DK172505B1 - Kerne-kappe-dispersionspolymere og deres fremstilling, biologisk aktive dispersionspolymere og deres anvendelse, samt diagn - Google Patents

Description

i DK PR 172505 B1

Opfindelsen angår kerne-kappe-dispersionspolymere og deres fremstilling, biologisk aktive dispersionspolymere og deres anvendelse, samt diagnostisk middel.

Kerne-kappe-dispersionspolymerene består af latex-5 partikler, som er fremstillet ved en kimpolymeriserings- fremgangsmåde således, at det anvendte kimpolymerisat desuden indeholder en andel på 5-50 vægtprocent ikke- færdigpolymeri-serede monomere, og kimpolymeriseringen gennemføres med monomere, idet mindst en monomer er en forbindelse indehol-10 dende acetalgrupper.

Man udvinder deraf biologisk aktive dispersions-polymere ved, at man binder biologisk aktive substanser, som råder over frie aminogrupper, til reaktive, af aldehydfunktionen afledede grupper, på overfladen af dispersionspolymer-15 partiklerne ifølge opfindelsen. Disse biologisk aktive latex-konjugater er egnede til serologiske eller immunologiske analysef remaangsmåder .

Det er kendt at øge følsomheden af serologiske eller immunologiske fremgangsmåder til bestemmelse ved an-20 vendeisen af indikator- eller bærerpartikler, som er belæssede med det tilsvarende immunologiske reagens. Som bærermateriale kan man eksempelvis anvende røde blodlegemer eller celler fra en cellekultur. Der anvendes ligeledes latexpartikler med en diameter på 0,02-5 μπι hertil.

25 Fra EP-A nr. 0 080 614 kendes latexpartikler, som indeholder via syreamidgrupper bundne acetalfunktioner. I et vandigt medium kvældes på forhånd fremstillede la-texkerner med vinylmonomere, som indeholder via syreamidgrupper bundne acetal-funktioner, og disse vinylmonomere, 30 som skal være tilstrækkeligt vanduopløselige, copolyroeri-seres derpå sammen med yderligere monomere, som kan være af hydrofil eller ionisk natur. Sådanne reagenser kan anvendes til nephelornetrisk og turbidimetrisk bestemmelse af proteiner.

35 Til dette formål bindes antistoffer mod det pro tein, der skal bestemmes, til latexen. Efter tilsvarende fortynding af den antistof-holdige latex kan det således dannende reagens anvendes til måling: Efter inkubation med DK PR 172505 B1 2 det antigen, der skal bestemmes, dannes agglutinater, som kan måles nephelometrisk eller turbidimetrisk. De således tilvejebragte signaler fra det spredte lys ved denne kendte teknik er ret lave og tillader følgelig ikke nogen god re-5 producerbar måling. En øgning i reagensets analysefølsomhed og dermed forbundet ligeledes en forhøjelse af signalerne fra det spredte lys under omsætningen mellem et reagens ved teknikkens stade og det antigen, der skal påvises, er ikke uden videre mulig.

10 Det har nu overraskende vist sig, at de skildrede ulemper ved teknikkens stade kan overvindes, når man anvender bærerpartikler, som er fremstillet ved, at man anvender på forhånd fremstillede, ikke fuldstændigt færdigpolymeriserede latexkerner, hvori en betragtelig del af de anvendte monomere 15 ikke er polymeriseret, og som altså har et højt restmonomer-indhold, og disse ikke fuldstændigt færdigpolymeriserede og følgelig i den monomere, eksempelvis styren, kvældede latexkerner copolymeriseres i et vandigt medium med acryl- eller methacrylmonomere, som indeholder via syreamidgrupper bundne 20 acetalgrupper, eventuelt sammen med acryl- eller methacryl-syremonomere.

Den foreliggende opfindelse angår således kernekappe -disper s ionspolymere til anvendelse ved diagnostiske metoder, hvorved ændringer af partikelstørrelsen måles, og 25 som indeholder latexpartiker, på hvis overflade der befinder sig et copolymerisat af en monomerblanding, som indeholder mindst en forbindelse med formlen I indeholdende acetalgrupper O s OR2

30 CH = C- C- N- (CH~) - CH^ formel I

' ’ ' ά n \ „ H R-j^ H ORj hvori n = 1-6, R, = H, CH.., og 35 1 * DK PR 172505 B1 3 R2 og R3 er ens eller forskellige, idet R2, R3 = - “ CH3, hvor m = 0-7, eller

/X

5 -C - Y, hvori X, Y, Z = (CH2)pCH3, hvori p = 1-3, og X, Y, Z er ens eller forskellige eller R2, R3 = arylgruppe, og eventuelt indeholder crotonsyre og/eller acrylsyre og/-10 eller methacrylsyre, og/eller carbocycliske, aromatiske monovinyl idenmonomere, hvilke dispersionspolymere er ejendommelige ved, at restmonomerindholdet i kerne-latex-partiklerne før polymerisering af kappen er 5-50 vægt-% af latexpartik-lerne.

15 Den foreliggende opfindelse angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af dispersionspolymere ifølge opfindelsen, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man først fremstiller kimpolymere med et restmonomerindhold på 5-50 vægtprocent ved, at man gennemfører polymeriseringen 20 således, at kun 30-90% af den forud tilsatte monomere færdig-polymeriseres, derpå skilles de ikke til den polymere bundne monomere fra og endelig polymeriseres der i nærvær af den således tilvejebragte kimpolymere en monomerblanding, som indeholder mindst en forbindelse med formlen I og yderligere 25 0-30 vægtprocent, beregnet på blandingen, acryl-, methacryl- og/eller crotonsyre og/eller yderligere 0-30 vægtprocent, atter beregnet på hele blandingen, af carbocycliske aromatiske vinylidenmonomere. Fortrinsvis polymeriseres kimlatexen således, at kun 40-80 vægtprocent af de monomere, som man 30 går ud fra, færdigpolymeriseres. Især foretrækkes en polymerisationsfremgangsmåde for kimlatexen, ved hvilken 50-70 vægtprocent af de forud tilsatte monomere færdigpolymeriseres .

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen får man føl-35 gelig polymerkerner, som desuden indeholder 5-50 vægtprocent af en monomer, beregnet på den polymere. Tilberedninger, som indeholder 10-40 vægtprocent af en monomer, beregnet på den polymere, foretrækkes. Især foretrækkes tilberedninger, som indeholder 20-30 vægtprocent af en monomer, beregnet på den polymere.

DK PR 172505 B1 4

De latexpartikler, som anvendes som kimdispersion til dispersionerne ifølge opfindelsen, skal være ikke-film-dannende polymerisater. Ved "ikke-filmdannende" forstås polymerlatexpartikler, som ikke danner nogen film og un-5 der anvendelsesbetingelserne ikke flyder sammen. Polymerisater af carbocycliske aromatiske monovinylidenmonomere, såsom styren, vinyltoluen og vinylnaphthalen samt blandinger af disse monomere med hinanden og/eller med methyl-methacrylat og acrylonitril, foretrækkes. Polystyren-late-10 xer er især foretrukne kimdispersioner. Fremstillingen af en polystyrenkimdispersion sker ved i og for sig kendte fremgangsmåder.

Til fremstilling af den her omhandlede dispersions -polymere sættes der principielt til en på forhånd fremstillet 15 latex med en partikeldiameter på 0,02-2 μτη, fortrinsvis 0,05-0,5 μτη, fra ca. 20 til ca. 80 vægtprocent af en emulgatormængde, som skulle være nødvendig til en maksimal monomolekylær dækning af latexoverfladen. Målinger til bestemmelse af den emulgatormængde, som leder til en maksimal 20 dækning af latexoverfladen, gennemføres ved hjælp af et tensiometer. De er eksempelvis blevet offentliggjort af I.

Phrma og S.R. Chen i Journal of Colloid and Interface Science, bind 74 (1979), s. 90-102 og første gang af S.H.

Maron, M.E. Elder og I.N. Ulevitch i Journal of Colloid 25 Interface Sciences, bind 9 (1954), s. 89-104.

På tale kommende emulgatorer er eksempelvis poly-glycolethere med langkædede, aliphatiske alkoholer, som fortrinsvis har 10-20 carbonatomer, eller alkylphenol, hvis alkylgruppe fortrinsvis indeholder 6-12 carbonatomer, el-30 ler dialkylphenoler eller trialkylphenoler, hvis alkyl-grupper fortrinsvis indeholder forgrenede alkylgrupper med hver gang 3-12 carbonatomer. Eksempler herpå er omsætningsprodukter af ethylenoxid med laurylalkohol, stearyl-alkohol, oleylalkohol, kokosfedtalkohol, octylphenol, no-35 nylphenol, diisopropylphenol, triisopropylphenol, di-t--butylphenyl og tri-t-butylphenyl. Reaktionsprodukter af

O

DK PR 172505 B1 5 ethylenoxidet med polypropylenglycol er ligeledes egnede.

Af de ioniske emulgatorer er fremfor alt anioniske emulgatorer egnede, især alkalimetal- eller ammoniumsalte af alkylsulfonater eller alkylarylsulfonater samt af de 5 tilsvarende sulfater, phosphater eller phosphonater, som eventuelt har oxyethylen-enheder mellem den hver gang foreliggende carbonhydridgruppe og den anioniske gruppe. Eksempler herpå er natriumdodecylsulfat, natriumlaurylsulfat, natriumoctylphenolglycolethersulfat, natriumdodecylben-10 zensulfonat, natriumlauryldiglycolsulfat, ammonium-tri--t-butylphenolpentaglycolsulfat og ammonium-tri-t-butyl-phenoloctaglycolsulfat. Natriumdodecylsulfat anvendes fortrinsvis .

Til den kimdispersion, som foruden emulgator inde-!5 holder en radikalstarter (initiator), sættes dråbevis under omrøring en monomerblanding, som indeholder mindst en forbindelse med formlen I indeholdende en acetalgruppe. Temperaturen af dispersionen ligger mellem +10°C og +120°C, fortrinsvis mellem +50°C og +90°C.

20 Polymerisationen sker ved i og for sig kendte fremgangsmåder i nærværelse af en radikaldannende initiator, eksempelvis en peroxid-forbindelse eller en alipha-tisk azoforbindelse. Initiatoren er vandopløselig; den anvendes i en mængde fra 0,05 til 10 vægtprocent, fortrins-25 vis fra 0,1 til 3 vægtprocent (beregnet på hele mængden af den monomere). Kendte radikaldannende initiatorer er eksempelvis hydrogenperoxid, alkalimetal- eller ammoniumsalte af peroxydisvovlsyren eller peroxydiphosphorsyren, eksempelvis natriumperoxydisulfat, kaliumperoxydisulfat 30 og ammoniumperoxydisulfat, endvidere alkylhydrogenperoxi- der såsom t-butylhydrogenperoxid, dialkylperoxider såsom di-t-butylperoxid, diacylperoxider såsom diacetylperoxid, dilauroylperoxid og dibenzoylperoxid samt azodiisosmør-syrenitril, azodicarboxamid og azo-gamma,gamma'-bis(4-35 -cyanovalerianesyre). Fortrinsvis anvendes alkalimetal- eller ammoniumsaltene af peroxydisvovlsyren, såsom natrium-, kalium- og ammoniumperoxydisulfat.

DK PR 172505 B1 6

Initiatoren anvendes eventuelt sammen med et reduktionsmiddel, især med et alkalimetalsalt eller jord-alkalimetalsalt med en reducerende virkende svovlholdig syre; fortrinsvis egnede er sulfiter, bisulfiter, pyro-5 sulfiter, dithioniter, thiosulfater og formaldehydsulfoxy-later. Ligeledes anvendelige er også glycose og ascorbin-syre.

Som monomere indeholdende acetalgrupper anvendes forbindelserne med formlen I. Fortrinsvis anvender man 10 acryl- eller methacrylamidoalkylaldehyd-di-alkylacetal med alkyl = C2~Cg. Man anvender især acryl- eller meth-acrylamidoacetaldehyd-di-n-pentylacetal.

Til monomerblandingen indeholdende en forbindelse med formlen I kan man sætte op til 30 vægtprocent, bereg-15 net på hele blandingen, styren, vinylnaphthalen eller vi-nyltoluen. Derudover kan monomerblandingen eventuelt yderligere indeholde op til 30 vægtprocent, beregnet på hele blandingen, methacrylsyre, acrylsyre eller crotonsyre.

Monomerblandingen sættes til kimdispersionen i 20 mængder fra 90 til 5 vægtprocent, fortrinsvis fra 40 til 10 vægtprocent, beregnet på hele mængden af kimdispersion og monomerblanding.

Det kan være hensigtsmæssigt for at opnå en vellykket polymerisation i nærværelse af den kimpolymere, at mono-25 merblandingen under stadig omrøring dråbevis sættes til suspensionen af latexkerner ved polymerisationsbetingelser, dvs. ved en temperatur fra 10 til 120°C, fortrinsvis fra 50 til 90°C. Under den dråbevise tilsætning sætter den tilsatte mængde af den monomere sig hele tiden på de allerede frem-30 stillede kimlatexpartikler, påpolymeriseres der og danner yderligere polymer omkring latexpartiklerne.

Derpå befries polymerisatet fra overskydende monomere, rester af initiator og emulgator ved kendte fremgangsmåder. Fordelagtigt underkaster man polymerisatet en dialyse, 35 eksempelvis mod NaHC03-puffer (0,01-0,05 vægtprocent).

DK PR 172505 B1 7

Opfindelsen angår endvidere: - Biologisk aktive dispersionspolymere, som er ejendommelige ved, at de består af dispersionspolymere ifølge opfindelsen og derpå bundne antistoffer, antigener eller 5 haptener.

- Anvendelsen af en biologisk aktiv dispersionspolymer ifølge opfindelsen til diagnostisk påvisning af antigener, antistoffer eller haptener.

- Anvendelsen af en biologisk aktiv dispersionspoly-10 mer ifølge opfindelsen ved nephelometriske og turbidimetriske fremgangsmåder samt ved part ikel tael lings fremgangsmåde r.

- Et diagnostisk middel, som er ejendommeligt ved, at det indeholder biologisk aktive dispersionspolymere, som består af dispersionspolymere ifølge opfindelsen og derpå 15 bundne antistoffer, antigener eller haptener.

Til fremstilling af de her omhandlede biologisk aktive dispersioner, i det følgende ligeledes betegnet som latexkonjugat, indstilles en dispersion af de ovenfor beskrevne kimpolymeriserede latexpartikler til en pH-værdi, 20 der er under 5, fortrinsvis under 3, og inkuberes med det immunologisk aktive-materiale, der skal bindes, såsom antistoffer, antigener eller haptener.

De labile bindinger mellem en aminogruppe i et protein og det frigivne aldehyd på latexpartiklen ifølge 25 opfindelsen reduceres ved kendte fremgangsmåder. Fortrinsvis anvendes en opløsning af natriumcyanoborhydrid i neutral puffer hertil. Man skiller eventuelt ubundet immunologisk aktivt materiale eller andre forureninger fra reaktionsudgangsblandingen. Dette sker på hensigtsmæssig måde 30 ved centrifugering eller vaskning på egnede membraner.

De her omhandlede kimpolymeriserede latexer udmærker sig ved særlig stabilitet. De egner sig til fremstilling af følsomme reagenser. De her omhandlede reagenser kan tørres ved lyophilisering.

35 Reagenser, fremstillet ifølge teknikkens stade, viser ved nephelometrisk eller turbidimetrisk måling en reaktion med det antigen, der skal påvises, under agglutinering og følgelig forøgelse af signalet fra det spredte

O

DK PR 172505 B1 8 lys eller extinktionen i målekuvetten. Således fremstilles eksempelvis et reagens til bestemmelse af C-reaktivt protein, en vigtig betændelsesparameter, under anvendelse af kanin-antistoffer målt C-reaktivt protein (CRP). Omsættes 5 dette reagens med forskellige CRP-koncentrationer, og måles signalerne fra det spredte lys i et nephelometer efter 30 minutters inkubationstid, får man således en standardkurve, som viser højere signaler fra det spredte lys med tiltagende CRP-koncentration. En sådan standardkurve 10 er vist på tegningen i fig. 1. Man ser tydeligt, at der ved de anvendte koncentrationer af CRP kun kan måles lave signaler fra spredt lys. I sammenhæng dermed står en ringe følsomhed af målingen, den nedre påvisningsgrænse for reagenset ligger på ca. 288 μg/liter CRP, dvs., at koncentra-15 tioner af CRP i området mellem 36 pg/liter og 288 pg/liter ikke længere kan omfattes.

Det her omhandlede reagens, fremstillet ved binding af antistoffer, eksempelvis mod CRP, på latextilbe-redninger, udvundet ved kimpolymerisering på ikke-færdig-20 polymeriserede polymere indeholdende restmonomere, viser derimod en meget stærkere agglutineringsreaktion efter omsætning med CRP. Omsættes dette her omhandlede reagens med forskellige CRP-koncentrationer, og måles efter 30 minutters inkubationstid signalerne fra det spredte lys i et 25 nephelometer, får man således en standardkurve, som allerede ved lave CRP-koncentrationer viser høje signaler fra det spredte lys. En sådan standardkurve er vist i fig. 2.

Man ser, at følsomheden af reagenset er så højt, at man også kan måle lave CRP-koncentrationer ned til 36 ug/liter.

30 Hertil kommer, at signalerne fra det spredte lys for CRP- -koncentrationer mellem 36 og 2300 Mg/liter er meget højere end for et reagens ifølge teknikkens stade. Dvs., at reproducerbarheden af målingen er meget bedre end ifølge teknikkens stade.

35

O

DK PR 172505 B1 9

Yderligere her omhandlede reagenser med tilsvarende fordelagtige egenskaber får man, når de her omhandlede latextilberedninger eksempelvis er belastede med antistoffer mod alpha-føtoprotein (AFP), Ferritin, Human Placen-5 tal Lactogen (HPL), Thyroxin, bindende Globulin (TBG),

Immunoglobulin E, B2“Mi-cro9l°bulin' svangerskabsspecifikt B-^-Glycoprotein og Human chorionic Gonadotropin (BHCG).

Man kan ligeledes fordelagtigt anvende monoklo-nale antistoffer til fremstilling af reagenserne ifølge 10 opfindelsen. På samme måde kan latextilberedninger belastes med bakterielle eller virale proteiner, såsom Streptolysin 0, Streptococcus B Antigen, H. Influenza Antigen, Pneumococcus Antigen, Lues Antigen, Toxoplasma-antigener, HBsAg, Rubella Antigen, Herpes Antigen og Tetanus Antigen, 15 0g de tilsvarende antistoffer kan påvises med disse her omhandlede antigen-holdige reagenser.

Endelig kan på samme måde latextilberedninger i-følge opfindelsen belastes med derivatiserede haptener, såsom hormoner eller lægemidler, såsom Thyroxin (T4), 20 Trijodothyronin (T^), Cortisol, Progesteron, Testosteron,

Gentamycin og Digoxin, hvorved man får biologisk aktive dispersionspolymere, dvs. reagenserne ifølge opfindelsen, ved hjælp af hvilke man ved inhiberings-prøver, dvs. under samtidig anvendelse af egnede antistoffer, kan måle koncen-25 trationen af de nævnte haptener.

De her omhandlede latextilberedninger er enkle at fremstille og det er skånsomt at binde dem med følsomme immunologisk aktive materialer til dannelse af et diagnostisk reagens.

Latexkonjugaterne kan anvendes ved alle diagnos-30 tiske fremgangsmåder, som måler partikelstørrelsesforandrin ger, eksempelvis i kvantitative og semikvantitative analyser af stoffer ved hjælp af visuelle latex-agglutinerings-prøver, samt i nephelometriske eller turbidimetriske analyser af sporproteiner ved den direkte eller kompetitive 35 agglutineringsprøve eller ved latex-hapten-inhiberings-prø- ven.

DK PR 172505 B1 10 o

EKSEMPLER

1. Fremstilling af kimpolymerisat

Til en cylindrisk glasbeholder, udstyret med gastil- og gasafgangsrør samt en lille magnetrørestav, sættes 5 der 310 ml nitrogenmættet bidestilleret vand. Der tilsættes 500 mg natriumstearat, og dette opløses under omrøring. Endvidere tilsættes 1,5 ml 25%1 s ammoniak-opløsning. pH--værdien kontrolleres og er 11,09. Ved at evakuere og fylde med nitrogen flere gange gøres polymerisationsbeholder-10 en fri for oxygen. Under uafbrudt omrøring opvarmes detergent-opløsningen ved hjælp af et vandbad til 70°C.

Derpå sætter man 90 ml frisk-destilleret styren under nitrogen ved hjælp af en skilletragt med trykudligning til polymerisationsbeholderen. Ved 70°C omrøres der 15 i 15 minutter til emulgering af styrenen. Derpå hæves temperaturen til 90°C, og der røres i yderligere 1 time. Derefter tilsættes 67,5 mg kaliumperoxydisulfat, opløst i 50 ml nitrogenmættet destilleret vand. Man lader ororøre i 80 minutter ved 90°C. Polystyrenen tilsættes gennem et fol-20 defilter. Herved bliver eventuelt nogle ml styren tilbage på filteret. Denne styren kan, da noget er til stede i overskud, ikke fuldstændigt opløses i polystyren.

Den filtrerede polystyren dialyseres mod 10 liter 0,01 vægtprocents ammoniumhydrogencarbonat-opløsning (med 25 0,01 vægtprocent NH4HCC>3, 0,01 vægtprocent NaN^, indstil let med 10,5 ml 25 vægtprocents ammoniak-opløsning i 10 liter til en pH-værdi på 10,0) i 50 timer. Man får efter dialyse 410 ml polymerisat med en tørvægt på 12,8 g/dl.

Følgelig er ca. 60 vægtprocent af den anvendte monomere 30 blevet polymeriseret. Ved en forlængelse af polymerisationstiden med 5-10 minutter kan man øge andelen af den polymeriserede styren ved samtidig reduktion af den i polystyrenen opløste monomere.

Ved en reduktion i polymeriseringstiden med 5-35 -10 minutter kan andelen af den færdigpolymeriserede sty ren derimod reduceres ved samtidig øgning af den i styrenen opløste monomere.

DK PR 172505 B1 11 o 2. Kimpolymerisering under anvendelse af den ifølge eksempel 1 fremstillede polymere

Til en cylindrisk glasbeholder, udstyret med gas-ind- og gasafgangsrør samt en lille magnetrørestav sættes 5 156,3 ml af en polystyren-latex-dispersion med et indhold af faste stoffer på 12,8 vægtprocent samt 238,7 ml destilleret vand og 250 mg natriumdodecylsulfat, og der opløses under omrøring. Ved at evakuere og fylde med nitrogen flere gange gøres polymeriseringsbeholderen fri for oxygen. La-1o tex-detergent-blandingen opvarmes under uafbrudt omrøring til 70°C i et vandbad.

Der tilsættes en monomerblanding, fremstillet ud fra 2 ml styren, 2 ml methacrylamidoafcetaldehyd-di-n--pentylacetal og 1 ml methacrylsyre under nitrogen. Der-15 på emulgerer man under omrøring i 1 time ved ca. 20°C.

Derefter opvarmes polymerisationsblandingen i et vandbad til 70°C. Efter 15 minutters omrøring ved 70°C startes copolymeriseringen. Hertil sætter man 5 ml af en kaliumperoxydisulfatopløsning (16 mg/ml i destilleret vand).

20 Temperaturen af polymeriseringsblandingen holdes på 70°C.

Man omrører i 5 timer ved den nævnte temperatur. Polymeri-seringen er dermed tilendebragt, og dispersionen afkøles til stuetemperatur og filtreres ved hjælp af foldefilter.

Man får 395 ml af en latexsuspension. Denne dialyseres der-25 på i 17 timer mod en NaHCO^-pufferopløsning (0,25 g/liter, pH-værdi = 8-8,2). Man får 415 ml af en latex-dispersion med et indhold af faste stoffer på 6,8 vægtprocent.

3. Binding af anti-CRP-antistoffer til et polymerisat i-følge opfindelsen.

Til et polymerisat, fremstillet ifølge eksempel 2, bindes anti-CRP-antistoffer. Det anvendte polymerisat fortyndes med destilleret vand til et indhold af faste stoffer på 5,8 vægtprocent. Et antiserum, udvundet ved immuni-sering af kaniner med oprenset CRP, isoleres ved kendte fremgangsmåder som gammafraktion. Man koncentrerer derpå, indtil der fås et proteinindhold på 10 mg/ml.

O

DK PR 172505 B1 12 0,5 ml af det ovennævnte polymerisat blandes med 0,05 ml af anti-CRP-antistof-opløsningen. Derpå tilsættes 0,025 ml af en 20%'s vandig opløsning af eikosaoxyethylen--sorbitanlaurylsyreester (Tween® 20), og det hele blan-5 des endnu engang. Hertil sætter man 0,01 ml 1 N HC1 således, at man opnår en pH-værdi på ca. 2. Efter en inkubationstid på 30 minutter ved stuetemperatur tilsætter man 0,125 ml mættet vandig natriumhydrogenphosphat-opløsning (pH-værdi =6,5) og 0,125 ml vandig natriumcyanoborhydrid-10 -opløsning (25 mq/ml) og blander godt igennem. Derefter sker en inkubation med en varighed på 1 time ved stuetemperatur. Denne udgangsblanding centrifugeres derefter i 30 minutter ved ca. 50.000 g (Beckman Zentrifuge, 20.000 opm).

Den ovenstående væske kastes bort. Remanensen gensuspende-15 res i 0,75 ml af en glycin-NaCl-puffer (0,1 mol glycin, 0,17 mol NaCl, 0,5 vægtprocent eikosaoxyethylen-sorbitan-laurylsyreester (Tween® 20), pH-værdi = 8,2).

Derefter følger en ultralyd-behandling (Bronson Sonyfier B 15) i 2 sekunder. Det således gendispergerede 20 reagens fortyndes i et volumenforhold på 1:80 med den o- venfor nævnte glycin-NaCl-puffer og behandles endnu engang i 30 sekunder med ultralyd.

4. Måling af CRP-koncentrationer i serumprøver 25 Man anvender det ifølge eksempel 3 ved binding af anti-CRP-antistoffer til her omhandlede latextilberedninger fremstillede reagens til bestemmelse af CRP til måling af CRP i patientsera. Som standard anvendes LN-CRP-standarden (human) (Fa. Behringwerke AG). Denne CRP-standard indehol-30 der ifølge forpakningsbilaget 86 mg CRP/liter. Standarden fortyndes i glycin-kogsalt-puffer (0,1 mol glycin, 0,17 M NaCl, pH-værdi = 8,2) først til 2,3 mg/liter og derpå trinvis til hver gang det dobbelte volumen. Man får således en standardrække med aftagende CRP-koncentrationer. Til må-35 ling blandes 10 pliter standardserumfortynding med 150 0 13 DK PR 172505 B1 yliter af en reaktionspuffer (0,1 mol glycin, 0,17 mol NaCl, 4 vægtprocent polyethylenglycol (PEG) 6000, 0,5 vægtprocent eikosaoxyethylen-sorbitanlaurylsyreester (Tween ® 20), pH-værdi = 8,2 og med 50 Mliter reagens i-5 følge eksempel 3 i BLN-kuvetter (Fa. Behringwerke AG) og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur. Kuvetterne måles derpå i et lasernephelometer (Fa. Behringwerke AG). Referencekurven for målingen af standardsera aftegnes på semilogaritmisk papir og ved det vurderes måleværdierne 10 for patientsera. En typisk referencekurve er angivet i fig. 2.

15 20 25 30 35

Claims (10)

1. Kerne-kappe-dispersionspolymere til anvendelse ved diagnostiske metoder, hvorved ændringer af partikelstørrelsen måles, og som indeholder latexpartikler, på hvis 5 overflade der befinder sig et copolymerisat af en monomer-blanding, som indeholder mindst en forbindelse med formlen I indeholdende acetalgrupper O ^0R2 CH = C - C - N - (CH7) - CH formel I H Rx H ^OR3 hvori n = 1-6, = H, CH3, og

15 R2 og R3 er ens eller forskellige, idet r2' r3 = ' (CH2^m " ch3, hvor m = 0-7, eller -C - Y, hvori X, Y, Z =* (CH2)pCH3, hvori p = 1-3, 20 og X, Y, Z er ens eller forskellige eller R2, R3 = arylgruppe, og eventuelt indeholder crotonsyre og/eller acrylsyre og/-eller methacrylsyre og/eller carbocycliske, aromatiske mono-25 vinylidenmonomere, kendetegnet ved, at restmono-merindholdet i kerne-latexpartiklerne før polymerisering af kappen er 5-50 vægtprocent af latexpartiklerne.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af dispersionspolymere ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man 30 først fremstiller kimpolymere med et restmonomerindhold på 5-50 vægtprocent ved, at man gennemfører polymeriseringen således, at kun 30-90% af den forud tilsatte monomere færdig-polymeriseres, derpå skilles de ikke til den polymere bundne monomere fra og endelig polymeriseres der i nærvær af den 35 således tilvejebragte kimpolymere en monomerblanding, som indeholder mindst en forbindelse med formlen I og yderligere DK PR 172505 B1 15 0-30 vægtprocent, beregnet på blandingen, acryl-, methacryl-og/eller crotonsyre og/eller yderligere 0-30 vægtprocent, atter beregnet på hele blandingen, af carbocycliske aromatiske vinylidenmonomere.

3. Dispersionspolymere ifølge krav 1, kende tegnet ved, at kimpolymeren er polystyren-latex.

4. Dispersionspolymere ifølge krav 1, kendetegnet ved, at kimpolymeren har et restmonomerindhold på 10-40 vægtprocent, beregnet på den polymere.

5. Dispersionspolymere ifølge krav 1, kende tegnet ved, at man som monomere med formlen I anvender acryl- eller methacrylamidoalkylaldehyd-di-alkyl-ace-tal, hvori alkyl = C2_g.

6. Dispersionspolymere ifølge krav 1, kende- 15 tegnet ved, at man som monomer med formlen I anvender methacrylamidoacetaldehyd-di-n-pentylacetal.

7. Biologisk aktive dispersionspolymere, kendetegnet ved, at de består af dispersionspolymere ifølge krav 1 og derpå bundne antistoffer, antigener eller 20 haptener.

8. Anvendelse af en biologisk aktiv dispersionspolymer ifølge krav 7 til diagnostisk påvisning af antigener, antistoffer eller haptener.

9. Anvendelse af en biologisk aktiv dispersions- 25 polymer ifølge krav 7 ved nephelometriske og turbidimetriske fremgangsmåder samt ved partikeltællingsfremgangsmåder.

10. Diagnostisk middel, kendetegnet ved, at det indeholder biologisk aktive dispersionspolymere, som består af dispersionspolymere ifølge krav 1 og 30 derpå bundne antistoffer, antigener eller haptener.