FI89449C - Foerfarande foer framstaellning av en vaermeresistant, icke-bitter, vattenloeslig peptidprodukt - Google Patents

Description

! 89449

Menetelmä lämmönkestävän, ei-karvaan vesiliukoisen peptidituotteen valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää lämpökestoisen, ei-karvaan, helposti veteen liukenevan peptidituotteen valmistamiseksi kaseiinia sisältävistä heran proteiinimateriaaleista.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja peptidituot-teita voidaan käyttää proteiineja täydentävinä ja korvaavina aineina ravintoaineissa ja virvokkeissa ja aineosana diee-tei ssä.

Viime vuosina on esiintynyt lisääntynyttä kiinnostusta pepti-dituotteiden valmistamiseksi sellaisiin tarkoituksiin, ja näillä tuotteilla on oltava neutraali maku, ne eivät saa olla karvaita, niiden on oltava helposti veteen liukenevia ja läm-pökestoisia. Heraproteiinien välttämättömien aminohappojen sisältö on hyvin edullinen, ja ne ovat huokeita ja helposti saatavissa suurina määrinä, ja peptidi tuotteiden valmistusmenetelmät edellä mainittuihin tarkoituksiin heraproteiineista luovat erityistä kaupallista mielenkiintoa.

Erilaisista sellaisista menetelmistä on laadittu ehdotuksia.

US-patenttijui kaisussa 4107334 tuodaan esille menetelmä liukoisen peptidituotteen valmistamiseksi, jonka mukaan heraproteiinia kuumennetaan kunnes 50 Ϊ proteiinista on saostunut. Saostunut heraproteiini, jota nimitetään 1aktalbumiiniksi, saatetaan lievään proteolyyttiseen, entsymaattiseen hydrolyy-siin, josta on tuloksena hydrolysaatti, jossa pääosa proteiineista on pilkkoutuneena liukoisiksi peptideiksi. Hydroly-saattia käsitellään sen jälkeen lämmöllä käytetyn proteinaa-sin inaktivoi mi sek si. Mainitun lämpökäsittelyn käyttäminen, 2 89449 koskien sekä 1aktalbumiinin valmistusta että proteinaasin inaktivoi nti a, tuo kuitenkin mukanaan tärkeiden rikkipitoisten aminohappojen menetyksen, epämiellyttävien aromien muodostumisen, ja laktoosin läsnä ollessa Maillard- reaktiotuotteiden muodostumisen, jotka usein ovat ai 1ergeenisiä (ks. esim. Otani, H. ja Tokitz, F. 1982, Japan J. Zootechn. Sei. Voi. 53, sivu 344, ja Matsuda, T et ai 1985, J. Food Sei. Voi. 50 , sivu 618).

US-patenttijui kaisussa 4293571 tuodaan myös esille menetelmä peptidi tuotteen valmistamiseksi esimerkiksi heraproteiinista entsymaattisen hydrolyysln avulla, jota seuraa lämpökäsittely. UItrasuodatuksen jälkeen saadulla peptidituotteel1 a on samoja haittatekijöitä kuin mitä mainittiin edellä mainitun lämpökäsittelyn tuotteen yhteydessä.

EP-patenttihakemukset 0065663 ja 0022019 koskevat menetelmiä peptidituotteiden valmistamiseksi heraproteiinin entsymaatti-sen hydrolyysin avulla, jotka koostuvat pääasiallisesti pienistä peptideistä, käsittäen peptidit 5 aminohappotähteeseen saakka, ja joita on tarkoitus käyttää eri koisdieeteissä potilaille, joilla on alentunut tai puuttuva kyky sulattaa ja/tai absorboida proteiineja sisältävää ruokaa. EP-patenttihakemus 0065663 koskee näin ollen peptidituotetta, joka sisältää vähintään 50 paino-% aminohappojen, dipeptidien ja tripeptidien yhdistelmää, eikä enempää kuin 25 paino-% polypeptidejä, jotka sisältävät 10 tai enemmän aminohappoa, kun taas patenttihakemus 0022019 koskee peptidituotetta, jossa vähintään 50 % peptidien määrästä sisältää 2-5 aminohappotähdettä, ja vapaiden aminohappojen osuus on vähemmän kuin 15 %.

Useimmat proteiinit pyrkivät hydrolysoitaessa tuottamaan peptidejä, joiden maku on karvas, ja karvaus on voimakkainta, mikäli kysymyksessä ovat lyhytketjuiset peptidit, jotka si- 3 89449 säitävät alle 10 aminohappoa, erityisesti 4-8 aminohappoa. Peptidi tuotteet, jotka sisältävät runsaasti peptidejä, joissa on alle 10 aminohappoa, voivat sen vuoksi olla aromiltaan hyvin karvaita. Ottamalla huomioon se tosiseikka, että hydrofobiset aminohapot ovat karvaita, samalla kun monet polaariset aminohapot maistuvat suolaiselle, suuri määrä vapaita aminohappoja aiheuttaa myös ongelmia aromin suhteen. Suuri määrä vapaita aminohappoja saa lisäksi aikaan tuotteen, jonka osmo-laarisuus on korkea, mikä ehkäisee nesteen absorboitumista sellaisesta tuotteesta.

Edellä olevan johdosta, EP-patenttihakemuksissa 0065663 ja 0022019 esille tuoduilla tuotteilla on hyvin rajoitettu käyttöalue, nimittäin erityiset dieetti vai misteet potilaille, jotka kärsivät mahan ja suolen toimintahäiriöstä.

Erilaisia menetelmiä karvaan maun eliminoimiseksi on esitetty. Karvaat peptidit ovat yleensä hydrofobisia, ja tätä voidaan käyttää hyväksi karvaiden peptidien poistamiseksi valikoivasti, uuttamalla orgaanisilla liuottimilla tai adsorboimalla aktiivihiileen, lasikuituihin tai muuhun hydrofobiseen materiaaliin.

US-patenttijui kaisussa 4075195 tuodaan esille menetelmä, joka käsittää adsorption fenolisubstituoituun hartsiin.

Mainittuja menetelmiä haittaavat kuitenkin sellaiset tekijät, että niissä menetetään tiettyjä välttämättömiä, hydrofobisia aminohappoja, ja että käytetyt adsorbentit on regeneroi tava suurilla määrillä orgaanisia liuottimia.

GB-patenttijui kaisussa 1338936 tuodaan esille menetelmä, jonka mukaisesti karvaat peptidit pilkotaan käyttämällä ekso-peptidaaseja. Mainittu pilkkominen johtaa kuitenkin peptidi- 4 39449 tuotteiden muodostumiseen, jotka sisältävät runsaasti vapaita aminohappoja, mikä ei ole toivottavaa kuten edellä mainittiin.

Kuten edellä olevasta ilmenee, aikaisemmat peptidi tuotteet, jotka saatiin heraproteiinin entsymaattisen hydrolysoinnin avulla, sisältävät haittatekijöitä mitä tulee makuun ja/tai aminohappokoostumukseen.

Keksinnön tarkoituksena on sen vuoksi tuoda käyttöön menetelmä 1ämpökestoisen, ei-karvaan, helposti veteen liukenevan peptidi tuotteen valmistamiseksi heraproteiinin entsymaattisen hydrolysoinnin avulla, ja johon ei liity edellä olevia haittatekijöitä.

Yllättäen on nyt osoitettu, että heran proteiinimateriaalin hydrolysointi, josta kaseiini on eliminoitu yhden tai useamman proteinaasin avulla, johtaa peptidi tuotteen muodostumiseen, joka ei sisällä karvasta aromia.

Mainittu päämäärä toteutetaan niin muodoin menetelmän avulla, jota keksinnön mukaisesti luonnehditaan seuraavilla vaiheilla: a) kaseiinin eliminointi heran proteiinimateriaalista, b) kohdan a) mukaisesti saadun heran kaseiinivapaan protei i ni materi aal i n hydrolysointi vähintään yhdellä protei-n a a s i 11 a , c) kohdassa b) saadun hydrolysaatin uitrasuodatus membraanin läpi, jonka cut-off-arvo (ekskluusi oraja-arvo) ei ylitä 20000 Daltonia, minkä jälkeen suodoksen talteenotto, ja myöhemmin, niin haluttaessa, suodoksen konsentroi nti ja/tai kuivaus.

Lähtömateriaalina käytetty, kaseiinia sisältävä heran protei i nimateri aal i voi olla mitä tahansa heramateriaalia, joka sisältää heran proteiinia (määriteltynä tässä patenttihakemuksessa herasta saatavissa olevana proteiinina, erillään ka- 5 89449 sei inistä), (nestefaasi kaseiinin saostamisen jälkeen joko juustonvalmistuksen yhteydessä tai teollisessa kaseiinin tuotannossa), kuten esimerkiksi makea hera tai hapan hera, hera-konsentraatit ja heran proteiinikonsentraatit, saatuna ultra-suodatuksen tai sen 1ämpödenaturoinnin (1aktalbumiini) avulla.

Heran jäännöskaseiinisisä1tö muodostaa tyypillisesti noin 30 % (kuiva-aineesta) materiaalin kokona i sprotei inisi säilöstä.

Kaseiini, jota vesi faasissa on läsnä suspendoituneina kömpi ek -seina, voidaan keksinnön mukaisen menetelmän suoritusmuodon mukaan eliminoida heraproteiinista suodattamalla pois kaseiini parti kkel i t membraanilla, jonka huokoskoko on sellainen, että kaseiinipartikkelit pidättyvät, samalla kun heran proteiinit läpäisevät suotimen .

On osoitettu lisäksi, että kaseiini voidaan eliminoida herasta, jota ei ole lämpökäsitelty, keksinnön mukaisen menetelmän edullisemman suoritusmuodon mukaan, säätämällä sen pH-arvo suurin piirtein kaseiinin isoelektriseen pisteeseen, so. 4,5-5,0 lisäämällä happoa ja samanaikaisesti lisäämällä

CaCl :ta, minkä jälkeen seos jätettiin vähintään yhdeksi tun-2 o o o niksi 30 C-50 C:een, edullisesti 40 C:een. Näin seostettu kaseiini voidaan helposti erottaa suodattamalla tai sentrifugoi-malla. Sentrifugointi , esim. Westfalian separaattorilla, on edullinen kun panokset ovat suuria. Happona käytetään esimer-merkiksi HC1 : ää .

Lisätyn C a Cl :n määrä on edullisesti alueella 1-25 g/100 1 2 välillä. Tässä suoritusmuodossa on tärkeätä, ettei heraproteiineja ole lämpökäsitelty, mikä tuo mukanaan denaturaation ja siten heraproteiinien saostumisen, jotka saostuvat yhdessä kaseiinin kanssa.

Yllättäen on lisäksi todettu, että Bacillus subtili k sen neutraali metal 1iproteinaasi (Neutrase, Novo Industri A/S, Tanska) 6 39449 on hyvin aktiivinen kaseiineja kohtaan, mutta ei lainkaan tai vain heikosti aktiivinen natiiveja kuin myös lämmöllä denaturoituja heraproteiineja kohtaan. Näin ollen on osoitettu, että kaseiini voidaan eliminoida heraproteiinimateriaalista hydrolysoimalla kaseiini Bacillus subtiUksen neutraalin metallipro- teinaasin avulla. Hydrolysoi nti voidaan toteuttaa pHrssa 4-9, o o edullisesti pHrssa 7,5, ja 1ämpötilassa alueella 30 C-60 C, o edullisesti 50 C. Hydrolyysin annetaan edullisesti mennä loppuun, so. kunnes saavutetaan noin 4 ϊ:η hydrolysoitumisaste, proteiinien kokonaismäärästä riippuen. Käytetyn neutraasin ja heraproteiinien määrien välinen suhteellinen osuus ei ole kriittinen tekijä, koska entsyymien määrä pelkästään määrää sen, kuinka nopeasti tavoiteltu hydrolyysiaste saavutetaan.

Kaseiinin pi 1kkoutumistuotteet voidaan eliminoida ultrasuoda-tuksen tai sentrifugoinnin avulla. Jos heran proteiinit ovat lämpökäsittelyn johdosta saostuneet, voidaan kaseiinin pilk-koutumistuotteet eliminoida uitrasuodatuksel1 a membraanin läpi, jonka huokoskoko mahdollistaa niiden läpimenon, tai sentrifugoinnin supernatantin mukana. Jos heran proteiineja on käsitelty vain lievästi tai ei lainkaan lämmöllä, ja ne ovat pääasiallisesti läsnä natiiveina proteiineina, kaseiini voidaan eliminoida uitrasuodatuksel1 a käyttäen membraania, jonka cut-off-arvo ei ylitä 20000.

Sen jälkeen kun kaseiini on eliminoitu heraproteiinista, tämä voidaan konsentroida, edullisesti suodattaen uitrasuodatus-membraani11 a, jonka cut-off-arvo ei ylitä 20000, esimerkiksi kunnes saavutetaan 5 im proteiinipitoisuus. Tämän seurauksena saadaan laktoosi erottumaan, edullisesti kunnes saavutetaan laktoosipitoisuus, joka ei ylitä 0,1 %, ja mahdollisesti läsnä olevat suolat, mikä voi olla edullista, jotta saataisiin peptidituotteita, joista puuttuu laktoosi, ja joiden os-molaarisuus on alhainen.

7 39449

Menetelmän mukaisen vaiheen b) mukaisesti saatujen kaseiini-vapaiden heraproteiinien hydrolysoi nti voidaan suorittaa millä tahansa proteinaasilla. Hydrolysoi nti voidaan esimerkiksi toteuttaa useilla erilaisilla proteinaaseilla perättäisesti tai samanaikaisesti ja valinnaisesti useammassa vaiheessa, joiden välillä on ultrasuodatus. On edullista käyttää seuraavia pro-tei naaseja:

Corolase PP (porsaan haimaproteinaasit - Rhom - Saksan liittotasavalta) ,

Rhozyme P41 (Aspergillus oryzaen proteinaasi - G^nencore -USA),

Pronase (Streptomyces griseuksen proteinaasi - Sigma),

Alcalase 2,4 L (Bacillus 1icheniformiksen proteinaasi, Novo

Industri A/S - Tanska), tai trypsiini (Novo Industri A/S - Tanska).

Käytettyjen entsyymien ja heraproteiinien määrien väliset suhteelliset osuudet eivät ole kriittisiä, koska se ei oleellisesti vaikuta peptidi tuotteen koostumukseen eikä saantoon, vaan asialla on merkitystä ainoastaan mitä tulee aikaan, joka kuluu halutun hydrolysointiasteen saavuttamiseksi.

Hydrolyysi saadaan edullisesti aikaan pH-arvossa noin 7,5 ja o lämpötilassa noin 50 C. Hydrolysointia jatketaan, kunnes saavutetaan hydrolyysiaste, joka vaihtelee välillä 8 ja 18 %, joka on riippuvainen saadun peptidi tuotteen sisältämien peptidien tavoitellusta kokojakaumasta ja tavoitellusta saannosta. Hydrolyysiastetta voidaan esimerkiksi mitata pH-staatti-menetelmän mukaan (ks. Adler-Nissen, J.J. Chem. Tech. Bio-technol . voi. 32, sivut 138-156 ).

Ultrasuodatus toteutetaan menetelmän vaiheen c) mukaisesti, kuten mainittiin, membraanin läpi, jonka cut-off-arvo ei ylitä 20000 Daltonia, erottaen siten kaseiinivapaiden herapro- β 39449 te 11nlmateriaal1 en hydrolyysissä muodostuneet peptidit ei-hydrolysoituneista tai riittämättömästi hydrolysoituneista heran proteiineista, jotka kerrostuvat membraani11 e. Kaseii-nivapaan heraproteiinimateriaa 1in hydrolysoinnissa käytetyt proteinaasit pidättyvät myös mainitussa uitrasuodatuksessa.

Keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti voidaan käyttää vapaasti saatavissa olevia membraaneja uitrasuodatuksen mem-braaneina, edellyttäen, että niillä on määrätty cut-off-arvo (ekskluusi o-raja-arvo ) . On edullista käyttää hyväksi membraaneja, joita on yleisesti saatavana markkinoilla, ja jotka on valmistettu hyvin kestävistä, synteettisistä polymeereistä, ja jotka voidaan puhdistaa paikan päällä, esim. hapolla tai emäksellä. Sellaisia uitrasuodatusmembraaneja markkinoivat muun muassa DDS-RO-Division, Tanska, Rhone-Poulenc, Ranska, Romicon, Ranska ja Alfa-Laval, Ruotsi. DDS-RO-Divis1onin GR61PP-membraaneja voidaan esimerkiksi käyttää membraaneina, joiden cut-off-arvo on 20000.

On erityisen edullista käyttää hyväksi uitrasuodatusmembraa-nia, jonka cut-off-arvo on noin 6000.

Uitrasuodatuksessa aikaansaatu suodos voidaan myöhemmin, niin haluttaessa, konsentroida ja/tai kuivata, jotta saataisiin keksinnön mukaista peptidi tuotetta.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu peptidituote ei ole karvas 3 paino %:ssa vesiliuoksessa, se sisältää neutraalin aromin ja liukenee täydellisesti pH:ssa 4-5 kuumentamisen o jälkeen 100 C:een 10 minuutin ajaksi. Keksinnön mukaisesti valmistetut peptidi tuotteet sisältävät maksimaalisesti 15 % peptidejä, jotka sisältävät vähemmän kuin 6 aminohappoa. Vapaiden aminohappojen ja pienten peptidien alhaisesta pitoisuudesta johtuen niiden osmolaarisuus on lisäksi alhainen.

9 89449

Ominaisuuksistaan johtuen pepti di tuotteet sopivat käytettä vi k -si dieeteissä, ja ne ovat yleisesti sopivia aminohappolähteinä ja proteiinien korvikkeina ravintoaineissa ja virvokkeissa, kuten esimerkiksi helposti metaboloituvissa proteiinitäydennysalueissa urheilijoille, makkaroissa, piirakoissa, jäätelössä, suklaassa ja hiilihappoisissa juomissa, kuten esimerkiksi oluessa ja hii1ihappovedessä.

Erityistä mielenkiintoa liittyy peptidituotteisiin, joita on valmistettu keksinnön mukaisella menetelmällä uitrasuodattaen niitä membraanin läpi, jonka cut-off-arvo on 6000 vaiheessa c). Mainittuja peptidituotteita voidaan käyttää proteiinien korvikkeina ravintoaineissa ja virvokkeissa henkilöille, jotka ovat allergisia lehmän maidolle. Mainitut peptidi tuotteet eivät sido vasta-aineita immunoelektroforeesissa tai ELISA:ssa (entsyymikytkentäinen immunosorbenttimääritys) käyttämällä saatavissa olevia kaupallisia vasta-aineita naudan heraproteiineja tai naudan kaseiineja vastaan (Pharmacia, Ruotsi, ja Dako patts, Tanska). Samalla tavalla, ne eivät aiheuta passiivisia ihon herkistysreakti oi ta hiirissä, joita on herkistetty hiirten vasta-aineilla naudan heraproteiineja tai kaseiineja vastaan. Ne eivät myöskään aiheuta ai 1ergeenisiä reaktioita ärsytyseiiminaatiokokeissa lapsilla, jotka kärsivät kliinisestä, selvästi osoitetusta allergiasta lehmän maidolle.

Keksinnön mukaista menetelmää valaistaan yksityiskohtaisesti seuraavilla esimerkeillä.

Esimerkki 1

Peptidituotteiden valmistaminen tuoreesta juustoherasta hydrolysoimalla Bacillus 1icheniformiksen proteinaasi11 a (Alcalase 2,4 L, Novo Industri A/S, Tanska).

20 q CaCL · 2H 0:ta lisättiin 200 Iraan tuoretta juustoheraa, a 2 2 ja juustoheran pH säädettiin arvoon 4,6 2N HClrn avulla. Juus- 10 39449 tohera jätettiin sitten sekoittaen 60 minuutiksi 40°C:een ja o vielä 60 minuutiksi 40 C:een ilman sekoitusta. Tässä käsittelyssä kaseiini saostui, ja kirkas hera, joka juoksutettiin varovasti pois, kirkastettiin edelleen suodattamalla steriilin kankaan läpi. Näin saatu hera oli käytännöllisesti katsottuna kaseiinivapaata, ja sisälsi proteiinia 0,52 %, kun taas juus-tohera, ennen kaseiinin isoelektristä seostamista, sisälsi proteiinia 0,79 paino-% mitattuna Kjeldahl-menetelmän mukaan. Kaseiinivapaa hera konsentroitiin myöhemmin, ja siitä poistettiin laktoosi uitrasuodattamal1 a ja diasuodattamal1 a GR61PP-membraanei11 a käyttämällä LAB 20-ultrasuodatusmoduulia DDS-R0-Divisioni1 ta, Tanska. Saatua heraproteiinikonsentraattia, joka oli vapaa kaseiinista ja laktoosista (15 litraa, jonka o proteiinipitoisuus oli 5 paino-%) kuumennettiin 50 C:een ja säädettiin pH-arvoon 7,5 4,0 N Na0H:n kanssa. Hydrolysoi nti aloitettiin sitten lisäämällä Alcalase 2,4 L:ää (5,0 ml); ja hydrolyysiä jatkettiin kunnes saavutettiin 12 %:n hydrolyysi-aste, mitattuna pH-staattimenetelmän mukaan, pitämällä pH-arvo vakiona 7,5:ssä titraamalla jatkuvasti 4,0 N Na0H:n kanssa. Saadut peptidit erotettiin hydrolysoitumattomista heraprotei i nei sta ja proteinaaseista uitrasuodattamal1 a GR61PP-membraanei11 a sallimalla peptidien mennä läpi. UItrasuodatuk-sesta näin saatua peptidiä sisältävää permeaattia konsentroitiin pakastekuivauksella ja suspendoimaila uudelleen de ionisoituun veteen. Peptidien saanto peptidi tuotteessa oli 72 % heraproteiini konsentraatin proteiinisi säilöstä. Peptidi tuotteen 10 % liuos osoittautui olevan täysin liukeneva pH:ssa o 4,0-5,0 vieläpä kuumennettaessa 100 C:een 10 minuutin ajaksi. Peptidi tuotteen 3 %:11 a liuoksella oli neutraali maku. Pep-tidituotteen sisältämien peptidien molekyylipainojakauman kolooni k romatografi set tutkimukset geelisuodatuksen avulla Bio-gel P-6:11 a (Biorad Labs, Ranska) paljastivat, että noin 17 paino-% peptideistä käsitti mol ekyyl i pa i non, joka' ylitti 6000, 15 paino-% peptideistä vaihteli molekyylipainoltaan välillä 11 39449 4000-6000, 59 paino-% peptideistä käsitti molekyyl1painon, joka vaihteli välillä 1000 ja 4000, ja 9 paino-% peptideistä käsitti molekyylipainon alle 1000,

Esimerkki 2

Peptidituotteiden valmistaminen tuoreesta juustoherasta hydrolysoimalla haimaproteinaasei11 a (Corolase PP, Rhom Chemie, Saksan liittotasavalta).

Kaseiinivapaata ja laktoosivapaata heraproteiinikonsentraat-tia (15 1, jonka proteiinipitoisuus oli 5 paino-%) valmistettiin tuoreesta juustoherasta kuten kuvattiin esimerkissä 1.

Heraproteiinikonsentraattia, joka oli vapaata kaseiinista ja o laktoosista, hydrolysoitiin 50 C:ssa ja pHrssa 8,0, lisäämällä 3,0 g Corolase PP:tä, ja hydrolysoi nti a jatkettiin, kunnes saavutettiin noin 10 % hydrolyysiaste. Peptidiä sisältävää permeaattia valmistettiin uitrasuodattamal1 a GR61PP-membraa-neilla, ja pakastekuivattua peptidi tuotetta saatiin, kuten tuotiin julki esimerkissä 1.

Peptidien saanto peptidi tuotteessa oli 49 % heraproteiinikon- sentraatin proteiinimäärästä. Peptidituote oli pysyvä pHrssa o 4,5 ja 100 C:ssa 10 minuutin ajan ja sisälsi 3 %:ssa liuoksessa neutraalin aromin.

Esimerkki 3

Peptidituotteiden valmistaminen tuoreesta juustoherasta hydrolysoimalla porsaan trypsiinillä (Novo Industri A/S, Tanska).

Kaseiinivapaata ja laktoosivapaata heraproteiinikonsentraat-tia valmistettiin kuten esitettiin esimerkissä 1, ja hydrolysoitiin kuten kuvattiin esimerkissä 2. Peptidien saanto pepti di tuotteessa , jota saatiin uitrasuodattamal1 a GR61PP-mem- 12 39449 braaneilla, oli 42 % heraproteiinikonsentraatin sisältämästä proteiinista. Peptidi tuotteen 10 % liuos oli pysyvä pHrssa o 4,5, jopa kuumentamisen jälkeen 100 C:een 10 minuutin ajaksi. Peptidi tuotteen aromi oli neutraali 3 %:ssa deionisoidun veden liuoksessa.

Esimerkki 4

Peptidituotteiden valmistaminen tuoreesta juustoherasta hydrolysoimalla Aspergillus oryzaen proteinaasi11 a (Rhozyme P41, Gönencore, USA).

Kaseiinivapaata ja laktoosivapaata heraproteiinikonsentraattia (15 1, jonka proteiinipitoisuus oli 5 paino-%) valmistettiin o kuten kuvattiin esimerkissä 1, ja hydrolysoitiin 50 C:ssa ja pHtssa 7,5 lisäämällä 15 g Rhozyme P41:tä. Hydrolyysiä jatkettiin kunnes saavutettiin noin 8 % hydrolysoitumisaste. Pepti-dituotetta saatiin uitrasuodatuksen permeaattina GR61PP-mem-braaneilla, ja peptidi saanto peptidi tuotteessa oli 39 % hera-proteiini konsentraati n proteiini sisällöstä. Peptidi tuote oli pysyvä happamessa alustassa kuten esimerkkien 1-3 mukaisesti valmistetut tuotteet, ja se sisälsi hyväksyttävän neutraalin maun.

Peptidien molekyylipainojakautuman koi onni kromatografiset tutkimukset Biogel P-6:lla toivat esille, että pääosa peptideistä (60 %) vaihteli molekyylipainoltaan välillä 1500-2500, kun taas alle 10 % oli molekyylipainol taan suurempia kuin 6000 ja pienempiä kuin 1000, vastaavasti.

Esimerkki 5

Peptidi tuotteen, 100 kg, valmistaminen tuoreesta juustoherasta hydrolysoimalla Alcalase 2,4 L:11ä ja ui trasuodattamal1 a GR61PP-membraaneilla.

Alcalase 2,4 L:ää käytettiin, koska tämä proteinaasi osoitti esimerkkien 1-4 mukaisesti antavan maksimi saannon.

13 39449 4500 g CaCl · 2H 0:ta lisättiin 45000 Iraan tuoretta juusto-2 2 heraa, ja juustoheran pH säädettiin arvoon 4,6 konsentroidun o HCl:n avulla. Seistyään 5 tuntia, kaseiini saostui 40 C:ssa, . minkä jälkeen se eliminoitiin sentrifugoimal1 a Westfalian se paraattori 11 a (6500 rpm). 35000 1:n määrä kirkasta heraa (proteiinipitoisuus 0,56 paino-ί) otettiin talteen, konsentroitiin, ja siitä poistettiin laktoosi uitrasuodattamal1 a ja dia-suodattamalla GR61PP-membraaneilla. Heraproteiinikonsentraat-ti, josta puuttuivat kaseiini ja laktoosi, otettiin talteen, ja proteiinipitoisuus säädettiin 5 paino-%:ksi. 3000 1:n määrä heraproteiinikonsentraattia (pH 7,5) hydrolysoitiin sen o jälkeen 50 C:ssa 1 1:11a Alcalase 2,4 L:ää kunnes saavutettiin 12 %:n hydrolysoitumisaste.

Tässä esimerkissä pH-arvo pidettiin vakiona 7,5:ssä titraamaila jatkuvasti seoksella, joka sisälsi Ca(0H) :ta, Mg(0H) :ta, 2 2 K0H:ta ja NaOHrta, mikä vastasi 4,0 N NaOHrta mitä emäsvahvuu-teen tulee. Mainittua emässeosta käytettiin natriumlisäyksen rajoittamiseksi ja samanaikaisesti kalsiumin, magnesiumin ja kaliumin määrien lisäämiseksi peptidi tuotteeseen. Hydrolysoin-nin lopettamisen jälkeen, hydrolysaattia uitrasuodatettiin GR61PP-membraanei11 a, ja peptidiä sisältävä permeaatti haihdutettiin alipaineessa ja pakastekuivattiin. Näin saatu pepti-dituote vastasi läheisesti tuotetta, joka saatiin esimerkin 1 mukaisesti. Tuotantolaitteiston hyvin suuresta kuolleesta tilavuudesta johtuen tässä esimerkissä, peptidi saanto peptidi-tuotteessa oli vain 57 % heraproteiinikonsentraatin proteiini-määrä stä.

Esimerkki 6

Peptidituotteiden valmistaminen tuoreesta juustoherasta käytettäväksi ravintoaineena lehmän maidolle allergisille henkilöille.

14 3 9449

Kaseiinivapaata ja laktoosivapaata heraproteiinikonsentraat-tia valmistettiin juustoherasta esimerkin 1 mukaisesti ja hydrolysoitiin Alcalase 2,4 L:llä esimerkin 1 mukaisesti, Coro-lase PP:llä esimerkin 2 mukaisesti, tai Rhozyme P41:llä esimerkin 4 mukaisesti. Päinvastoin kuin esimerkeissä 1-4, tässä esimerkissä saadut peptidit erotettiin hydrolysoi tumattomasta heraproteiinista ja proteinaaseista uitrasuodattamal1 a mem-braaneilla, joiden cut-off-arvo on 6000 (GR81PP-membraanit, DDS-RO-Division , Tanska). Mitkään saaduista peptidituotteista eivät sitoneet vasta-aineita immunoelektroforeesissa tai ELISA: ssa, eivätkä mitkään peptidituotteista kyenneet aiheuttamaan passiivisia ihonherkistysreaktioi ta herkistetyissä hiirissä. Taulukossa I esitetään peptidi saanto, paino-ϊ juusto-heran sisältämien proteiinien määrästä ja mainittujen kolmen peptidi tuotteen peptidien molekyylipainojen suhteelliset osuudet.

Taulukko I

Käytetty Peptidi saanto Peptidien molekyylipaino proteinaasi 3000-6000 1000-3000 <1000

Alcalase 2,4 1 44 % 20 % 64 % 16 %

Corolase PP 38 Ϊ 33 % 47 « 20 %

Rhozyme P41 39 % 18 % 76 % 6 %

Kuten taulukosta 1 ilmenee, kolmen peptidi tuotteen peptidi-saanto oli alhainen verrattuna saantoon esimerkeissä 1-4. Alhainen saanto johtui siitä tosiasiasta, että GR81PP-membraa-nit eivät läpäise peptidejä, joiden molekyylipaino ylittää 6000 ja läpäisevät niukasti peptidejä, joiden molekyylipaino ylittää noin 4000.

Esimerkki 7

Peptidituotteiden valmistaminen tuoreesta juustoherasta käytettäviksi ravintoaineissa henkilöille, jotka ovat allergisia lehmän maidolle, käyttämällä hyväksi eri proteinaasien yhdiste! mi ä.

is 89449

Kaseiini vapaata ja laktoosivapaata heraproteiinikonsentraattia valmistettiin esimerkin 1 mukaisesti. Herakonsentraattia hydrolysoitiin Alcalase 2,4 L:n, Corolase PP:n ja Rhozyme P41:n . yhdistelmien kanssa, siten, että jokainen yksittäinen hydroly- sointi suoritettiin kahdella mainituista proteinaaseista samanaikaisesti. Jokaista hydrolyysiä jatkettiin kunnes prosessi oli käytännöllisesti päättynyt, mikä vastasi hydrolyysiastetta, joka vaihteli välillä 12 % ja 17 % riippuen käytetystä proteinaasien yhdistelmästä. Peptidituotteita saatiin ultra-suodattamalla GR81PP-membraanei11 a esimerkin 6 mukaisesti. Alcalase 2,4 L:n (6,5 ml/kg heraproteiinia) ja Rhozyme P41:n (20 g/kg heraproteiinia) yhdistelmä osoitti antavan erityisen sopivaa peptidi tuotetta, sekä peptidi tuotteessa saadun suuren peptidi saannon suhteen (74 paino-%) että peptidi vai misteen sisältämien peptidien edullisen molekyylipainojakauman suhteen, jossa valmisteessa suurin osa peptideistä (noin 70 %) vaihteli molekyylipainoltaan välillä 1500 ja 3000, ja alle 15 % oli molekyyli pai nol taan alle 1000.

Esimerkki 8

Peptidi tuotteen, 135 kg, valmistaminen tuoreesta juustoheras-ta, jota on hydrolysoitu Alcalase 2,4 L:n ja Rhozyme P41:n seoksella, käytettäväksi ravintoaineissa henkilöille, jotka ovat allergisia lehmän maidolle.

Alcalase 2,4 L ja Rhozyme P41 olivat edullisia, koska tämä yhdistelmä johti esimerkin 7 mukaisesti kaikkein sopivimpaan peptidi tuotteeseen.

4000 litraa kaseiinivapaata ja laktoosivapaata heraproteiini-konsentraattia, jonka proteiinisisältö oli 5 paino-%, valmistettiin esimerkin 5 mukaisesti. Heraproteiinikonsentraattia kuumennettiin 50°C:een ja pH säädettiin arvoon 7,5 emässeok- sella, johon kuuluivat Mg(0H) , Ca(0H) , Κ0Η ja NaOH. Hydro- 2 2 lysointi aloitettiin lisäämällä 1300 ml Alcalase 2,4 L:ää ja 16 39449 4,0 kg Rhozyme P41:tä lietettynä 20 Iraan vettä. pH-arvo pidettiin vakiona emässeoksen avulla, kuten esitettiin esimerkissä 5, ja hydrolyysiä jatkettiin kunnes saavutettiin hydrolysoi tumi sa ste 16-17 %. Peptidit erotettiin myöhemmin hydrolysoi tumattomasta heraproteiinista ja proteinaaseista ultrasuo- 2 dattamalla GR81PP-membraanei11 a (membraanin pinta-ala 35 m ). Peptidien saanto peptidissä nousi noin 60 %:iin heraproteiini-konsentraatin proteiinisisäl1östä, ja peptidituote oli tasaveroista vastaavan tuotteen kanssa, jota valmistettiin esimerkin 7 mukaisesti. Saatua peptidi tuotetta annettiin kahden kuukauden koejakson aikana päivittäisenä peptidi täydennyksenä (10 g päivässä) 10 lapselle, joiden ikä oli 0-7 vuotta, ja jotka oli kliinisesti osoitettu selvästi allergisiksi lehmän maidolle, ja asianosaisilla lapsilla ei esiintynyt merkkiäkään allergisista reaktioista.

Esimerkki 9

Peptidi tuotteiden valmistaminen kaupallisesta heraproteiini-konsentraati sta.

Heraproteiinikonsentraatteja, jotka on tuotettu juustoherasta menetelmän mukaisesti, joka sisältää uitrasuodatuksen ja dia-suodatuksen, voimakkaan 1ämpökäsittelyn, vakuumi haihdutuksen ja sumutuskuivauksen, on kaupallisesti saatavissa eri yhtiöistä. Tässä tapauksessa käytetyn heraproteiinikonsentraatin (Lacprodan-80 Denmark Protein A/S:ltä, Tanska) proteiinipitoisuus oli noin 80 %, josta noin 30-40 paino-% oli kaseiinia, ja 1aktoosipitoisuus 10-12 %. Heraproteiinit denaturoituvat ja ovat sen vuoksi liukenemattomia sekoitettaessa jauhetta veteen. Sitä vastoin saadaan pysyvä liete. Hydrolysoitaessa Lacprodan-80:tä Alcalase 2,4 L:n kanssa (hydrolysoitumisaste = 12 %) kontrol1ikokeessa, saatiin peptidi tuotetta, joka sisälsi äärimmäisen karvaan aromin.

17 89449

Lacprodan-80:n sisältämä kaseiini eliminoitiin hydrolysoimalla Bacillus subtiliksen proteinaasi11 a (Neutrase, Novo Industri A/S, Tanska): 10 litran määrä Lacprodan-80 suspensiota, jonka proteiinipi- o toisuus oli 5 %, kuumennettiin 50 C:een, ja pH säädettiin arvoon 7,5 4,0 N NaOH:n avulla. Kaseiinin hydrolyysi aloitet tiin lisäämällä 10 ml Neutrasea. pH-arvo pidettiin vakiona titraamalla jatkuvasti 4,0 N NaOH:n kanssa, ja hydrolyysiä jatkettiin, kunnes prosessi oli päättynyt, mikä vastasi noin 4 ϊ:η hydrolysoitumisastetta kaikista Lacprodan-80:n sisältämän proteiinin peptidi sidoksista. Kaseiinin pi 1kkoutumistuot-teet ja laktoosi eliminoitiin sen jälkeen uitrasuodattamal1 a ja diasuodattamal1 a GR81PP-membraanei11 a. Permeaatin sisältämä peptidi saanto oli 28 %, mikä täsmäsi hyvin Lacprodan-80:n kaseiinisisä11ön kanssa. Retentaatissa pidättyneet proteiinit muodostivat nyt kaseiinivapaan ja laktoosivapaan heraproteii-nikonsentraatin, jossa denaturoituneet heraproteiinit olivat yhä vesilietteenä. Tämän menetelmän mukaisesti muodostuneet retentaatit hydrolysoitiin myöhemmin joko pelkästään Alcalase 2,4 L:11ä esimerkin 1 mukaisesti, tai Alcalase 2,4 L:n ja Rhozyme P41:n kanssa yhdessä, kuten spesifioitiin esimerkissä 7. Hydrolysaatit uitrasuodatettiin sitten GR61PP-membraa-neilla (kuten esimerkissä 1) tai GR81PP-membraanei11 a (kuten esimerkissä 7). Näin tuotetut peptidi tuotteet olivat, koskien karvauden puuttumista, peptidi saantoa ja molekyylipainojakau-tumaa, olennaisesti samanlaisia kuin peptidi tuotteet, jotka 011 tuotettu tuoreesta juustoherasta esimerkkien 1 ja 7 mukaisesti. Esimerkin 9 mukaiset peptidi tuotteet sisälsivät kuitenkin heikon palaneen maun, joka mahdollisesti aiheutui Lacpro-dan-80:n lämpökäsittelystä mainitun tuotteen valmistuksen yhteydessä .

Esimerkki 10

Peptidituotteiden valmistaminen 1aktalbumiinista.

ie 89449

Laktalbumiinia, joka sisälsi kaseiineja ja 1ämpödenaturoitune itä heraproteiineja, valmistettiin 100 litrasta tuoretta juustoheraa seuraavan menetelmän mukaisesti, joka vastaa periaatteessa 1aktalbumiinin teollista valmistusta:

Juustoheran pH säädettiin arvoon 4,6 2 N HCl:n avulla, ja se o kuumennettiin 90 C:een 30 minuutin ajaksi. Kaseiinin ja lämpö-denaturoidun heraproteiinin liete, jotka yhdessä muodostavat 1aktalbumiinin, otettiin talteen sentrifugoimal1 a ja suspen-doitiin uudelleen veteen siten, että sen proteiinipitoisuudeksi tuli 5 %. Kontrol1ikokeessa 1aktalbumiininäytettä hydrolysoitiin Alcalase 2,4 L:n kanssa tuottaen sillä tavalla pepti-dituotetta, jonka maku oli äärimmäisen karvas. Näin valmistetun 1aktalbumiinin sisältämät kaseiinit hydrolysoitiin Neutra-sen kanssa kuten mainittiin esimerkissä 9. UItrasuodatus, joka suoritettiin Neutrase-hydrolyysin jälkeen, tuotti perme-aattia, jonka peptidi saanto oli noin 32 % 1aktalbumiinin koko-nai sprotei i ni n määrästä.

Näin valmistettua kaseiinivapaata ja laktoosivapaata laktalbu-miinia hydrolysoitiin joko yksistään Alcalase 2,4 L:n kanssa tai yhdessä Alcalase 2,4 L:n ja Rhozyme P41:n kanssa, ja saatiin peptidituotteita kuten esitettiin esimerkissä 9. Saadut peptidi tuotteet, joissa ei ollut karvasta makua, vastasivat läheisesti esimerkin 9 mukaan saatuja peptidi tuotteita.

Claims (11)

19 89449

1. Menetelmä lämpökestoisen, ei-karvaan, helposti veteen liukenevan peptidi tuotteen valmistamiseksi kaseiinia sisältävästä heraproteiinimateriaalista, tunnettu siitä, että valmistus käsittää seuraavat vaiheet: a) kaseiinin eliminointi heraproteiinimateriaalista, b) kohdan a) mukaisesti saadun, kaseiinivapaan heraproteiini-materiaalin hydrolysoi nti vähintään yhdellä proteinaasi11 a, c) kohdassa b) saadun hydrolysaati n uitrasuodatus membraanin läpi, jonka cut-off-arvo (ekskluusioraja-arvo) ei ylitä 20000 Daltonia, sen jälkeen suodoksen ta 1teenottaminen, ja jälkeenpäin, niin haluttaessa suodoksen konsentroi nti ja/tai kuivaus.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaseiini eliminoidaan 1ämpökäsittelemättömästä herasta vaiheessa a), erottamalla kaseiinipartikkelit suoti-mella, jonka huokoskoko on sellainen, että kaseiini partikkelit pidättyvät, kun taas heraproteiinit läpäisevät suotimen, edullisesti noin 0,2 μ:η huokoskoko.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaseiini eliminoidaan lämpökäsittelemättömästä herasta vaiheessa a), säätämällä pH-arvo 4,5-5,0:ksi lisäämällä happoa, ja samanaikaisesti lisäämällä CaCl :ta määränä, 2 joka vaihtelee välillä 1 ja 25 g/litra, jättämällä seos vä- o hintään yhdeksi tunniksi 30-50 C:een, ja erottamalla näin saostuneet kaseiinit.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaseiini eliminoidaan heraproteiinimateriaalista vaiheessa a), hydrolysoimalla kaseiini Bacillus subtiliksen neutraalin metalliproteinaasin avulla, kunnes saavutetaan edullisesti noin 4 %:n hydrolysoitumisaste, perustuen proteiinin kokonaismäärään, ja erottamalla kaseiinin pilkkoutu-mistuotteet. 20 39449

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaseiinin hydrolyysi toteutetaan pH-arvossa, joka vaihtelee välillä 4 .ja 9 ja lämpötilassa välillä 30 C ja fiO C.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 1 a k t a 1hu m i i n i a käytetään he r a pr o t e i i n i ma t e ri a a 1i-na, ja että ennen Hydro 1ysointia vaiheessa h) kaseiinin hajo-tu s tuo t tee I. ero te la a n spji I ei f h cjo i ma Ma.

7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että e fin e n hydrolyysiä vaiheessa ti) kaseiinin pilkkou-tumistuotteet erotetaan ultrasuodatukse 11 a memhraani11 a, jonka CUt-off-arvo ei ylitä noin 20000 Oaltöniä.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että konsentroidaan vaiheessa a) saatu kaseii-nivapaa hera pro teiinimateriaa 1i, ja/tai erotetaan laktoosi, edullisesti diasuodattamal1 a uitrasuodatusmembraani11 a, jonka cut-off-arvo on noin 20000 Daltonia tai vähemmän, ennen hydrolysointia.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaseiiui vapaa heraproteiini hydrolysoidaan hydrolyysiasteeseen, joka vaihtelee välillä 8 ja 18 %.

10. Jorikin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteinaasina käytetään porsaan haiman pro tein a a sia , Aspergillus o ryza en pro teinaa sia, Streptomyces / griseuksen protelnaasia, Racillus 1icheniformik sen proteinaa-' si a tai trypsi i ni H.

11. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että uitrasuodatus vaiheessa c) suoritetaan memhraa n i n avulla, .jonka cut-off-arvo on noin 0000 Daltonia. 2i 39449