FR2540629A1 - Transfert de macromolecules d'un substrat chromatographique a une matrice d'immobilisation - Google Patents

Abstract

PROCEDE DE TRANSFERT DE MACROMOLECULES, TELLES QU'UN ACIDE NUCLEIQUE ET DES PROTEINES, D'UN SUBSTRAT CHROMATOGRAPHIQUE A UNE MATRICE D'IMMOBILISATION. CELLE-CI EST UNE MEMBRANE MICROPOREUSE A CHARGE MODIFIEE, COMPORTANT UNE QUANTITE MODIFICATRICE DE CHARGE D'UN AGENT DE MODIFICATION DE CHARGE CATIONIQUE, LIE A SENSIBLEMENT TOUTES LES SURFACES MOUILLEES DE LA MEMBRANE. LA MEMBRANE MICROPOREUSE A CHARGE MODIFIEE PEUT EGALEMENT ETRE UNE MEMBRANE MICROPOREUSE RENFORCEE, DE PREFERENCE UNE FEUILLE POREUSE DE RENFORCEMENT, IMPREGNEE AVEC UNE MEMBRANE MICROPOREUSE DE POLYMERE. PRODUIT DE TRANSFERT D'ACIDE NUCLEIQUE OU DE PROTEINE, QUI COMPREND UNE MATRICE CHROMATOGRAPHIQUE COMPORTANT SUR UNE DE SES SURFACES LA MEMBRANE MICROPOREUSE A CHARGE MODIFIEE.

Description

La présente invention se rapporte au transfert

de macromolécules et plus particulièrement à celui d'a-

cides nucléiques et de protéines au moyen d'une membrane

microporeuse à charge modifiée.

Smithies l"Electrophorèse de zone dans des gels d'amidon variations de groupe dans les protéines du

sérum d'adultes humains normaux", Biochem J 61: 629-

641 ( 1955)l a montré que le gel d'amidon pouvait servir de

tamis moléculaire à travers lequel a lieu une électropho-

rèse de zone des protéines Depuis lors, il y a eu de cons-

tantes innovations dans la technique de l'électrophorèse

de gel L'introduction de gels d'acrylamide, les disposi-

tifs à tampon discontinu, l'utilisation de dodécylsulfate

de sodium pour désagréger les complexes protéiniques à ré-

soudre sur des gels et l'emploi combiné possible de dodé-

cylsulfate de sodium dans des dispositifs à tampon discon-

tinu pour l'électrophorèse de gel de polyacrylamide ont été les principales contributions au développement d'un des outils d'analyse et de préparation les plus largement

utilisés dans la biologie moderne.

L'objet principal de ces procédés a été de dé-

montrer visuellement l'homogénéité ou la complexité d'une préparation de protéine, par observation de l'apparition ou de la disparition d'une "bande" particulière, pendant

le déroulement d'un processus expérimental donné On a cons-

taté que les gels unidimensionnels convenaient,à condition

d'analyser seulement des échantillons de protéine relati-

vement simple, par exemple des virus, des bactériophages, des membranes fantômes d'érythrocytes, etc Des systèmes

plus complexes nécessitent un plus grand pouvoir de réso-

lution et on a créé de nouveaux systèmes de gel bidimen-

sionnel Actuellement, même les milliers de polypeptides, qui font partie des échantillons protéiniques les plus

compliqués, peuvent être efficacement résolus.

Le travail de corrélation non équivoque d'une

"bande" ou d'un "point" avec une fonction reconnue a sou-

vent été difficile et l'est encore davantage lorsque la

résolution des protéines dépend de leur dénaturation.

Néanmoins, on a mis au point divers procédés qui permet-

tent l'identification d'une enzyme spécifique, d'un anti- gène, d'une glycoprotéine ou d'un récepteur d'hormone, etc dans un gel Ces procédés reposent sur la possibilité

de maintenir au moins une des conditions préalables ci-

après: ( 1) il faut que les polypeptides conservent leur activité pendant l'électrophorèse; ( 2) la régénération

d'un polypeptide dénaturé; et ( 3) la liaison croisée co-

valente de la protéine concernée à un ligand détectable

pendant l'électrophorèse En outre, le traitement effec-

tif des gels implique de multiples manipulations et des incubations et procédures de lavage prolongées Cela prend beaucoup de temps et expose très souvent à des accidents de manipulation, par exemple la cassure et la déchirure de gels humides ou la fissuration pendant le séchage des gels. Pour essayer de vaincre certaines des difficultés

rencontrées dans l'analyse de gels, on a élaboré une nou-

velle méthode De nombreux rapports ont été publiés, démon-

trant que la méthode bien connue appelée "imprégnation de Southern", c'est-à-dire le transfert de motifs d'ADN de gels d'agarose à des membranes de nitrocellulose, peut être appliquée à des motifs de protéine dans des gels de polyacrylamide Les motifs de protéine intacts sont élués des gels et sont immobilisés sur un substrat Le substrat est soumis, à son tour, au même type de procédures qui ont

été utilisées sur des gels pour l'identification par "ban:-

de" ou "point" Toutefois, par transfert des électrophoré-

togrammes à des matrices d'immobilisation, on peut bénéfi-

cier des avantages suivants: 1) les matrices d'immobilisa-

tion humides sont pliables et faciles à manipuler; 2) les

protéines immobilisées sont accessiblesfacilement et éga-

lement, à divers ligands (puisque les limitations créées

dans les gels par la porosité différentielle sont évi-

tées); 3) l'analyse par transfert demande en général de

petites quantités de réactifs; 4) les temps de traite-

ment (incubations et lavages) sont sensiblement diminués; ) on peut faire de multiples reproductions des gels, 6) les motifs transférés peuvent être stockés pendant des

mois, avant leur utilisation; 7) les transferts de pro-

téine peuvent subir de multiples analyses De plus, les motifs de protéine transférés peuvent être soumis à des

analyses qui seraient bsans cela très difficiles ou impos-

sibles à effectuer sur des gels.

Le terme "transfert" se rapporte ici à l'opéra-

tion de transfert de macromolécules biologiques, par exemple d'acides nucléiques et de protéines, entre des gels et une matrice d'immobilisation Le terme est souvent utilisé en association avec la macromolécule concernée,

par exemple transfert de protéine, d-ADN ou d'ARN La ma-

trice résultante, contenant la macromolécule transférée et immobilisée, peut être incubée avec un ligand, cette

opération pouvant être considérée comme un "recouvrement".

Ainsi, par exemple, l'immuno-revêtement, le revêtement de

lectine ou le revêtement de calmoduline désignent l'incuba-

tion d'un'"transféréavec un anticorps, la lectine ou la

calmoduline, respectivement.

Le transfert d'ADN, qui est un type de transfert d'acide nucléique, a son origine dans le procédé souvent

appelé "Transfert de Southern", créé par Southern, Détec-

tion de séquences spécifiques parmi des fragments d'ADN

séparés par électrophorèse de gel, J Mol Biol 98: 503-

517 ( 1975) Après la séparation chromatographique des frag-

ments d'ADN, l'ADN est dénaturé pendant qu'il est dans le gel et celui-ci estneutralisé Le gel est placé entre du papier à absorption capillaire qui est en contact avec un réservoir tampon; on place de la nitrocellulose au-dessus du gel et on place des papiers buvards secs au- dessus de la nitrocellulose L'écoulement du tampon à travers le gel provoque l'élution de l'ADN qui se lie ensuite à la nitrocellulose Ainsi, le motif de fragment d'ADN séparé électrophorétiquement est transféré et préservé sur la ni- trocellulose L'hybridation avec un acide nucléique marqué,

spécifique permet la détection des fragments complémentai-

res, spécifiques, liés à la nitrocellulose.

En 1976, on a constaté que l'ARN et l'ADN à chaîne unique pouvaient être accouplés de façon covalente

à une poudre de cellulose substituée par des groupes amino-

benzyloxyméthyle activés par diazotation de l'amine pour obtenir une diazobenzyloxyméthyl (DBM) cellulose Cela a comblé un manque dans la technologie de l'hybridation,

puisque l'ARN ne se lie pas bien à la nitrocellulose, ren-

dant difficile ou impossible un "transfert-de Southern".

En 1977, Alwine et autres, "Procédé de détection d'ARN spé-

cifiques dans des gels d'agarose par transfert à un pa-

pier diazobenzyloxyméthylé et hybridation avec des indica-

teurs d'ADN", Proc Natl Acad Sci U S A, 74: 5350-

5354, ont préparé une feuille de cellulose fibreuse (c'est-

à-dire un papier buvard) dérivée avec des groupes diazo-

benzyloxyméthyle, appelée papier DBM, représentée par papier-CH 2-O-C 2 + N 2 qui pouvait être utilisée pour le transfert d'un motif d'

ARN séparé électrophorétiquement, à partir d'un gel d'aga-

rose, par un procédé analogue à un Transfert de Southern.

Un papier à l'aminophénylthioéther activé en la forme diazo (papier DPT) a également été utilisé Ces deux papiers accouplent de façon covalente et irréversible l'ADN, l'ARN

et les protéines.

' Le papier DBM et le papier DPT, qui présentent l'inconvénient de nécessiter une activation, ont une durée de vie limitée, c'est-à-dire que leur activité est labile, ils ont une capacité de liaison seulement comparable à celle de la nitrocellulose,qui accouple ir- réversiblement les macromolécules, empêchant ainsi leur

élution ultérieure, et ils peuvent présenter des diffi-

cultés dans la résolution, du fait de la texture de la surface.

Dans une tentative pour éviter certains des in-

convénients du papier DBM, Thomas, en 1980, a élaboré une méthode de transfert d'ARN et de petits fragments d'ADN à

la nitrocellulose, avec utilisation de fortes concentra-

tions salines On a trouvé un rendement de liaison d'ARN

de 80 pg/cm, à comparer à 35 pg/cm 2 pour le papier DBM.

L'élution des macromolécules de gels de polyacrylamide

peut être effectuée efficacement par électrophorèse Tou-

tefois, la nécessité d'employer de fortes concentrations

salines conduirait à des courants trop intenses en prati-

que.

Bien qu'ils aient été d'abord élaborés en re-

lation avec l'étude d'ADN et d'ARN, on a constaté que les

procédés de transfert, créés par Southern, pouvaient ê-

tre appliqués aux protéines Les techniques de transfert

de protéine ont d'abord été élaborées par Renart, "Trans-

fert de protéines, de gels à un papier diazobenzyloxyméthy-

lé, et détection avec des antisérums: méthode pour l'étu-

de de la spécificité des anticorps et de la structure des antigènes", Proc Natl Acad Sci U S A 76: 3116-3120

( 1979), qui a réalisé le transfert de protéine à un pa-

pier DBM, avec utilisation de gels composites agarose-acry-

lamide, dans lesquels l'agent de liaison croisée d'acry-

lamide était réversible Après électrophorèse, la liaison

croisée était supprimée, laissant un gel à faible pourcen-

tage d'agarose duquel les protéines étaient facilement transférées Peu de temps après, un procédé de transfert de protéine a été élaboré par Bowen et autres, "Détection de protéine à liaison d' ADN par transfert de protéine,

Nuc Acids Res 8 1-20 ( 1980)", avec utilisation de ni-

trocellulose pour le transfert de protéines à liaison d'

ADN ou autre ligand, séparées sur des gels de dodécylsul-

fate de sodium-polyacrylamide Dans ce procédé, le trans-

fert est effectué par diffusion Towbin et autres ( 1979) Proc Natl Acad Sci U S A 76 4350-4354, et Bittner, Met autres ( 1980) Anal Biochem 102 459-471, ont montré

que le transfert pouvait être effectué électrophorétique-

ment, même à de faibles concentrations salines.

D'une manière générale, le transfert de protéi-

ne doit être considéré comme comprenant deux étapes suc-

cessives, à savoir l'élution du polyp Eptide du gel et

l'adsorption de la substance éluée sur une matrice d'immo-

bilisation. Trois forces d'entraînement principales ont été utilisées pour l'élution des macromolécules L'une est la diffusion Dans ce cas, le gel contenant les macromolécules à transférer est interposé entre deux feuilles de matrice d'immobilisation qui sont elles-mêmes interposées entre

des tampons de mousse et des tamis en acier inoxydable.

Cet ensemble final est ensuite immergé dans deux litres de liquide tampon et on le laisse reposer pendant 36 à 48 heures Le résultat de cette incubation est qu'on obtient deux exemplaires identiques de "transférés" Le rendement

du transfert peut atteindre 75 %, mais cette valeur doit ê-

tre répartie entre les deux exemplaires Si la quantité de macromolécule adsorbée sur la matrice est suffisante pour les titrages envisagés, et si la longue durée de transfert

n'est pas gênante, on peut utiliser le transfert par dif-

fusion. Le deuxième mode de transfert de macromolécule est essentiellement basé sur un flux massique de liquide à travers le gel, de la même façon'dont on obtient des transferts d'ADN dans le procédé d'origine, décrit par Southern Le gel est placé dans un réservoir de liquide

tampon Une matrice est appliquée au gel et des serviet-

tes en papier sont empilées sur la matrice Les serviet- tes absorbent le liquide tampon du réservoir, à-travers le gel et la'matrice Ce déplacement du fluide sert de force d'entraînement qui extrait du gel, par élution, les protéines qui sont ensuite retenues dans le filtre Ce

procédé demande moins de temps que le transfert par diffu-

sion et le rendement d'élution est meilleur On a suggéré

une modification de cette méthode, permettant un trans-

fert bidirectionnel En outre, le temps nécessaire à une

élution efficace a été très fortement réduit par applica-

tion d'un vide, pour faciliter l'opération.

Le mode de transfert de protéine le plus large-

ment utilisé est basé sur l'électro-élution des protéines à partir de gels Cela est rendu possible du fait que les

protéines, contrairement à l'ADN, adsorbent la nitrocellu-

lose, même dans des liquides tampon de faible force ionique (lorsqu'on utilise d'autres matrices d'immobilisation, par exemple du papier DBM, ce n'est plus à considérer) Par conséquent, on peut extraire les protéines du gel, par

électrophorèse, sans engendrer de courants inacceptables.

Il faut noter que le principe de 1 'électro-émulsion de

macromolécules, pour le transfert, a été décrit initiale-

ment par Arnheim et Southern en 1977 (Hétérogénéité des gènes ribosomiques chez les souris et les hommes,Cell 11:

363-370) De nombreux appareils ont été décrits et quel-

'ques uns sont maintenant disponibles dans le commerce Es-

sentiellement, une substance de matrice humide est placée sur un gel et on s'assure qu'il n'y a pas de bulles d'air

emprisonnées dans le filtre ou entre la matrice et le gel.

La matrice et le gel sont ensuite interposés entre des

tampons supports poreux, par exemple des tampons de récu-

rage ',Scotch Brite",du caoutchouc mousse ou des couches de papier buvard humide L'ensemble est ensuite supporté

par des grilles continues (généralement non conductrices).

Il est très important que le gel et la matrice soient so-

lidement tenus ensemble Cela assure un bon transfert et évite la déformation des bandes de protéine Le sandwich

"gel + matrice",ainsi supporté,est introduit dans un ré-

servoir contenant un liquide tampon de transfert et placé entre deux électrodes Les électrodes,qui peuvent être

collées aux côtés du réservoir, sont conçues pour engen-

drer un champ homogène dans toute la surface du gel qui doit être transféré Des feuilles conductrices continues

peuvent être utilisées comme électrodes et elles sont théo-

riquement les plus appropriées à cet usage On a également

utilisé des lames de graphite et des plaques d'acier ino-

xydable Toutefois, les dispositifs comportant de telles électrodes ne fonctionnent généralement pas en pratique,

du fait de la nécessité de courants très élevés Un appa-

reil utilise un grillage en acier inoxydable ou un gril-

lage en platine Un dispositif économique et cependant efficace, qui semble fonctionner assez bien, est décrit

par Bittner et autres,"Transfert électrophorétique de pro-

téines et d'acides nucléiques, entre des gels en plaque et des feuilles de cellulose diazobenzyloxyméthylée ou

de nitrocellulose",Ana Biochem 102: 459-471) Les fac-

teurs qui peuvent agir-sur l'homogénéité du champ sont la distance entre le gel et l'électrode et la densité du

matériau d'électrode, c'est-à-dire la distance entre cha-

que brin de fil utilisé En général, plus l'électrode

comporte de matière, plus la résistance électrique du dis-

positif est faible Par conséquent, celui-ci nécessite des

courants plus forts afin d'obtenir des différences de po-

tentiel convenablespour entraîner l'élution Les liquides tampon de transfert utilisés peuvent être de faible force ionique, par exemple un tampon de phosphate, un tampon de

tris-borate ou de tris-glycine,et ils peuvent ou non conte-

nir du méthanol Le méthanol tend à accroître la capacité de liaison de la nitrocellulose pour la protéine et à stabiliser la géométrie du gel transféré, mais il diminue le rendement d'élution de la protéine à partir de gels de dodécylsulfate de sodium et, en sa présence, l'électro- élution doit être effectuée pendant une longue durée, en

général plus de 12 heures, pour obtenir un transfert ef-

ficace des protéines de haut poids moléculaire En l'ab-

sence de méthanol, les gels d'acrylamide tendent à gonfler et, si on laisse ce phénomène se produire pendant le transfert de protéine, il en résulte une déformation de

la bande.

Les conditions du transfert proprement dit dé-

pendent du type de gel, de la matrice d'immobilisation et

de l'appareil de transfert utilisé,ainsi que des macromolé-

cules elles-mêmes Des gels non dénaturants, des gels de

dodécylsulfate de sodium, des gels contenant du dodécyl-

sulfate de lithium, des gels d'iso-électroconcentration de type 2 D et des gels d'agarose ont tous été utilisés

pour le transfert de protéine Il est nécessaire de dé-

terminer la charge électrique de la protéine à éluer et de placer la matrice sur la face appropriée du gel Les protéines de gels de dodécylsulfate de sodium, par exemple,

sont éluées comme des anions et, par conséquent, la matri-

ce doit être placée du côté anode du gel On peut rencon-

trer le cas inverse pour des gels non dénaturants Lorsque-

l'électro-élution progresse, les électrolytes provenant du gel sont également élués et contribuent à la conductivité du liquide tampon, ce qui fait chuter la résistance Si

on effectue le transfert sous tension constante, le cou-

rant augmente en conséquence et des courants supérieurs à

un ampère et même jusqu'à cinq ampères peuvent apparaître.

Des sources d'alimentation de forte intensité (un à cinq ampères) sont maintenant disponibles dans le commerce pour

l'électro transfert Une autre variante consiste à uti-

liser un chargeur de batterie de 12 volts,qui semble très bien convenir Toutefois, comme la plupart des sources d'alimentation usuelles, utilisées pour l'électrophorèse de gel, ne peuvent pas dépasser 200 à 250 m A, on trouve avantage à fonctionner à intensité maximale constante (c'est-à-dire 200 m A) et on laisse la tension diminuer

progressivement pendant le transfert.

On rencontre des cas o les protéines isolées, de poids moléculaire faible ou moyen, ne s'éluent pas ef-_ ficacement d'un gel Cela peut avoir lieu dans les cas

oces protéines sont fortuitement à leur point isoélec-

trique et n'ont pas tendance à migrer dans le champ élec-

trique exercé Dans un tel cas, on peut utiliser d'autres

conditions du tampon.

De nombreuses matrices d'immobilisation sont ac-

tuellement disponibles Bien que la nitrocellulose soit

le matériau le plus largement utilisé comme matrice, l'in-

teraction d'une protéine avec la nitrocellulose est com-

plexe et elle n'est pas complètement élucidée Par exem-

ple, à un p H de 8 auquel on effectue généralement l'élec-

tro-élution de protéine, la nitrocellulose est chargée

négativement, de même que les protéines adsorbées Des ef-

fets hydrophobes jouent un rôle dans cette interaction et,

en effets l'élution de protéine de la matrice est facili-

tée par des détergents non ioniques Certaines protéines, en particulier celles qui ont un faible poids moléculaire se lient avec une faible affinité à la nitrocellulose, et

elles peuvent être perdues pendant le transfert ou un trai-

tement ultérieur Pour éviter cette perte, le polypeptide transféré peut être fixé par réticulation à la matrice,

ce qui stabilise de façon covalente le motif de protéine.

La présence d'acétate de cellulose dans des matrices à mem-

brane de nitrocellulose semble réduire leur capacité de

liaison avec la protéine Toutefois, des matrices d'acéta-

te de cellulose ont été utilisées avec succès pour le

transfert de protéine.

Afin de remédier à certains des inconvénients des matrices en nitrocellulose, on a proposé d'autres matrices d'immobilisation Le transfert à un papier DBM a pour résultat un motif de protéine lié de façon cova- lente et stable La résolution est légèrement inférieure sur cette matière, du fait de sa rugosité intrinsèque, comparativement à des matrices à membrane D'autre part, la glycine, qui est une substance couramment utilisée dans les solutions tampons de transfert, peut interférer avec le transfert de protéine sur du papier DBM Il existe

donc encore un besoin d'une matrice d'immobilisation évi-

tant les inconvénients de la nitrocellulose, du papier DBM et des autres matrices utilisées jusqu'à présent Une plus

grande capacité de transfert est également souhaitable.

Il est connu des hommes de l'art que des membra-

nes peuvent être utilisées en chromatographie en général et en électrophorèse en particulier On peut se reférer, par exemple, aux brevets des Etats-Unis 3 808 118 de Golias, 3 829 370 de Bourat,3 945 926 de Kesting, 3 957 651 de Kesting, 3 989 613 de Gritzner, 4 043 895 de Gritzner, 4 111 784 de Dahms, 4 158 683 de Del Campo, 4 204 929 de Bier, 4 243 507 de Martin, 4 310 408 de Roe et 4 311 574 de Ishikawa De plus, on sait que des poudres

de polyamide peuvent être utilisées pour effectuer des sé-

parations chromatographiques On peut se reporter par exem-

ple aux brevets des Etats Unis 3 418 158 de Perry et

3 523 350 de Goldberg.

Hiratsuka et autres, dans le brevet des Etats -

Unis 4 128 470, indiquent que des membranes microporeuses

en nylon peuvent être utilisées en électrophorèse et con-

centration isoélectrique,comme milieu par l'intermédiaire

duquel la chromatographie est exécutée.

* New England Nuclear vend une membrane en nylon non chargée, utilisable pour le transfert, dans sa gamme

de produits pour électrophorèse "Gene Screen" Cette ma-

tière semble avoir une capacité de liaison pour les pro-

téines équivalente à celle de la nitrocellulose.

Les macromolécules transférées peuvent être "recouvertes" par divers réactifs, sensiblement de la

même façon qui a été mise au point pour les gels La ma-

nipulation des matrices filtrantes demande moins de temps,

est plus économique en ce qui concerne les réactifs utili-

sés et elle est moins sujette à des accidents de manuten-

tion Toutefois, le plus important est le fait que le transfert de protéines, des gels aux matrices, supprime effectivement les barrières de diffusion En outre, des polypeptides dénaturés peuvént parfois être régénérés par

élimination du dodécylsulfate de sodium de ces polypepti-

des, et ce processus est probablement beaucoup plus prati-

que et efficace lorsqu'on utilise des transferts.

Actuellement, la plupart des indicateurs ou a-

gents utilisés sont des macromolécules se liant bien, de façon spécifique, à des domaines définis des polypeptides

sous examen Les lectines ont permis la détection de glyco-

protéines et d'anticorps et l'identification de leurs an-

tigènes correspondants Quel que soit le titrage envisagé, les zones libres de la matrice, qui ne contiennent pas de bandes de protéine, peuvent absorber non spécifiquement des substances pendant l'opération de recouvrement, ce qui a pour conséquence un fond inacceptable Par conséquent, les sites non liés de la matrice doivent être inactivés

avant le recouvrement de l'élément transféré Le plus sou-

vent, l'inactivation est obtenue par incubation du "trans-

féré" dans des fortes concentrations d'albumine de sérum

bovin ou d'hémoglobine à 25-60 WC, pendant 1 à 12 heures.

On a également utilisé d'autres substances, telles que l'ovalbumine, la gélatine et divers sérums animaux La

température, le choix de la protéine et la durée de l'inac-

tivation dépendent du type de la matière de matrice et de l'agent utilisés On a également inclus des détergents non ioniques dans des solutions tampons d'inactivation

ou de lavage, pour diminuer la liaison non spécifique.

Une fois que le "transféré" a été inactivé, on le fait réagir avec l'indicateur D'une manière géné- rale, toutes les réactions doivent être effectuées en présence de protéine d'inactivation Après réaction, on lave le "transféré" de façon prolongée dans une solution

tampon (qui ne doit pas contenir de protéine) Si l'in-

dicateur est lui-même radioactif ou conjugué à une enzyme ou à une substance fluorescente de marquage, le "transféré" peut être immédiatement autoradiographié, mis en réaction

avec le substrat approprié ou visualisé en lumière ultra-

violette, respectivement Si un deuxième ou un troisième réactif est encore nécessaire pour détecter la présence

de complexes de bandes d'indicateur, on fait ensuite incu-

ber chaque réactif consécutif avec l'élément transféré,

l'incubation étant suivie d'un lavage La grande sensibi-

lité de ces méthodes de recouvrement a permis la détection de très petites quantités (par exemple 1 ng) d'antigènes de virus dans des fluides naturels En outre, ces méthodes

ont également été employées dans l'analyse de sérums hu-

mains de malades atteints de divers désordres immunologi-

ques. L'un des avantages des "transférés" par rapport aux gels réside en ce qu'ils-peuvent être réutilisés ou soumis à des réactions multiples Une fois qu'un signal

a été obtenu et enregistré, le "transféré" peut être "ef-

facé" par élimination de l'indicateur mais conservation du motif de protéine initiale sur la matrice Le filtre

"effacé" peut être réutilisé pour une analyse supplémen-

taire par recouvrement, en vue d'une nouvelle caractérisa-

tion des éléments du motif du gel L'effacement peut être

effectué par abaissement du p H, afin de dissocier les com-

plexes anticorps-antigèneou par morcellement de l'indica-

Leur par incubation du "transféré" dans l'urée ou le do-

décylsulfate de sodium Une dissociation sélective des

complexes de bande d'indicateur, démontrant une spécifi-

cité, peut également être obtenue Les lectines peuvent être sélectivement chassées par des haptènes appropriés. La calmoduline peut être dissociée des protéines se liant

à la calmoduline, par élimination de Ca++ de la combinai-

son Ces réactions peuvent encore être effectuées même

après que le "transféré" de protéine ait été autoradio-

graphié pour obtenir le signal initial.

L'utilisation de transferts de protéine a généra-

lement comme objectifs de démontrer des interactions pro-

téine-protéine ou protéine-ligand ou d'exploiter la produc-

tion d'un polypeptide immobilisé comme étape intermédiai- re dans des analyses immunologiques ou biochimiques Ces deux idées ont été

exploitées dans des usages nouveaux de transferts de protéine Par exemple:

a) Analyse d'associations protéine-ligand.

On a analysé des interactions ADN-protéine et ARN-protéine au moyen de "transférés" de protéine Des associations d'histone H 2 avec H 3 et H 4 ont également été démontrées.

On a identifié le récepteur du facteur de crois-

sance épidermique par recouvrement d'hormone d'un motif transféré sur membrane Des membranes ont été préparées à partir de cellules cancéreuses d'épiderme humain (A-431)

et appliquées sur des gels dodécylsulfate de sodium-poly-

acrylamide On a ensuite effectué l'électro-transfert des

gels sur un papier DBM, puis une inactivation et un recou-

vrement avec le facteur de croissance de l'épiderme et en-

suite avec un anticorps de l'hormone marqué radioactivement.

On a détecté un signal très prédominant à 150 KD.

b) Identification de sous-unités d'enzyme.

La détection d'une enzyme inactive sur un "trans-

féré" de protéine a été réalisée On a fait bouillir par exemple de la phosphodiesterase I dans du dodécylsulfate de sodium à 2 % pendant 5 minutes et on l'a appliquée sur

un gel dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide La protéi-

ne a été transférée dans des filtres de nitrocellulose qu'on a fait réagir avec un excès d Vanti-phosphodiestera-

se I On a fait ensuite incuber la matrice avec une prépa-

ration brute contenant l'enzyme active L'enzyme active s'est liée, par l'intermédiaire des sites inoccupés de

l'anticorps, à la sous-unité résolue inactivée; immobili-

sée sur la matrice Les matrices ont été ensuite soumises à une réaction de détermination de l'activité de l'enzyme

et on a ainsi détecté les immunocomplexes.

c) Purification d'affinité d'anticorps monospécifiques.

Des "transférés" ont été utilisés pour la puri-

fication d'anticorps monospécifiques Des polypeptides ont

été résolus sur des gels dodécylsulfate de sodium-polyacry-

lamide et transférés sur un papier DBM ou CN Br Les matri-

ces ont été recouvertes avec un sérum contenant des anti-

corps polyclones Ensuite, des bandes séparées contenant des complexes antigène-anticorps ont été excisées dans les matrices desquelles l'anticorps monospécifique a été élué par incubation de la bande dans une solution tampon à faible p H ( 2 à 3) La substance éluée a pu ensuite être

utilisée pour des études de localisation immunocytochimi-

ques.

d) Démonstration d'interactions cellule-protéine.

On a utilisé des "transférés" de protéine pour mettre en évidence des interactions spécifiques cellule entière-polypeptide Du plasma humain a été appliqué sur

dse gels dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide et trans-

féré à des matrices de nitrocellulose Après inactivation

des matrices, on a fait incubercelles-ci avec des cellu-

les normales de reins de rats qui se sont liées spécifi-

quement à des polypeptides immobilisés probablement impli-

qués dans la fixation de la cellule Les cellules ont été teintes avec du noir d'amine et on a constaté qu'elles

étaient localisées dans deux bandes distinctes Ces ban-

des ont été identifiées comme étant la fibronectine et

une entité-nouvellement découverte à 70 KD.

La présente invention a pour objet une nouvelle matrice d'immobilisation utilisable dans le transfert de

macromoléculeavec une capacité d'adaptation, d'absorp-

tion et de rétention accrue par rapport aux matières connues.

L'invention vise également une matrice d'immobi-

lisation, pour le transfert de macromolécule, qui procure

un transfert plus efficace des macromolécules à la ma-

trice et évite les divers inconvénients des matrices con-

nues. L'invention a encore pour objet un procédé de

transfert électrophorétique de protéines d'un gel d'élec-

trophorèse à une matrice d'immobilisation qui possède une meilleure capacité d'adsorption et de rétention que les matières connues comme la nitrocellulose, et ne nécessite pas des concentrations salines élevées dans la solution

tampon de transfert.

L'invention a également pour objet un produit

de transfert de macromolécule d'un substrat chromatogra-

phique et d'une matrice d'immobilisation,qui possède une meilleure capacité d'adsorption que les produits connus de

transfert de macromolécule.

L'invention vise aussi un produit de transfert de macromolécule sur lequel des opérations de recouvrement

peuvent être efficacement effectuées.

Ces divers objets de l'invention sont atteints

par utilisation, comme matrice d'immobilisation, d'une mem-

brane microporeuse à charge modifiéequi comprend une mem-

brane microporeuse,organique,hydrophile,comportant une quantité de modification de charge d'un agent cationique de modification de chargelié à sensiblement toutes les surfaces mouillées de la membrane De préférence, , l'agent

cationique de modification de charge est un polymère or-

ganique soluble dans l'eau, de poids moléculaire supérieur à 1 000 environ, dans lequel chaque monomère comprend au moins un groupe époxyde capable de se lier à la surface

de la membrane et au moins une amine tertiaire ou un grou-

pe ammonium quaternaire Plus avantageusement, une partie

des groupes époxy du polymère organique sont liés à un a-

gent secondaire de modification de charge qui est une ami-

ne aliphatiquecomportant au moins un groupe amino primai-

re ou au moins deux groupes amino secondaires, ou une ami-

ne aliphatique comportant au moins un groupe amino secon-

daire et un substituant carboxyle ou hydroxyle.

L'agent de modification de charge peut égale-

ment être une amine aliphatique ou une polyamine liée à

la membrane par l'intermédiaire d'un agent de réticula-

tion qui est un polyépoxyde aliphatique de poids molécu-

laire inférieur à 500 environ.

La membrane microporeuse préférée est le nylon.

La membrane microporeuse à charge modifiée peut être uti-

lisée sous la forme d'une membrane feuilletée renforcée ou, de préférence, sous la forme d'une feuille poreuse de renforcement 1 imprégnée avec une membrane microporeuse

de polymère.

L'invention sera mieux comprise à la lumière de

la description de ses formes de réalisation, non limita-

tives, illustrées par les dessins annexés dans lesquels Fig 1 illustre la liaison d'albumine de sérum bovin marquée à l'iode 125, à une membrane utilisée dans

la présente invention et à une matrice suivant l'art an-

térieur;

Fig la illustre l'effet de concentrations varia-

bles d'albumine de sérum bovin sur la liaison de protéines marquées à l'iode 125 à des membranes d'immobilisation;

Fig lb illustre l'effet de concentrations varia-

bles d'hémoglobine de bovin sur la liaison de protéines marquées à l'iode 125 à des membranes d'immobilisation; Fig 2 est une quantification du transfert de quantités variables d'albumine de sérum bovin marquée à l'iode 125 aux matrices de la figure 1; Fig 3 illustre la récupération d'albumine de

sérum bovin marquée à l'iode 125 sur des couches succes-

sives des matrices de la figure 1; et Fig 4 est une comparaison de la récupération d'albumine de sérum bovin sur les couches des matrices de

la figure 1.

La matrice d'immobilisation suivant l'invention est une membrane microporeusehydrophile,à charge modifiée,

comprenant une membrane organique,microporeuse,qui com-

porte une quantité modificatrice de charge d'un agent ca-

tionique de modification de charge lié à sensiblement tou-

tes les surfaces mouillées de la membrane Les membranes

microporeuses et les membranes cationiques à charge modi-

fiée sont bien connues dans le domaine de la filtration

des fluides, par exemple des liquides Les membranes mi-

croporeuses cationiques à charge modifiée, leur prépara-

tion et leur utilisation dans la filtration de fluides sont décrites dans la publication EPC n 0066 814,au nom de Ostreicher et autres,et dans la publication EPC

n 0050 864 au nom de Barnes et autres qui décrit l'em-

ploi d'une membrane à charge modifiée pour la filtration

d'eau ultra-pure (d'une résistivité de 18 megohm-cm)j uti-

lisée dans l'industrie électronique Ostreicher et autres décrivent l'emploi d'une membrane à charge modifiée pour

la filtration de liquides du corps ou d'alimentation paren-

térale De plus, il faut noter que ces membranes filtran-

tes peuvent être renforcées par divers moyens Leurs des-

criptions sont incorporées à la présente, pour référence.

En outre, des membranes filtrantes,microporeuses, en nylon sont vendues par-Pall Corp, Glen Cove, NY,sous le nom commercial de ULTIPOR N 66 et N 66 POSIDYNE, cette dernière étant une membrane filtrante à charge cationique modifiée.

D'autre part, AMF Inc, Cuno Div, vend une mem-

brane filtrantemicroporeuse;en nylon, à charge cationi-

que modifiée, sous le nom de ZETAPOR.

L'expression "membrane microporeuse'" utilisée

icidésigne une membrane poreuse, de préférence sensible-

ment symétrique et isotrope, d'une dimension de pore d'au moins 0,05 micron ou plus, d' un point de bullage initial

dans l'eau, lorsque cette expression est utilisée ici, in-

férieur à 8,4 bars La dimension de pore peut atteindre 1,2 micron environ, ou un point de bullage supérieur à 0,7 bars environ Par "symétrique", on entend que la structure de pore est sensiblement la même sur les deux faces de la membrane Lorsqu'on utilise le terme "isotrope", cela signifie que la structure de pore est uniforme dans

toute la membrane.

La membrane est de préférence hydrophile Le

terme "hydrophile",utilisé dans la description de la mem-

brane microporeuse,désigne une membrane qui adsorbe ou ab-

sorbe l'eau En général, cette caractéristique hydrophile

est produite par une quantité suffisante de radicaux hy-

droxyle (-OH)> carboxyle (-COOH),amino (-NH 2) et/ou de

groupes fonctionnels analogues sur la surface de la mem-

brane De tels groupes aident à l'adsorption et/ou l'ab-

sorption de l'eau sur la membrane Cette caractéristique hydrophile de la matrice d'immobilisation est un élément nécessaire de la présente invention La caractéristique

hydrophile de la membrane en elle-même procure une liai-

son adéquate de l'agent de modification de charge à la

membrane microporeuse.

Une membrane microporeuse préférée est celle qui est fabriquée en nylon Le terme "nylon" s'entend pour

toutes les résines polyamides de formation-de filmcompre-

nant des copolnymères et des terpolymères qui contiennent

le groupement amido récurrent.

Bien que, d'une manière générale, les divers

"nylons" o U résines polyamides soient tous des copoly-

mères d'une diamine et d'un acide dicarboxylique, ou des homopolymères d'un lactame d'un aminoacide, ils varient beaucoup en cristallinité ou structure solide, en point

de fusion et autres propriétés physiques Les nylons pré-

férés pour l'utilisation dans la présente invention sont

les copolymères d'hexaméthylène diamine et d'acide adipi-

que (nylon 66), les copolymères d'hexaméthylène diamine et d'acide sébacique (nylon 610), et les homopolymères

de poly-o-caprolactame (nylon 6).

En variante, ces résines polyamides préférées ont un rapport du méthylène (CH 2) aux groupes amides (NHCO) compris entre 5/1 environ et 8/1 environ, et de préférence entre 5/1 environ et 7/1 environ Le nylon 6 et le nylon 66 ont chacun un rapport de 6/1, tandis que le nylon 610

a un rapport de 8/1.

Les polymères de nylon existent dans une grande variété de qualités qui diffèrent notablement en ce qui

concerne le poids moléculaire, dans la plage de 15 000 en-

viron à 42 000 environ, et d'autres caractéristiques.

Le type le plus avantageux des unités composant la chaîne de polymère est l'adipamide de polyhexaméthylène,

c'est-à-dire le nylon 66, et des poids moléculaires supé-

rieurs à 30 000 environ sont préférés On préfère en géné-

ral des polymères exempts d'additifs,mais l'addition d'an-

tioxydants ou d'additifs analogues peut être avantageuse

dans certaines conditions.

Les substrats de membrane préférés sont fabri-

qués par le procédé décrit dans le brevet US n 3 876 738, de Marinaccio et autres Un autre procédé de fabrication de telles membranes est décrit dans la demande de brevet

européen n O 005 536, de Pall Les descriptions complètes

de ces deux documents sont incorporées à la présente,

pour référence.

D'autre part, n'importe quelle membrane micro-

poreuse hydrophile dispohible dans le commerce, par exem-

ple ULTIPOR N 66 (nylon) de Pall Corp, Durapore (fluorure de polyvinylidène) de Millipore et des membranes acétate

de cellulose/nitrate fabriquées par de nombreuses socié-

tés, conviennent pour la modification de charge cationi-

que en vue d'utilisation conforme à la présente invention.

Les membranes en nylon préférées, c'est-à-dire celles qui sont décrites dans Marinaccio et autres et Pall, sont caractérisées par une structure isotrope, à surface

effective élevée et à fine microstructure interne de di-

mensions de pore déterminées, avec une répartition étroite

de taille de pore et un volume de pore adéquat Par exem-

ple, une membrane représentative en nylon 66 (adipamide de polyhexaméthylène),d'une taille nominale de 0,22 micron, possède un point de bullage initial de l'ordre de 3,1 à 3,5 bars, un point de surmoussage de l'ordre de 3,5 à 3,9 bars, permet un débit d'eau de 70 à 80 ml/mn sous 0,35 bars (pour des disques de 47 mm de diamètre), présente une surface (BET, adsorption d'azote) de l'ordre de 13

m 2/g et une épaisseur de l'ordre de 0,11 à 0,12 mm.

L'agent de modification de charge est lié à sen-

siblement toute la surface mouillée de la membrane micro-

poreuse Le terme "lié" signifie que le ou les agents de

modification de charge sont suffisamment attachés à la mem-

brane et/ou l'un à l'autre de sorte qu'ils ne se séparent

pas sensiblement dans les conditions prévues d'utilisa-

tion L'expression "sensiblement toute la surface mouillée", utilisée ici, désigne toute la surface externe et les

surfaces internes des pores qui sont mouillées par un flui-

de traversant la membrane ou dans lequel la membrane est immergée. Un agent préféré de modification de charge qui peut être utilisé dans la présente invention est décrit

dans Ostreicher et autres Il s'agit d'un polymère orga-

niquefsoluble dans l'eau, de poids moléculaire supérieur à 1000 environ, dans lequel le monomère comporte au moins un substituant époxyde capable de liaison avec la surface

de la membrane et au moins une amine tertiaire ou un grou-

pe ammonium quaternaire capable de constituer un site à

charge cationique De préférence, ce modificateur de char-

ge est une résine cationique polyamido-polyamine épichlo-

rhydrine, en particulier celles qui sont décrites dans les brevets US 2 926 116 de Keim, 2 926 154 de Keim, 3 224 986 de Butler et autres, 3 311 594 de Earle, Jr, 3 332 901 de

* Keim, 3 382 096 de Boardman, 3 761 350 de Munjat et autres.

Les descriptions complètes de tous ces brevets sont incor-

porées à la présente, pour référence.

Les résines cationiques préférées polyamido-po-

lyamine épichlorhydrine sont disponibles dans 'le commerce, par exemple Polycup 172, 1884, 2002 ou S 2064 (Hercules),

résine Cascamide p R-420 (Borden); ou Nopcobond 35 (Nopco).

De préférence, la résine polyamido-polyamine épichlorhy-

drine est la résine Hercules R 4308, dans laquelle l'atome d'azote chargé fait partie d'un groupe hétérocyclique et

est lié par l'intermédiaire d'une moitié de groupe méthy-

lène à un groupe époxyde réactif correspondant.

Chaque groupe monomère dans R 4308 a la formule générale suivante:

/ CH 2

3 CH 2 CH CH

I J

CH 2 CH 2

N

CH 3 CH CH-CH 2

Polycup 172, 2002 et 1884, d'autre part, compor-

tent des groupes monomères de formule générale suivante Cl R.

C(CH 2)4 CNHCH 2 CH 2 NCH 2 CH 2 NH 2

O O CH 2

O

dans laquelle R est méthyle ou hydrogène (Polycup 172 et 2002, R = H; et Polycup 1884, R = CH 3)o De préférence, lorsque l'agent de modification de charge est un polymère organique soluble dans l'eau, de poids moléculaire supérieur à 1 000 environ, on peut utiliser un agent secondaire de modification de charge pour renforcer la charge cationique de l'agent primaire de modification de charge et/ou améliorer la liaison de l'agent primaire de modification de charge à la surface

microporeuse et/ou à lui-même.

L'agent secondaire de modification de chargez utilisé dans cette inventionest choisi dans le groupe comprenant (i) des amines aliphatiques comportant au moins une

amine primaire ou au moins deux moitiés d'amine secondai-

re; et (ii) des amines aliphatiques comportant au moins une

amine secondaire et un substituant carboxyle ou hydroxyle.

De préférence, l'agent secondaire de modifica-

tion de charge est une polyamine de formule ci-après H

H 2 N (R 1-N-) X R 2-NH 2

dans laquelle R 1 et R 2 sont des radicaux alkyle de 1 à 4 atomes de carbone et x est un nombre entier de O à 4 De

préférence, Ri et R 2 sont tous deux des radicaux éthyle.

Les polyamines préférées sont Ethylène diamine H 2 N-(CH 2)2-NH 2 Diéthylènetriamine H 2 N-(CH 2)2-NH-(CH 2)2 -NH 2 Triéthylènetetramine H 2 N-(CH 2-CH 2-NH)2-CH 2-CH 2-NH 2 Tetraéthylènepentamine H 2 N-(CH 2-CH 2-NH)3-CH 2-CH 2-NH 2

La polyamine préférée en premier est la tétraéthylènepen-

tamine. En variante, les amines aliphatiques utilisées dans la présente invention peuvent comporter au moins une moitié d'amine secondaire et un substituant carboxyle ou hydroxyle Comme exemples de telles amines aliphatiques,

on peut citer l'acide gamma amino-butyrique (H 2 NCH 2 CH 2 CH 2-

COOH) et le 2-aminoéthanol (H 2 NCH 2 CH 2 OH).

L'agent secondaire de modification de charge est lié à la membrane microporeuse par liaison à une partie

des substituants de type époxyde de l'agent polymère pri-

maire de modification de charge.

La quantité d'agent primaire et d'agent secondai-

re cationiques de modification de charge utilisée est

une quantité suffisante pour renforcer le potentiel élec-

tropositif de capture de la membrane microporeuse Cette

quantité dépend beaucoup des agents spécifiques de modifi-

cation de charge utilisés.

D'une manière générale, les agents primaire et secondaire de modification de charge cationique, décrits

ci-dessus, sont liés à une membrane microporeuse hydrophi-

le de polymère organique, par exemple du nylon, par appli-

cation à la membrane d'une quantité modificatrice de char-

ge de l'agent primaire de modification de charge cationi-

que lié à la structure de membrane par l'intermédiaire de l'époxyde de substitution De préférence, le traitement comprend (a) la mise en contact de la membrane avec une solution aqueuse de l'agent primaire de modification de charge cationique et (b) la mise en contact de la membrane

avec une solution aqueuse de l'agent secondaire de modifi-

cation de charge Les opérations de mise'en contact peu-

vent être exécutées dans un ordre quelconque, c'est-à-

dire l'opération (a) avant l'opération (b) ou inverse-

ment Il est toutefois préférable, pour une extraction optimale Minimale), de mettre d'abord en contact la mem- brane avec une solution aqueuse de l'agent cationique primaire de modification de charge et de mettre ensuite en contact la membrane, ainsi traitée, avec la solution

aqueuse de l'agent secondaire de modification de charge.

Dans un autre mode de réalisation de la présen-

te invention, l'agent secondaire de modification de char-

ge, décrit plus haut, peut être utilisé comme l'agent de modification de charge, à condition qu'il soit lié à la

structure de membrane microporeuse par un agent de réti-

culation polyépoxyde aliphatique, de poids moléculaire in-

férieur à 500 environ De préférence, le polyépoxyde est un di ou tri époxyde de poids moléculaire compris entre

146 environ et 300 environ Ces polyépoxydes ont des vis-

cosités (à l'état non dilué) inférieures à 200 centipoises

environ à 25 C Puisqu'il est nécessaire que l'époxyde a-

gisse comme un agent de réticulation, les monoépoxydes, par exemple les glycidyle éthers, ne conviennent pas De même, en théorie, un polyépoxyde comportant plus de trois groupes époxy ne présente pas d'intérêt et,en fait,peut limiter les réactions d'accouplement du polyépoxyde par empêchement stérique En outre, la présence de groupes époxyde n'ayant pas réagi,dans la membrane microporeuse à charge cationique modifiée,peut être indésirable dans le

produit fini.

Les polyépoxydes les plus avantageux ont la formule ci-après:

R(O-CH 2-CH H 2)

o dans laquelle R est un alkyle de 1 à 6 atomes de carbone et N est de 2 à 3 Le nombre d'atomes de carbone dans la

partie non époxyde (R) est limité à moins de 6,de fa-

çon à ce que le polyépoxyde soit soluble dans l'eau ou

des mélanges éthanol-eau, par exemple jusqu'à 20 % d'étha-

nol Bien-que des substances à plus forte teneur en car-

bone soient fonctionnellement acceptables, leur applica-

tion nécessiterait l'emploi de solvants organiques polai-

res, avec pour conséquence des inconvénients de toxicité,

d'inflammabilité et d'émissions de vapeur.

L'agent de modification de charge, du type ami-

no polyamine aliphatique, peut être lié à la membrane mi-

croporeuse par (a) mise en contact de la membrane avec une solution aqueuse de l'agent de modification de charge cationique et (b) mise en contact de la membrane avec

une solution aqueuse de l'agent de réticulation polyépoxy-

de Les opérations de mise en contact peuvent être exécu-

tées dans un ordre quelconque, c'est-à-dire l'opération (a) avant l'opération (b) ou inversement Ces opérations

de mise en contact comprennent également la mise en con-

tact de la membrane avec une solution aqueuse d'un mélange

de l'agent de modification de charge et de l'agent de ré-

ticulation polyépoxyde Il est toutefois préférable, pour obtenir des durées optimales (minimales)de rinçage, de mettre d'abord en contact la membrane avec une solution aqueuse de l'agent de modification de charge cationique puis de mettre en contact la membrane, ainsi traitée, avec

la solution aqueuse de l'agent de réticulation polyépoxy-

de Toutefois, pour obtenir une modification maximale de

la charge, il est préférable de mettre la membrane en con-

tact avec une solution aqueuse d'un mélange de l'agent de

modification de charge et de l'agent de réticulation poly-

époxyde. Après le contact de la membrane microporeuse avec les solutions aqueuses, la membrane est séchée et durcie à chaud, de préférence à l'état maintenu pour empêcher un

retrait.

Le séchage de la membrane en configuration main-

tenue est décrit dans la demande de brevet des Etats Unis n O 201 086, de Repetti, déposée le 27 Octobre 1980 La

description complète de cette demande-est incorporée à

la présente, pour référence D'une manière générale, on peut utiliser pendant le séchage toute méthode appropriée de maintien de forme, telle que l'enroulement serré de la membrane autour d'une surface de séchage, par exemple un tambour Un réglage biaxial est préféré et la tension de la membr'ane sur un cadre d'étirage est considérée comme le procédé le plus avantageux De préférence, la retenue

imposée ne permet pas de réduction des dimensions.

Les températures finales de séchage et de cuis-

son doivent être prévues pour sécher et cuire les membra-

nes traitées, de préférence entre 1200 C et 1400 C environ,

de manière à minimiser les durées de séchage sans entraî-

ner de fragilisation ou autres effets négatifs pour la membrane.

La membrane terminée peut être roulée et sto-

ckée en attente d'utilisation, dans les conditions ambian-

tes. La membrane microporeuse à charge modifiée peut

également être employée sous la forme d'une membrane ren-

forcée et/ou feuilletée, de préférence sous une forme dans laquelle une feuille poreuse de renforcement est imprégnée avec une membrane microporeuse de polymère qui est ensuite chargée cationiquement Une membrane feuilletée renforcée

et une feuille poreuse de renforcement préférées sont dé-

crites dans la demande précitée no 332 068,de Barnes et

autres Une telle feuille imprégnée est de préférence ob-

tenue parcoulage d'une quantité suffisante d'une solution d'enduction sur la feuille poreuse de renforcement, de

manière à obtenir-une feuille portant une solution de re-

vêtement qui est ensuite mise en contact avec un bain dui-

nactivation.

La feuille de renforcement est en matière poreu-

se qui est de préférence mouillable par la solution dlen-

duction, pour augmenter l'imprégnation de la solution

d'enductionlors de la coulée et pour obtenir une fixa-

tion solide à la feuille lors de la précipitation de la

membrane de polymère, par exemple du nylon Il n'est tou-

tefois pas impératif que la feuille soit mouillable par

la,olution d'énd uction Si la feuille n'est pas mouilla-

ble, le revêtement de solution d'enduction est principale-

ment limité à la surface de la feuille mais il adhère

néanmoins à celle-ci du fait de l'imprégnation de la so-

lution dans la feuille et de l'adhérence de la membrane

à la feuille.

De telles feuilles de renforcement, mouillables et non mouillables, peuvent par exemple être réalisées en textiles non tissés et en étoffe, ainsi qu'en filets de divers types comprenant des filets en filament de matière plastique extrudée,en papier et matières analogues Les feuilles de renforcement qui ne sont pas mouillables par

la solution d'enduction peuvent être des feuilles non tis-

sées à fins interstices, en fibres telles que du polypro-

pylène ou du polyéthylène Les feuilles de renforcement mouillables appropriées comprennent des polyesters, sous la forme de feuilles fibreuses non tissées ou de feuilles

tissées, utilisant des monofilaments ou un fil multifila-

ments, les monofilaments étant préférés compte tenu de la structure ouverte et des pertes de charge plus faibles, des feuilles tissées de fibres de polyamide,des feuilles

tissées et non tissées de polyamides aromatiques, et d'au- tres produits fibreux relativement polaires tels que la cellulose, la

cellulose régénérée, les esters de cellulose, les éthers de cellulose,les fibres de verre et matières analogues Les papiers filtrants cellulosiques et en fibres( synthétiques peuvent également être utilisés comme feuille

de renforcement, ainsi que des feuilles perforées en matiè-

re plastique et des matières plastiques expansées à mail-

les ouvertes Si le substrat est relativement rugueux ou à structure tissée très ouverte, même si les fibres ne sont pas substantiellement mouillées par la solution de résine, le substrat peut néanmoins être imprégné par la matière de la membrane Ainsi, des matières non mouilla-

bles telles que le polypropylène et le polyéthylène peu-

vent être imprégnées par la membrane si elles ont une

structure suffisamment ouverte.

Un mode préféré de fabrication de la feuille de

renforcement imprégnée consiste à couler une quantité suf-

fisante de la solution d'enduction sur la feuille de ren-

forcement poreuse, pour obtenir une feuille comportant une solution de revêtement Cette solution de revêtement

est ensuite calandrée, c'est-à-dire pressée, de préfé-

rence par des rouleaux, dans la feuille, dans des condi-

tions de température, de pression et de durée suffisan-

tes pour réduire la viscosité de la solution de revête-

ment à une valeur permettant une meilleure pénétration

de la solution de revêtement dans la feuille et l'évacua-

tion sensiblement de tout l'air emprisonné, de manière à

obtenir une feuille revêtue De telles conditions de tem-

pérature, de pression et de durée dépendent beaucoup du type de feuille de renforcement utilisée, de la solution

d'enduction, du type de rouleaux, etc Ces conditions peu-

vent être facilement déterminées par un homme de l'art,

par examen de la pénétration de la solution dans la feuil-

le et des bulles et microtrous dans le revêtement final.

La feuille ainsi revêtue est ensuite traitée par coulée d'une quantité suffisante de solution d'enduction sur la feuille, de manière à obtenir une feuille revêtue portant une solution de revêtement supplémentaire Cette feuille

ainsi revêtue est ensuite inactivée dans un bain d'inacti-

vation,pour former la feuille imprégnée avec laquelle les

membranes extérieures sont ensuite laminées.

Après formation de la membrane renforcée, celle-

ci peut être traitéecomme décrit plus haut,pour obtenir la membrane microporeuse à charge cationique modifiée,

utilisée dans la présente invention.

Les membranes microporeuses à charge cationique modifiée sont employées comme matrice d'immobilisation dans le transfert de macromolécule,de la même façon que

la nitrocellulose et le papier DBM utilisés jusqu'à pré-

sent Toutefois, les membranes microporeuses à charge mo-

difiée, conformes à la présente invention, ont une capa-

cité beaucoup plus grande que les matrices d'immobilisa-

tion utilisées jusqu'à présent Par exemple, on a consta-

té qu'une membrane microporeuse à charge modifiée,suivant la présente invention,possède une capacité de liaison de protéine d'au moins 480 gg/cm alors que la nitrocellulose a une capacité de l'ordre de 80 pg/cm Il n'est également pas impératif d'utiliser du méthanol dans le tampon de transfert avec la-matrice d'immobilisation utilisée dans la présente invention, comme c'est généralement le cas

lorsqu'on emploie la nitrocellulose En outre, les matri-

ces d'immobilisation en nitrocellulose, lorsqu'on les uti-

lise en relation avec l'ADN, nécessitent des concentrations

salines élevées dans le liquide tampon Par suite, des in-

tensités de courant élevées, atteignant 5 ampères, sont nécessaires et la chaleur engendrée affecte négativement

l'ADN Les concentrations salines élevées ne sont pas né-

cessaires lorsqu'on utilise les présentes membranes micro-

poreuses à charge modifiée et, par conséquent, on peut em-

ployer des courants d'électrophorèse dans la plage des mil-

liampères.

Le recouvrement des "transférés" (ou des élec-

trophorétogrammes transférés) peut être effectué de la même façon avec la matrice immobilisée utilisée dans la

présente invention qu'avec les autres matrices d'immobili-

sation, de façon connue Comme dans le cas des autres ma-

trices, les sites de liaison potentielle résiduels sur la matrice doivent être inactivés, afin de minimiser le fond

non spécifique La forte affinité de la membrane micro-

poreuse à charge modifiée, utilisée dans la présente invention, pour les protéines a pour conséquence que les

procédures normales d*'inactivation peuvent être insuffi-

santes On a constaté que les membranes microporeuses à

charge modifiée utilisées-dans la présente invention peu-

vent être effectivement inactivées par incubation dans de l'albumine de sérum bovin à 10 % dans une solution saline tamponnée au phosphate, pendant une nuit à 45-50 'C On a également trouvé que l'hémoglobine à 1 % dans une solution saline tamponnée au phosphate à 45-50 'C était efficace

pour inactiver les transferts.

Bien que l'invention soit particulièrement uti-

le en relation avec le transfert électrophorétique d'un substrat chromatographique à une matrice, elle s'applique également aux techniques de transfert en général, par

exemple au transfert par convexion, c'est-à-dire à l'uti-

lisation d'un débit de fluide comme force d'entraînement

pour l'élution des macromolécules du substrat chromatogra-

phique à la matrice, et au transfert par diffusion.

Il est prévu, conformément à la présente inven-

tion, que la membrane microporeuse chargée cationiquement puisse être utilisée comme matrice d'immobilisation pour

des macromolécules dérivées non seulement de gels de poly-

acrylamide ou d'agarose mais également d'autres substrats

chromatographiques,tels que des produits de chromatogra-

phie en couche mince ou d'électrophorèse sur papier à hau-

te tension, ou de solutions contenant ces molécules, c'est-

à-dire de taches déposées directement, et être utilisée

pour des titrages en phase solide.

La présente invention, qui a été décrite d'une manière générale, sera mieux comprise avec référence à

certains exemples spécifiques qui sont inclus ici seule-

ment pour les besoins de l'illustration et ne sont pas li-

mitatifs de l'invention.

EXEMPLE 1

A Preparation d'une membrane microporeuse Une membrane représentative en nylon 66 d'une taille nominale de 0,22 micron, ayant une surface nominale de l'ordre de 13 m 2/g, un point de bullage initial de l'or-

dre de 3,29 bars et un point de moussage général de l'or-

dre de 3,64 bars, est préparée par le procédé de Marinaccio

et autres, suivant le brevet U S 3 876 738, par utilisa-

tion d'une composition contenant 16 % en poids de nylon 66 (Monsanto Vydyne 66 B), 7,1 % de méthanol et 76,9 % d'acide

formique, d'une composition de bain d'inactivation conte-

nant 25 % de méthanol et 75 % d'eau en volume (régénérée comme demandé par le procédé de Knight et autres, Brevet U.S 3 928 517), à une vitesse d'enduction de 61 cm/mn et

une température de bain d'inactivation de 20 Co La membra-

ne est enduite juste sous la surface du bain d'inactiva-

tion,par application sur un tambour d'enduction en rota-

tion dans le bain ( 0,23 à 0,25 mm à l'état humide, pour

obtenir 0,11 à 0,14 mm à l'état sec) et séparation du tam-

bour après un arc de 90 environ à partir du point d'appli-

cation, la membrane auto-supportée formant une courbe en chaînette peu profonde vers la reprise Une partie du film opaque uniforme est séchée (en situation maintenue pour résister au retrait) dans un four à ventilation forcée, à

90 C, pendant 30 minutes.

B Préparation d'une membrane microporeuse à charge modi-

fiée.

1 On plonge des échantillons de membrane (sé-

chés et non séchés) dans un bain de résine Hercules 1884

( 4 % de solides en poids), du type polyamido-polyamine épi-

chlorhydrine, et on maintient en immersion jusqu'à attein-

dre l'équilibre d'adsorption Les échantillons de membrane

traitée sont lavés pour éliminer la résine en excès et sé-

chés en situation maintenue sur un tambour à une tempéra-

tuire de 110 C, pendant 3 minutes environ.

Les échantillons de membrane traitée sont com-

* parés en ce qui concerne les caractéristiques de débit -

et de point de bullage, comme indiqué plus loin, et on constate que les échantillons traités et non traités sont sensiblement identiques, ce qui prouve la conservation de la géométrie des pores et de la surface Les résultats

sont reportés dans le Tableau 1.

TABLEAU 1

Témoin Membrane Membrane (sans non séchée traitement) séchée Epaisseur (mm) 0,108 0,116 0,123

Point de bullage ini-

tial (bar) 3,06 3,13 3,13

Point de moussage gé-

néral (bar) 3,85 3,78 3,83 Débit rapporté à l'épaisseur (cm 3 mm/mn cm 2 bar) 2,61 2,65 2,58 BET, adsorption N 2 13,12 13,58 Le point de moussage général est déterminé par établissement du point de bullage initial, conformément à ASTM D-2499-66 T, puis augmentation de la pression d'air jusqu'à ce que le débit d'air à travers l'échantillon de membrane humide, mesuré par un débitmètre placé dans la

conduite entre le régulateur et le porte-échantillon, at-

teigne 100 cm 3/mn Le point de moussage général est direc-

tement proportionnel au diamètre moyen de pore de l'échan-

tillon de membrane.

Le Tableau 1 montre que, en ce qui concerne les

paramètres morphologiques et hydrodynamiques qui détermi-

nent le tamisage mécanique, les caractéristiques ci-dessus

des membranes traitées sont sensiblement identiques à cel-

les de la membrane en nylon non traitée.

2 On effectue des déterminations semblables des

caractéristiques d'un autre échantillon de membrane, pré-

parée de la même façon mais traitée avec une résine Hercu-

les R 4308 à 2 % (une résine polymérisée à radical libre, à base de substances contenant de l'azote diallyle, qui ont réagi avec l'épichlorhydrine) dans un bain réglé à

un p H de 10,5, revêtue avec de la tétraéthylène penta-

mine à 0,1 %, séchée, durcie à chaud, lavée et reséchée.

Les résultats sont indiqués dans le Tableau 2.

TABLEAU 2

Témoin Membrane (sans traitée traitement) Résistance à la traction (da N/cm 2) humide sec Allongement (%) 36,-4 59.,3 43,8 66,2 humide 140 100 sec 95 40 La surface des membranes traitée et non traitée reste sensiblement inchangée La résistance à la traction augmente avec le traitement et il y a une certaine perte d'allongement La feuille traitée est plus flexible Le pliage de la feuille non traitée provoque une fissuration

et une séparation.

EXEMPLE 2

Deux couches de membrane microporeuse humide, fabriquée comme dans l'exemple l A, sont laminées ensemble et séchées à une humidité de 20 à 25 % On constate que la membrane dans cet état humide et gonflé absorbe les agents

de modification de charge plus efficacement que la membra-

ne séchée à coeur.

On introduit ensuite la double couche de membrane dans une solution à 1, 25 % en poids de Hercules R 4308 Le

p H du bain est de 10,5.

Ce bain est obtenu par dilution de 17,17 kg de résine Hercules R 4308,de sa concentration initiale de 20 % en poids à une concentration de 5 % On ajoute ensuite une solution ( 5 N) d'hydroxyde de sodium, pour élever le p H à

,5 La solution est alors diluée avec de l'eau déminé-

ralisée d'une résistivité supérieure à 150 000 ohm-cm, dans un rapport (en volume) de 2,5/1 Le volume total de

la solution du bain est de 227 litres.

La membrane est introduite dans le bain de Hercules R 4308 suivant un angle de 30 par rapport à 1 ' horizontale, pour éviter d'emprisonner des bulles dans la membrane,ce qui pourrait empêcher l'agent de modification de charge de diffuser dans la membrane La membrane est traitée dans ce bain à une Vitesse de 76,2 cm/mn pour une

longueur de 121,9 cm.

A la sortie de ce bain, la membrane est essuyée sur la surface inférieure, de manière à enlever l'eau en

excès Une exposition de 3-minutes à l'air,-avec-un mouve-

ment d'air frais, est effectuée avant d'introduire la mem-

brane dans le bain d'agent secondaire de modification de charge. Ce bain est obtenu par addition de tétraéthylène pentamine à 0,023 % en poids, soit 0,0513 kg, à 227 litres d'eau déminéralisée d'une résistivité supérieure à 150 000

ohm-cm Le p H est de l'ordre de 9 Les conditions d'immer-

sion sont identiques à celles du premier bain d'agent pri-

maire de modification de charge La membrane est ensuite

enroulée autour d'un rouleau de reprise.

Le rouleau de reprise de la membrane humide est

stocké pendant 3 heures au moins On sèche ensuite le rou-

leau à 121 'C pendant 3 minutes, pour terminer la réaction

des agents de modification de charge.

On lave ensuite la membrane, dans une opération

ultérieure, et on vérifie les niveaux d'extraction.

EXEMPLE 3

Une membrane microporeuse en nylon, préparée

comme dans l'exemple 1 A, est traitée avec un agent primai-

re de modification de charge Hercules R 4308 (le p H du bain étant réglé à 10 au moyen d'hydroxyde de sodium) et, dans

les cas indiqués, avec un agent secondaire de modifica-

tion de charge du type polyamine.

Les caractéristiques de débit des membranes res-

pectives ne présentent que peu ou pas de différence, com-

me indiqué dans le Tableau 3.

TABLEAU 3

Traitement Modificateur de charge Prlmaire Secondaire Séquence Aucun

0,133 %

Anquami-

ne**

0,133 %

Anquami-

ne

0,133 %

Anquami-

ne

aucun -

primaire d'abord

secondai-

re d'abord mélangés Caractéristiques de membrane

Point Point Débit rap-

de de mous porté à

bul sage l'épais-

lage général seur*.

init. nit (bars) (bars) (cm 3 mam/ (b__ars)_ mn cm 2 bar

3,36 3,59 2,49

3,26 3,61 2,49

3,13 3,47

3,36 3,54

3,22 3,52

2,37 2,23 2,67 2,0 % 0,03 % primaire 3,42 3,73 2,13 tétraéthy d'abord lène pentamine * Débit (cm 3) x épaisseur (mmn) AP (bars) x surface (cm 2) Cette relation empirique permet de corriger les résultats

en fonction des différences d'épaisseur.

** Anquamine 100 est une substance polyamide cationique de faible poids moléculaire (inférieur à 10 000),qui fait

apparaître une fonction amine secondaire par spectroanaly-

se comparative en ultravioletfournie par Pacific Anchor Chemical Corp.

EXEMPLE 4

Afin de comparer les résultats de différents mo-

Aucun 2,0 % 2,0 % 2,0 % 2,0 %

dificateurs de charge primaires, en particulier les di-

verses résines polyamide-polyamine épichlorhydrine, et d'optimiser les niveaux d'application et les conditions de p H, on effectue les essais suivants, avec des résines Hercules R 4308, Polycup 172 (au p H de 4,7 tel que fourni)

et Polycup 2002 ( 27 % de solides, p H 3,0 tel que fourni).

Les résultats sont indiqués dans le Tableau 4.

TABLEAU 4

Modificateur de p H du bain Point de Point de charge primaire bullage moussage initial général

1 % R 4308 10,3 3,24 3,45

2 % R 4308 10,3 3,11 3,38

3 % R 4308 10,3 3,04 3,52

1 % 172 11,0 3,17 3,45

1 % 172 4,9 3,24 -3,45

2 % 172 11,0 3,24 3,59

2 % R 4308 11,0 3,24 3,59

2 % 2002 11,0 3,38 3,59

Témoin 3,17 3,45

EXEMPLE 5

Une membrane microporeuse en nylon, lavée et séchée en étirage, préparée comme dans l'exemple 1 A, est

immergée dans une solution à 2 % en poids de solide de 1,4-

butanediol diglycide-1 éther,préparée avec un mélange 80-

20 d'eau déminéralisée à 18 megohm-cm dans de l'éthanol de haute pureté et ayant un p H de 6,1 à 6,4 On retire la membrane de la solution et on la laisse égoutter pendant une minute environ On immerge ensuite la membrane dans une

solution à 0,5 % en poids de solide de tétraéthylène penta-

mine,préparée avec de l'eau déminéralisée à 18 megohm-cm et d'un p H de 11,2 à 11,4 On retire la membrane de la solution, on la laisse égoutter pendant une minute environ

puis on la sèche en tension à 130 C pendant 5 minutes.

EXEMPLE 6

Une feuille imprégnée de nylon,comportant une membrane microporeuse d'une taille nominale de pore de l'ordre de 0,65 micron,est fabriquée avec une feuille de

renforcement en polyester Reemay 2250 de du Pont Corpora-

tion, de type non tissé "spun bonded", au moyen d'une so-

lution d'enduction comprenant 16 % en poids de nylon 66,

78,04 % en poids d'acide formique et 5,96 % en poids de mé-

thanol Une première membrane microporeuse extérieure est placée en contact avec la feuille imprégnée,de manière à

obtenir une ligne de contact humide par trempage à la jonc-

tion des deux couches, et une deuxième membrane microporeu-

se extérieure est placée sur la surface opposée de la

feuille imprégnée, de façon analogue La membrane feuil-

letée à trois couches est séchée sur un tambour en acier revêtu de Téflon, équipé de bandes deretenue sur les deux

côtés de la membrane feuilletée et de radiateurs à infra-

rouge espacés les uns des autres sur la circonférence du

tambour Ensuite, on traite la membrane feuilletée renfor-

cée, avec un modificateur de charge cationique, comme dans

l'exemple B.

EXEMPLE 7

A Matières et Procédés -1 Préparation d'échantillons de protéine:

On prépare des fantômes d'érythrocyte comme dé-

crit par Fairbanks, G, Steck, T L et Wallach, D F H.

( 1971) Biochemistry 10: 2606-2617, à partir de sang ac-

cumulé dans la cavité pleurale après perforation cardiaque de souris CD 1 anesthesiées Des homogénats de cortex de cerveau de bovin sont préparés comme décrit par De Camilli, P., Ueda, T, Bloom, F E Battenerg, E, et Greengard, P.

( 1979) Proc Natl Acad Sci U S A: 76 5977-5981 On pro-

cède au marquage radioactif à l'iode de standards de protéi-

ne, de protéine A, et de concanavaline A, avec 1,3,4,6-té-

trachloro-3 a,6 a-diphénylglycolurile, comme décrit par Fraker,P J et Spek, J C ( 1978) Biochem Biophys Res.

Commun: 80, 849-857, sauf en ce que les protéines sont dis-

soutes dans une solution saline tamponnée au phosphate ( 1 mg/ml) L'iode 125 libre est séparée des protéines

marquées à l'iode 125, sur une colonne de 5 ml de Bio-

Gel P-2 ou sur une colonne de 0,4 ml de AG-1-X 8 Les ac-

tivités spécifiques obtenues de façon courante sont com-

prises entre 106 et 107 cpm par Fg de protéine.

2 Electrophorèse de gel de polyacrylamide.

Les échantillons de protéine sont solubilisés

dans une solution tampon contenant (concentrations fina-

les) 2 % (poids/volume) de dodécylsulfate de sodium, 2 % (volume/volume) de P -mercaptoéthanol, 10 % (volume/volume) de glycérol, 0,1 % (poids/volume) de bleu de bromophénol

et 100 m M de Tris-HC 1, à un p H de 6,8 On fait bouillir -

les échantillons dans ce mélange pendant 3 minutes puis on procède à leur résolution, suivant le système de Laemmli -lLaemmli, U K ( 1970) Nature (London): 227, 680-685 l sur

des plaques de gels à 10 % de polyacrylamide.

3 Transfert électrophorétique.

Après achèvement de l'électrophorèse, le gel

(ou des parties du gel) est placé sur un tampon de récu-

rage Scotch-Brite mouillé et sa surface est rincée avec un tampon de transfert refroidi ( 8 à 10 C) comprenant ,6 m M Tris-120 m M glycine, à un p H de 8,3, avec ou sans méthanol à 20 % (volume/volume) On essaie également une composition contenant 41 m M Tris-40 m M acide borique, à un p H de 8,3 On ne remarque pas de différence sensible entre les deux compositions de tampon La membrane microporeuse modifiée cationiquement de l'exemple 2 (appelée dans ce

qui suit "MMCM") ou la nitrocellulose (toutes deux généri-

quement appelées, dans ce qui suit, matrices d'immobilisa-

tion "MI") sont ensuite mouillées par flottation sur la solution tampon de transfert et placées sur le gel, en s' assurant qu'il n'y a pas de bulles d'air emprisonnées dans

la matrice d'immobilisation ou entre celle-ci et le gel.

La matrice d'immobilisation est alors recouverte d'un deu-

xième tampon de récurage Scotch-Brite Une pluralité de

tels ensembles gel-Ml, séparés par des tampons Scotch-

Brite, peuvent être montés en séquence pour des trans-

ferts simultanés L'ensemble est placé entre des grilles en matière plastique qui sont ensuite insérées à frot- tement doux, la membrane d'immobilisation étant située

vers l'anode, dans une cuve en plexiglass contenant 4 li-

tres de solution tampon de transfert refroidie Des élec-

trodes en platine, de configuration semblable à celle qui est décrite par Bittner et autres, Anal Biochem. ( 1980): 102, 459-471, sont fixées aux parois larges de la cuve Avec une distance de 8 cm entre l'anode et la cathode, le champ électrique engendré pendant le transfert électrophorétique s'avère homogène Pendant le transfert, la composition tampon varie puisque des sels sont élués des gels et, par suite, l'intensité du courant augmente lorsque la tension est maintenue constante Du fait qu'on

utilise une source d'alimentation normalisée (Buchler Modè-

le 3-1500), on trouve parfois plus pratique d'effectuer le transfert à intensité constante ( 200 m A) et de laisser la

tension diminuer progressivement Dans un transfert carac-

téristique d'une durée de 2 heures, la tension tombe, par exemple, de 42 V à 30 V La variation de tension pourrait

être évitée par équilibrage préalable des gels avec la so-

lution tampon de transfert Cette méthode pourrait égale-

ment éviter le gonflement du gel pendant le transfert,

qui est un phénomène courant pour des concentrations d'a-

crylamide supérieures ou égales à 10 % Les membranes d'im-

mobilisation peuvent être utilisées immédiatement après le

transfert,ou séchées et stockées entre des feuilles de pa-

pier chromatographique Whatman 3 MM Dans des essais dans lesquels le transfert de protéine marquée à l'iode 125

est quantifié, à la fois les gels et les membranes d'immo-

bilisation sont auto-radiographiés après le transfert,avec d 3

utilisation d'un film Kodak XAR-5 et/un écran de renforce-

ment Du Pont Cronex Lightning Plus, à -700 C Les bandes

radioactives sont excisées des gels et des membranes d'im-

mobilisationet comptées dans un compteur Beckman Biogamma II. 4 Traitement de transferts avec des anti-

corps et des lectines.

Pour empocher la liaison de fond non spécifi-

que, les membranes d'immobilisation doivent être inacti-

vées Pour la nitrocellulose, il suffit de faire incuber les filtres à température ambiante pendant une heure dans m M de solution saline tamponnée au phosphate, à un p H de 7,4, contenant 2 % (poids/volume) d'albumine de sérum bovin ou 1 % (poids/volume) d'hémoglobine L'incubation de membranes d'immobilisation du type membrane microporeuse à charge modifiée, dans une solution saline tamponnée au phosphate, contenant 10 % d'albumine de sérum bovin ou 1 %

d'hémoglobine, pendant 12 heures à 45-50 C, s'avère satis-

faisante pour l'inactivation On fait réagir les membranes d'immobilisation inactivées avec les ligands correspondants (par exemple anticorps, protéine A, lectines) pendant une heure,à température ambiante, dans une-solution tamponnée au phosphate contenant 2 % d'albumine de sérum bovin ou 1 % d'hémoglobine,puis on les lave au moins 5 fois dans 50 à ml de solution saline tamponnée au phosphate, à raison

de 20 minutes pour chaque lavage Toutes les solutions u-

tilisées dans la procédure de recouvrement contiennent de l'azide de sodium ( 0,05 % en poids/volume) Les membranes d'immobilisation lavées sont auto-radiographiées à -70 C,

comme décrit plus haut.

B Résultats 1 Liaison de macromolécule aux membranes d'immobilisation. (a) On effectue des essais de liaison pour

comparer la capacité d'adsorption d'albumine de sérum bo-

vin marquée à l'iode 125 des membranes d'immobilisation.

On fait incuber des carrés de membrane d'immobilisation,

pendant une heure,dans des solutions de concentration dif-

férente d'albumine de sérum bovin marquée à l'iode 125

( 0,01 à 5 % en poids/volume dans une solution saline tam-

ponnée au phosphate) Chaque échantillon du milieu d'in-

cubation contient une quantité égale de traceur de l'albu-

mine de sérum bovin marquée à l'iode 125 ( 177 000 6 100 cpm ml-1; quantité estimée 180 ng ml 1) Après incubation, les membranes d'immobilisation sont lavées cinq fois avec

5 ml de solution saline tamponnée au phosphate et comptées.

Les résultats de comptage sont transformés en quantités

d'albumine de sérum bovin liée (gg cm 2).

La capacité de la membrane microporeuse à charge modifiée à lier l'albumine de sérum bovin(ou ASB)

est notablement plus grande que celle de la nitrocellulose.

Cela est particulièrement net lorsqu'on utilise des concen-

trations élevées en ASB Par exemple, pour une concentra-

tion de 5 % en ASB, les membranes d'immobilisation lient

-2 -2

respectivement 480 gg cm 2 et 80 gg cm Ces résultats

apparaissent sur la figure 1,sur laquelle la membrane mi-

croporeuse à charge modifiée est représentée par O et la nitrocellulose par O. (b) On fait incuber des morceaux de 1 cm 2 de membrane microporeuse à charge modifiée, de nitrocellulose, de nylon non modifié et de la membrane de l'exemple 5, dans des concentrations différentes d'hémoglobine ( O à 5 % dans une solution saline tamponnée au phosphate) ou d'ASB

( O à 10 % dans une solution saline tamponnée au phosphate).

On fait incuber chaque filtre dans 1 ml et il est mis en

rotation pendant 2 heures à une température ambiante.

On ajoute ensuite à chaque réceptacle 50 Al d'un mélange de protéines marquées à l'iode 125 ( 50 gl = 5 000 cpm Ig A; 000 cpm de calmoduline; 5 000 cpm d'A 53) Les filtres sont ainsi incubés une heure à 25 C puis lavés 5 fois dans

1 ml de solution saline tamponnée au phosphate et comptés.

Le fond ( 85 cpm) est soustrait des résultats,qui sont re-

portés ensuite sur la figure la (ASB) et lb (hémoglobine).

On constate, par exemple,qu'à 1 % d'ASB, le signal de pro-

téine radioactive liée est réduit de 98 %, 48 %, 94 % et 77 % lorsqu'on utilise la nitrocellulose, la membrane micropo-

reuse à charge modifiée, le nylon non chargé et-la membra-

ne de l'exemple 5, respectivement Les membranes d'immo-

bilisation non inactivées sont ensuite lavées pendant 2

heures environ dans du Triton X-100 à 1 %, qui est un d tergent non ionique, pour déterminer la quantité de pro-

téine radioactive pouvant être enlevée On trouve que 40 % sont enlevés de la membrane microporeuse à charge modifiée, environ 80 % de la membrane d'immobilisation de l'exemple , 92 % de la membrane non chargée et 92 % de la nitrocellu-

lose Ces résultats prouvent la contribution de la modifi-

cation de charge à l'interaction des protéines avec les

membranes d'immobilisation.

(c) Quatre carrés de 2 cm 2 de membranes d'im-

mobilisation sont tachés avec 50 000 cpm de 3 -globine m ARN humaine transcrite in vitro et marquée au phosphore 32 (Kole et Weissman, Nucleic Acid Research, 10: 5429 ( 1982), puis lavés avec une solution saline tamponnée au

phosphate jusqu'à ce que les comptes dans le lavage attei-

gnent la valeur de fond On mesure alors la quantité de

m ARN marqué qui est liée aux filtres Les carrés de nitro-

* cellulose du commerce et d'acétate de cellulose lient moins de 100 cpm, tandis que les deux membranes microporeuses à charge modifiée ( 0,45 et 0, 2 Dm de porosité) lient environ

000 cpm.

2 Transfert électrophorétique de protéines

de gels à des filtres.

On procède à un essai des membranes d'immobi-

lisation dans un transfert électrophorétique (une heure à volts) d'ASB marquée à l'iode 125 ( 200 ng environ), dans des conditions de liquide tampon semblables à celles qui sont décrites par Towbin et autres, c'està-dire 15,6 m M

de Tris, 120 m M de glycine, 20 % (volume/volume) de métha-

nol, à un p H de 8,3 Lorsque le méthanol est supprimé du tampon de transfert, l'élution augmente de 30 % à plus de 60 % et à 50 % environ de la charge,lorsqu'on utilise la

membrane microporeuse à charge modifiée et la nitrocellu-

lose, respectivement Toutefois, en l'absence de méthanol, l'ASB marquée à l'iode 125 traverse au moins cinq couches de nitrocellulose, sur lesquelles elle est détectée en

quantités décroissantes, par exemple de 15 à 8 % de la char-

ge, tandis que la plus grande partie de l'ASB marquée à l'iode 125 (plus de 60 % de la charge) peut être retenue

sur le premier filtre à membrane microporeuse à charge mo-

difiée, moins de 1 % étant détecté sur chaque filtre sui-

vant On obtient des résultats analogues avec d'autres types de protéines, par exemple phosphorylase b, fétuine, ovalbumine, anhydrase carbonique et inhibiteur de trypsine de soja Une analyse détaillée d'un essai représentatif, dans lequel de i'ASB marquee à l'iode 125 est transférée en l'absence de méthanol, est illustrée par les figures

2 à 4.

La figure 2 illustre quantitativement le trans-

fert de valeurs variables d'ASB marquée à l'iode 125, à une

membrane microporeuse à charge modifiée ou à la nitrocellu-

lose Des reproductions de quatre concentrations croissan-

tes d'ASB marquée à l'iode 125 (estimées à 150, 300, 514 et 1400 ng) sont appliquées sur un gel de dodécylsulfate de

sodium à 10 %-polyacrylamide Après électrophorèse, une sé-

rie de bandes sont transférées à 8 couches successives de MMCM ( ;, â%) et les autres à 10 couches successives de nitrocellulose ( O, O,) A la fin du transfert

(deux heures dans Tris-acide borique, à p H 8,3,sans métha-

nol, sous tension constante de 32 V), on compte les gels et les membranes d'immobilisation La quantité d'ASB éluée de chaque bande de gel ( O, O) est déterminée par calcul

Z 540629

de la différence entre la radioactivité chargée et la ra-

dioactivité restant dans le gel correspondant, après trans-

f ert L'ASB non prise en compte ( zl, Aà) est la diffé-

rence calculée entre la radioactivité éluée de chaque gel et la radioactivité récupérée sur les filtres correspon-

dants de MMCM ou de nitrocellulose ( E, U)-.

La figure 3 indique les quantités d'ASB mar-

quée à l'iode 125 sur 8 filtres de MMCM ( O) ou 10 fil-

tres de nitrocellulose ( O),pour la charge maximale d' ASB ( 1 400 ng) utilisée La flèche 1 indique la quantité

totale récupérée sur 8 couches de MMCM La flèche 2 indi-

que la quantité totale récupérée sur 10 couches de nitro-

cellulose. La figure 4 illustre la comparaison de la

récupération d'ASB sur le premier filtre à membrane micro-

poreuse à charge modifiée, la première couche de nitro-

cellulose et les 10 couches successives de nitrocellulose.

Les résultats obtenus dans l'essai illustré par la figure

2 sont rapportés à la quantité d'ASB récupérée sur la to-

talité des 8 couches de MMCM,pour chaque concentration en ASB Cette valeur est prise comme récupération à 100 % On voit que,pour les trois concentrations inférieures en ASB, la première couche de MMCM (hachures) adsorbe autant ou

plus que la totalité des 10 couches de nitrocellulose (ha-

chures croisées) Dans tous les cas, la quantité d'ASB ré-

cupérée sur la première couche de MMCM est beaucoup plus grande (environ 4 fois) que celle qui est récupérée sur le

premier filtre de nitrocellulose (pointillés).

Les figures 2, 3 et 4 montrent que (i) plus de 80 % de la protéine chargée sur le gel peuvent être pris en compte lorsqu'on utilise une ou deux couches de MMCM

(figures 2 et 3); (ii) 80 % (à faible charge) à 50 % (à for-

te charge) de l'ASB liée à la membrane d'immobilisation sont récupérés sur la première couche de MMCM (figure 4) et (iii) l'utilisation de plus de 3 couches de MMCM ne

semble pas améliorer le degré de récupération (figure 3).

On n'obtient pas de résultats semblables même lorsqu'on utilise 10 couches de nitrocellulose (figures 2 à 4) L' ASB marquée à l'iode 125 qui n'est pas prise en compte (probablement perdue dans le liquide tampon) s'élève à plus de 25 % de la charge lorsqu'on utilise la nitrocellu- lose et est inférieure ou égale à 15 % dans le cas d'une

membrane microporeuse à charge modifiée.

3 Rétention de protéines transférées sur des filtres. Une fois adsorbée sur une membrane microporeuse

à charge modifiée, la protéine est très bien retenue, com-

me le montrent les résultats des essais ci-après L'ASB marquée à l'iode 125, appliquée sur un gel dodécylsulfate

de sodium-polyacrylamide, est transférée électrophorétique-

ment à une membrane microporeuse à charge modifiée ou à la

nitrocellulose Après transfert, les membranes d'immobili-

sation sont incubées dans l'une des conditions suivantes:

(i) 15 minutes dans 0,5 % de glutaraldéhyde dans une solu-

tion saline tamponnée au phosphate, (ii) 1 heure dans 25 % d'isopropanol10 % d'acide acétique, et (iii) 1 heure dans une solution saline tamponnée au phosphate seule Ensuite, les membranes d'immobilisation sont rincées plusieurs fois

dans une solution saline tamponnée au phosphate puis la-

vées pendant une nuit dans 0,1 % de triton X-100 dans une

solution saline tamponnée au phosphate La quantité de mar-

queur sur chaque membrane d'immobilisation est déterminée après transfert et lavage -au détergent Dans le cas de la nitrocellulose, on trouve que 80 % de l'ASB marquée à l'iode

sont entraînés par lavage des membranes d'immobilisa-

tion non fixées Bien que les résultats soient variables, des comptes au moins 1,5 à 2 fois plus grands peuvent être retenus sur de telles membranes d'immobilisation, après

les traitements au glutaraldéhyde ou à l'acide et à l'al-

cool Lorsqu'on utilise une MMCM, plus de 65 % des comptes initiaux sont retenus en l'absence de toute fixation et la fixation porte cette valeur à plus de 90 % O En outre, la rétention de la protéine sur la membrane microporeuse à charge modifiée ne semble pratiquement pas affectée par la variation du p H (allant de 2,0 à 8,3) des solutions de lavage.

4 Recouvrement de transferts.

Avant de pouvoir procéder à un recouvrement d'un

motif transféré, les sites de liaison potentielle rési-

duels sur le filtre doivent être inactivés pour minimiser le fond non spécifique Une membrane microporeuse à charge modifiée est effectivement inactivée par incubation dans

de l'ASB à 10 % dans une solution saline tamponnée au phos-

phate,pendant une nuit à 45-50 C Une température plus basse (par exemple 37 C), des concentrations inférieures en ASB ou des durées d'incubation plus courtes du filtre avec la solution ci-dessus à 50 C ont pour conséquence un fond trop fort et inacceptable dans les recouvrements, lorsque ces substances sont utilisées L'hémoglobine ( 1 % dans une solution tamponnée au phosphate à 45-50 C) est également efficace pour l'inactivation de transferts de MMCM. Des recouvrements de motifs de protéine sont transférés à une membrane microporeuse à charge modifiée

ou à la nitrocellulose, avec des anticorps ou des lecti-

nes En particulier, des parties aliquotes d'homogénats de

cortex de cerveau de bovin (de 25 gg chacune) sont réso-

lues sur un gel de dodécylsulfate de sodium à 10 %-polyacry-

lamide et transférées électrophorétiquement à une MMCM ou à la nitrocellulose,pendant deux heuresdans un tampon de

Tris-glycine,à 200 m A Après inactivation avec de l'albu-

mine de sérum bovin, les membranes d'immobilisation sont recouvertes pendant une heure avec un sérum de lapin dilué ( 1/300) contenant une anti-protéine I (synapsine), lavées puis incubées avec une protéine A marquée à l'iode 125 ( 106 cpm au total) pendant une heure, lavées à nouveau puis autoradiographiées On applique la même procédure à des parties aliquotes de fantômes érythocytiques de murine

(de 25 Fg chacune), les filtres étant inactivés à l'hémo-

globine et la concanavaline A marquée à l'iode 125 ( 5 x 105 cpm au total) étant utilisée comme indicateur La

plus grande capacité de liaison de la membrane micropo-

reuse à charge modifiée, par rapport à la nitrocellulose, rend ces procédés plus sensibles lorsqu'on utilise une MMCM.

La spécificité de liaison de la lectine est vé-

rifiée au moyen d'haptènes appropriés Dans le cas des auto-radiographies de la concanavaline A marquée à l'iode

, par exemple, la radioactivité nette liée aux membra-

nes d'immobilisation respectives est déterminée par déduc-

tion, à partir des comptes totaux, des comptes de fond me-

surés sur les parties inférieures des bandes Le signal

net sur MDMCM est 1,6 fois plus grand que sur nitrocellulo-

se Un premier lavage dans une solution tamponnée au phos-

phate contenant 100 m M de î -méthyl-glucoside élimine 82 %

et 76 % du signal de M 4 CM et nitrocellulose, respectivement.

Un deuxième lavage dans une solution saline tamponnée au phosphate contenant 100 m M de v-méthylmannoside augmente

l'élimination à 90 % pour MMCM et 84 % pour la nitrocellulo-

se.

Le récepteur d'acétylcholine a également été ana-

lysé par transfert de protéine Des organo-membranes élec-

triques, préparées selon Torpedo, sont appliquées à 4 C sur des gels de polyacrylamide contenant du dodécylsulfate

de lithium Les électrophorétogrammes sont électrotransfé-

rés à des membranes microporeuses à charge modifiée qui sont ensuite inactivées à l'hémoglobine et recouvertes avec une c -bungarotoxine marquée à l'iode 125 Seule,la sous-unité i du récepteur est liée à la toxine Cette liaison peut être en concurrence avec 1 ' o -bungarotoxine

non radioactive et la tubocurarine, qui est un autre anta-

goniste d'acétylcholine.

Il est entendu que des modifications de détail peuvent être apportées dans la forme et la mise en oeuvre du produit et du procédé suivant l'invention, sans sortir du cadre de celle-ci.

Claims (12)

Revendications

1 Produit comprenant un substrat chromatographi-

que qui porte sur une de ses surfaces une matrice d'immo-

bilisation, caractérisé en ce que la matrice d'immobili-

sation est une membrane microporeuse hydrophile à charge modifiée, constituée d'une membrane microporeuse organi- que comportant une quantité modificatrice de charge d'un

agent de modification de charge cationique lié à sensible-

ment toutes les surfaces mouillées de la dite membrane.

2 Produit suivant la revendication 1, caractérisé

en ce que la membrane microporeuse organique est hydro-

phile. 3 Produit suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la membrane microporeuse en polymère organique

hydrophile est un ester de cellulose.

4 Produit suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la membrane microporeuse en polymère organique

hydrophile est un polyamide.

Produit suivant la revendication 2, caractérisé

en ce que l'agent de modification de charge est un poly-

mère organique, soluble dans l'eau, de poids moléculaire supérieur à 1 000 environ, dont chaque monomère comprend au moins un groupe époxyde capable de liaison avec la

surface de la membrane et au moins un groupe amine ter-

tiaire ou ammonium quaternaire.

6 Produit suivant la revendication 5, caractérisé en ce que le polymère organique soluble dans l'eau est

une résine polyamido-polyamine épichlorhydrine, ce poly-

mère comprenant de préférence des unités monomères ré-

pétitives de formule CH 2

CH.2 CH 2

\+/ N f 1

CH 3 CH CH-CH

32

7 Produit suivant la revendication 6, caractérisé en ce que la membrane est un polyhéxaméthylène adipamide, le substrat étant de préférence un gel d'électrophorèse

qui est de préférence un polyacrylamide.

8 Produit suivant la revendication 5, caractérisé en ce qu'une partie des groupes époxy de l'agent polymère organique de modification de charge sont liés à un agent secondaire de modification de charge choisi dans le groupe composé de: (i) amines aliphatiques comportant au moins un groupe amino primaire ou au moins deux groupes amino secondaires; et (ii) amines aliphatiques comportant-au moins un groupe amino secondaire et un substituant carboxyle ou hydroxyle,

l'agent secondaire de modification de charge étant de pré-

férence la tétraéthylène pentamine et le substrat étant

de préférence un gel d'électrophorèse.

9 Produit suivant la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent de modification de charge est choisi dans le groupe composé de: (i) amines aliphatiques comportant au moins un groupe amino primaire ou au moins deux groupes amino secondaires; et

(ii) amines aliphatiques comportant au moins un grou-

pe amino secondaire et un substituant carboxyle ou hy-

droxyle, et en ce que l'agent de modification de charge

est lié à la structure de membrane microporeuse par l'in-

termédiaire d'un agent polyépoxyde aliphatique de réticu-

lation de poids moléculaire inférieur à 500 environ, ce polyépoxyde étant de préférence 1,4-butanediol diglycidal

éther, l'agent de modification de charge étant de préfé-

rence la tétraéthylène pentamine et le substrat étant de

préférence un gel d'électrophorèse.

10 Produit suivant la revendication 4, caractérisé

en ce que la membrane a une dimension de pore de 0,05 mi-

cron environ à 1,2 micron environ.

11 Procédé pour le transfert de macromolécules d'un substrat chromatographique à une matrice d'immobilisation, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser comme matrice une membrane microporeuse hydrophile à charge modifiée constituée d'une membrane microporeuse organique portant

une quantité modificatrice de charge d'un agent de modifi-

cation de charge cationique lié Sensiblement à toutes les

surfaces mouillées de la membrane, suivant l'une quelcon-

que des revendications 1 à 10.

12 Procédé suivant la revendication 11, caractérisé

en ce que la protéine transférée est incubée avec un li-

gand, la membrane microporeuse à charge modifiée étant de préférence inactivée après transfert de la protéine et avant incubation avec le ligand, l'inactivation étant de préférence effectuée par incubation de la membrane avec de

l'albumine de sérum bovin ou de l'hémoglobine à températu-

re élevée.

13 Procédé suivant la revendication 11, caractérisé

en ce que le transfert est effectué par électro-élution.

14 Procédé de titrage en phase solide, dans lequel une macromolécule est immobilisée dans la phase solide,

caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser comme phase so-

lide une membrane microporeuse hydrophile à charge modi-

fiée constituée d'une membrane microporeuse organique por-

tant une quantité modificatrice de charge d'un agent de

modification de charge cationique lié à sensiblement tou-

tes les surfaces mouillées de la membrane, suivant une

quelconque des revendications 1 à 10.