FI89503C - Kaern-skal-dispersionspolymerer, foerfarande foer deras framstaellning och deras anvaendning - Google Patents

Description

1 39503

Ydin-kuori-dispersiopolymeerejä, menetelmä niiden valmistamiseksi ja niiden käyttö Tämä keksintö koskee ydin-kuori-dispersiopolymee-5 rejä, menetelmää niiden valmistamiseksi ja niiden käyttöä, jotka dispersiopolymeerit koostuvat lateksihiukka-sista, jotka valmistetaan siemenpolymerointimenetelmällä sillä tavalla, että käytettävä siemenpolymeraatti sisältää vielä polymeroitumattornia monomeereja osuutena 5-50 10 paino-% ja siemenpolymerointi tehdään käyttämällä mono- meerejä, joista vähintään yksi on asetaaliryhmiä sisältävä yhdiste.

Niistä saadaan biologisesti aktiivisia dispersio-polymeerejä sitomalla biologisesti aktiivisia aineita, 15 joissa on vapaita aminoryhmiä, keksinnön mukaisten dis-persiopolymeerihiukkasten pinnoilla oleviin reaktiivisiin, funktionaalisista aldehydiryhmistä peräisin oleviin ryhmiin. Nämä biologisesti aktiiviset lateksikonjugaatit soveltuvat serologisiin tai immunologisiin määritysmene-20 telmiin.

On tunnettua, että serologisten tai immunologisten määritysmenetelmien herkkyyttä voidaan parantaa käyttämällä indikaattori- tai kantajahiukkasia, jotka on kuormitettu kyseessä olevalla immunologisella reagenssilla.

25 Kantajamateriaalina voidaan käyttää esimerkiksi veren pu nasoluja tai soluviljelmäsoluja. Tähän tarkoitukseen käytetään myös lateksihiukkasia, joiden läpimitta on 0,02 -5 pm.

EP-hakemuksessa 82110273.8 kuvataan lateksihiukka-30 siä, jotka sisältävät happoamidiryhmien kautta sidottuja funktionaalisia asetaaliryhmiä. Vesipohjaisessa väliaineessa ennalta valmistettuja lateksiytimiä liuotetaan yhdessä vinyylimonomeerien kanssa, jotka sisältävät happoamidiryhmien kautta sitoutuneita funktionaalisia asetaa-35 liryhmiä, ja nämä vinyylimonomeerit, joiden tulee olla riittävässä määrin veteen liukenemattomia, kopolymeroi- 2 89503 daan sitten yhdessä muiden monomeerien kanssa, jotka voivat olla luonteeltaan hydrofiilisiä tai ionisia. Tällaisia reagensseja voidaan käyttää proteiinien nefelomet-riseen tai turbidimetriseen määrittämiseen.

5 Tätä varten sidotaan lateksiin määritettävän pro teiinin vastaista vasta-ainetta. Vasta-aineella kuormitetun lateksin sopivan laimentamisen jälkeen voidaan täten saatua reagenssia käyttää mittauksiin; inkuboitaessa määritettävän antigeenin kanssa muodostuu agglutinaatteja, 10 jotka voidaan mitata nefelometrisesti tai turbidimetri-sesti. Tällä menetelmällä saadut sirontasäteilysignaalit ovat sangen heikkoja, eivätkä siten mahdollista hyvin toistettavissa olevaa mittausta. Reagenssin osoitusherk-kyyden parantaminen ja siten myös tunnetun reagenssin ja 15 osoitettavan antigeenin reaktiossa syntyvien sirontasä-teilysignaalien voimistaminen ei ole ilman muuta mahdollista .

Nyt on yllättävästi havaittu, että kuvatut tunnettujen menetelmien epäkohdat voidaan välttää käyttämällä 20 kantajahiukkasia, jotka valmistetaan menetelmällä, jolle on tunnusmerkillistä se, että käytetään ennalta valmistettuja, loppuun asti polymeroitumattomia lateksihiuk-kasia, joissa huomattava osa käytetyistä monomeereista on vielä polymeroitumatta ja joiden jäännösmonomeeripitoi-25 suus on siis suuri, ja kopolymeroidaan nämä loppuun asti polymeroitumattomat ja siten monomeerin, esimerkiksi styreenin, joukossa olevat lateksiytimet vesipohjaisessa väliaineessa olevien akryyli- tai metakryylimonomeerien, jotka sisältävät happoamidiryhmien kautta sitoutuneita 30 asetaaliryhmiä, ja mahdollisesti akryyli- tai metakryyli-happomonomeerien kanssa.

Keksintö koskee siten ydin-kuori-dispersiopolymee-rejä käytettäviksi diagnostisissa menetelmissä, joissa mitataan hiukkaskoon muutoksia, jotka sisältävät lateksi-35 hiukkasia, joiden pinnalla on kopolymeraattia, joka on valmistettu monomeeriseoksesta, joka sisältää vähintään 3 89503

yhtä asetaaliryhmiä sisältävää yhdistettä, jolla on kaava I

Il 2

5 CH=C-C-N-(CH_) -CH ^ Kaava I

Il I ' 2'n H R^ H 0R3 jossa n = 1 - 6, 10 Rj = H, CH3 ja R2 ja R3 ovat samanlaisia tai erilaisia ryhmiä, jolloin R2, R3 = -(CH2)m - CH3, jossa m = 0 - 7, tai

X

15 -C —Y, jossa X, Y, Z = (CH2)pCH3, ^ z jossa p = 1 - 3, jolloin X, Y ja Z ovat samanlaisia tai erilaisia, tai R2, R3 = akryyliryhmä, 20 ja mahdollisesti sisältää krotoni- ja/tai akryyli- ja/tai metakryylihappoa ja/tai karbosyklisiä, aromaattisia monovinylideeni-monomeerejä.

Keksintö koskee lisäksi menetelmää dispersioiden valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusmerkillistä 25 se, että valmistetaan ensin lateksidispersiosiemen poly-meroimalla monomeereja, esimerkiksi styreeniä, sillä tavalla, että vain 30 - 90 paino-% käytetyistä monomeereis-ta polymeroituu, ja erotetaan sitten ylimääräinen mono-meeri, joka ei ole liuenneena polymeeriin, suodattamalla 30 tai dialysoimalla perusteellisesti, ja lisätään sitten monomeeriseos ja tehdään polymerointi. Tämä seos sisältää kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa on pääteasemassa olevia asetaaliryhmiä, ja mahdollisesti krotoni- ja/tai akryyli- ja/tai metakryylimonomeereja samoin kuin mono-35 meereja, joista siemenpolymeeri koostuu, esimerkiksi styreeniä. Siemenlateksi polymeroidaan edullisesti sillä ta- 4 09503 valla, että vain 40 - 80 paino-% monomeereista polymeroi-tuu. Erityisen edullinen on sellainen menetelmä siemenla-teksin polymeroimiseksi, jossa 50 - 70 paino-% monomeereista polymeroituu.

5 Keksinnölle on tunnusomaista, että ydinlateksi- hiukkasten jäännöspolymeeripitoisuus ennen kuoren polyme-rointia on 5 - 50 paino-% lateksihiukkasista laskettuna. Valmisteet, jotka sisältävät 10 - 40 paino-% monomeeria polymeeristä laskettuna, ovat edullisia. Erityisen edul-10 lisiä ovat valmisteet, jotka sisältävät 20 - 30 paino-% monomeeria polymeeristä laskettuna.

Lateksihiukkasten, joita käytetään keksinnön mukaisten dispersioiden siemendispersioina, tulee olla kalvoa muodostamattomia polymeraatteja. "Kalvoa muodostamat-15 tornina" pidetään polymeerilateksihiukkasia, jotka eivät muodosta kalvoa eivätkä sulaudu yhteen käyttöolosuhteissa. Karbosyklisten, aromaattisten monovinylideenimonomee-rien, kuten styreenin, vinyylitolueenin ja vinyylinafta-leenin, samoin kuin näiden monomeerien seokset keskenään 20 ja/tai metyylimetakrylaatin ja akryylinitriilin kanssa ovat edullisia. Erityisen edullista siemendispersioita ovat polystyreenilateksit. Polystyreenisiemendispersio valmistetaan sinänsä tunnetulla tavalla.

Keksinnön mukaisen dispersiopolymeerin valmistami-25 seksi lisätään ennalta valmistettuun lateksiin, jossa hiukkasläpimitta on 0,02 - 2 pm, edullisesti 0,05 -0,5 pm, ensin emulgaattoria noin 20 - 80 paino-% siitä määrästä, joka tarvittaisiin lateksipinnan peittämiseen kokonaan yksimolekyylikerroksella. Se emulgaattorimäärä, 30 joka johtaa lateksipinnan peittymiseen kokonaan, määritetään tensiometrin avulla. Tällaisia mittauksia ovat kuvanneet esimerkiksi I. Phrma ja S.-R. Chen [Journal of Colloid and Interface Science 74 (1979) 90 - 102] ja ensimmäisen kerran S. H. Maron, M. E. Elder ja I. N.

35 Ulevitch [Journal of Colloid Interface Sciences 9 (1954) 89 - 104].

5 39503

Kyseeseen tulevia emulgaattoreita ovat esimerkiksi pitkäketjuisten, alifaattisten alkoholien, joissa on edullisesti 10 - 20 hiiliatomia, alkyyl.ifenolien, joiden al-kyyliryhmät sisältävät edullisesti 6-12 hiiliatomia, 5 tai dialkyyli- tai trialkyylifenolien, joiden alkyyliryh- mät ovat edullisesti haaroittuneita ja sisältävät kukin 3-12 hiiliatomia, polyglykolieetterit. Esimerkkejä tällaisista aineista ovat etyleenioksidin reaktiotuotteet lauryylialkoholin, stearyylialkoholin, oleyylialkoholin, 10 kookosrasva-alkoholin, oktyylifenolin, ninyylifenolin, di-isopropyylifenolin, tri-isopropyylifenolin, di-t-butyy-lifenolin ja tri-t-butyylifenolin kanssa. Etyleenioksidin ja polypropyleeniglykolin reaktiotuotteet ovat myös soveltuvia.

15 Ionisista emulgaattoreista ovat soveltuvia ennen kaikkea anioniset emulgaattorit, erityisesti alkyylisulfo-naattien tai alkyyliaryylisulfonaattien samoin kuin vastaavien sulfaattien, fosfaattien tai fosfonaattien, joissa on mahdollisesti oksietyleeniyksiköitä kyseessä olevan 20 hiilivetyryhmän ja anionisen ryhmän välissä, alkalimetalli- tai ammoniumsuolat. Esimerkkejä tällaisista aineista ovat natriumdodekyylisulfaatti, natriumlauryylisulfaatti, nat-riumoktyylifenoliglykolieetterisulfaatti, natriumdodekyy-libentseenisulfonaatti, natriumlauryylidiglykolisulfaatti, 25 ammonium-tri-t-butyylifenolipentaglykolisulfaatti ja ammo nium- tri-t-butyylifenolioktaglykoiisuifaatti. Edullisesti käytetään natriumdodekyylisulfaattia.

Siemendispersioon, joka sisältää emulgaattorin lisäksi radikaali-initiaattoria, lisätään pisaroittain 30 ja sekoittaen monomeeriseos, joka sisältää ainakin yhtä kaavan I mukaista asetaaliryhmiä sisältävää yhdistettä. Dispersion lämpötila on + 10 - + 120°C, edullisesti + 50 -90°C.

Polymerointi tehdään sinänsä tunnetulla tavalla 35 radikaaleja muodostavan initiaattorin, esimerkiksi perok- sidiyhdisteen tai alifaattisen atsoyhdisteen, läsnä- 6 39503 ollessa. Initiaattori on vesiliukoinen ja sitä käytetään 0,05 - 10, edullisesti 0,1 - 3 paino-% (monomeerien kokonaismäärästä laskettuna). Tunnettuja radikaaleja muodostavia initiaattoreita ovat esimerkiksi vetyperoksidi, perok-5 sidirikkihapon tai peroksidifosforihapon alkalimetalli tai ammoniumsuolat, esimerkiksi natriumperoksidisulfaatti, kaliumperoksidisulfaatti ja ammoniumperoksidisulfaatti, sekä lisäksi alkyylihydroperoksidit, kuten t-butyylihyd-roperoksidi, dialkyyliperoksidit, kuten di-t-butyyliperok-10 sidi, diasvyliperoksidit, kuten diasetyyliperoksidit, di- lauroyyliperoksidi ja dibentsoyyliperoksidi, samoin kuin atsidi-isovoihapponitriili, atsodikarbonamidi ja atso-gamma, gamma'-bis(4-syaanivaleriaanahappo). Edullisesti käytetään peroksidirikkihapon alkalimetalli- tai ammonium-15 suoloja, kuten natrium-, kalium- ja ammoniumperoksidisul- faattia.

Initiaattoria käytetään mahdollisesti yhdessä pel-kistimen, erityisesti pelkistävän rikkipitoisen hapon alkali- tai maa-alkalimetallisuolan, kanssa; edullisia 20 ovat sulfiitit, bisulfiitit, pyrosulfiitit, ditioniitit, tiosulfaatit ja formaldehydisulfoksylaatit. Myös glukoosia ja askorbiinihappoa voidaan käyttää.

Asetaaliryhmiä sisältävinä monomeereina käytetään kaavan I mukaisia yhdisteitä; edullisesti käytetään akryy-25 li- tai metakryyliamidoalkyylialdehydi-dialkyyliasetaalia, jonka alkyyliryhmä sisältää 2-8 hiiliatomia. Erityisen edullisia ovat akryyli- tai metakryyliamidoasetaldehydi-di-n-pentyyliasetaali.

Kaavan I mukaista yhdistettä sisältävään monomeeri-30 seokseen voidaan lisätä korkeintaan 30 paino-% seoksen kokonaismäärästä styreeniä, vinyylinaftaleenia tai vinyy-litolueenia. Lisäksi monomeeriseos voi sisältää mahdollisesti vielä korkeintaan 30 paino-% seoksen kokonaismäärästä motukryylihappoa, akryylihappoa tai krotonihappoa.

3'1 Siemendispersioon lisätään monomeeriseosta 90-5, edullisesti 40 - 10 paino-% siemendispersion ja monomeeri-seoksen yhteismäärästä laskettuna.

7 39503 Tärkeää siemenpolymeerin läsnäollessa tehtävän polymeroinnin onnistumiselle voi olla se, että monomeeri-seos lisätään pisaroittain koko ajan sekoittaen lateksi-ydinsuspensioon polymerointiolosuhteissa, ts. lämpötilas-5 sa + 10 - + 120°C, edullisesti + 50 - + 90°C. Pisaroittaen tehtävän lisäyksen aikana kiinnittyy lisättävä monomeeri-määrä pysyvästi jo valmiille siemenlateksihiukkasille, polymeroituu siinä ja muodostaa lisää polymeeriä lateksi-hiukkasille.

10 Sen jälkeen polymeraatista poistetaan ylimääräiset monomeerit, initiaattorijäännökset ja emulgaattori tavanomaisesti. On edullista tehdä polymeraatille dialyysi, esimerkiksi NaHCO^-puskuria (0,01 - 0,05 paino-%:inen) vastaan.

15 Keksinnön mukaisten, biologisesti aktiivisten dis persioiden, joita kutsutaan tästedes myös lateksikonju-gaateiksi, valmistamiseksi säädetään edellä kuvattujen siemenpolymeroitujen lateksihiukkasten suspension pH arvoon alle 5, edullisesti alle 3, ja inkuboidaan sitä 20 sidottavan, immunologisesti aktiivisen materiaalin, kuten esimerkiksi vasta-aineiden, antigeenien tai hapteenien, kanssa.

Proteiinin aminoryhmän ja keksinnön mukaisella lateksihiukkasella olevan vapautuneen aldehydin väliset 25 labiilit sidokset pelkistetään tunnetulla tavalla. Tähän tarkoitukseen käytetään edullisesti natriumsyaaniboori-hydridin liuosta neutraalissa puskurissa. Reaktioseokses-ta poistetaan mahdollinen sitoutumaton immunologisesti aktiivinen materiaali tai muut epäpuhtaudet. Tämän on 30 tarkoituksenmukaista tehdä sentrifugoimalla tai pesemäl lä sopivan kalvon päällä.

Keksinnön mukaiset siemenpolymeroidut lateksit ovat erityisen stabiileja. Ne soveltuvat herkkien reagenssien valmistukseen. Keksinnön mukaiset reagenssit voidaan kyl-· 35 mäkuivata.

8 ;< 9 5 ϋ 3

Tunnetuilla menetelmillä valmistetut reagenssit reagoivat nefelometrisen tai turbidimetrisen mittauksen yhteydessä osoitettavan antigeenin kanssa, jolloin tapahtuu agglutinaatio ja siten sirontasäteilysignaalin tai 5 ekstintion voimistuminen kyvetissä. Niinpä on valmistettu esimerkiksi C-reaktiivisen proteiinin määrittämisreagens-si käyttämällä C-reaktiivisen proteiinin (CRP) vastaisia kaniinin vasta-aineita. Kun tämän reagenssin annetaan reagoida erilaisten CRP-pitoisuuksien kanssa ja mitataan 10 sirontasäteilysignaali nefelometrillä 30 min:n inkuboin- nin jälkeen, saadaan standardikäyrä, jossa sirontasäteily voimistuu CRP-pitoisuuden kasvaessa. Kuvio 1 esittää tällaista standardikäyrää. Siitä nähdään selvästi, että käytetyillä CRP-pitoisuuksilla voidaan mitata vain heikkoja 15 sirontasäteilysignaaleja. Siihen liittyy mittauksen huono herkkyys; havaittavuusraja tällä reagenssilla on noin 288 ^ug/1 CRP:tä, ts. CRP-pitoisuuksia 36 - 288 ^,ug/l ei enää voida määrittää.

Keksinnön mukaisella reagenssilla, joka on valmis-20 tettu sitomalla esimerkiksi CRP-vasta-aineita lateksi- valmisteille, jotka on valmistettu siemenpolymeroimalla loppuun asti polymeroimattomille, monomeerijäännöksiä sisältäville polymeereille, tapahtuu sen sijaan paljon voimakkaampi agglotinaatioreaktio sen reagoitua CRP:n 25 kanssa. Kun tämän keksinnön mukaisen reagenssin annetaan reagoida erilaisten CRP-pitoisuuksien kanssa ja mitataan 30 min:n inkuboinnin jälkeen sirontasäteilysignaali nefe-lometrilla, saadaan standardikäyrä, jossa sirontasätei-lysignaalit ovat voimakkaita jo pienilläkin CRP-pitoisuuk-30 silla. Kuvio 2 esittää tällaista standardikäyrää. Nähdään, että reagenssin herkkyys on niin hyvä, että voidaan mitata pieniäkin CRP-pitoisuuksia aina pitoisuuteen 36 ^ug/1 asti. Sirontasäteilysignaali on CRP-pitoisuuksilla 36 -2800 ^ug/1 lisäksi sangen paljon voimakkaampi kuin tähän 35 asti tunnetulla reagenssilla. Tämä merkitsee sitä, että 9 39503 mittauksen toistettavuus on sangen paljon parempi kuin tähänastisilla menetelmillä.

Muita keksinnön mukaisia reagensseja, joilla on vastaavat edulliset ominaisuudet, saadaan kuormittamalla 5 keksinnön mukaiset lateksivalmisteet esimerkiksi alfa- fetoproteiinin (AFP:n), ferritiinin, ihmisen istukkalak-togeenin (HPL:n), tyroksiinia sitovan globuliinin (TGB:n), immunoglobuliini E:n, p^-roikroglobuliinin, raskausspesi-fisen ίί-^-glykoproteiinin ja ihmisen koriogonadotropiinin 10 (SHCG:n) vastakkaisilla vasta-aineilla.

Keksinnön mukaisten reagenssien valmistukseen voidaan edullisesti käyttää myös monoklonaalisia vasta-aineita. Lateksivalmisteet voidaan kuormittaa myös bakteeri- tai virusproteiineilla, kuten esimerkiksi streptoly-15 siini 0:11a, H. influenzae -antigeenillä, Pneumococcus-antigeenilla, kuppa-antigeenilla, toksoplasma-antigee-neilla, BHsAg:lla, vihurirokkoantigeenilla, herpesanti-geenilla ja jäykkäkouristusantigeenilla, ja osoittaa vastaavat vasta-aineet näillä antigeenillä kuormitetuil-20 la, keksinnön mukaisilla reagensseilla.

Lopuksi mainittakoon, että keksinnön mukaiset lateksivalmisteet voidaan samalla tavalla kuormittaa hap-teenijohdoksilla, esimerkiksi hormoneilla tai lääkeaineilla, kuten tyroksiinilla (Teillä), trijodityroniinilla 25 (T^rlla), kortisonilla, progesteronilla, testosteronilla, gentamysiinillä ja digoksiinilla, jolloin saadaan biologisesti aktiivisia dispersiopolymeerejä, siis keksinnön mukaisia reagensseja, joilla voidaan inhibitiotestien kautta, siis käyttämällä samanaikaisesti sopivia vasta-30 aineita, mitata mainittujen hapteenien pitoisuus.

Keksinnön mukaiset lateksivalmisteet ovat yksinkertaisesti valmistettavissa ja yhdistettävissä säästävällä tavalla herkkien immunologisesti aktiivisten materiaalien kanssa diagnostiseksi reagenssiksi.

35 Lateksikonjugaatteja voidaan käyttää kaikissa diag nostisissa menetelmissä, joissa mitataan hiukkaskoon 10 39503 muutoksia, esimerkiksi aineiden kvalitatiivisissa ja puoli-kvantitatiivisissa määrityksissä visuaalisten lateksiagg-lutinaatiotestien avulla samoin kuin hivenainepitoisuuksina esiintyvien proteiinien nefelometrisissa tai turbidi-5 metrisissä määrityksissä suoralla tai kompetitiivisella agglutinaatiotostillä tai lateksi-hapteeni-inhibitiotcs-tillä.

Esimerkkej ä 1. Siemenpolymeraatin valmistus 10 Kaasunsyöttö- ja -poistoputkella ja magneettisau- valla varustettuun lieriön muotoiseen lasiastiaan laitettiin 310 ml typellä kyllästettyä kahdesti tislattua vettä. Lisättiin 500 mg natriumstearaattia ja liuotettiin se sekoittamalla. Lisäksi lisättiin 1,5 ml 25 %:ista ammoniakin kia. Mitattiin pH, ja todettiin sen olevan 11,09. Polyme- rointiastia tehtiin hapettomaksi imemällä se useaan kertaan tyhjäksi kaasuista ja täyttämällä typellä. Detergent-tiliuos kuumennettiin vesihauteen avulla lämpötilaan + 7 0°C koko ajan sekoittaen.

20 Sen jälkeen lisättiin typpi suojakaasuna 90 ml juuri tislattua styreeniä paineentasaimella varustetusta tipu-tussuppilosta polymerointiastiaan. Sekoitettiin 15 min lämpötilassa + 70°C styreenin emulgoimiseksi. Sen jälkeen lämpötila kohotettiin 90°C:seen ja sekoitettiin vielä 25 tunti. Sen jälkeen lisättiin 67,5 mg kaliumproksidisul- faattia liuotettuna 50 ml:aan typellä kyllästettyä tislattua vettä. Sekoitettiin 80 min lämpötilassa + 90°C. Polystyreeni suodatettiin poimusuodattimella. Tällöin suodattimelle jäi näissä olosuhteissa muutamia millilit-30 roja styreeniä. Tätä styreeniä ei voitu liuottaa täydel lisesti polystyreeniin, koska sitä oli jonkin verran ylimäärin.

Suodatettua polystyreeniä dialysoitiin 50 tuntia 10 1:aa vastaan 0,01 paino-%:ista ammoniumvetykarbonaat-35 tiliuosta (0,01 paino-% NH^HCO^sa ja 0,01 paino-% NaN^:ä, i 11 3 9503 pH säädettiin arvoon 10,0 lisäämällä 10,5 ml 25 paino-i:ista ammoniakkia/10 1). Dialyysin jälkeen saatiin 410 ml poly-meraattia, jonka tiheys kuivana oli 12,8 g/dl. Siten noin 60 paino-% käytetystä monomeerista polymeroitui. Pidentä-5 mällä polymerointiaikaa 5-10 min voitiin polymeroitu- neen styreenin osuutta suurentaa ja samalla vähentää poly-styreeniin liuennutta monomeeria.

Lyhentämällä polymerointiaikaa 5-10 min voitiin sitä vastoin pienentää polymeroituneen styreenin osuutta 10 lisäten samalla styreeniin liuenneen monomeerin määrää.

2. Siemenpolymerointi, jossa käytetään esimerkin 1 mukaisesti valmistettua polymeeriä__

Kaasusyöttö- ja poistoputkella ja magneettisauvalla varustettuun lieriön muotoiseen lasiastiaan laitettiin 156,3 ml polystyreenilateksidispersiota, jonka kiintoaine-pitoisuus oli 12,8 paino-%, sekä 238,7 ml tislattua vettä ja 250 mg natriumdodekyylisulfaattia, ja liuotettiin sekoittaen. Tyhjentämällä astia useaan kertaan kaasuista ja täyttämällä se typellä tehtiin polymerointiastia hapetto-20 maksi. Lateksi-detergenttiseos kuumennettiin koko ajan sekoittaen lämpötilaan + 70°C vesihauteessa.

Lisättiin monomeeriseos, joka oli valmistettu styreenistä (2 ml), metakryyliamidoasetaldehydi-di-n-pentyy-liasetaalista (2 ml) ja metakryylihaposta (1 ml), typpi 25 suojakaasuna. Sen jälkeen seos emulgoitiin sekoittaen 1 tunti lämpötilassa noin 20°C.

Sen jälkeen polymerointipanos kuumennettiin lämpötilaan + 70°C vesihauteessa. Kun oli sekoitettu 15 min lämpötilassa + 70°C, aloitettiin kopolymerointi. Sen ai-30 kaansaamiseksi lisättiin 5 ml kaliumperoksidisulfaatti- liuosta (16 mg/ml tislatussa vedessä). Polymerointipanok-sen lämpötila pidettiin + 70°C:na. Sekoitettiin 5 tuntia mainitussa lämpötilassa. Polymeroituminen meni tällöin loppuun, ja dispersio jäähdytettiin huoneen lämpötilaan 35 ja suodatettiin poimusuodattimella. Saatiin 395 ml latek-sisuspensiota. Sitä dialysoitiin 17 tuntia NaHCO^-puskuri- 12 39503 liuosta vastaan (0,25 g/1, pH 8 - 8,2). Saatiin 415 ml lateksidispcrsiota, jonka kiintoainepitoisuus oli noin 6,8 %.

3. Anti-CRP-vasta-aineiden sitominen keksinnön 5 mukaiseen polymeraattiin__

Esimerkin 2 mukaisesti valmistettuun polymeraattiin sidottiin anti-CRP-vasta-aineita. Käytetty polymeraatti laimennettiin tislatulla vedellä kiintoainepitoisuuteen 5,8 paino-%. Antiseerumi, jota saatiin immunisoimalla 10 kaniinit puhdistetulla CRP:llä, eristettiin tunnetulla me netelmällä gammafraktiona. Sen jälkeen sitä konsentroitiin, kunnes saavutettiin proteiinipitoisuus 10 mg/ml.

Sekoitettiin 0,5 ml edellä mainittua polymeraattia ja 0,05 ml anti-CRP-vasta-aineliuosta. Sen jälkeen lisät- 15 tiin 0,025 ml eikosaoksietyleenisorbitaanilauryylihappo- R) esterin (Tween 20) 20-%:ista vesiliuosta, ja sekoitettiin. Lisättiin 0,01 ml 1 N HCl:a, niin että pH-arvoksi tuli noin 2. Kun oli inkuboitu 30 min huoneen lämpötilassa, lisättiin 0,125 ml natriumvetyfosfaatin kylläistä vesi-20 liuosta (pH 6,5) ja 0,125 ml natriumsyaaniboorihydridin vesiliuosta (25 mg/ml), ja sekoitettiin hyvin. Sen jälkeen inkuboitiin 1 tunti huoneen lämpötilassa. Tätä kuor-mituspanosta sentrifugoitiin sitten 30 min suunnilleen kiihtyvyydellä 50 000 x g (Beckman-sentrifugi, kierros-25 nopeus 20 000 min ). Supernatantti heitettiin pois.

Jäännös suspendoitiin 0,75 ml:aan glysiini-NaCl-puskuria /0,1 mol/1 glysiiniä, 0,17 mol/1 NaCl:a ja 0,5 paino-% eikosaoksietyleenisorbitaanilauryylihappoesteriä (Tween®20), pH 8,2/ 30 Sen jälkeen tehtiin 2 s kestävä ultraäänikäsittely (Bronson Sonyfier B 15). Siten takaisindispergoitu reagens-si laimennettiin suhteessa 1:80 edellä mainitulla glysii-ni-NaCl-puskurilla, ja ultraäänikäsiteltiin uudelleen 30 s.

13 i 9 50 3 4. Seeruminäytteiden CRP-pitoisuuksien mittaaminen Reagenssia, joka oli valmistettu esimerkin 3 mukaisesti sitomalla anti-CRP-vasta-aineita keksinnön mukaisiin lateksivalmisteisiin, käytettiin potilasseerumien 5 CRP-pitoisuuksien mittamiseen. Standardina käytettiin LN- CRP-standardia (ihminen) (Fa. Behringwerke AG). Tämä CRP-standardi sisälsi pakkauksessa annettujen tietojen mukaan 86 mg/1 CRP:tä. Standardi laimennettiin glysiini-NaCl-puskurilla (0,1 mol/1 glysiiniä, 0,17 mol/1 NaClra, pH 10 8,2) ensin pitoisuuteen 2,3 mg/1, ja edelleen vaiheittain aina kaksinkertaiseen tilavuuteen. Siten saatiin standardisarja, jossa CRP-pitoisuus pieneni. Mittauksen tekemiseksi sekoitettiin 10 ^ul standardiseerumilaimennosta, 150 ^ul reaktiopuskuria /0,1 mol/1 glysiiniä, 0,17 mol/1 15 NaCl:a, 4 paino-% polyetyleeniglykoli (PEG) 6000:a ja 0,5 paino-% eikosaoksietyleenisorbitaanilauryylihappoes-teriä (Tween® 20), pH 8,27ja 50 ^ul esimerkin 3 mukaista reagenssia BLN-kyveteissä (Fa. Behringwerke AG), ja inku-boitiin 30 min huoneen lämpötilassa. Sitten kyvetit mi-20 tattiin laserefelometrillä (Fa. Behringwerke AG). Stan dardisarjan mittauksista saatu vertailukäyrä piirrettiin puolilogaritmipaperille, ja katsottiin siltä potilassee-rumiarvot. Kuvio 2 esittää tyypillistä vertailukäyrää.

Claims (10)

14 -39503

1. Ydin-kuori-dispersiopolymeerejä käytettäviksi diagnostisissa menetelmissä, joissa mitataan hiukkaskoon 5 muutoksia, jotka sisältävät lateksihiukkasia, joiden pinnalla on kopolymeraattia, joka on valmistettu monomeeri-seoksesta, joka sisältää vähintään yhtä asetaaliryhmiä sisältävää yhdistettä, jolla on kaava I 10 0 0Ro Il 2 CH=C-C-N-(CH«) -CH ^ (I) Il I /n H R1 H ^ 0R3 jossa 15 n = 1 - 6, Rj = H, CH3 ja R2 ja R3 ovat samanlaisia tai erilaisia ryhmiä, jolloin R2, R3 = -(CH2)m - CH3, jossa m = 0 - 7, tai 20 -C-Y, jossa X, Y, Z = (CH2)pCH3, ^ Z jossa p = 1 - 3, jolloin X, Y ja Z ovat samanlaisia tai 25 erilaisia, tai R2, R3 = akryyliryhmä, ja mahdollisesti sisältää krotonihappoa ja/tai akryylihappoa ja/tai metak-ryylihappoa ja/tai karbosyklisiä, aromaattisia monoviny-lideeni-monomeerejä, tunnettu siitä, että ydin-lateksihiukkasten jäännöspolymeeripitoisuus ennen kuoren 30 polymerointia on 5 - 50 paino-% lateksihiukkasista laskettuna .

2. Patenttivaatimuksen 1 mukaisia dispersiopoly-meerejä, tunnetut siitä, että siemenpolymeeri on polystyreenilateksi.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukaisia dispersiopoly- meerejä, tunnetut siitä, että siemenpolymeerin 15 5 9 50 3 jäännösmonomeeripitoisuus on 10 - 40 paino-% polymeeristä laskettuna.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukaisia dispersiopoly-meerejä, tunnetut siitä, että kaavan I mukaisina 5 monomeereina käytetään akryyli- tai metakryyliamidoalkyy-lialdehydi-di-alkyyliasetaaleja, joiden alkyyliryhmässä on 2 - 8 hiiliatomia.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukaisia dispersiopoly-meerejä, tunnetut siitä, että kaavan I mukaisena 10 monomeerina käytetään metakryyliamidoasetaldehydi-di-n- pentyyliasetaalia.

6. Menetelmä dispersiopolymeerien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että valmistetaan ensin siemen-polymeerejä, joiden jäännösmonomeeripitoisuus on 5 - 50 15 paino-%, suorittamalla polymerointi sillä tavalla, että vain 30 - 90 % läsnä olevista monomeereista polymeroituu, erotetaan sitten polymeeriin sitoutumattomat monomeerit ja polymeroidaan sitten siten saatujen siemenpolymeerien läsnä ollessa polymeroidaan monomeeriseos, joka sisältää 20 vähintään yhtä kaavan I mukaista yhdistettä ja lisäksi 0-30 paino-% seoksesta akryyli-, metakryyli- ja/tai krotonihappoa ja/tai vielä 0-30 paino-% myös seoksen kokonaismäärästä laskettuna, karbosyklisiä, aromaattisia vinylideenimonomeerej ä.

7. Biologisesti aktiivisia dispersiopolymeerejä, tunnetut siitä, että ne koostuvat patenttivaatimuksen 1 mukaisista dispersiopolymeereistä ja niihin sidotuista vasta-aineista, antigeeneistä tai hapteeneista.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukaisen biologisesti ak- 30 tiivisen dispersiopolymeerin käyttö antigeenien, vasta- aineiden tai hapteenien diagnostiseen osoittamiseen.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukaisen biologisesti aktiivisen dispersiopolymeerin käyttö nefelometrisessa ja turbidimetrisessä menetelmässä samoin kuin hiukkaslasken- 35 tamenetelmässä. 16 ! 9 5 C 3

10. Diagnostinen aine, tunnettu siitä, että se sisältää biologisesti aktiivisia dispersiopolymee-rejä, jotka koostuvat patenttivaatimuksen 1 mukaisista dispersiopolymeereistä ja niihin sidotuista vasta-aineis-5 ta, antigeeneistä tai hapteeneista. i 17 o 9 5 ϋ 3