KR100812123B1 - 매화마름 접합자배로부터 체세포배 발생 및 배발생현탁배양세포로부터 고효율 식물체 재생 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 매화마름의 배발생 캘러스로부터 체세포배 및 유식물체를 대량으로 재생 증식하는 방법에 관한 것으로, 매화마름 종자를 1/2 SH 기본배지에서 발아시키는 단계와; 상기 발아된 종자를 종축방향으로 절단하여 1/2 SH 기본배지에 치상하여 접합자 배를 유도하는 단계와; 상기 유도된 접합자 배를 2,4-D가 첨가된 1/2 SH 배지에서 배양하여 캘러스를 형성시키는 단계와; 상기 캘러스를 SH 배지 또는 V 배지에서 증식시키는 단계와; 상기 증식된 캘러스를 SH 액체배지 또는 V 액체배지에서 현탁배양하는 단계와; 상기 현탁배양단계에서 형성된 세포괴를 1/2 SH 고체배지에서 계대배양하여 유식물체를 분화시키는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 매화마름의 체세포배 및 유식물체의 재생 증식 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 접합자배 유래 캘러스로부터 현탁배양을 통하여 체세포배 및 유식물체를 대량으로 재생 증식하는 방법은 멸종위기 수생식물인 매화마름의 효과적인 기내 대량 증식 방법으로 매화마름 유전자원의 효과적인 현지외 보존수단으로 평가되었고, 이를 이용하여 매화마름을 유용 형질 도입을 통한 분자육종의 소재로 활용이 가능할 것으로 기대되었다.

매화마름, 재생 증식, 기내 증식, 체세포배, 현탁배양

Description

매화마름 접합자배로부터 체세포배 발생 및 배발생 현탁배양세포로부터 고효율 식물체 재생 방법{Method of High Frequency Plant Regeneration from Zygotic Embryo-derived Embryogenic Cell Suspension Cultures of Ranunculus kazusensis}

도 1은 본 발명의 체세포배 발생을 통한 매화마름의 식물체 재분화 과정을 보여주는 사진이다. (A: 접합자 배(zygotic embryos), B: 접합자 배로부터 형성된 캘러스(callus), C: 배 발생 캘러스의 분화 및 체세포배(somatic embryos)의 형성, D: 배발생 세포 현탁 배양물(embryogenic cell suspension cultures)의 전개, E: 세포 현탁 배양물로부터 체세포배의 발생, F: 식물체(plantlets) 형성 및 뿌리 발달, G: 현탁 배양물로부터 다수의 식물체 형성, H: 형성된 식물체의 토양이식 및 순화, I:토양 이식 식물체로부터 개화)

도 2는 본 발명의 매화마름의 접합자 배로부터 캘러스 형성에 미치는 농도별 2,4-D 처리의 영향을 보여주는 그래프이다.

본 발명은 매화마름의 접합자배 유래 캘러스로부터 현탁배양을 통하여 체세포배 및 유식물체를 대량으로 재생 증식하는 방법에 관한 것이다.

매화마름(Ranunculus kazusensis Makino)은 미나리아재비과(Ranunculaceae)에 속하는 2년생 수초로서 주로 논이나 늪, 연못에 자생하고 있다. 길이는 약 50㎝ 정도로 줄기 속이 비어 있고 마디에서 뿌리가 나고 잎은 어긋나게 붙으며 실 모양으로 갈라진다. 매화마름은 국내에서 강화도 및 태안지역에 군락지가 존재하는 것으로 알려져 있는 희귀 멸종식물로서 강력한 보존 대책이 요구되고 있는 식물종이다.

미나리아재비과 식물에 대한 조직배양 연구는 많지 않으며, 라넌큘러스(Ranunculus asiaticus)의 기관발생(Pugliesi et al., 1992) 및 체세포배발생을 통한 식물체 재생(Beruto and Debergh, 1992), 미나리아재비(Ranunculus japonicus)의 약배양을 통한 식물체 재생( Ko et al ., 1994), Ranunculus lyallii의 기관발생을 통한 식물체 재생(Bicknell et al., 1996) 등이 보고된 바 있다. 또한 미나리아재비과 식물 추출물의 항염증 효과(Cao et al., 1992)가 보고된 바 있지만, 약리적 활성에 대한 연구도 활발하게 이루어지지 않은 실정이다. 그러나 멸종위기종인 매화마름에 대한 조직배양 연구는 전혀 보고된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 멸종위기 수생식물종인 매화마름의 기내 배양체계를 확립함으로써 멸종위기 식물종의 기내 대량증식 체계를 확립하고, 또한 유전자원의 현지외보존 수단으로 활용하고자 하는 것이다.

이와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은 매화마름의 접합자배 유래 캘러스로부터 체세포배 및 유식물체를 대량으로 재생 증식하는 방법에 관한 것으로 하기와 같은 단계를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 한다.

⑴ 매화마름 종자를 1/2 SH 기본배지에서 발아시키는 단계와;

⑵ 상기 발아된 종자를 종축방향으로 절단하여 1/2 SH 기본배지에 치상하여 접합자 배를 유도하는 단계와;

⑶ 상기 유도된 접합자 배를 2,4-D가 첨가된 1/2 SH 배지에서 배양하여 캘러스를 형성시키는 단계와;

⑷ 상기 캘러스를 SH 배지 또는 V 배지에서 증식시키는 단계와;

⑸ 상기 증식된 캘러스를 SH 액체배지 또는 V 액체배지에서 현탁배양하는 단계와;

⑹ 상기 현탁배양단계에서 형성된 세포괴를 1/2 SH 고체배지에서 계대배양하여 유식물체를 분화시키는 단계.

본 발명의 상기 제 ⑴단계 및 제 ⑵단계의 1/2 기본배지는 5 ㎎/L 티아민(thiamine ㆍHCl), 5 ㎎/L 니코틴산(nicotinic acid), 0.5 ㎎/L 피리독신(pyridoxineㆍHCl), 1,000 ㎎/L 마이오-이노시톨(myo-inositol), 30 g/L 수크로오스(sucrose) 및 4 g/L 젤라이트(Gelrite)가 첨가된 1/2 SH 배지인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 제 ⑴단계의 발아단계는 배지 pH 5.8 조건에서 25℃ 암배양으로 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 제 ⑶단계의 1/2 SH 배지는 2,4-D가 1 ㎎/L 이하의 저농도로 첨가된 것을 특징으로 하며, 상기 배양은 25℃ 암배양으로 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 제 ⑷단계의 배지는 0.5 ㎎/L 2,4-D, 2.0 ㎎/L p-CPA 및 0.1 ㎎/L 키네틴(kinetin)이 첨가된 SH 액체배지 또는 0.1 ㎎/L 인돌아세트산(IAA), 0.1 ㎎/L 나프탈레인 아세트산(NAA), 1.5 ㎎/L 2,4-D, 0.25 ㎎/L 키네틴 및 20 g/L 수크로오스가 첨가된 B5 액체배지(V 액체배지)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 제 ⑸단계의 현탁배양은 25℃, 100rpm 조건에서 계대배양으로 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 제 ⑹단계의 분화단계는 25℃에서 2주간 암배양 후, 25℃에서 광주기 16/8시간 조건으로 명배양하는 단계로 수행되는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 구성을 바람직한 실시 예를 통하여 보다 상세히 설명할 것이나, 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 구체적으로 예시하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 범위는 오직 특허청구범위에 기재된 바에 의해 한정되어야 할 것이다.

<실시예 1> 종자 발아 및 캘러스 유도

매화마름(Ranunculus kazusensis Makino) 종자는 한국생명공학연구원내에 위치한 한국야생식물종자은행으로부터 분양을 받아 사용하였다. 종자를 수돗물에 세척한 다음 10% 상업용 락스 용액에 20분간 표면살균을 하였다. 표면 살균된 종자를 무균작업대 내에서 멸균수로 3-4회 세척한 다음, 멸균된 여과지에서 표면의 수분을 제거하였다.

표면 살균된 매화마름 종자 발아를 위하여 SH(Schenck and Hildebrandt, 1972)의 무기염류 농도를 1/2로 낮추고 5 ㎎/L 티아민(thiamineㆍHCl), 5 ㎎/L 니코틴산(nicotinic acid), 0.5 ㎎/L 피리독신(pyridoxineㆍHCl), 1,000 ㎎/L 마이오-이노시톨(myo-inositol), 30 g/L 수크로오스(sucrose) 및 4 g/L 젤라이트(Gelrite)가 첨가된 배지를 기본배지(1/2 SH 배지)로 사용하였다. 배양배지의 pH는 고압살균전에 1N 수산화나트륨(NaOH) 용액으로 5.8로 조정하였다. 종자발아는 25℃ 암실에서 배양하였고, 각 페트리디쉬 (87×15 ㎜)당 종자를 10개씩 치상하였으며, 총 3개의 반복구를 준비하였다.

종자로부터 접합자 배를 적출하기 위해 표면 살균된 종자를 무균작업대 내에서 포셉(forcep) 및 스칼펠(scalpel)을 이용하여 종자의 종축방향으로 가볍게 상처를 주면서 절단한 다음 1/2 SH 기본배지에 치상하였다. 약 2주간 암배양 후 나출된 접합자 배를 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid)가 각각 0, 0.1, 0.3, 1, 3과 10 ㎎/L 첨가된 1/2 SH 배지로 옮겨 25℃ 암실에서 배양 개시하였다. 각 처리구당 10개씩 3 반복구를 준비하였다. 생장조절제 첨가에 따른 매화마름 접합자 배의 반응 양상 및 캘러스 형성 여부를 주기적으로 관찰하였으며 계대배양 없이 8주간 배양 후 치상된 접합자 배로부터 백색의 캘러스 형성유무를 조사하였다.

<실시예 2> 현탁배양 및 배발생 세포주로부터 식물체 재생

매화마름 캘러스로부터 현탁배양체계를 확립하기 위하여 0.5 ㎎/L 2,4-D, 2.0 ㎎/L p-CPA, 그리고 0.1 ㎎/L 키네틴이 첨가된 SH 및 0.1 ㎎/L 인돌아세트산, 0.1 ㎎/L 나프탈렌 아세트산(NAA), 1.5 ㎎/L 2,4-D, 0.25 ㎎/L 키네틴, 그리고 20 g/L 수크로오스가 첨가된 B5 (Gamborg et al., 1968)배지(V 배지)에서 증식된 캘러스를 사용하였다. 증식된 매화마름 접합자 배 유래 캘러스를 SH 액체배지 또는 V 액체배지 20 ㎖이 첨가된 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask) (250 ㎖)로 옮겨준 다음, 25℃, 100 rpm으로 현탁배양을 개시하였다. 약 1주간 배양한 다음 동일 조성의 액체배지를 각각 20 ㎖ 첨가하여 1주간 배양하였다. 이후에는 현탁배양세포 5 ㎖을 동일 조성의 액체배지 50 ㎖이 첨가된 삼각 플라스크로 옮겨 약 2주 간격으로 계대배양하였다.

현탁배양 중인 세포주로부터 식물체 재생을 위하여 약 2주 배양된 세포괴를 생장조절제가 첨가되지 않은 1/2 SH 고체배지로 옮겨 각 페트리디쉬(87×15 ㎜)당 세포괴를 10개씩 치상하였으며, 총 3개의 반복구를 준비하여 25℃ 암실에서 배양 개시하였다. 약 2주간 배양후 발달된 체세포배는 동일 조성의 고체배지로 옮겨 25℃ 명배양 (약 80 μ㏖ m^-2s^-1; 광주기(명/암) 16/8시간)을 통하여 정상적인 식물체 재생이 이루어지는지 여부를 조사하였다.

매화마름 접합자 배 유래 배발생 현탁배양 세포주로부터 체세포배 발생을 통한 식물체 재생 체계를 확립하였다(도 1). 표면살균된 매화마름 종자의 1/2 SH 기본배지 상에서 4주간 배양 후 발아율은 약 84.1%이었다. 발아된 종자는 하배축이 약 1-2 ㎝ 정도로 길게 신장되었다. 그러나 2,4-D가 첨가된 처리구에서는 하배축 신장이 관찰되지 않았으며, 종자절단면에서 나출된 매화마름 접합자 배로부터(도 1A) 캘러스 유도를 위해 2,4-D 농도별 영향을 조사한 결과, 배양개시 4주 후 접합자 배의 유근 주위로부터 백색의 캘러스가 형성되었으며(도 1B), 자엽 부위에서는 조직의 팽창 및 돌출구조가 발달하였다. 배양이 지속되면서 백색 캘러스 사이에서 연황색 캘러스 및 구형의 백색 돌출구조가 발달하였다(도 1C).

캘러스의 증식을 유도하기 위하여 백색 및 연황색의 캘러스가 혼재되어 있는 캘러스를 절단하여 각각 SH 고체배지 및 V 고체배지로 옮겨 배양을 유지하였다. 증식된 캘러스로부터 현탁배양체계를 확립하였으며 약 2주간 현탁배양된 매화마름 접합자 배 유래 세포주로부터(도 1D) 세포괴를 수거하여 생장조절제가 첨가되지 않은 1/2 SH 기본배지에서 배양한 결과, 세포괴로부터 백색의 전형적인 체세포배가 다수 발달하였으며(도 1E), 체세포배를 명배양한 결과 정상적인 식물체로 발달하였다(도 1F).

매화마름 접합자 배로부터 약 8주 배양후 백색의 캘러스 형성빈도는 0.1 ㎎/L 2,4-D 처리구에서 84.9%로 가장 높았으며 0.3-1 ㎎/L 2,4-D 처리구까지는 65%, 3-10 ㎎/L 2,4-D 처리구에서는 25% 정도로 낮아졌다(도 2).

이상의 결과로 미루어 볼 때, 매화마름 접합자 배로부터 캘러스 형성은 1 ㎎/L 이하의 저농도 2,4-D 처리가 효과적임을 알 수 있었으며, 배양기간이 장기화되면서 백색의 캘러스 사이에서 연황색의 구형구조, 즉 체세포배의 초기구조가 형성됨을 알 수 있었다. 이는 배양 초기 백색 캘러스의 형성후 접합자 배의 자엽조직으로부터 연황색 캘러스의 발달이 이루어졌을 것으로 추측되며, 향후 접합자 배의 조직별 로 세분화하여 배양을 시도함으로써 기원 규명이 가능할 것으로 예상된다.

현탁배양중인 세포괴로부터 생장조절제가 첨가되지 않은 1/2 SH 기본배지에 배양한 결과, 치상한 세포괴의 약 80% 이상에서 백색의 체세포배 구조가 발달하며 정상적인 식물체로 발달함을 관찰할 수 있었다.

이상에서 상술한 바와 같이 본 발명에 따른 접합자 배 유래 캘러스로부터 현탁배양을 통하여 체세포배 및 유식물체를 대량으로 재생 증식하는 방법은 멸종위기 수생식물인 매화마름의 효과적인 기내 대량 증식 방법인 것으로 평가되었다. 또한, 본 발명의 따른 접합자 배 유래 캘러스로부터 현탁배양을 통하여 체세포배 및 유식물체를 대량으로 재생 증식하는 방법은 매화마름 유전자원의 효과적인 현지외 보존수단으로 평가되었고, 이를 이용하여 매화마름을 유용 형질 도입을 통한 분자육종의 소재로 활용이 가능할 것으로 기대되었다.

Claims (9)

1. 매화마름의 배발생 캘러스로부터 체세포배 또는 유식물체를 대량으로 재생하는 방법에 있어서,

   ⑴ 매화마름 종자를 모든 무기염류 농도를 1/2로 낮춘, pH 5.8인 1/2 SH 고체배지에서 25℃ 암배양하여 발아시키는 단계와;

   ⑵ 상기 발아된 종자를 종축방향으로 절단하여 상기의 1/2 SH 고체배지에 치상하여 접합자 배를 신장시키는 단계와;

   ⑶ 상기 신장시킨 접합자 배를 0.1-1 ㎎/L 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid)가 첨가된 1/2 SH 고체배지에서 25℃ 암배양하여 캘러스를 형성시키는 단계와;

   ⑷ 상기 캘러스를 0.5 ㎎/L 2,4-D가 첨가된 SH 액체배지 또는 B5 배지에 0.1 ㎎/L 인돌아세트산(IAA), 0.1 ㎎/L 나프탈렌 아세트산(NAA), 1.5 ㎎/L 2,4-D, 0.25 ㎎/L 키네틴(kinetin)를 첨가하여 제작된 V 액체배지가 20㎖ 첨가된 플라스크에 옮겨 1주일 동안 배양하여 현탁배양체계를 확립하고 증식시키는 단계와;

   ⑸ 상기 증식된 캘러스를 SH 액체배지 또는 V 액체배지에서 25℃, 100rpm 조건에서 계대배양으로 현탁배양하는 단계와;

   ⑹ 상기 현탁배양단계에서 형성된 세포괴를 1/2 SH 고체배지에서 계대배양하여 유식물체를 25℃에서 2주간 암배양 후, 25℃에서 광주기 16/8시간 조건으로 명배양하는 단계로 수행하여 분화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 매화마름의 체세포배 또는 유식물체의 재생 증식 방법.
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