FI95146B - Menetelmä hylkimistä vastustavan proteiinin PP15 tai sen immunogeenisen osan valmistamiseksi - Google Patents

Description

95146 *

Menetelmä hylkimistä vastustavan proteiinin PP15 tai sen immunogeenisen osan valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää hylkimistä vastustavan 5 proteiinin PP15 tai sen immunogeenisen osan valmistamiseksi. Immuunisuppressiivisesti eli hylkimistä vastustavana toimiva proteiini PP15 on kuvattu seuraavin parametrein patenttijulkaisussa DE-A 2 952 792 (US-A 4 348 316): a) hiilihydraattimäärä 3,35 ± 0,9 %, joka koostuu 10 heksooseista 2,8 ± 0,5 %, heksoosiamiineista 0,3 ± 0,2 %, fukoosista 0,05 ± 0,05 % ja neuramiinihaposta 0,20 ± 0,15 %, b) sedimentaatiokerroin SMw0 2,9 ± 0,2 S, c) ultrasentrifugissa määritelty molekyylipaino 30 15 700 ± 3 200 (dimeeri), d) ekstinktiokerroin E,,»1 * (280 nm) 14,2 ± 1,0 ja e) elektroforeettinen liikkuvuus albumiinin alueella samoin kuin f) isoelektrinen piste 4,4 ± 0,1, C t f.

20 g) aminohappokoostumuksella Jäännöksiä 100 Variaatio-jäännöstä kerroin

Aminohappo kohti (mol %) (%)_ . Lysiini 4,74 3,30 • 25 Histidiini 3,81 5,43

Arginiini 1,62 3,43

Asparagiinihappo 13,39 5,08

Treoniini 3,85 5,35

Seriini 6,38 2,81 . 30 Glutamiinihappo 13,43 5,32

Proliini 4,35 14,25

Glysiini 6,87 2,13

Alaniini 6,51 8,26

Kystiini 1/2 2,48 4,55 35 Väliini 2,29 15,67 2 95146

Metioniini 2,87 10,86

Isoleusiini 8,39 8,18

Leusiini 8,18 6,72

Tyrosiini 2,09 8,49 5 Fenyylialaniini 6,27 2,27

Tryptofaani 2,51 6,81

Molekyylipainon määritys SDS-polyakryyliamidigee-lielektroforeesin avulla antoi molekyylipainoksi noin 10 15 000 d (monomeeri).

Tämän proteiinin geenitekninen valmistus on erit täin toivottavaa koska se on hylkimistä vastustavien ominaisuukseensa takia tullut terapeuttisen ja diagnostisen kiinnostuksen kohteeksi. Keksintö koskee siten menetelmää 15 PP15:n valmistamiseksi geeniteknisesti. Kuvataan myös tähän vaadittavaa mRNA:ta, siitä saatua cDNA:ta, tämän cDNA-:n kokonaan tai osittain sisältävät DNA-rakenteet ja vektorit, sellaisella DNA:11a transformoidut solut, näistä soluista ekspressoituvan polypeptidin ja sen käytön lääke-20 aineena. Lisäksi esitetään PP15:n aminohapposekvenssi samoin kuin aminohapposekvenssin osasekvenssi, sen avulla saadut spesifiset vasta-aineet, vasta-aineista valmistetut diagnostiset reagenssit ja vasta-ainepylväät samoin kuin pylväiden avulla saatu polypeptidi. Keksinnön eräs lisä-• 25 muodostelma koskee diagnostisia reagensseja, jotka sisäl tävät kokonaan tai osittain PP15:tä koodaavan tai sen komplementaarisen DNA:n tai RNA:n ja diagnostisia menetelmiä, joilla tutkitaan kehonnesteitä ja kudoksia näiden diagnostisten reagenssien avulla. Keksinnön muita näkökohtia va-. . 30 laistaan lähemmin seuraavassa tai määritetään patenttivaa- " timuksissa.

Ensin yritettiin spesifisten PP15:tä vastaan suunnattujen vasta-aineiden avulla kaupallisesti saatavissa olevassa cDNA-ekspressoitumispankissa, joka on ihmisen 35 kypsän istukan mRNA:sta (Fa. Genofit, Heidelberg), osoit-

II

95146 3 taa klooneja, jotka ekspressoivat PP15:tä. Koska oli tunnettua, että PP15 vaikuttaa hylkimistä vastustavasti, niin muodoin spesifiset vasta-aineet olivat vain huonosti, jos ylipäänsä lainkaan valmistettavissa, valmistettiin spesi-5 fisiä vasta-aineita osapeptidejä vastaan.

Sen vuoksi hajotettiin proteiini PP15 spesifisiin fragmentteihin leikkaamalla bromisyaanilla, trypsiinillä tai proteinaasi V8:lla, jotka fragmentit sekvenssoitiin myöhemmin. Saatiin seuraavat fragmentit:

10 (A) MVVGQLKADEDPIMGFHQMF

(B) FRLALHNFG

(C) VSVYAEAAER

(D) L S S L P F Q K I Q (H)

(E) FDNDRTQLGAIYIDAS-LT-E

15 (F) LLKNINDAWT

Peptidit A, B ja C syntetisoitiin yleisesti tunnettujen menetelmien avulla ja tuotettiin spesifisiä vasta-aineita kaneissa tavallisten menetelmien mukaan. Yllä mainitussa cDNA-ekspressoitumispankissa, joka sisälsi >1 x 106 20 rekombinoitunutta Lambda gtll-kloonia, ei onnistuttu paikallistamaan positiivisia klooneja. Peptidi A:ta ja B:tä vastaan suunnatut vasta-aineet saostivat tällöin kontrol-likokeessa PP15:n, kun taas vasta-aineet peptidi C:tä vastaan eivät reagoineet. Kuten myöhemmin tuli ilmi, peptidi • 25 C ei myöskään sisälly seuraavaksi cDNA-sekvenssistä joh dettuun PP15-proteiinisekvenssiin, joten se täytyy todennäköisesti rinnastaa PP15:n seuralaisproteiiniin.

Sen jälkeen valittiin PP15-oligopeptidi A:ta koo-daavista oligonukleotideistä PP15-oligonukleotidi-103 30

5'ATGGTGGTGG GCCAGCTGAA GGCTGATGAG GACCCC, vastaavasti oligopeptidi E:stä PP15-oligonukleotidi-140 35 5'TTTGACAATG ACCGGACCCA GCTGGGCGCC ATCTACATTG ATGC

4 95146 ja oligopeptidi F:stä 64-kertaisesti degeneroitunut PP15-oligonukleotidi-139

5'AAAAATATTAATGATGCCTGGAC 5 G C C C C

A

R. Lathen [J. Mol. Biol. (1985) 183, 1 - 12] tilastollisten tietojen perusteella.

10 Näiden oligonukleotidikoettimien avulla tehtiin cDNA-pankille, joka oli valmistettu ihmisen kypsän istukan mRNA:sta, screening. Ensin eristettiin istukasta mRNA ja siitä valmistettiin cDNA. Tämä varustettiin EcoRI-päillä ja ligoitiin faagivektori Lambda gtl0:n EcoRI-leikkauskoh-15 tiin. Osoitettiin 2 kloonia (PP15-24 ja PP15-28), joissa oli PPl5:n koko cDNA. DNA:n sekvenssointi tapahtui sinänsä tunnetuilla menetelmillä; PP15:n täydellinen cDNA-sekvens-si (koodaava juoste) esitetään taulukossa 1. cDNA on 894 emäsparia (bp) pitkä, sillä on 5'-päässä 99 emäsparin ei-20 translatoitu sekvenssi, sillä on 381 emäsparin avoin luku-kehys ja jättää 3'-päässä 414 emäsparia, kahdeksan emäspo-ly (A):ta mukaanlukien, translatoimatta.

Taulukossa 1 ovat nukleotidikoetinkohdat allevii-. vaarnalla merkitty, lisäksi aminohapposekvenssi on merkit- • 25 ty.

Keksinnön mukaisesti voidaan koodaavaa cDNA:ta käyttää sopivan ekspressoitumissysteemin avulla ekspres-soimaan PP15:tä. Isännän valinnalla voidaan vielä vaikuttaa PP15:n modifiointiin. Niinpä bakteereissa ei tapahdu 30 glykosylaatiota ja hiivasoluissa tapahtuu toisenlainen glykosylaatio kuin korkeammissa eukaryoottisissa soluissa.

Kun tiedetään PP15:n aminohapposekvenssi, on mahdollista valmistaa tavanomaisilla tai geeniteknisillä menetelmillä aminohappo-osasekvenssejä, jotka voivat toimia il 5 95146 TAULUKKO 1 10 30 50 GGAAGGGACAGTCGGCCGCAGACCGCGCTGGGTTGCCGCTGCCGCTGCCGCCATCGTGCC 70 90 110

5 AGCCCCTCGGGTCTCCGTGAGGCCGGGTGACGCTCCAGAATGGGAGACAAGCCAATTTGG

M G D K P I W

130 150 170

GAGCAGATTGGATCCAGCTTCATTCAACATTACTACCAGTTATTTGATAATGATAGAACC

EQIGSSFIQHYYQLFDNDRT

10 190 210 230

CAACTAGGCGCAATTTACATTGACGCGTCATGCCTTACGTGGGAAGGACAACAGTTCCAG

QLGAIYIDASCLTWEGQQFQ

250 270 290 GGGAAAGCTGCCATTGTGGAGAAGTTGTCTAGCCTTCCGTTCCAGAAAATTCAGCACAGC 15

GKAAIVEKLSSLPFQKIQHS

310 330 350

ATCACCGCGCAGGACCATCAGCCCACTCCAGATAGCTGCATCATCAGCATGGTTGTGGGC

I TAQDHQPTPDSCI I SMVVG

20 370 390 410

CAGCTTAAGGCGGATGAAGACCCCATCATGGGGTTCCACCAGATGTTCCTATTAAAGAAC

QLKADEDPIMGFHQMFL'LKN

430 450 470

ATCAACGATGCTTGGGTTTGCACCAATGACATGTTCAGGCTCGCCCTGCACAACTTTGGC

25 INDAWVCTNDMFRLALHNFG

490 510 530 TGACCTCCTCTCAGCTAGGCACTCACGCTGTTTCCTCCTCCCTCCTCTTCCCAATACTAT 550 570 590 TCCCACTCCTCCAGATGCTCCAAATATCATGCACAAATGAGCAGGGCCGCGGTGGGAGTG 610 630 650 on GGCGCAGTGCGCTGCTGCCACTGAGGTGTTGTGCATGATGTTTGGATGCTAGACTAGTTG 670 690 710 CATCTGACGGGAGAAGTTTGTGTTGTACCAGCGCATGCCTTGGAAAGACTTAAGTAATGC 730 750 770 AAAAGGTTGTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAATCTACTGACAAGTTGCTCTAGTAA 790 810 830 C C CAAAGAAGTGAAGGAGAAAGCAGCTGC CT CAC CGC CCAGACATTGATTTGTTCAGATG 850 870 890

35 TTTCAATGCCTCATGATACAATAAAACCACAAAAATTTTCTTAACAAAAAAAAA

95146 6 antigeeneinä polyklonaalisten tai monoklonaalisten vasta-aineiden valmistuksessa. Sellaiset vasta-aineet ovat käyttökelpoiset sekä diagnostisiin tarkoituksiin että myös vasta-ainepylväiden valmistamiseen, jonka avulla PP15 voi-5 daan erottaa liuoksista, jotka sisältävät sitä muiden proteiinien rinnalla.

cDNA:n tai sen osien avulla voidaan myös yksinkertaisella tavalla eristää geenipankista PP15:tä koodaava genominen klooni, jonka avulla ei ainoastaan ekspressoi-10 tuminen eukaryoottisissa soluissa helpotu, vaan myös muita diagnostisia lausuntoja voidaan antaa.

Keksintöä on lisäksi määritetty patenttivaatimuksissa ja esitetty edelleen seuraavissa esimerkeissä.

Mikäli tekstissä ei ole selitetty, käytetään seu-15 raavia lyhenteitä.

EDTA = natriummetyleenidiamiinitetra-asetaatti SDS = natriumdodekyylisulfaatti DTT - ditiotreitoli BSA - naudan seerumin albumiinia 20 Esimerkki 1 RNA:n eristys ihmisen istukasta RNA saatiin kypsästä ihmisen istukasta [Chirgwin et ai. mukaan, Biochemistry 18 (1979) 5294 - 5299]. Noin 10 g . istukkakudosta murskattiin nestemäisessä typessä, suspen- • 25 doitiin 80 ml:aan 4 M guanidiiniumtiosyanaattia, jossa oli 0,1 M merkaptaanietanolia, ja käsiteltiin 90 sek. 20 000 rpm homogenisaattorissa (Ultraturrax). Lysaattia sentrifu-goitiin 15 min. 7 000 rpm (Sorvall-GSA -roottori) ja su-pernatantti saostettiin 2 ml:11a 1 M etikkahappoa ja 60 30 ml:11a abs. etanolia -20 °C:ssa yön yli. Kun nukleiinihap-po oli sedimentoitu 6 000 rpm:ssä ja -10 °C:ssa 10 min., se liuotettiin täydellisesti 40 ml:aan 7,5 M guanidiinium-hydrokloridia (pH 7,0) ja saostettiin seoksella, jossa oli 1 ίηΐ 1 M etikkahappoa ja 20 ml abs. etanolia. DNA:n erot-35 tamiseksi toistettiin seostaminen toisen kerran puolilla

II

7 95146 tilavuuksilla. RNA liuotettiin 12 ml:aan H20, saostettiin seoksella, jossa oli 1,2 ml 4 M kaliumasetaattia ja 24 ml abs. etanolia, sedimentoitiin ja liuotettiin lopuksi 10 mitään H2o (1 ml kudosgrammaa kohti).

5 Esimerkki 2

PolWAI -pitoisen istukka-mRNA: n valmistus Istukka-RNA erotettiin poly (A)-pitoisen mRNA:n valmistamiseksi oligo(dT)-selluloosakromatografiällä [Aviv ja Leder, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69 (1973) 1408 - 1412] 10 2 ml:n Pasteur-pipetissä LiCl:ssa. Noin 5 mg istukka-RNA:- ta erotettiin puskuri l:ssä (500 mM LiCl, 20 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 % SDS) pylväässä. Poly(A)+-RNA sitoutui oligo(dT)-selluloosaan, ja poly(A)'-RNA taas voitiin eluoida. Puskurilla 2 suoritetun pesuvaiheen jälkeen (100 15 mM LiCl, 20 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 % SDS), eluoi-tiin poly (A) +-RNA (istukka-mRNA) puskurilla 3 (5 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,05 % SDS) pylväästä.

Lisäpuhdistusta varten laitettiin poly(A)+-RNA puskuri l:een ja kromatografoitiin uudelleen oligo(dT)-sel-20 luloosalla.

Istukka poly(A)+-RNA:n saanto tämän toisen puhdis-tusvaiheen jälkeen oli noin 4 % RNA:n aloitusmäärästä. Esimerkki 3 i cDNA:n synteesi ihmisen istukan (istukka-cDNAI ia ’ 25 kaksiiuosteisesta cDNA:sta fdsDNA)

Poly (A)-pitoisen istukka-mRNA: n koskemattomuus tutkittiin ennen cDNA-synteesiä 1,5 % agaroosigeeIissä.

Sen jälkeen 4 μg istukka-mRNA:ta liuotettiin 65,5 Ml:aan H20:ta, denaturoitiin 10 min. 70 °C:ssa ja jäähdy-30 tettiin jäissä.

cDNA-synteesi tapahtui 100 μ1:η annoksena, kun oli lisätty 20 μΐ RT,-puskuria (250 mM Tris, pH 8,2, 42 °C:ssa, 250 mM KCl, 30 mM MgCl2), 2,5 μΐ 20 mM:sta dNTP:tä (tämä tarkoittaa kaikki neljä deoksinukleosiditrifosfaattia), 35 1 μΐ oligo(dT):tä 1 μg/ml:sta, 1 μΐ 1 M DTT:tä, 2 μΐ RNA- 8 95146 t asia (Boehringer Mannheim) ja 8 μΐ käänteistranskriptaasia (24 U/μΙ, Boehringer Mannheim) 90 min. 42 °C:ssa. Kaksi-juosteinen cDNA (dsDNA) syntetisoitiin Gublerin ja Hoff-mannin mukaan [Gene 25 (1983) 263 - 269]. Synteesi tapah-5 tui heti cDNA-synteesin jälkeen lisäämällä 305,5 μΐ H20, 80 μΐ RT2-puskuria (100 mM Tr is, pH 7,5, 25 mM MgCl2, 500 mM KC1, 50 mM DTT, 250 μg/ml BSA), 2 μΐ RNaasi H (2 U/ml), 2,5 μΐ E. coli DNA-ligaasia (5 ϋ/μΐ), 5 μΐ 15 mM B-NAD ja 5 μΐ DNA-polymeraasi I (5 ϋ/μΐ) ja inkuboimalla 5 h 15 10 °C:ssa. Reaktio lopetettiin kuumainaktivoinnilla (70 eC, 30 min.).

Reaktioseosta inkuboitiin vielä 30 min. 37 °C:ssa sen jälkeen, kun oli lisätty 55 μΐ 250 μM:sta dNTP, 55 μΐ 10 mM Tris (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 μg/ml BSA, 3 μΐ T4 15 DNA-polymeraasi I (l ϋ/μΐ), 2 μΐ RNaasi H (2 ϋ/μΐ) ja 2 μΐ RNaasi A (2 μg/ml), jotta taattaisiin synteesin täydellisyys toiseen DNA-juosteeseen ("Repair Reaction").

Esimerkki 4

EcoRI-linkkereiden liaaatio dsDNA:hän ia linkkerei-20 den avaaminen

Istukka-cDNA-pankin perustamiseksi varustettiin dsDNA EcoRI-päillä, jotta ne voitaisiin ligatoida faagi-vektori λ gtl0:n EcoRI-leikkauskohtiin [T. Maniatis et ai. (1982), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold 25 Spring Harbor]. Tämän lisäksi dsDNA

a) käsiteltiin EcoRI-metylaasilla, dsDNA:n sisäisten EcoRI-leikkauskohtien suojaamiseksi, b) varustettiin EcoRI-linkkerillä, jotka c) sen jälkeen leikattiin EcoRI:11a.

30 a) : dsDNA:n metylaasireaktio tapahtui suoraan "Repair Reactionin" yhteydessä, kun oli lisätty 25 μΐ 500 mM EDTA (pH 8,0), 60 μΐ metylaasipuskuria (100 mM NaOAc, pH 5,2, 2 mg S-adenosyyli-L-metioniini) ja 2 μΐ EcoRI-metylaasia 35 (20 U/μΙ) inkuboimalla 37 °C:ssa 30 min.

il 9 95146 4

Reaktioseos uutettiin fenolilla ja dsDNA seostettiin 60 Ml:lla 4 M NaOAc ja 1300 μΐ etanolia. dsDNA pestiin kaksi kertaa 70 %:lla etanolilla, ravistettiin yhden kerran eetterin kanssa ja kuivattiin.

5 b) :

EcoRI-metyloitu dsDNA liuotettiin 88 μΐ:aan H20 ja kun oli lisätty 10 μΐ ligaasipuskuria (500 mM Tris, pH 7,4, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 10 mM spermidiini, 10 mM

ATP, 1 mg/ml BSA), 1 μΐ T4 DNA-ligaasia (10 U/μΙ) 1 μ1:η 10 kanssa EcoRI-linkkeriä (0,5 μg/μl, pGGAATTCC tai pAGAATTCT) ligatoitiin yön yli 15 eC:ssa.

c) :

Ligaatioseoksen tilavuus tehtiin 120 μΐ^εί 6 μ1:11β H20, 12 μ1:1ΐ3 10 x EcoRI-puskuria ja 2 μ1:1ΐΆ 15 EcoRIa (120 U/μΙ). EcoRI-pilkkominen tapahtui 2 h 37 °C:ssa.

Esimerkki 5

Ei-sitoutuneen linkkerin erotus kaliumasetaatti- aradientilla ia dsDNA;n koon selektio 20 Kaiken ei-sitoutuneen EcoRI-linkkerin erottamiseksi dsDNA:sta EcoRI-reaktioseos laitettiin kokonaisuudessaan kaliumasetaattigradienttiin (5 - 20 % KOAc, 1 mM EDTA, 1 μΐ/ml etidiumbromidi) ja sentrifugoitiin 3 h 50 000 rpm ja 20 °C:ssa (Beckman SW 65 -roottori).

:* 25 Gradientti fraktioitiin alhaalta niin, että ensim mäiset viisi fraktiota olivat 500 μΐ ja kaikki loput 100 μΐ. Fraktiot saostettiin 0,01 tilavuudella akryyliamidia (2 mg/ml) ja 2,5 tilavuudella etanolia, pestiin yhden kerran 70 %:lla etanolilla, kuivattiin ja liuotettiin 5 μΐ:-30 aan H20:ta.

• dsDNA:n koon määritystä varten analysoitiin 1 μΐ jokaista fraktiota l,5-%:isessa agaroosigeelissä. Lisäksi määritettiin dsDNA:n määrä 1 μl:sta jokaisesta fraktiosta.

ίο 95146

Fraktiot, joiden dsDNA oli 500 emäsparia, yhdistettiin ja näyte konsentroitiin siten, että loppukonsentraa-tio oli 27 pg/ml.

Esimerkki 6 5 dsDNA:n siirtäminen faaaivektoriin λ atlO 1a "in vitro pakkaus" -reaktio dsDNA:n siirtämisen faagivektorin λ gtlO EcoRI-leikkauskohtaan (Vector Cloning Systems, San Diego, CA) tapahtui 4 μ1:η ligaatioseoksessa: 2 μΐ dsDNA, 1 μΐ gtlO x 10 EcoRI (1 pg/ml), 0,4 μΐ ligaasipuskuria, 0,5 μΐ H20, 0,1 μΐ T4 DNA-ligaasia. Seosta inkuboitiin 4 h 15 °C:ssa.

Istukka-cDNA-pankin perustaminen faagivektoriin λ gtlO tapahtui ligaasiseoksen "in vitro pakkaus" -reaktiolla E. coli NS 428 ja NS 433 λ-lysogeenisen solu-uut-15 teen kanssa 2 h huoneen lämpötilassa (Vector Cloning Systems, San Diego, CA; Enquist ja Sternberg, Methods in En-zymology 68, (1979), 281 - 298). Reaktio pysäytettiin 500 pl:lla suspensioalustaa (SM: 0,1 M NaCl, 8 mM MgS04, 50 mM Tris, pH 7,5, 0,1 % gelatiini) ja 2 pisaralla kloroformia.

20 Esimerkki 7

Istukka-cDNA-pankin tiitterin määritys ia analysointi

Istukka-cDNA-pankin pesäkkeitä muodostavien yksiköiden (PFU) lukumäärä määritettiin E. coli K 12 -kannan ' 25 C600 HFL kompetenttien solujen avulla: arvo oli 1 x 106 PFU:ta.

Esimerkki 8

Ollaonukleotidikoettimet istukka-cDNA-pankin seulontaa varten 30 Oligonukleotidikoettimet (PP15-oligonukleotidi 103 : ja -140) ja oligonukleotidipooli (PP15-oligonukleotidipoo- li 139) syntetisoitiin istukka-cDNA-pankin analyysiä varten. Niiden sekvenssit johdettiin PP15:n kolmen bromisyaa-nifragmentin aminohapposekvenssistä.

li il 95146

Koettimien rakentaminen ja käyttö seurasi olennaisesti R. Lathen, edellä sääntöjä.

Oligonukleotidisekvenssit leimattiin T4-polynukleo-tidikinaasilla (γ-32Ρ)ΑΤΡ:η läsnä ollessa 5'päähän (käy-5 tettiin 60 μ0ΐ/40 μ1:η reaktioseosta). Koettimilla oli spesifinen aktiivisuus 1 x 10* Bq/μΐ tai 1,5 x 106 Bq/pmol.

Esimerkki 9

Istukka-cDNA:n seulonta spesifisellä oliaonukleoti- aillä 10 1 x 106 PFU:ta istukka-cDNA-pankkia tutkittiin yhdessä oligonukleotidikoettimien 103, 140 ja 139 kanssa.

Tätä varten maljättiin 3 x 104 PFU:ta E. coli K 12 -kanta C 600 HFL:n kanssa pehmytagariin 13,5 cm:n petrimaljoille ja inkuboitiin 6 h 37 °C:ssa. Tähän ajankohtaan mennessä 15 ei vielä esiintynyt konfluenttia lyysiä. Maljoja inkuboitiin yön yli jääkaapissa ja faagit siirrettiin nitrosellu-loosasuodattimille (Schleicher & Schiill, BA 85, Ref.-Nr.

401 124) (kaksoiskappaleet). Nitroselluloosasuodatin ja petrimaljat merkittiin injektiokanyylillä, jotta mahdol-20 listettaisiin positiivisten plakkien myöhempi rinnastaminen. Petrimaljat varastoitiin nitroselluloosasuodattimen prosessoinnin aikana kylmähuoneeseen. Nitroselluloosasuo-dattimilla oleva DNA denaturoitiin laittamalla suodatin 5 minuutiksi 1,5 M NaCl:lla, 0,5 M NaOHilla kastetun suoda- « • 25 tinpaperin (Whatman-M3) päälle. Seuraavaksi suodattimet renaturoitiin samalla lailla 1,5 M NaCl:lla, 0,5 M Tris:-llä, pH 8,0, ja pestiin 2 x SSPErllä (0,36 M NaCl, 16 mM NaOH, 20 mM NaH2P04, 2mM EDTA). Suodattimet kuivattiin sitten 2 h 80 °C:ssa tyhjiössä. Suodattimia pestiin 4 h 65 30 °C:ssa 3 X SSC:ssä, 0,1 % SDS:ssä (20 X SSC - 3 M NaCl, 0,3 M Na-sitraatti) ja esihybridisoitiin 4 h 65 °C:ssa [esihybridisaatioliuos: 0,6 M NaCl, 0,06 M Tris, pH 8,3, 6 mM EDTA, 0,2 % ei-ioninen synteettinen sakkaroosipoly-meeri ( Ficoll) , 0,2 % polyvinyylipyrrolidoni 40, 0,2 % 35 BSA, 0,1 % SDS, 50 μg/ml denaturoitu sillin sperma -DNA].

12 95146

Suodattimia inkuboitiin yön yli dekantterilaseissa tai kiinnipoltetuissa polyetyleenifoolioissa kevyesti ravistellen hybridisaatioliuoksessa, johon oli lisätty 100 000 - 200 000 Bq leimattua oligonukleotidiä/ml hybridisaatio-5 liuosta (kuin esihybridisaatioliuos, kuitenkin ilman sillin sperman DNA:ta). Hybridisaatiolämpötila oli 46 °C oli-gonukleotidikoettimelle 139 ja 52 °C muille koettimille. Nitroselluloosasuodattimet pestiin 6 x SCCtssä, 0,05 M natriumpyrofosfaatissa tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja 10 lisätunti kulloisessakin hybridisaatiolämpötilassa. Suodattimet kuivattiin ja autoradiografoitiin yön yli. Rönt-genfilmillä olevat signaalit, jotka esiintyivät molemmissa kaksoiskappaleissa, paikallistettiin petrimaljoilla ja alue (n. 50 plakkia) levitettiin läpi pasteur-pipetin le-15 veällä päällä ja faagit suspendoitiin uudelleen l ml:aan SM-puskuria. Positiivisia faageja eriteltiin toisistaan kolmen kierroksen avulla, kunnes oli vain yksi ainoa positiivinen klooni.

1 x 106 PFU:ta istukka-cDNA-pankkia tutkittiin kolme 20 kertaa. Vasta kolmannella etsimisellä identifioitiin 2 signaalia kaksoiskappalesuodattimella. Molemmissa klooneissa PP15-24 ja PP15-28 oli PP15:n koko cDNA.

Oligonukleotidisekvenssien 103, 139 ja 140 vertailu ilmoitetun PP15-sekvenssin kanssa on koottu taulukkoon 2.

· » - · 11 13 95146 TAULUKKO 2 PP15-sekvenssi versus PP15-oligonukleotidi 103 5 301 ATCACCGCGCAGGACCATCAGCCCACTCCAGATAGCTGCATCATCAGCAT 350 1 ................................................AT 2 • · · · · 351 GGTTGTGGGCCAGCTTAAGGCGGATGAAGACCCCATCATGGGGTTCCACC ^00 3 GGTGGTGGGCCAGCTGAAGGCTGATGAGGACCCC................ 36 10 PP15-sekvenssi versus PP15-oligonukleotidi 139 • ♦ · · « 401 AGATGTTCCTATTAAAGAACATCAACGATGCTTGGGTTTGCACCAATGAC 450 15 1 ..............AAGAACATCAACGATGCCTGGAC............. 23 PP15-sekvenssi versus PP15-oligonukleotidi 140 • · · · ♦ 151 TACTACCAGTTATTTGATAATGATAGAACCCAACTAGGCGCAATTTACAT 200 20 1 ............TTTGACAATGACCGGACCCAGCTGGGCGCCATCTACAT 38 • · · · · 201 TGACGCGTCATGCCTTACGTOGGAAGGACAACAGTTCCAGGGGAAAGCTG 250 39 TGATGC............................................ 44 : 25 Esimerkki 10 DNA-sekvenssianalwsi

Faagiklooneja PP15-24 ja PP15-18 monistettiin ja niiden DNA uutettiin kummassakin tapauksessa. Vastaava EcoRI-fragmentti eristettiin ja ligatoitiin Bluescript M13 30 -vektorin (Stratagene, San Diego, CA, USA) EcoRI-kohtaan entsymaattisen dideoksimenetelmän avulla Sangerin mukaan restriktioanalyysiä ja sekvenssianalyysiä varten. Sekvenssi osoittaa avoimen lukukehyksen, ja koodaa proteiinia, jolla on enintään 127 aminohappoa. PP15:llä on laskettu 14 95146 molekyylipaino 14 478 d (metioniini mukaanlukien), mikä on yhtäpitävä alussa mainitun patenttijulkaisun DE-A 2 952 729 arvon kanssa.

Esimerkki 11 5 Hylkimistä vastustavan proteiinin PP15 ekspressoi- tuminen

Vektoria pTrc99A [E. Amann et ai. (1988) Gene 69, 301 - 315] käytettiin ei-yhteenliittyneen, kypsän PP15 proteiinin ekspressoitumiseen E. colissa. PP15-cDNA:n DNA-10 sekvenssi aloituskodonin kohdalla on:

Met Gly Asp 5' ... CGCTCCAGA ATG GGA GAC ...3' 15 Koska ATG:ssä ei ole Ncol-kohtaa, DNA:ta ei voida kloonata suoraan pTrc99A-ekspressoitumisvektoriin. Ncol-kohta saadaan kuitenkin kahden emäksenvaihdon avulla PP15-sekvens-sissä: 5' GAATGG 3' mutageneesin kautta 5' CCATGG 3'. Toinen aminohappo (Gly) ei vahingoitu tämän muutoksen aikana, 20 koska PP15:n rakennesekvenssin toinen kodoni alkaa G:llä. Mutageneesiä varten eristettiin PP15-cDNA:n PP15-28-kloo-nin 902 emäsparia suuri EcoRI-fragmentti ja ligatoitiin samalla lailla EcoRI:11a pilkottuun ja defosforyloituun mutageneesivektoriin pMa5-8 (kuvio). Saadulle plasmidille • · :: 25 pMa5-8-PP15 (jolla oli oikea PP15 EcoRI-insertin suunta

Fl-aloituskohtaan nähden) tehtiin sitten "gapped duplex"-mutageneesi [Kramer et ai. (1984) Nucl. Acids. Res. 12, 9441 - 9456], jolloin käytettiin seuraavaa oligodeoksinuk-leotidiä: 30 : 1 5' GGCTTGTCTCCCATGGTGGAGCGTCAC 3'

Klooni, joka sisälsi toivotun mutaation, identifioitiin restriktioanalyysillä ja merkittiin pMc5-8-NcoI.

35 Tältä plasmidilta eristettiin 798 emäsparia suuri Ncol-

II

is 95146 4

EcoRI -fragmentti ja ligatoitiin vastaavasti pilkottuun pTrc99A-vektoriin. Saatu plasmidi pTrc99A-PP15 käsittää 4918 emäsparia ja ekspressoi ei-yhteenliittynyttä, n. 15 kD suurta PP15 proteiinia trc-promoottorin induktion jäl-5 keen.