FI95146B - Menetelmä hylkimistä vastustavan proteiinin PP15 tai sen immunogeenisen osan valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä hylkimistä vastustavan proteiinin PP15 tai sen immunogeenisen osan valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI95146B FI95146B FI891249A FI891249A FI95146B FI 95146 B FI95146 B FI 95146B FI 891249 A FI891249 A FI 891249A FI 891249 A FI891249 A FI 891249A FI 95146 B FI95146 B FI 95146B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- cdna
- ecori
- protein
- placental
- dna
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4715—Pregnancy proteins, e.g. placenta proteins, alpha-feto-protein, pregnancy specific beta glycoprotein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
95146 *
Menetelmä hylkimistä vastustavan proteiinin PP15 tai sen immunogeenisen osan valmistamiseksi
Keksintö koskee menetelmää hylkimistä vastustavan 5 proteiinin PP15 tai sen immunogeenisen osan valmistamiseksi. Immuunisuppressiivisesti eli hylkimistä vastustavana toimiva proteiini PP15 on kuvattu seuraavin parametrein patenttijulkaisussa DE-A 2 952 792 (US-A 4 348 316): a) hiilihydraattimäärä 3,35 ± 0,9 %, joka koostuu 10 heksooseista 2,8 ± 0,5 %, heksoosiamiineista 0,3 ± 0,2 %, fukoosista 0,05 ± 0,05 % ja neuramiinihaposta 0,20 ± 0,15 %, b) sedimentaatiokerroin SMw0 2,9 ± 0,2 S, c) ultrasentrifugissa määritelty molekyylipaino 30 15 700 ± 3 200 (dimeeri), d) ekstinktiokerroin E,,»1 * (280 nm) 14,2 ± 1,0 ja e) elektroforeettinen liikkuvuus albumiinin alueella samoin kuin f) isoelektrinen piste 4,4 ± 0,1, C t f.
20 g) aminohappokoostumuksella Jäännöksiä 100 Variaatio-jäännöstä kerroin
Aminohappo kohti (mol %) (%)_ . Lysiini 4,74 3,30 • 25 Histidiini 3,81 5,43
Arginiini 1,62 3,43
Asparagiinihappo 13,39 5,08
Treoniini 3,85 5,35
Seriini 6,38 2,81 . 30 Glutamiinihappo 13,43 5,32
Proliini 4,35 14,25
Glysiini 6,87 2,13
Alaniini 6,51 8,26
Kystiini 1/2 2,48 4,55 35 Väliini 2,29 15,67 2 95146
Metioniini 2,87 10,86
Isoleusiini 8,39 8,18
Leusiini 8,18 6,72
Tyrosiini 2,09 8,49 5 Fenyylialaniini 6,27 2,27
Tryptofaani 2,51 6,81
Molekyylipainon määritys SDS-polyakryyliamidigee-lielektroforeesin avulla antoi molekyylipainoksi noin 10 15 000 d (monomeeri).
Tämän proteiinin geenitekninen valmistus on erit täin toivottavaa koska se on hylkimistä vastustavien ominaisuukseensa takia tullut terapeuttisen ja diagnostisen kiinnostuksen kohteeksi. Keksintö koskee siten menetelmää 15 PP15:n valmistamiseksi geeniteknisesti. Kuvataan myös tähän vaadittavaa mRNA:ta, siitä saatua cDNA:ta, tämän cDNA-:n kokonaan tai osittain sisältävät DNA-rakenteet ja vektorit, sellaisella DNA:11a transformoidut solut, näistä soluista ekspressoituvan polypeptidin ja sen käytön lääke-20 aineena. Lisäksi esitetään PP15:n aminohapposekvenssi samoin kuin aminohapposekvenssin osasekvenssi, sen avulla saadut spesifiset vasta-aineet, vasta-aineista valmistetut diagnostiset reagenssit ja vasta-ainepylväät samoin kuin pylväiden avulla saatu polypeptidi. Keksinnön eräs lisä-• 25 muodostelma koskee diagnostisia reagensseja, jotka sisäl tävät kokonaan tai osittain PP15:tä koodaavan tai sen komplementaarisen DNA:n tai RNA:n ja diagnostisia menetelmiä, joilla tutkitaan kehonnesteitä ja kudoksia näiden diagnostisten reagenssien avulla. Keksinnön muita näkökohtia va-. . 30 laistaan lähemmin seuraavassa tai määritetään patenttivaa- " timuksissa.
Ensin yritettiin spesifisten PP15:tä vastaan suunnattujen vasta-aineiden avulla kaupallisesti saatavissa olevassa cDNA-ekspressoitumispankissa, joka on ihmisen 35 kypsän istukan mRNA:sta (Fa. Genofit, Heidelberg), osoit-
II
95146 3 taa klooneja, jotka ekspressoivat PP15:tä. Koska oli tunnettua, että PP15 vaikuttaa hylkimistä vastustavasti, niin muodoin spesifiset vasta-aineet olivat vain huonosti, jos ylipäänsä lainkaan valmistettavissa, valmistettiin spesi-5 fisiä vasta-aineita osapeptidejä vastaan.
Sen vuoksi hajotettiin proteiini PP15 spesifisiin fragmentteihin leikkaamalla bromisyaanilla, trypsiinillä tai proteinaasi V8:lla, jotka fragmentit sekvenssoitiin myöhemmin. Saatiin seuraavat fragmentit:
10 (A) MVVGQLKADEDPIMGFHQMF
(B) FRLALHNFG
(C) VSVYAEAAER
(D) L S S L P F Q K I Q (H)
(E) FDNDRTQLGAIYIDAS-LT-E
15 (F) LLKNINDAWT
Peptidit A, B ja C syntetisoitiin yleisesti tunnettujen menetelmien avulla ja tuotettiin spesifisiä vasta-aineita kaneissa tavallisten menetelmien mukaan. Yllä mainitussa cDNA-ekspressoitumispankissa, joka sisälsi >1 x 106 20 rekombinoitunutta Lambda gtll-kloonia, ei onnistuttu paikallistamaan positiivisia klooneja. Peptidi A:ta ja B:tä vastaan suunnatut vasta-aineet saostivat tällöin kontrol-likokeessa PP15:n, kun taas vasta-aineet peptidi C:tä vastaan eivät reagoineet. Kuten myöhemmin tuli ilmi, peptidi • 25 C ei myöskään sisälly seuraavaksi cDNA-sekvenssistä joh dettuun PP15-proteiinisekvenssiin, joten se täytyy todennäköisesti rinnastaa PP15:n seuralaisproteiiniin.
Sen jälkeen valittiin PP15-oligopeptidi A:ta koo-daavista oligonukleotideistä PP15-oligonukleotidi-103 30
5'ATGGTGGTGG GCCAGCTGAA GGCTGATGAG GACCCC, vastaavasti oligopeptidi E:stä PP15-oligonukleotidi-140 35 5'TTTGACAATG ACCGGACCCA GCTGGGCGCC ATCTACATTG ATGC
4 95146 ja oligopeptidi F:stä 64-kertaisesti degeneroitunut PP15-oligonukleotidi-139
5'AAAAATATTAATGATGCCTGGAC 5 G C C C C
A
R. Lathen [J. Mol. Biol. (1985) 183, 1 - 12] tilastollisten tietojen perusteella.
10 Näiden oligonukleotidikoettimien avulla tehtiin cDNA-pankille, joka oli valmistettu ihmisen kypsän istukan mRNA:sta, screening. Ensin eristettiin istukasta mRNA ja siitä valmistettiin cDNA. Tämä varustettiin EcoRI-päillä ja ligoitiin faagivektori Lambda gtl0:n EcoRI-leikkauskoh-15 tiin. Osoitettiin 2 kloonia (PP15-24 ja PP15-28), joissa oli PPl5:n koko cDNA. DNA:n sekvenssointi tapahtui sinänsä tunnetuilla menetelmillä; PP15:n täydellinen cDNA-sekvens-si (koodaava juoste) esitetään taulukossa 1. cDNA on 894 emäsparia (bp) pitkä, sillä on 5'-päässä 99 emäsparin ei-20 translatoitu sekvenssi, sillä on 381 emäsparin avoin luku-kehys ja jättää 3'-päässä 414 emäsparia, kahdeksan emäspo-ly (A):ta mukaanlukien, translatoimatta.
Taulukossa 1 ovat nukleotidikoetinkohdat allevii-. vaarnalla merkitty, lisäksi aminohapposekvenssi on merkit- • 25 ty.
Keksinnön mukaisesti voidaan koodaavaa cDNA:ta käyttää sopivan ekspressoitumissysteemin avulla ekspres-soimaan PP15:tä. Isännän valinnalla voidaan vielä vaikuttaa PP15:n modifiointiin. Niinpä bakteereissa ei tapahdu 30 glykosylaatiota ja hiivasoluissa tapahtuu toisenlainen glykosylaatio kuin korkeammissa eukaryoottisissa soluissa.
Kun tiedetään PP15:n aminohapposekvenssi, on mahdollista valmistaa tavanomaisilla tai geeniteknisillä menetelmillä aminohappo-osasekvenssejä, jotka voivat toimia il 5 95146 TAULUKKO 1 10 30 50 GGAAGGGACAGTCGGCCGCAGACCGCGCTGGGTTGCCGCTGCCGCTGCCGCCATCGTGCC 70 90 110
5 AGCCCCTCGGGTCTCCGTGAGGCCGGGTGACGCTCCAGAATGGGAGACAAGCCAATTTGG
M G D K P I W
130 150 170
GAGCAGATTGGATCCAGCTTCATTCAACATTACTACCAGTTATTTGATAATGATAGAACC
EQIGSSFIQHYYQLFDNDRT
10 190 210 230
CAACTAGGCGCAATTTACATTGACGCGTCATGCCTTACGTGGGAAGGACAACAGTTCCAG
QLGAIYIDASCLTWEGQQFQ
250 270 290 GGGAAAGCTGCCATTGTGGAGAAGTTGTCTAGCCTTCCGTTCCAGAAAATTCAGCACAGC 15
GKAAIVEKLSSLPFQKIQHS
310 330 350
ATCACCGCGCAGGACCATCAGCCCACTCCAGATAGCTGCATCATCAGCATGGTTGTGGGC
I TAQDHQPTPDSCI I SMVVG
20 370 390 410
CAGCTTAAGGCGGATGAAGACCCCATCATGGGGTTCCACCAGATGTTCCTATTAAAGAAC
QLKADEDPIMGFHQMFL'LKN
430 450 470
ATCAACGATGCTTGGGTTTGCACCAATGACATGTTCAGGCTCGCCCTGCACAACTTTGGC
25 INDAWVCTNDMFRLALHNFG
490 510 530 TGACCTCCTCTCAGCTAGGCACTCACGCTGTTTCCTCCTCCCTCCTCTTCCCAATACTAT 550 570 590 TCCCACTCCTCCAGATGCTCCAAATATCATGCACAAATGAGCAGGGCCGCGGTGGGAGTG 610 630 650 on GGCGCAGTGCGCTGCTGCCACTGAGGTGTTGTGCATGATGTTTGGATGCTAGACTAGTTG 670 690 710 CATCTGACGGGAGAAGTTTGTGTTGTACCAGCGCATGCCTTGGAAAGACTTAAGTAATGC 730 750 770 AAAAGGTTGTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAATCTACTGACAAGTTGCTCTAGTAA 790 810 830 C C CAAAGAAGTGAAGGAGAAAGCAGCTGC CT CAC CGC CCAGACATTGATTTGTTCAGATG 850 870 890
35 TTTCAATGCCTCATGATACAATAAAACCACAAAAATTTTCTTAACAAAAAAAAA
95146 6 antigeeneinä polyklonaalisten tai monoklonaalisten vasta-aineiden valmistuksessa. Sellaiset vasta-aineet ovat käyttökelpoiset sekä diagnostisiin tarkoituksiin että myös vasta-ainepylväiden valmistamiseen, jonka avulla PP15 voi-5 daan erottaa liuoksista, jotka sisältävät sitä muiden proteiinien rinnalla.
cDNA:n tai sen osien avulla voidaan myös yksinkertaisella tavalla eristää geenipankista PP15:tä koodaava genominen klooni, jonka avulla ei ainoastaan ekspressoi-10 tuminen eukaryoottisissa soluissa helpotu, vaan myös muita diagnostisia lausuntoja voidaan antaa.
Keksintöä on lisäksi määritetty patenttivaatimuksissa ja esitetty edelleen seuraavissa esimerkeissä.
Mikäli tekstissä ei ole selitetty, käytetään seu-15 raavia lyhenteitä.
EDTA = natriummetyleenidiamiinitetra-asetaatti SDS = natriumdodekyylisulfaatti DTT - ditiotreitoli BSA - naudan seerumin albumiinia 20 Esimerkki 1 RNA:n eristys ihmisen istukasta RNA saatiin kypsästä ihmisen istukasta [Chirgwin et ai. mukaan, Biochemistry 18 (1979) 5294 - 5299]. Noin 10 g . istukkakudosta murskattiin nestemäisessä typessä, suspen- • 25 doitiin 80 ml:aan 4 M guanidiiniumtiosyanaattia, jossa oli 0,1 M merkaptaanietanolia, ja käsiteltiin 90 sek. 20 000 rpm homogenisaattorissa (Ultraturrax). Lysaattia sentrifu-goitiin 15 min. 7 000 rpm (Sorvall-GSA -roottori) ja su-pernatantti saostettiin 2 ml:11a 1 M etikkahappoa ja 60 30 ml:11a abs. etanolia -20 °C:ssa yön yli. Kun nukleiinihap-po oli sedimentoitu 6 000 rpm:ssä ja -10 °C:ssa 10 min., se liuotettiin täydellisesti 40 ml:aan 7,5 M guanidiinium-hydrokloridia (pH 7,0) ja saostettiin seoksella, jossa oli 1 ίηΐ 1 M etikkahappoa ja 20 ml abs. etanolia. DNA:n erot-35 tamiseksi toistettiin seostaminen toisen kerran puolilla
II
7 95146 tilavuuksilla. RNA liuotettiin 12 ml:aan H20, saostettiin seoksella, jossa oli 1,2 ml 4 M kaliumasetaattia ja 24 ml abs. etanolia, sedimentoitiin ja liuotettiin lopuksi 10 mitään H2o (1 ml kudosgrammaa kohti).
5 Esimerkki 2
PolWAI -pitoisen istukka-mRNA: n valmistus Istukka-RNA erotettiin poly (A)-pitoisen mRNA:n valmistamiseksi oligo(dT)-selluloosakromatografiällä [Aviv ja Leder, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69 (1973) 1408 - 1412] 10 2 ml:n Pasteur-pipetissä LiCl:ssa. Noin 5 mg istukka-RNA:- ta erotettiin puskuri l:ssä (500 mM LiCl, 20 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 % SDS) pylväässä. Poly(A)+-RNA sitoutui oligo(dT)-selluloosaan, ja poly(A)'-RNA taas voitiin eluoida. Puskurilla 2 suoritetun pesuvaiheen jälkeen (100 15 mM LiCl, 20 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 % SDS), eluoi-tiin poly (A) +-RNA (istukka-mRNA) puskurilla 3 (5 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,05 % SDS) pylväästä.
Lisäpuhdistusta varten laitettiin poly(A)+-RNA puskuri l:een ja kromatografoitiin uudelleen oligo(dT)-sel-20 luloosalla.
Istukka poly(A)+-RNA:n saanto tämän toisen puhdis-tusvaiheen jälkeen oli noin 4 % RNA:n aloitusmäärästä. Esimerkki 3 i cDNA:n synteesi ihmisen istukan (istukka-cDNAI ia ’ 25 kaksiiuosteisesta cDNA:sta fdsDNA)
Poly (A)-pitoisen istukka-mRNA: n koskemattomuus tutkittiin ennen cDNA-synteesiä 1,5 % agaroosigeeIissä.
Sen jälkeen 4 μg istukka-mRNA:ta liuotettiin 65,5 Ml:aan H20:ta, denaturoitiin 10 min. 70 °C:ssa ja jäähdy-30 tettiin jäissä.
cDNA-synteesi tapahtui 100 μ1:η annoksena, kun oli lisätty 20 μΐ RT,-puskuria (250 mM Tris, pH 8,2, 42 °C:ssa, 250 mM KCl, 30 mM MgCl2), 2,5 μΐ 20 mM:sta dNTP:tä (tämä tarkoittaa kaikki neljä deoksinukleosiditrifosfaattia), 35 1 μΐ oligo(dT):tä 1 μg/ml:sta, 1 μΐ 1 M DTT:tä, 2 μΐ RNA- 8 95146 t asia (Boehringer Mannheim) ja 8 μΐ käänteistranskriptaasia (24 U/μΙ, Boehringer Mannheim) 90 min. 42 °C:ssa. Kaksi-juosteinen cDNA (dsDNA) syntetisoitiin Gublerin ja Hoff-mannin mukaan [Gene 25 (1983) 263 - 269]. Synteesi tapah-5 tui heti cDNA-synteesin jälkeen lisäämällä 305,5 μΐ H20, 80 μΐ RT2-puskuria (100 mM Tr is, pH 7,5, 25 mM MgCl2, 500 mM KC1, 50 mM DTT, 250 μg/ml BSA), 2 μΐ RNaasi H (2 U/ml), 2,5 μΐ E. coli DNA-ligaasia (5 ϋ/μΐ), 5 μΐ 15 mM B-NAD ja 5 μΐ DNA-polymeraasi I (5 ϋ/μΐ) ja inkuboimalla 5 h 15 10 °C:ssa. Reaktio lopetettiin kuumainaktivoinnilla (70 eC, 30 min.).
Reaktioseosta inkuboitiin vielä 30 min. 37 °C:ssa sen jälkeen, kun oli lisätty 55 μΐ 250 μM:sta dNTP, 55 μΐ 10 mM Tris (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 μg/ml BSA, 3 μΐ T4 15 DNA-polymeraasi I (l ϋ/μΐ), 2 μΐ RNaasi H (2 ϋ/μΐ) ja 2 μΐ RNaasi A (2 μg/ml), jotta taattaisiin synteesin täydellisyys toiseen DNA-juosteeseen ("Repair Reaction").
Esimerkki 4
EcoRI-linkkereiden liaaatio dsDNA:hän ia linkkerei-20 den avaaminen
Istukka-cDNA-pankin perustamiseksi varustettiin dsDNA EcoRI-päillä, jotta ne voitaisiin ligatoida faagi-vektori λ gtl0:n EcoRI-leikkauskohtiin [T. Maniatis et ai. (1982), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold 25 Spring Harbor]. Tämän lisäksi dsDNA
a) käsiteltiin EcoRI-metylaasilla, dsDNA:n sisäisten EcoRI-leikkauskohtien suojaamiseksi, b) varustettiin EcoRI-linkkerillä, jotka c) sen jälkeen leikattiin EcoRI:11a.
30 a) : dsDNA:n metylaasireaktio tapahtui suoraan "Repair Reactionin" yhteydessä, kun oli lisätty 25 μΐ 500 mM EDTA (pH 8,0), 60 μΐ metylaasipuskuria (100 mM NaOAc, pH 5,2, 2 mg S-adenosyyli-L-metioniini) ja 2 μΐ EcoRI-metylaasia 35 (20 U/μΙ) inkuboimalla 37 °C:ssa 30 min.
il 9 95146 4
Reaktioseos uutettiin fenolilla ja dsDNA seostettiin 60 Ml:lla 4 M NaOAc ja 1300 μΐ etanolia. dsDNA pestiin kaksi kertaa 70 %:lla etanolilla, ravistettiin yhden kerran eetterin kanssa ja kuivattiin.
5 b) :
EcoRI-metyloitu dsDNA liuotettiin 88 μΐ:aan H20 ja kun oli lisätty 10 μΐ ligaasipuskuria (500 mM Tris, pH 7,4, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 10 mM spermidiini, 10 mM
ATP, 1 mg/ml BSA), 1 μΐ T4 DNA-ligaasia (10 U/μΙ) 1 μ1:η 10 kanssa EcoRI-linkkeriä (0,5 μg/μl, pGGAATTCC tai pAGAATTCT) ligatoitiin yön yli 15 eC:ssa.
c) :
Ligaatioseoksen tilavuus tehtiin 120 μΐ^εί 6 μ1:11β H20, 12 μ1:1ΐ3 10 x EcoRI-puskuria ja 2 μ1:1ΐΆ 15 EcoRIa (120 U/μΙ). EcoRI-pilkkominen tapahtui 2 h 37 °C:ssa.
Esimerkki 5
Ei-sitoutuneen linkkerin erotus kaliumasetaatti- aradientilla ia dsDNA;n koon selektio 20 Kaiken ei-sitoutuneen EcoRI-linkkerin erottamiseksi dsDNA:sta EcoRI-reaktioseos laitettiin kokonaisuudessaan kaliumasetaattigradienttiin (5 - 20 % KOAc, 1 mM EDTA, 1 μΐ/ml etidiumbromidi) ja sentrifugoitiin 3 h 50 000 rpm ja 20 °C:ssa (Beckman SW 65 -roottori).
:* 25 Gradientti fraktioitiin alhaalta niin, että ensim mäiset viisi fraktiota olivat 500 μΐ ja kaikki loput 100 μΐ. Fraktiot saostettiin 0,01 tilavuudella akryyliamidia (2 mg/ml) ja 2,5 tilavuudella etanolia, pestiin yhden kerran 70 %:lla etanolilla, kuivattiin ja liuotettiin 5 μΐ:-30 aan H20:ta.
• dsDNA:n koon määritystä varten analysoitiin 1 μΐ jokaista fraktiota l,5-%:isessa agaroosigeelissä. Lisäksi määritettiin dsDNA:n määrä 1 μl:sta jokaisesta fraktiosta.
ίο 95146
Fraktiot, joiden dsDNA oli 500 emäsparia, yhdistettiin ja näyte konsentroitiin siten, että loppukonsentraa-tio oli 27 pg/ml.
Esimerkki 6 5 dsDNA:n siirtäminen faaaivektoriin λ atlO 1a "in vitro pakkaus" -reaktio dsDNA:n siirtämisen faagivektorin λ gtlO EcoRI-leikkauskohtaan (Vector Cloning Systems, San Diego, CA) tapahtui 4 μ1:η ligaatioseoksessa: 2 μΐ dsDNA, 1 μΐ gtlO x 10 EcoRI (1 pg/ml), 0,4 μΐ ligaasipuskuria, 0,5 μΐ H20, 0,1 μΐ T4 DNA-ligaasia. Seosta inkuboitiin 4 h 15 °C:ssa.
Istukka-cDNA-pankin perustaminen faagivektoriin λ gtlO tapahtui ligaasiseoksen "in vitro pakkaus" -reaktiolla E. coli NS 428 ja NS 433 λ-lysogeenisen solu-uut-15 teen kanssa 2 h huoneen lämpötilassa (Vector Cloning Systems, San Diego, CA; Enquist ja Sternberg, Methods in En-zymology 68, (1979), 281 - 298). Reaktio pysäytettiin 500 pl:lla suspensioalustaa (SM: 0,1 M NaCl, 8 mM MgS04, 50 mM Tris, pH 7,5, 0,1 % gelatiini) ja 2 pisaralla kloroformia.
20 Esimerkki 7
Istukka-cDNA-pankin tiitterin määritys ia analysointi
Istukka-cDNA-pankin pesäkkeitä muodostavien yksiköiden (PFU) lukumäärä määritettiin E. coli K 12 -kannan ' 25 C600 HFL kompetenttien solujen avulla: arvo oli 1 x 106 PFU:ta.
Esimerkki 8
Ollaonukleotidikoettimet istukka-cDNA-pankin seulontaa varten 30 Oligonukleotidikoettimet (PP15-oligonukleotidi 103 : ja -140) ja oligonukleotidipooli (PP15-oligonukleotidipoo- li 139) syntetisoitiin istukka-cDNA-pankin analyysiä varten. Niiden sekvenssit johdettiin PP15:n kolmen bromisyaa-nifragmentin aminohapposekvenssistä.
li il 95146
Koettimien rakentaminen ja käyttö seurasi olennaisesti R. Lathen, edellä sääntöjä.
Oligonukleotidisekvenssit leimattiin T4-polynukleo-tidikinaasilla (γ-32Ρ)ΑΤΡ:η läsnä ollessa 5'päähän (käy-5 tettiin 60 μ0ΐ/40 μ1:η reaktioseosta). Koettimilla oli spesifinen aktiivisuus 1 x 10* Bq/μΐ tai 1,5 x 106 Bq/pmol.
Esimerkki 9
Istukka-cDNA:n seulonta spesifisellä oliaonukleoti- aillä 10 1 x 106 PFU:ta istukka-cDNA-pankkia tutkittiin yhdessä oligonukleotidikoettimien 103, 140 ja 139 kanssa.
Tätä varten maljättiin 3 x 104 PFU:ta E. coli K 12 -kanta C 600 HFL:n kanssa pehmytagariin 13,5 cm:n petrimaljoille ja inkuboitiin 6 h 37 °C:ssa. Tähän ajankohtaan mennessä 15 ei vielä esiintynyt konfluenttia lyysiä. Maljoja inkuboitiin yön yli jääkaapissa ja faagit siirrettiin nitrosellu-loosasuodattimille (Schleicher & Schiill, BA 85, Ref.-Nr.
401 124) (kaksoiskappaleet). Nitroselluloosasuodatin ja petrimaljat merkittiin injektiokanyylillä, jotta mahdol-20 listettaisiin positiivisten plakkien myöhempi rinnastaminen. Petrimaljat varastoitiin nitroselluloosasuodattimen prosessoinnin aikana kylmähuoneeseen. Nitroselluloosasuo-dattimilla oleva DNA denaturoitiin laittamalla suodatin 5 minuutiksi 1,5 M NaCl:lla, 0,5 M NaOHilla kastetun suoda- « • 25 tinpaperin (Whatman-M3) päälle. Seuraavaksi suodattimet renaturoitiin samalla lailla 1,5 M NaCl:lla, 0,5 M Tris:-llä, pH 8,0, ja pestiin 2 x SSPErllä (0,36 M NaCl, 16 mM NaOH, 20 mM NaH2P04, 2mM EDTA). Suodattimet kuivattiin sitten 2 h 80 °C:ssa tyhjiössä. Suodattimia pestiin 4 h 65 30 °C:ssa 3 X SSC:ssä, 0,1 % SDS:ssä (20 X SSC - 3 M NaCl, 0,3 M Na-sitraatti) ja esihybridisoitiin 4 h 65 °C:ssa [esihybridisaatioliuos: 0,6 M NaCl, 0,06 M Tris, pH 8,3, 6 mM EDTA, 0,2 % ei-ioninen synteettinen sakkaroosipoly-meeri ( Ficoll) , 0,2 % polyvinyylipyrrolidoni 40, 0,2 % 35 BSA, 0,1 % SDS, 50 μg/ml denaturoitu sillin sperma -DNA].
12 95146
Suodattimia inkuboitiin yön yli dekantterilaseissa tai kiinnipoltetuissa polyetyleenifoolioissa kevyesti ravistellen hybridisaatioliuoksessa, johon oli lisätty 100 000 - 200 000 Bq leimattua oligonukleotidiä/ml hybridisaatio-5 liuosta (kuin esihybridisaatioliuos, kuitenkin ilman sillin sperman DNA:ta). Hybridisaatiolämpötila oli 46 °C oli-gonukleotidikoettimelle 139 ja 52 °C muille koettimille. Nitroselluloosasuodattimet pestiin 6 x SCCtssä, 0,05 M natriumpyrofosfaatissa tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja 10 lisätunti kulloisessakin hybridisaatiolämpötilassa. Suodattimet kuivattiin ja autoradiografoitiin yön yli. Rönt-genfilmillä olevat signaalit, jotka esiintyivät molemmissa kaksoiskappaleissa, paikallistettiin petrimaljoilla ja alue (n. 50 plakkia) levitettiin läpi pasteur-pipetin le-15 veällä päällä ja faagit suspendoitiin uudelleen l ml:aan SM-puskuria. Positiivisia faageja eriteltiin toisistaan kolmen kierroksen avulla, kunnes oli vain yksi ainoa positiivinen klooni.
1 x 106 PFU:ta istukka-cDNA-pankkia tutkittiin kolme 20 kertaa. Vasta kolmannella etsimisellä identifioitiin 2 signaalia kaksoiskappalesuodattimella. Molemmissa klooneissa PP15-24 ja PP15-28 oli PP15:n koko cDNA.
Oligonukleotidisekvenssien 103, 139 ja 140 vertailu ilmoitetun PP15-sekvenssin kanssa on koottu taulukkoon 2.
· » - · 11 13 95146 TAULUKKO 2 PP15-sekvenssi versus PP15-oligonukleotidi 103 5 301 ATCACCGCGCAGGACCATCAGCCCACTCCAGATAGCTGCATCATCAGCAT 350 1 ................................................AT 2 • · · · · 351 GGTTGTGGGCCAGCTTAAGGCGGATGAAGACCCCATCATGGGGTTCCACC ^00 3 GGTGGTGGGCCAGCTGAAGGCTGATGAGGACCCC................ 36 10 PP15-sekvenssi versus PP15-oligonukleotidi 139 • ♦ · · « 401 AGATGTTCCTATTAAAGAACATCAACGATGCTTGGGTTTGCACCAATGAC 450 15 1 ..............AAGAACATCAACGATGCCTGGAC............. 23 PP15-sekvenssi versus PP15-oligonukleotidi 140 • · · · ♦ 151 TACTACCAGTTATTTGATAATGATAGAACCCAACTAGGCGCAATTTACAT 200 20 1 ............TTTGACAATGACCGGACCCAGCTGGGCGCCATCTACAT 38 • · · · · 201 TGACGCGTCATGCCTTACGTOGGAAGGACAACAGTTCCAGGGGAAAGCTG 250 39 TGATGC............................................ 44 : 25 Esimerkki 10 DNA-sekvenssianalwsi
Faagiklooneja PP15-24 ja PP15-18 monistettiin ja niiden DNA uutettiin kummassakin tapauksessa. Vastaava EcoRI-fragmentti eristettiin ja ligatoitiin Bluescript M13 30 -vektorin (Stratagene, San Diego, CA, USA) EcoRI-kohtaan entsymaattisen dideoksimenetelmän avulla Sangerin mukaan restriktioanalyysiä ja sekvenssianalyysiä varten. Sekvenssi osoittaa avoimen lukukehyksen, ja koodaa proteiinia, jolla on enintään 127 aminohappoa. PP15:llä on laskettu 14 95146 molekyylipaino 14 478 d (metioniini mukaanlukien), mikä on yhtäpitävä alussa mainitun patenttijulkaisun DE-A 2 952 729 arvon kanssa.
Esimerkki 11 5 Hylkimistä vastustavan proteiinin PP15 ekspressoi- tuminen
Vektoria pTrc99A [E. Amann et ai. (1988) Gene 69, 301 - 315] käytettiin ei-yhteenliittyneen, kypsän PP15 proteiinin ekspressoitumiseen E. colissa. PP15-cDNA:n DNA-10 sekvenssi aloituskodonin kohdalla on:
Met Gly Asp 5' ... CGCTCCAGA ATG GGA GAC ...3' 15 Koska ATG:ssä ei ole Ncol-kohtaa, DNA:ta ei voida kloonata suoraan pTrc99A-ekspressoitumisvektoriin. Ncol-kohta saadaan kuitenkin kahden emäksenvaihdon avulla PP15-sekvens-sissä: 5' GAATGG 3' mutageneesin kautta 5' CCATGG 3'. Toinen aminohappo (Gly) ei vahingoitu tämän muutoksen aikana, 20 koska PP15:n rakennesekvenssin toinen kodoni alkaa G:llä. Mutageneesiä varten eristettiin PP15-cDNA:n PP15-28-kloo-nin 902 emäsparia suuri EcoRI-fragmentti ja ligatoitiin samalla lailla EcoRI:11a pilkottuun ja defosforyloituun mutageneesivektoriin pMa5-8 (kuvio). Saadulle plasmidille • · :: 25 pMa5-8-PP15 (jolla oli oikea PP15 EcoRI-insertin suunta
Fl-aloituskohtaan nähden) tehtiin sitten "gapped duplex"-mutageneesi [Kramer et ai. (1984) Nucl. Acids. Res. 12, 9441 - 9456], jolloin käytettiin seuraavaa oligodeoksinuk-leotidiä: 30 : 1 5' GGCTTGTCTCCCATGGTGGAGCGTCAC 3'
Klooni, joka sisälsi toivotun mutaation, identifioitiin restriktioanalyysillä ja merkittiin pMc5-8-NcoI.
35 Tältä plasmidilta eristettiin 798 emäsparia suuri Ncol-
II
is 95146 4
EcoRI -fragmentti ja ligatoitiin vastaavasti pilkottuun pTrc99A-vektoriin. Saatu plasmidi pTrc99A-PP15 käsittää 4918 emäsparia ja ekspressoi ei-yhteenliittynyttä, n. 15 kD suurta PP15 proteiinia trc-promoottorin induktion jäl-5 keen.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3809119A DE3809119A1 (de) | 1988-03-18 | 1988-03-18 | Gentechnisch hergestelltes protein pp 15 |
DE3809119 | 1988-03-18 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI891249A0 FI891249A0 (fi) | 1989-03-16 |
FI891249A FI891249A (fi) | 1989-09-19 |
FI95146B true FI95146B (fi) | 1995-09-15 |
FI95146C FI95146C (fi) | 1995-12-27 |
Family
ID=6350091
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI891249A FI95146C (fi) | 1988-03-18 | 1989-03-16 | Menetelmä hylkimistä vastustavan proteiinin PP15 tai sen immunogeenisen osan valmistamiseksi |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0333134B1 (fi) |
JP (2) | JPH029370A (fi) |
KR (1) | KR890014739A (fi) |
AT (1) | ATE141104T1 (fi) |
AU (1) | AU616248B2 (fi) |
DE (2) | DE3809119A1 (fi) |
DK (1) | DK131989A (fi) |
ES (1) | ES2090019T3 (fi) |
FI (1) | FI95146C (fi) |
GR (1) | GR3020755T3 (fi) |
PT (1) | PT90031B (fi) |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2952792A1 (de) * | 1979-12-31 | 1981-07-02 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Neues protein (pp(pfeil abwaerts)15(pfeil abwaerts)) mit immunsuppressiver wirkung |
-
1988
- 1988-03-18 DE DE3809119A patent/DE3809119A1/de not_active Withdrawn
-
1989
- 1989-03-14 DE DE58909708T patent/DE58909708D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-14 AT AT89104516T patent/ATE141104T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-03-14 ES ES89104516T patent/ES2090019T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-14 EP EP89104516A patent/EP0333134B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-16 FI FI891249A patent/FI95146C/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-03-17 DK DK131989A patent/DK131989A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-03-17 AU AU31431/89A patent/AU616248B2/en not_active Ceased
- 1989-03-17 PT PT90031A patent/PT90031B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-03-18 KR KR1019890003375A patent/KR890014739A/ko not_active Application Discontinuation
- 1989-03-18 JP JP1067402A patent/JPH029370A/ja active Pending
-
1996
- 1996-06-21 JP JP8161789A patent/JPH09131188A/ja active Pending
- 1996-08-08 GR GR960401980T patent/GR3020755T3/el unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU616248B2 (en) | 1991-10-24 |
DE3809119A1 (de) | 1989-10-05 |
FI95146C (fi) | 1995-12-27 |
JPH09131188A (ja) | 1997-05-20 |
FI891249A0 (fi) | 1989-03-16 |
EP0333134A2 (de) | 1989-09-20 |
AU3143189A (en) | 1989-09-21 |
PT90031A (pt) | 1989-11-10 |
DE58909708D1 (de) | 1996-09-12 |
FI891249A (fi) | 1989-09-19 |
DK131989A (da) | 1989-09-19 |
DK131989D0 (da) | 1989-03-17 |
GR3020755T3 (en) | 1996-11-30 |
KR890014739A (ko) | 1989-10-25 |
EP0333134A3 (en) | 1990-06-06 |
ATE141104T1 (de) | 1996-08-15 |
EP0333134B1 (de) | 1996-08-07 |
ES2090019T3 (es) | 1996-10-16 |
PT90031B (pt) | 1994-05-31 |
JPH029370A (ja) | 1990-01-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kalfayan et al. | α-Tubulin genes of Drosophila | |
Reilly et al. | cDNA cloning and immunolocalization of a Na (+)-H+ exchanger in LLC-PK1 renal epithelial cells | |
EP0205579A1 (en) | METHODS AND COMPOSITIONS USEFUL FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES. | |
Than et al. | Cloning and sequence analysis of cDNAs encoding human placental tissue protein 17 (PP17) variants | |
EP0580672B1 (en) | SYNTHETIC CDw52(CAMPATH-1) PEPTIDE ANTIGEN | |
JPH01165386A (ja) | 遺伝子操作による抗凝固性タンパク質pp4の製造 | |
US5840832A (en) | Transcription factor regulating MHC expression, CDNA and genomic clones encoding same and retroviral expression constructs thereof | |
FI95146B (fi) | Menetelmä hylkimistä vastustavan proteiinin PP15 tai sen immunogeenisen osan valmistamiseksi | |
DK172677B1 (da) | Monoklonale antistoffer mod et interferoninduceret protein, fremgangsmåde til fremstilling deraf, hybridomacellelinier som | |
JP2002543761A (ja) | 結核症抗原およびそのための使用の方法 | |
Roebber et al. | 739 Isolation and characterization of allergen Amb a VII from short ragweed pollen | |
KR960001820B1 (ko) | 재조합 dna 기법에 의해 생성된 민악티빈 | |
US7217692B2 (en) | Complex of a human FOXC2 protein and a FOXC2-interacting protein | |
US5830684A (en) | Native type II GAP, methods for purifying various GAPs and uses of GAPs to diagnose cancer | |
US5202419A (en) | Anticoagulative protein pp4-x | |
WO1994029448A1 (fr) | Adn et proteine codee par celui-ci | |
US5317094A (en) | Protein PP 15 preprared by genetic manipulation | |
EP0506377B1 (en) | Calmodulin binding protein | |
US5320950A (en) | DNA encoding anticoagulative protein PP4-X, and its preparation and use | |
US6368790B1 (en) | cDNA encoding P2P proteins and use of P2P cDNA derived antibodies and antisense reagents in determining the proliferative potential of normal, abnormal, and cancer cells in animals and humans | |
WO2004052927A1 (fr) | Gene associe a la calvitie et polypeptide code par ce gene, et utilisations correspondantes | |
JP2001500019A (ja) | 顆粒球走化性タンパク質2変異体 | |
CA2006535A1 (en) | Cdna coding for placenta protein 11 (pp11), the isolation and use thereof | |
Bass et al. | 740 Isolation and translation of messenger RNA from white oak pollen and inflorescences | |
Ghosh et al. | 737 c-DNA cloning of Amb V allergens from ragweed pollens |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
BB | Publication of examined application | ||
MM | Patent lapsed | ||
MM | Patent lapsed |
Owner name: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT |