CN111670745B

CN111670745B - 一种紫椴规模化繁育方法

Info

Publication number: CN111670745B
Application number: CN202010754215.8A
Authority: CN
Inventors: 任建武
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2020-07-30
Filing date: 2020-07-30
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2040-07-30
Also published as: CN111670745A

Abstract

本发明涉及植物规模化繁育技术领域，具体公开了一种紫椴规模化繁育方法，包括以下步骤：第一，量化检测监控下的精准化种子采集；第二，变温层积与赤霉素组合的种子催芽处理；第三，穴盘分穴播种工厂化育苗。本发明利用椴树果实色彩变化与内源激素脱落酸含量波动的相关关系，来精准把控采种时机，通过激素加变温的椴树种子处理方式，显著提高了深度休眠椴树种子的发芽率和出苗整齐度，同时，为规模化工厂化椴树种苗生产提供了切实可行技术工艺。

Description

一种紫椴规模化繁育方法

技术领域

本发明涉及植物规模化繁育技术领域，具体涉及一种紫椴规模化繁育方法。

背景技术

紫椴树冠巨大、树姿挺拔，抗烟尘和重金属污染能力强，又是良好的蜜源植物。在北京，紫椴林在妙峰山、松山、云蒙山、慕田峪、雾灵山五个地区内有分布，以云蒙山的紫椴林面积最大。妙峰山、松山和慕田峪有少量紫椴林的分布。在慕田峪风景区、十渡万景仙沟、妙峰山、八达岭丁香谷有保护较好的紫椴林。主要伴生植物有：五角枫、蒙古栎、胡桃楸、北京丁香、小花溲疏、五味子、绒毛绣线菊、山楂叶悬钩子、六道木、毛榛等。

近年来，人们就椴树属植物硬枝扦插、嫩枝扦插和组织培养等无性繁殖方法进行了研究，这些无性繁殖方法有一定的应用潜力，扦插成活率达到40％，而紫椴嫁接对于砧木、嫁接方法的选择有着较高要求，组培筛选出0.3mg·L-1IBA和0.1mg L-1NAA的WPM的培养基，但由于各种原因迄今还与生产应用有很大距离。目前，生产中仍以种子繁殖为主要繁殖方式，但是椴树属的种子具有深休眠特性，阻碍了其可持续性开发和利用，给育苗生产带来了一定的困难。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种紫椴规模化繁育方法，通过确定种子采集时间，变温层积与赤霉素运用的种子催芽处理，显著提高了深度休眠椴树种子的发芽率和出苗整齐度。

本发明提供了一种紫椴规模化繁育方法，包括以下步骤：

S1，种子采集：于7月底至9月初进行紫椴种子采集，根据果皮的色差值观测确定具体日期；

S2，种子处理：去除S1中采集到的紫椴种子中杂质、干瘪粒、空粒、病虫侵害种粒，用100-200μg/g的赤霉素浸泡46-50h，然后消毒3-5h，清水冲洗后，用27-35℃的温水中浸泡20-28h；

S3，变温层积催芽：将种子与湿沙按体积比1:2.5-3.5混合均匀，于室内15-20℃下层积55-65天，然后铺于储藏坑中，上面再铺8-12cm厚的一层湿沙，最后盖13-16cm厚的表土，于0-4℃下低温层积105-115天；

S4，实验室发芽：将S3中变温层积催芽后的紫椴种子置于培养皿中发芽培养28-32天；

S5，场圃发芽：采用穴盘育苗的方式进行发芽育苗。

优选的，S1中，种子采集采用人工爬树采集，每周采集一次。

优选的，S1中，紫椴果皮色差值最小值的时间即为即为种子内脱落酸含量最低值的时间。

优选的，S2中，消毒所用试剂为浓度为0.1-0.3％的高锰酸钾溶液。

优选的，S3中，所述湿沙以手握成团不出水为度。

优选的，S3中，所述储藏坑深度为50-60cm。

优选的，S4中，所述培养皿中放置一层润湿的滤纸，然后将变温层积催芽后的紫椴种子置于培养皿中的滤纸上进行培养，所述发芽培养温度为25-27℃，光照时长为10-14h；

优选的，所述滤纸保持湿润，且每隔3-4天更换一次。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明利用椴树果实色彩变化与内源激素脱落酸含量波动的相关关系，来精准把控采种时机，通过激素加变温的椴树种子处理方式，显著提高了深度休眠椴树种子的发芽率和出苗整齐度，同时，为规模化工厂化椴树种苗生产提供了切实可行技术工艺；

2、本发明利用160μg·g^-1的赤霉素处理行将层积催芽的紫椴种子，显著缩短了紫椴发芽时间和整齐度；

3、本发明中使用的穴盘播种方式有利于提高紫椴幼苗活力指数。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中采集紫椴种子过程展示图；

图2为本发明实施例1中采集得到的紫椴种子；

图3为本发明实施例1中紫椴果皮亮度变化图；

图4为本发明实施例1中紫椴果皮红绿色值变化图；

图5为本发明实施例1中紫椴果皮黄蓝色值变化图；

图6为本发明实施例1中紫椴果皮色差数值在果期的变化；

图7为本发明实施例1中紫椴果实成熟期种子脱落酸含量变化；

图8为不同催芽方式对发芽质量的影响；

图9为本发明实施例1和对比例4中不同育苗方式对发芽质量的影响；

图10为实施例1穴盘育苗效果图；

图11为对比例4平盘育苗效果图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1：

一种紫椴规模化繁育方法，包括以下步骤：

S1，种子采集，根据果皮的色差值观测确定具体日期，选择种子成熟期间，果皮色差值最小值时的时间作为具体的采集种子的日期，具体过程如下：

I，于2018年7月底至9月初进行紫椴种子采集，在北京市南城公园采集紫椴果实，人工爬树采集，每周采集一次，分为7个批次，每次采集时，采用日本产柯尼卡美能达CM-700D型全自动色差计测定果皮颜色，孔径3mm，随机选取皮色中庸的30粒饱满果实进行测定，记录L*、a*、b*值；

其中，L*表示光泽明亮度，L*值越大，亮度越高，范围从0(黑)-100(白)；a*值表示红/绿，a*值的正值表示色泽红，正值越大，红色越深，负值表示色泽绿，负值越小，绿色越深；b*值表示黄/蓝，b*的正值表示黄色程度，负值表示蓝色程度，ΔE为色差值，根据L*、a*、b*检测结果按照式(1)进行计算：

ΔE＝[(ΔL*)²+(Δa*)²+(Δb*)²]^1/2, (1)

ΔL*＝L*(0)-L*(i)；Δa*＝a*(0)-a*(i)；Δb*＝b*(0)-b*(i)

II，采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定种子内源激素脱落酸含量，具体操作如下：

(1)采来的种子，打碎果壳，脱除种皮，剥出胚乳，于超低温冰箱中保存；

(2)称取冰箱中保存的种子材料，加入样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入试管，再用提取液分次将研钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在2℃冰箱中，2℃下提取4h,8000rpm低温离心15min而后取上清液，沉淀中再加1mL提取液，搅匀，置2℃下再提取，离心，合并上清液并记录体积,残渣弃去；

(3)上清液过C-18固相萃取柱。操作步骤：1ml的80％甲醇平衡柱→上样收集样品→移开样品→用100％甲醇洗柱→100％乙醚洗柱→100％甲醇洗柱→循环将过柱后的样品转入5mL塑料离心管中，真空浓缩干燥，去除提取液中的甲醇,用样品稀释定容；

(4)包被：在10mL包被缓冲液中加入一定量的包被抗原激素蛋白质复合物，混匀，在酶标版每小孔中加入100uL，然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内,置于37℃下3h；

(5)洗板：将包被好的板取出,放在室温下平衡，然后甩掉包被液，将下口瓶内的洗涤液通过乳胶管均匀加入板上，使每孔充满洗涤液,放置约30s,再甩掉洗涤液，重复3次，将板内残留洗涤液在吸水纸上甩干；

(6)加标准物、待测样和抗体。加标样及待测样：取0.98mL样品稀释液,内加20uL激素的标样试剂(100ug/mL)，即成2000ng/mL的标准液，然后再依次稀释毗1000，500，250，125，0ng/mL，将系列溶液加入98孔酶标板的前三行，每个浓度加3孔，每孔50uL，其余孔加待测样,每个样品重复三孔，每孔50uL，然后加抗体在5mL样品稀释液中加入一定量的抗体,混匀后每孔加50uL，接着将酶标板加入湿盒内开始竞争，竞争条件为37℃30min；

(7)洗板：方法同包被之后的洗板。但要注意以下两点①加洗涤液时一定要从标准曲线的低浓度一边向高浓度一边加,并且酶标板要向高浓度的一边倾斜。②第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第二次。注意这两点的目的是防止各孔的交叉反应。加二抗将一定量的酶标羊抗兔抗体,加入10mL酶稀释缓冲液中(稀释倍数1:1000,加10uL,混匀后,在酶标板每孔加100uL,然后将其放入湿盒内,置30℃下,置育30min；

(8)洗版5次，加底物显色称取10-20mg邻苯二胺溶于底物10mL缓冲液中,完全溶解后加入30％过氧化氢溶液4uL，混匀,在每孔中加入100uL(在暗处操作)，然后加入湿盒内,当显色适当后,加入硫酸终止反应；

(9)比色：用2000ng/mL浓度孔即标准曲线最高浓度孔调零,在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品490nm处的值，用Logit曲线法计算结果，脱落酸浓度单位为ng·g-1FW，即为每克鲜胚乳中脱落酸的纳克数。

分析上述研究结果，由图3-6可知，在种子成熟期间，果皮色差值会出现一个低谷，处于黄褐色向褐色转变的时间；

由图7可知，在紫锻种实发育过程中，种子中ABA含量变化可以分为三个阶段，第一阶段是花后5-6周，果实外观开始显现黄色，此时种子中ABA含量迅速升高，由121.26ng/gFW能够上升到133.95ng/gFW；一阶段主要是受精和受精卵细胞分裂期，合子从第一次分裂,到球形原胚、心形胚、鱼雷胚的形成至少在花后35天左右完成，ABA的不断升高看来并未对细胞分裂和球形原胚、心形胚、鱼雷胚形成有抑制作用；第二阶段的变化是从花后35天至花后65天，的迅速下降到118.52ng/gFW，恰恰与胚的迅速增长相一致，这一阶段胚从肉眼可见发育到完全发育成熟；第三阶段变化是从花后9周到果实形态成熟，ABA含量又大幅度升高并维持在较高水平，抑制胚生长；紫椴胚乳ABA的这种变化完全符合种子发育的基本规律。

果皮色差值会出现的低谷正好与种子内脱落酸低谷对应，因此，在种子成熟期间，密切注意观察果皮颜色变化，在其b*值出现最大而开始下降后，找准⊿E最低点即可，而在本实验中⊿E最低点就出现在8月23日；

因此，8月23日为北京市南城公园日后采集种子的具体时间。

S2，种子处理：经过净种，去除紫椴果实中杂质、干瘪粒、空粒、病虫侵害种粒，检测千粒重、生活力、净度、饱满度、含水量指标，其中种子生活力用2％TTC(2，3，5—氯化三苯基四氮唑)染色法；然后用200μg/g的赤霉素浸泡48h，然后用0.3％的高锰酸钾消毒4h，清水冲洗后，在30℃的温水中浸泡24h；

S3，变温层积催芽：将种子与湿沙按体积比1:3混合均匀，沙子以手握成团不出水为度，于室内18℃下层积60天；

进入11月份，降温后，在胖龙丽景科技有限公司三高基地的苗圃地里挖深度约55cm的储藏坑，然后将种子后铺于储藏坑中，上面再铺约10cm厚的一层湿沙，最后盖约15cm厚的表土，于2℃下进行低温层积110天；

S4，实验室发芽：经过层积催芽的种子，各设置3次重复，每次重复100粒种子，在培养皿中置一层用蒸馏水润湿的滤纸，将紫椴种子摆放在培养皿中的滤纸上，置于恒温培养箱内培养，发芽温度为26℃，光照12h，保持滤纸湿润，并记录种子发芽数，每3天更换1次滤纸，以保持各处理浓度相对稳定，发芽测定按GB2772—99《林木种子检验方法》的要求进行；

具体测定项目与方法如下：

种子发芽能力参照《国际种子检验规程》计算发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数，本试验发芽时间为30天；

发芽率(％)＝规定时间内的种子发芽总数/供试种子数×100；

发芽势(％)＝规定时间内发芽达到高峰期的种子发芽总数/供试种子数×100；

发芽指数GI＝∑(Gi/Di),其中Gi为第i天发芽数,Di为发芽天数；

活力指数VI＝GI×S,其中S为幼苗平均长度；

式中fi为萌发的天数，ni为第i天萌发的种子数，n为萌发种子的总数；

S5，场圃发芽：采用穴盘育苗的方式进行发芽育苗。

实施例2

一种紫椴规模化繁育方法，具体步骤与实施例1基本相同，区别在于：

S2中，使用100μg/g的赤霉素浸泡紫椴种子50h，用0.1％的高锰酸钾消毒5h，清水冲洗后，用27℃的温水中浸泡28h；

S3中，种子与湿沙的体积比为1:2.5，于室内15℃下层积55天，储藏坑深度约为50cm，然后铺于储藏坑中，上面再铺8cm厚的一层湿沙，最后盖13cm厚的表土，于0℃下低温层积105天；

S4中，所述发芽培养时间为28天，所述发芽培养温度为25℃，光照时长为10h，每隔4天更换一次滤纸。

实施例3

S2中，使用150μg/g的赤霉素浸泡紫椴种子46h，用0.2％的高锰酸钾消毒3h，清水冲洗后，用35℃的温水中浸泡20h；

S3中，种子与湿沙的体积比为1:3.5，于室内20℃下层积65天，储藏坑深度约为60cm，然后铺于储藏坑中，上面再铺12cm厚的一层湿沙，最后盖16cm厚的表土，于4℃下低温层积115天；

S4中，所述发芽培养时间为28天，所述发芽培养温度为27℃，光照时长为14h，每隔4天更换一次滤纸。

对比例1

一种紫椴繁育方法，具体步骤与实施例1基本相同，区别在于：

不经赤霉素浸泡，单独低温层积催芽170天。

对比例2

种子采收后，经过晾晒，含水量降至10.8％，不经赤霉素浸泡，单独低温层积催芽170天。

对比例3

将赤霉素用清水替换。

对比例4

S5中的场圃发芽采用平盘育苗方式。

以上为本申请的具体实施例和对比例，以实施例1为代表，检测紫椴种子成熟期间质量指标变化，结果见表2；以实施例1-2和对比例1-3为例研究种子催芽方式对发芽率的影响，结果见表3；

表1紫椴种子采集时候的脱落酸含量与发芽率的相关分析

*.在0.05水平(双侧)上显著相关

表2紫椴种子成熟期间质量指标变化

表3种子催芽方式对发芽率的影响

由表3可以看出，利用本发明实施例1中的技术方案，在8月23日发芽率最高，达到了76.11％，应用赤霉素能够显著提高了发芽率；

从图8可以看出，变温层积与单独低温层积相比，发芽势提高了32％，平均发芽时间缩短了。经方差分析，变温层积和自然低温层积发芽率和平均发芽时间差异显著。说明变温层积可以提高紫椴种子的发芽质量和发芽整齐度。

从图9-11可以看出，本发明中使用的穴盘育苗的幼苗活力指数较高。

通过实施例1-2和对比例1-3的对比可知，种子采集后晾晒不利于发芽，本发明实施例1-2中变温处理的种子发芽率显著高于对比例2中晾晒后单独低温层积催芽的处理效果，变温处理明显好于对比例1中单独低温层积催芽。

通过表3还可以看出，本发明根据果皮的色差值观测确定具体采种日期对于实际规模化繁育过程具有重要意义，本发明的方式确定的最佳采种日期(8月23日)种子发芽表现最好，可用于规模化生产育苗。

综上所述，本发明提供的一种紫椴规模化繁育方法，关键在于采种时机和种实的变温处理，利用种实外在形态、催芽处理方式和发芽率的多重相关关系来精准把控紫椴全流程育苗环节，将规模化育苗的生产实用性寓于科学性，确保了该发明的重现良好，利于在实践中复制推广。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种紫椴规模化繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，种子采集：于7月底至9月初进行紫椴种子采集，根据果皮的色差值观测和种子内脱落酸含量测定确定具体日期，确定所述紫椴果皮色差值最小值且与种子内源激素脱落酸含量最低值对应的时间作为种子采集时间，即处于黄褐色向褐色转变的时间；

所述果皮的色差值的计算公式为：ΔE＝[(ΔL*)²+(Δa*)²+(Δb*)²]^1/2；

S2，种子处理：去除S1中采集到的紫椴种子中杂质、干瘪粒、空粒、病虫侵害种粒，用100-200μg/g的赤霉素浸泡46-50h，然后消毒3-5h，消毒所用试剂为浓度为0.1-0.3％的高锰酸钾溶液，清水冲洗后，用27-35℃的温水中浸泡20-28h；

S3，变温层积催芽：将种子与湿沙按体积比1:2.5-3.5混合均匀，所述湿沙以手握成团不出水为度，于室内15-20℃下层积55-65天，然后铺于储藏坑中，所述储藏坑深度为50-60cm，上面再铺8-12cm厚的一层湿沙，最后盖13-16cm厚的表土，于0-4℃下低温层积105-115天；

S4，实验室发芽：将S3中变温层积催芽后的紫椴种子置于培养皿中发芽培养28-32天，所述培养皿中放置一层润湿的滤纸，然后将变温层积催芽后的紫椴种子置于培养皿中的滤纸上进行培养，发芽培养温度为25-27℃，光照时长为10-14h，所述滤纸保持湿润，且每隔3-4天更换一次；

S5，场圃发芽：采用穴盘育苗的方式进行发芽育苗。

2.如权利要求1所述的一种紫椴规模化繁育方法，其特征在于，S1中，种子采集采用人工爬树采集，每周采集一次。