivante: Approximativement 15 ml de la suspension de cellules sont placés 30 dans un tube à centrifuger gradué et que l'on fait tourner à approximativement 500 fois la pesanteur pendant 5 minutes Le PCV est déterminé

directement à partir du tube centrifugé.

EXEMPLE 2

La teneur en huile des graines de tournesol obtenue à partir des 35 plantes poussées sur le terrain des lignées de graines de tournesol croisées, testées dans l'exemple 1, est analysée pour être corrélée avec

les caractéristiques de croissance des cellules dans la culture.

Les graines ont été testées sur le terrain à Fresno, Californie.

Les plantes cultivées sur le terrain ont été semées en mai 1981 et récoltées en août 1981 Les sillons de plantation ont été écartés de cm et les plantes étaient espacées de 22,5 cm l'une de l'autre dans chaque sillon A la suite de la récolte, les graines sont séchées à l'air dans un sécheur à courant d'air force, à une température de 49 C 5 jusqu'à ce qu'elles atteignent une teneur en humidité inférieure à 6 %

avant que l'on en mesure la teneur en huile par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN).

L'huile de la graine de tournesol est analysée par utilisation d'un analyseur de Newport marque IIIA RMN et avec les modes opératoires 10 établis par le fabricant On utilise des échantillons de tournesol de 6,5 ml Les échantillons sont analysés-à la température ambiante avec un niveau RF de 225 p A et un temps d'intégration de 32 secondes La largeur de porte utilisé est de 1 gauss L'analyseur RMN est standardisé par utilisation d'un standard scellé de graine de tournesol FGIS On utilise 15 des échantillons de poids variables (les poids sont enregistrés jusqu'au 0,01 g les plus proches) La teneur en huile des échantillons de graines de tournesol est calculée à l'aide des formules suivantes: Constante lecture RMN du standard de calibrage (Constante poids de graine) x (teneur en huile du standard) %d'20 hul lecture RMN de l'échantillon de graine % d'huile (poids des échantillons) x (constante) La constante utilisée pour tous les échantillons de graine est égal à

0,2562.

Aux fins de l'analyse de corrélation, les données de teneur en 25 huile de la graine sont regroupées dans trois catégories: teneur en huile élevée poids d'huile supérieur à 40 % du poids de la graine entière (poids/poids); teneur en huile intermédiaire 35 à 40 % poids

pour poids; teneur en huile faible inférieure à 35 % poids pour poids.

La croissance de la cellule en suspension est de même classée en trois 30 catégories: croissance élevee > 10 ml de PCV, croissance intermédiaire > 6 à 10 ml de PCV, et croissance faible < à 6 ml de PCV La teneur en huile est analysée pour en établir la corrélation avec les caractéristiques de croissance de cellules en suspension et l'induction du cal au moyen d'analyses de Chi carré après construction de tables de contingence 35 3 x 3 Une corrélation significative (niveau (P) de probabilité 0,1 %) est trouvée entre une croissance élevée de cellules en suspension et une teneur en huile élevée Basé sur ces résultats de corrélation, un test de teneur en huile est développé en utilisant les critères suivants: une bonne croissance de cellules est définie comme étant une augmentation de fois de la croissance d'une cellule sur une période de croissance de 2 semaines dans les conditions de culture en suspension décrites dans le présent exemple 1 En général, un inoculum de cal initial de 1,5 à 2,0 g donne un PCV initial de 1,5 à 2,0 ml Des cultures de cellules en suspension ayant des PCV de 7,5 ml après 14 jours de culture de cellules en suspension à partir d'inocula de cal initiaux de 1,5 à 2,0 g sont

classées comme manifestant une bonne croissance.

Une corrélation significative (niveau P 0,1 %) entre une bonne induction de cal et une bonne croissance de cellules en suspension est

également trouvée Une corrélation plus faible mais significative entre une bonne induction de cal et la teneur en huile est également trouvée.

Si l'on considère la population totale des lignées de graines de contrôle, 48 % ont produit une graine ayant une teneur en huile de 40 % ou 15 plus Si l'on considère la population de ces graines qui ont donné une bonne induction de cal telle que mesurée par un poids frais de cal supérieur à 2 g, 65 % des souches montrant une bonne induction de cal ont eu des teneurs en huile de 40 % poids pour poids ou plus Si l'on considère la population de ces lignées de graines de tournesol donnant une 20 bonne croissance de cellules en suspension telle que mesurée par le volume de cellules déposées d'environ 5 fois le volume de l'inoculum de cal initial, 81 % des lignées manifestant une bonne croissance de cellules en suspension présentent des teneurs en huile de 40 % poids pour

poids ou plus.

Pour déterminer si les corrélations entre bonne croissance de cellules teneur en huile élevée et bonne induction de cal teneur en huile élevée sont chacune des correlations de liaison directe plutôt qu'une association indirecte via un troisième caractère tel que la hauteur de la plante, on applique une méthode statistique connue sous le 30 nom d'analyse coefficient de chemin, décrite dans Path Analyses, C.C Li, Boxwood Press, Pacific Grove Ca, aux données recueillies pour la croissance en suspension, l'induction de cal, la hauteur de plantes, la teneur en huile, la formation de pousses, l'induction de tumeur et la pigmentation des jeunes plants Au moyen de cette méthode statistique, 35 il est possible d'effectuer la partition de la corrélation des caractéristiques examinées ci-dessus en liaison directe et indirecte avec la

teneur en huile de la graine.

Les coefficients de corrélation sont calculés en utilisant le programme Proc Corr du système d'analyse statistique (SAS) et l'on effectue une régression linéaire multiple par utilisation du programme Proc GLM de SAS Ces deux programmes sont abordés à l'aide d'un ordina5 teur digital MINC 23 Les étapes principales de l'analyse de chemin sont: (a) on normalise les'données en exprimant chaque point de donnée sous forme de déviation de la moyenne (c'est-à-dire X e X) n (b) on utilise les données normalisées pour calculer les coefficients

de corrélation (r) entre toutes les combinaisons de variables.

(c) on obtient des coefficients (b) de régression concrète (non standardisée) à partir d'une analyse de régression linéaire multiple. (d) on calcule des coefficients de chemin (p) entre des paires de variables provenant du coefficient de régression concrète et les déviations standards (o) des variables en utilisant Po 1 = bo 1 1 ai a O (e) on calcule les effets indirects via un troisième caractère, par 20 exemple, P(huile cal via suspension) = P (huile suspension) x (rcal/suspension) (f) on vérifie que la somme des effets directs et indirects est égale au coefficient de corrélation, par exemple: Po 1 + Po 2 r 12 + p 03 r 13 + Po 4 r 14 r 01 = corrélation entre les variables 0,1 Les coefficients de chemin indiquant l'effet direct des caractères individuels sur la teneur en huile sont calculés comme décrit ci-dessus et ils sont utilisés pour construire un diagramme de chemin simple 30 apparaissant dans la figure 1 dans lequel les corrélations avec la teneur en huile ont été remplacées par des coefficients de chemin Les valeurs de ces coefficients de chemin montrent que les caractéristiques qui ont un effet direct significatif statistiquement sur la teneur en huile sont la croissance de la culture en suspension et la hauteur de la 35 plante Ainsi, les corrélations significatives entre induction de cal, pigmentation de la jeune plante et teneur en huile doivent avoir été dues à des effets indirects Ainsi, la croissance des cellules de tournesol dans une culture en suspension peut être utilisée pour prédire la teneur en huile des plants de tournesol et c'est un outil utile pour

la production de type de tournesol à haute teneur en huile.

EXEMPLE 3

Trois lignées de graines de tournesol connues pour avoir des teneurs en huile de tournesol qui sont répétitivement élevées, intermédiaires ou faibles, sont testées pour en déterminer la corrélation de la croissance de la culture de cellule en suspension et leur teneur en huile. On fait germer les graines comme dans l'exemple I ci-dessus Les 10 segments hypocotylés sont obtenus de façon stérile à partir des jeunes pousses ayant germé On utilise approximativement 1,5 à 2,0 9 de segments hypocotylés provenant de chaque lignée de graines comme inoculum pour faire démarrer les cultures de cellules en suspension au lieu du cal A tous les autres égards, les cultures sont mises en oeuvre comme 15 dans l'exemple 1 Dans chaque cas, la croissance de cellules attendue après 14 jours pour chacune des lignées de graines est en corrélation

avec la teneur en huile connue de la lignée de graines.

Claims (20)

REVENDICATIONS

1. Milieu de croissance de plante comprenant: (a) des sels minimum: (b) des vitamines comprenant: inositol thiamine H Cl acide nicotinique pyridoxine H Cl (c) des hormones végétales; 10 (d) du sucrose; et

(e) du lait de noix de coco.

2. Milieu de croissance de plante selon la revendication 1, caractérisé en ce que ces vitamines comprennent: environ 100 mg/1 d'inositol environ 40 mg/l de thiamine H Cl environ 20 mg/1 d'acide nicotinique environ i mg/1 de pyridoxine;

et en ce que lesdites hormones comprennent des auxines et des cytokinines.

3. Milieu de croissance de plante selon la revendication 2, caractérisé en ce que ces auxines sont choisies dans un groupe constitué de: acide naphtylacétique, acide indolylbutyrique, acide indolylacétique, acide 2,4dichlorophénoxyacétique; et les cytokinines étant choisies dans le groupe constitué par: benzyladénine, zéatine, kinétine, et

N 62 isopentyladénine.

4. Milieu de croissance de plante selon la revendication 3, caractérisé en ce que la concentration desdites auxines est: environ 0,1 à 10 mg/1 d'acide naphtylacétique, environ 1 à 10 mg/l d'acide indolylbutyrique, 35 environ 1 à 4 mg/1 d'acide indolylacétique, environ 0,01 à 1 mg/1 d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique; les concentrations de ces cytokinines sont dans un intervalle compris

entre environ 0,1 mg/1 et environ 10 mg/l et ce sucrose est en concentration d'environ 3 % (p/v).

5. Milieu de croissance de plante selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'acide naphtylacétique est en concentration d'environ 1,0 mg/l et la benzyladénine est en concentration d'environ

1,0 mg/l.

6 Milieu de croissance de plante selon la revendication 5, caractérisé en ce que le lait de noix de coco est en concentration

d'environ 20 % volume/volume.

7. Milieu de croissance de plante selon la revendication 6,

caractérisé en ce que le lait de noix de coco est en concentration 10 d'environ 10 % v/v.

8. Méthode de production de cellules de cultures en suspension de cellules de plant de tournesol comprenant les étapes de: (a) réalisation d'un tissu de tournesol; (b) réalisation du milieu défini dans la revendication 1, ce milieu 15 étant un milieu de culture en suspension de tournesol; et (c) culture de ce tissu dans ce milieu de culture de cellules en suspension.

9. Méthode de production de cultures de cellules en suspension de cellules de plant de tournesol selon la revendication 8, caractérisée en 20 ce que l'étape (c) consiste en outre à: i réalisation du milieu de suspension de cellules dans un ballon; ii culture de ce tissu dans ce milieu pendant environ 14 jours sur un agitateur rotatif dans des conditions de faible éclairement, entre environ 500 et 1 000 lux; iii séparation des résidus de ce tissu pour former des cellules de cultures en suspension; et,

iv culture de ces cellules de cultures en suspension dans des quantités fraîches du milieu de culture en suspension.

10. Méthode de production de cellules de cultures en suspension de 30 cellules de plant de tournesol selon la revendication 8, caractérisée en

ce que le tissu du tournesol est le cal.

11. Méthode de production de cellules de cultures en suspension de cellules de plant de tournesol selon la revendication 8, caractérisée en

ce que ledit tissu de tournesol est un segment hypocotylé d'une jeune 35 plante de tournesol.

12. Méthode de production de cellules de cultures en suspension de cellules de plant de tournesol selon la revendication 9, caractérisée en

ce que le tissu de tournesol est le cal.

13. Méthode de production de cellules de cultures en suspension de cellules de plant de tournesol selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit tissu de tournesol est un segment hypocotylé de jeune plant

de tournesol.

14. Méthode de détermination de lignées de graines de tournesol pour leur teneur en huile élevée consistant à: (a) réaliser un tissu de tournesol S partir de lignées de graines dont la teneur en huile doit être déterminée; (b) réaliser le milieu défini selon la revendication 1, ce milieu étant un milieu de culture en suspension de cellules de tournesol; (c) cultiver ce tissu dans le milieu de culture en suspension de cellules pendant une période suffisante pour obtenir une bonne croissance; et, (d) sélectionner les lignes de graines de tournesol manifestant une

bonne croissance.

15. Méthode de détermination de lignées de graines de tournesol pour leur teneur en huile élevée selon la revendication 14, caractérisée

en ce que le tissu de tournesol est le cal.

16. Méthode de sélection de lignées de graines de tournesol pour leur teneur en huile élevée selon la revendication 14, caractérisée en

ce que le tissu de tournesol est un segment hypocotylé d'une jeune 15 pousse de tournesol.

17. Méthode de sélection de lignées de graines de tournesol pour leur teneur en huile élevée selon la revendication 14, caractérisée en ce que l'étape (c) consiste en outre: i à cultiver ce tissu dans ce milieu de culture en suspension pendant environ 14 jours sur un agitateur rotatif dans des conditions d'éclairement faible, entre environ 500 et 1 000 lux; ii séparer les résidus de ce tissu des cellules de culture en suspension; et

iii détermination du volume de cellules déposées parmi les cellules de 25 culture en suspension.

18. Méthode de sélection de lignées de graines de tournesol pour leur teneur en huile élevée selon la revendication 17, caractérisée en

ce que ce tissu est le cal.

19. Méthode de sélection de lignées de graines de tournesol pour 30 leur teneur en huile élevée selon la revendication 17, caractérisée en

ce que ce tissu est un segment hypocotylé d'une jeune pousse de tournesol.

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20. Méthode de sélection de lignées de graines de tournesol pour leur teneur en huile élevée selon la revendication 17, caractérisée en ce que la bonne croissance consiste en un volume de cellules déposées d'environ 5 fois le volume dudit tissu de graines de tournesol provenant

de lignées de graines dont la teneur en huile doit être déterminée.