FI84625C - Foerfarande foer detektering av analytens troeskelvaerde. - Google Patents

Description

84625

MENETELMÄ ANALYYTIN KYNNYSARVON TOTEAMISEKSI

Keksinnön kohteena on entsymaattinen menetelmä ja reagenssiyhdistelmä, jolla osoitetaan määrätyn kynnysarvon ylittävä tai alittava analyytin pitoisuus PQQ-dehydrogenaasien avulla.

Kvantitatiivista kolorimetristä analyysiä käytetään usein orgaanisten tai epäorgaanisten aineiden (analyyttien) pitoisuuksien mittaamisessa näytteistä. Kemiallisessa reaktiossa muodostuvan värin voimakkuus vastaa tarkasti määritettävän analyytin pitoisuutta näytteessä. Tällaiset tarkat kvantitatiiviset määritykset ovat teknisesti vaativia suorittaa ja edellyttävät onnistuakseen monimutkaisia laitteistoja sekä laboratoriokoulutuksen saaneen henkilökunnan.

Tärkein analytiikan alue, jossa hyödynnetään värinvoimak-kuuden tai värisävyn muutoksiin perustuvaa aineen pitoisuuden mittaamista, on ilman erityisiä mittalaitteita suoritettu pitoisuusmääritys, visuaaliset testit. Visuaalisiin testeihin perustuvan analytiikan käyttöaluetta on pyritty laajentamaan kehittämällä helppo- ja kertakäyttöisiä "joka miehen testejä", joiden suoritus ei vaadi koulutusta. Toteutukset ovat usein ns. kuivakemiaa, jossa nestemäinen näyte liuottaa testivälineeseen kuivatut tai kiinnitetyt reagenssit ja käynnistää reaktiot. Näyte voidaan myös laimentaa ennen määritystä. Visuaalisesti tulkittavassa testivälineessä syntyy tai häviää väriä, jonka sävy tai voimakkuus on riippuvainen analyytin pitoisuudesta näytteessä.

Analyytin pitoisuutta vastaa siis testivälineen värisävyn, värinvoimakkuuden tai värjäytyneen alueen muutos.

Mitä tarkemmin värin muutos voidaan havaita, sitä varmemmin voidaan päätellä analyytin pitoisuus näytteessä.

Visuaalisissa testeissä on kuitenkin harvoin tarvetta tarkasti tuntea analyytin pitoisuus. Käytännössä 2 84625 päätöksenteon pohjaksi riittää usein tieto siitä, ylittääkö analyytin pitoisuus tietyn rajan. Tämän tyyppisiä rajoja voivat olla esimerkiksi työ- tai asuinympäristön ilman epäpuhtauksien ylin sallittu pitoisuus (esim. formaldehydi-pitoisuus) tai veren alkoholipitoisuus liikenteessä, työpaikalla tai ensiapuasemalla. Ilman mittalaitteita suoritettava testi voi toimia halpana seulontatestinä, jonka tuloksesta riippuen voidaan tehdä päätös kalliin laboratoriomäärityksen suorittamisesta.

Tähän tarkoitukseen sopivassa testivälineessä määrätty analyytin pitoisuus tai pitoisuudet aiheuttavat selkeän värisignaalin, joka ohjaa käyttäjän päätöksentekoa. Määrättyä pitoisuutta, kynnysarvoa, vastaa hyvin jyrkkä värin muutos, eräänlainen ΟΝ/EI -signaali. Tällainen analyytin vaste tulkitaan oikein, eikä se riipu havaitsijan subjektiivisista tulkinnoista kuten värien intensitetti- tai sävyeroihin perustuvissa analyysivälineissä.

Kolorimetrisiin analyyseihin soveltuvat yleensä parhaiten biokemialliset entsyymejä hyväkseen käyttävät menetelmät. Tavanomaisiin kemiallisiin reaktioihin perustuviin menetelmiin verrattuna ovat biokemialliset analyysit spesifisempiä, kätevämpiä suorittaa ja ovat nopeita huoneenlämpötilassa. Biologisia molekyylejä määritetään yleisesti kahden tyyppisillä redox-entsyymeillä: 1. Dehydrogenaaseilla, jotka käyttävät koentsyyminään NAD(P)H:ta. NAD(P)H määrän muutos reaktiossa voidaan mitata suoraan UV-alueella 340 nm:ssä fotometrisesti absorbans-simuutoksena tai kytkeä reaktio toiseen usein toisen entsyymin katalysoimaan reaktioon, jossa muodostuu tai häviää väriä.

2. Oksidaaseilla, joiden katalysoimassa reaktiossa muodostuu vetyperoksidia, jonka määrä voidaan mitata yleensä toisen entsyymin katalysoimalla väri reaktiolla.

3 84625

Tunnetaan runsaasti dehydrogenaaseja, jotka hapettavat tai pelkistävät NAD(P)(H):ta stökiömetrisessä reaktiossa substraatin kanssa. Patenttihakemus EP 154409 kuvaa testivälinettä ja menetelmää alkoholien määrittämiseksi, jossa NAD(P) alkoholidehydrogenaasin katalysoimassa reaktiossa pelkistyy alkoholin kanssa reagoidessaan. Syntyvä NAD(P)H pelkistää väriaineen diaforaasin katalysoimassa reaktiossa. Alkoholipitoisuus havaitaan visuaalisesti seuraamalla värinsävyn liukuvaa muutosta tai määrittämällä aika, jossa tietty värinmuutosaste tapahtuu. Tällaisen järjestelmän heikkoudet ovat ilmeisiä. Värin muutoksen selkeys mitattavalla analyytin pitoisuusalueella on oleellinen kysymys testivälineen luotettavuutta ja käyttökelpoisuutta arvioitaessa. Jos värin voimakkuuden tai värisävyn muutos on jatkuvasti liukuva, tämä johtaa voimakkaasti havaitsijasta ja suoritusolosuhteista riippuvaan tulkintaan. Värin voimakkuuserojen havaitseminen on hyvin subjektiivista. Tutkimusten mukaan eri henkilöiden tulkinta samalle vasteelle vaihtelee voimakkaasti näön, iän, vireystilan, valaistusolosuhteiden yms. mukaan. Värin intensiteettieroihin tai värisävyn muutoksiin perustuvien kertakäyttöisten testivälineiden tulokset eivät ole yksikäsitteisesti tulkittavissa. Ongelmat eivät ole pääasiassa laiterakenteissa, vaan reaktiokemiassa, jolla analyysiväline toteutetaan.

Ongelmana analyytin määrittämisessä suoraan näytematriisista on yleensä myös analyytin korkea pitoisuus, jolloin saatu värivaste on liian voimakas arvioitavaksi visuaalisesti tai mittalaitteilla. Tällöin joudutaan usein laimentamaan näyte ennen määritystä. Patenttijulkaisussa US 4490465 kuvataan systeemi, jossa on läsnä kaksi analyyttiä kuluttavaa entsyymiä, NAD(P):tä käyttävä dehydrogenaasi ja oksidaasi. Näin analyytistä muodostuu vähemmän kuin stökiömetrinen määrä NAD(P)H:ta, joka voidaan määrittää tunnetuilla menetelmillä. Analyytti johdetaan kahdeksi eri tuotteeksi kahden eri entsyymin katalysoimissa kilpailevissa reaktioissa.

84625

Menetelmässä pyritään välttämään näytteen laimentamista.

Värin muutoksen selkeyttä testivälineessä on pyritty parantamaan lisäämällä reaktioseokseen ns. kynnyskomponentti, joka estää värin muutokset ennen kuin analyytin pitoisuus ylittää määrätyn pitoisuuden. Kynnyskomponentin pitoisuutta muuttamalla voidaan analyytille säätää tietty raja-arvopi-toisuus, joka analyytin näytteessä on ylitettävä värisig-naalin syntymiseksi. Patenttihakemuksessa WO 88/04694 kuvataan laitetta ja menetelmää, jolla mitataan NAD(P)H:n pitoisuus tai välillisesti sellaisten orgaanisten yhdisteiden pitoisuus, jotka tuottavat NAD(P)H:ta reagoidessaan spesifisen dehydrogenaasin kanssa. Menetelmässä dehydrogenaasien katalysoimassa reaktiossa syntyvä NAD(P)H reagoi ensisijaisesti kilpailevan kynnysreagenssin kanssa, joka kuluu reaktiossa loppuun. Kynnyspitoisuuden mahdollisesti ylittävä NAD(P)H:n määrä aiheuttaa vasta värin muutoksen pelkistämällä väriaineen elektronikantajän välityksellä tai diaforaasin katalysoimassa reaktiossa. Tässä menetelmässä pyritään kynnysarvon asettamiseen analyytille, jolloin vaste olisi yksikäsitteinen ON/EI-värimuutos. Heikkoutena menetelmässä on huonosti säilyvän koentsyymin NAD(P):n käyttö. Sen säilymisen parantamiseksi joudutaan usein käyttämään mutkikkaita rakenteellisia ratkaisuja, esim. kuivaamaan se eri kerrokseen kuin muut kemikaalit. NAD(P) on kallista, joten sen määrän pienentäminen testivälineessä on taloudellinen kysymys. Toisaalta tavoitteena oleva NAD(P):n määrän oleellinen vähentäminen heikentää testivälineen säilyvyyttä ratkaisevasti. Diaforaasi toisena entsyyminä nostaa kustannuksia ja heikentää säilyvyyttä.

Usein ongelmana entsymaattisia testiliuoskoja valmistettaessa on saada reaktio menemään riittävän nopeasti loppuun. Tämä ongelma koskee selvästi myös edellä esitettyjä ratkaisuja. Esimerkiksi NAD:sta riippuvan alkoholidehydrogenaasin Michaelsin vakio (etanolipitoisuus, jossa saavutetaan puolimaksimaalinen reaktionopeus) on melko korkea, noin 13 5 84625 mmol/l, joka vastaa suuruusluokaltaan veressä tai syljessä yleisesti esiintyvää etanolipitoisuutta. Tästä johtuen nopea ja jyrkkä värimuutos reagoivassa vyöhykkeessä on toteutettavissa vain käyttämällä suuria entsyymimääriä. Lisäksi NAD(P):stä riippuvien entsyymien reaktio on usein reversiibeli, molempiin suuntiin tapahtuva reaktio, jonka tasapaino esim. etanolimäärityksessä on lähtöaineen puolella. Tämän ongelman ratkaisuun voidaan käyttää erilaisia apukemikaaleja tai -entsyymejä, jotka reagoivat lopputuotteen kanssa ja auttavat reaktioita menemään loppuun. Tämä toisaalta monimutkaistaa reaktiokemiaa ja vaikeuttaa analyysivälineen toteutusta, sekä voi edellyttää yhteen sopimattomien reagenssien soveltamista laiterakenteeseen.

NAD(P):tä käyttäviä entsyymejä sovellettaessa on usein ongelmana myös entsyymipreparattien epäpuhtaudet, reagenssien epästabiilisuus ja muut sivureaktioita aiheuttavat aineet ja entsyymit. NAD(P):tä käyttävät entsyymit ovat hyvin yleisiä biologisissa näytteissä. Edellä esitetyn valossa voidaan todeta, ettei tähän mennessä ole ollut saatavilla sopivaa entsymaattista okso- tai hydroksiryhmiä sisältävien analyyttien määritysmenetelmää, jonka pohjalta voitaisiin kehittää täysin luotettava, yksikäsitteisesti tulkittava, helppokäyttöinen ja hyvin säilyvä visuaalinen testiväline, jolla osoitetaan tietyn kynnysarvon ylittävä tai alittava analyytin pitoisuus.

Keksinnön mukaisen menetelmän ja reagenssiyhdistelmän avulla saadaan aikaan ratkaiseva parannus edellä esitetyissä epäkohdissa. Tämän toteuttamiseksi keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa, ja keksinnön mukaiselle reagenssiyhdistelmälle se, mitä on esitetty patenttivaatimuksen 4 tunnusmerkkiosassa.

Keksinnön mukaisen menetelmän ja reagenssiyhdistelmän etuna on, että tietyn kynnysarvon ylittävä tai alittava analyytin pitoisuus voidaan osoittaa entsymaattisesti selkeällä ja jyrkällä väri reaktiolla. Kalliita ja helposti tuhoutuvia 6 84625 koentsyymejä kuten NAD(P):tä ei tarvita. Samalla interferoivien sivureaktioiden todennäköisyys vähenee. Edelleen keksinnön mukaisen menetelmän entsyymi reaktiot ovat irreversiibeleitä, ja nopeita myös pienillä analyytin pitoisuuksilla. Lisäksi analyytin määrittämiseen tarvitaan vain yhtä entsyymiä.

Keksinnön kohteena on reaktiosysteemi, jota voidaan käyttää +/- -tyyppisessä testissä ennalta asetetun raja-arvon ylittävän tai alittavan analyytin pitoisuuden osoittamiseen. Keksinnön kohteena on myös kuvattuun reaktiosysteemiin perustuva reagenssiyhdistelmä, kitti tai testiväline, jota käyttäen analyytin pitoisuus voidaan määrittää tiettyjen ennalta asetettujen raja-arvojen välialueelle. Keksinnön mukaisen reaktiosysteemin antama vaste tapahtuu näkyvällä valon alueella, ja se voidaan tulkita mittalaitteella tai visuaalisesti.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä ja reagenssiyhdistelmässä käytetään hyväksi PQQ-entsyymejä. PQQ-entsyymit on äskettäin kuvattu uusi entsyymi ryhmä, joka käyttää prosteettisena ryhmänään pyrrolokinoliinikinonia (PQQ). PQQ-entsyymejä on löydetty lähes kaikista eliöryhmistä. Niitä on kuvattu mm. seuraavissa yleiskatsauksissa: Duine J A ja Jongejan J A,

Ann. Rev. Biochem. 5θι, 403 ( 1989); Anthony C, Adv. Microbial. Physiol. 2T_, 113, (1986); Duine et ai. Adv Enzymol. 59, 169, (1987) ja kirjassa "PQQ and Quinoproteins", toim. Jongejan J A ja Duine J A, Kluwer Academic Publishers, (1989). PQQ-dehydrogenaaseja on aikaisemmin käytetty eri analyyttien määrittämiseen fotometrisesti perinteisessä liuosanalytiikassa (esim. Ameyama M, Methods Enzymol. B_9, 20 (1982). Aikaisemmin ei ole kuvattu määritysmenetelmää, jossa olisi käytetty PQQ-entsyymejä ennalta asetetun kynnysarvon ylittävän tai alittavan ainemäärän määrittämiseen. PQQ-dehydrogenaasit voivat hapettaa analyytin useiden eri hapettimien avulla. PQQ-dehydrogenaasien elektroniakseptorina voivat toimia mm. Fe (III):n kelaatit, kuten esimerkiksi ferrisyanidi tai EDTA-kelaatti, sytokromi c, sekä useat 7 84625 kinoni-imiinivärit, kuten esimerkiksi indamiinit (Wursterin sininen), indofenolit (DCIP), atsiini- (PMS, PES, 1-metoksi-PMS), oksatsiini- (Meldolasini, Nilesini) ja tiatsiinijohdannaiset (tioniini ja metyleenisini). Tämä mahdollistaa PQQ-entsyymien käytön värinmuutoksiin perustuvassa analytiikassa suoraan, ilman muita indikaatiovaiheessa avustavia entsyymejä, tai lisättyjä epästabiileja koentsyymejä. Entsyymejä voidaan käyttää kineettisissä tai loppupistemittauksissa. Reaktiot ovat irreversiibeleitä ja nopeita, mitkä ovat analytiikan kannalta suuria etuja. Samoin etuna PQQ-entsyymejä käytettäessä on niiden suhteellisen matalat Michaelisin vakiot, esim. Acetobacter acetin MBADH:n (membraaniin sidottu alkoholidehydrogenaasi) Michaelisin vakio etanolille on 2 mmol/1 ja ferrisyanidille suuruusluokkaa 0.1 mmol/1.

Yllättäen on nyt havaittu, että PQQ-dehydrogenaaseilla on selvä preferenssijärjestys eräiden elektroniakseptorien suhteen siten, että paremmin hapettuva kuluu olennaisesti loppuun ennen kuin reaktio alkaa tapahtua toisen elektroniakseptorin kanssa, ja tätä ominaisuutta voidaan käyttää raja-arvokemiaan perustuvassa indikaatiokemiassa. Keksinnön mukaisessa menetelmässä ja reagenssiyhdistelmässä käytetään okso- ja hydroksiryhmien hapetukseen osallistuvia PQQ-dehydrogenaaseja näitä ryhmiä sisältävien analyyttien määrittämisessä kynnysarvon asettavassa indikaatiokemiassa. Tällaisia analyyttejä ovat tyypillisesti mm. alkoholit, hiilihydraatit ja aldehydit.

Keksinnön mukaisesti PQQ:ta koentsyyminä käyttävää dehydrogenaasia käytetään tietyn määrän ylittävän analyytin pitoisuuden osoittamiseen värireaktiolla. Menetelmä perustuu kilpailevien hapettimien periaatteeseen, jossa ensimmäisessä vaiheessa kuluu ensimmäinen, olennaisesti nopeammin pelkistyvä elektroniakseptori ja sen loputtua mikäli analysoitavaa analyyttiä on jäljellä, alkaa tapahtua toinen reaktio, jossa tapahtuu havaittava värin muutos kromogeenin pelkistyessä. Ensimmäisen elektroniakseptorin määrää β 84625 muuttamalla voidaan menetelmä tai reagenssiyhdistelmä säätää osoittamaan tietyn raja-arvon ylittävää analyyttimäärää näytteessä. Samoin ensimmäistä elektroniakseptoria voidaan käyttää analyytin antaman värivasteen alentamiseen siten, että värireaktion nopeus tai värin määrä reaktion lopussa on mitattavissa analyysilaitteilla tai arvioitavissa silmämääräisesti.

Analyytin pitoisuutta määritettäessä menetelmää voidaan käyttää PQQ-dehydrogenaasien kanssa myös kolmen elektroniakseptorin systeemissä, jossa ensimmäisessä vaiheessa kuluu raja-arvon olennaisesti määrittävä elektroniakseptori, toisessa vaiheessa häviää toisen elektroniakseptorin väri ja kolmannessa vaiheessa muodostuu kolmannesta elektroniakseptorista (kromogeenista) havaittava väri, joka mieluummin poikkeaa ensimmäisestä väristä. Näin saadaan aikaan värinmuutosketju, jota voidaan käyttää analyytin pitoisuuden arvioinnissa.

Keksinnön mahdollisia sovellutusalueita ovat teollisuus (mm. elintarviketeollisuus), lääketiede, diagnostiikka, ympäristöhygienia, työterveyshuolto, liikennevalvonta jne., joissa on usein tärkeää tietää ylittääkö vai alittaako analyytin pitoisuus jonkin määrätyn arvon. Keksinnön tärkeä sovellutusalue on "joka miehen" käyttöön soveltuvat kertakäyttöiset analyysivälineet. Alan ammattimiehelle on selvää, että keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää myös perinteisessä nestekemiaa edustavassa laboratorioanalytiikassa.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä PQQ-entsyyminä toimii edullisesti PQQ-alkoholidehydrogenaasi tai PQQ-aldehydidehydrogenaasi, joiden eristys voidaan suorittaa kirjallisuudesta tunnettujen proseduurien mukaan, esim. Ameyama, M., Methods Enzymol. 89, 20 (1982). Määritettäväksi soveltuvan analyyttijoukon laajuus on riippuvainen kulloinkin valitun PQQ-entsyymin substraattispesifisyydestä. PQQ-alkoholidehydrogenaasia käytettäessä analyyttinä voi olla 9 84625 esimerkiksi etanoli, n-propanoli, n-butanoli tai 1,4-butyyliglykoli. PQQ-aldehydidehydrogenaasia käytettäessä analyyttinä voi olla esimerkiksi formaldehydi tai asetaldehydi. Ainoa ehto keksinnön mukaisella menetelmällä määritettävälle analyytille on, että se voi toimia menetelmässä kulloinkin käytetyn PQQ-entsyymin substraattina.

Kuviot 1-7 esittävät raja-arvoperiaatteen toimivuutta keksinnön mukaisen menetelmän eräillä suoritusmuodoilla. Absorbanssit (A) ajan suhteen on esitetty suhteellisina yksikköinä (optinen matka < 1 cm).

Seuraavaksi kuvataan kaavamaisesti keksinnön mukaisen menetelmän erilaisia suoritusmuotoja, joissa PQQ-dehydrogenaaseja käytetään tietyn kynnysarvon ylittävän tai alittavan analyytin pitoisuuden osoittamiseen. .Keksintö ei rajoitu esitettyihin suoritusmuotoihin. Alan ammattimiehelle ilmeisiä variaatioita ja modifikaatioita voidaan suorittaa poikkeamatta keksinnön hengestä tai laajuudesta.

Keksinnön mukaisen menetelmän ensimmäinen suoritusmuoto voidaan kuvata seuraavasti:

E-PQQ

(1) , d + Slox ► A0 x + Slred

E-PQQ

( 3 ) Ar , d + S2 0 x * A0 x + S2 r e d jossa E-PQQ on PQQ-entsyymi, Slox ja Slred on kynnysarvon asettavan ensimmäisen elektroniakseptorin S2 hapettunut ja pelkistynyt muoto, S2ox ja S2ced on vastaavasti kromogeenin S2 hapettunut ja pelkistynyt muoto, Ar#d ja Aox on analyytin pelkistynyt ja hapettunut muoto, S2 on E-PQQ:lie parempi hapetin kuin S2. Tällöin ensimmäisessä vaiheessa kuluu ensimmäinen elektroniakseptori S2 loppuun, ja jos analyyttiä on tämän jälkeen jäljellä, alkaa vasta kulua kromogeeni S2.

10 84625

Sx:n määrä reaktiossa on raja-arvoa määräävä. Sx on väritön tai värillinen. S2:n määrä on reaktiossa suhteellisen pieni, ja sen pelkistyessä tapahtuu helposti havaittava värinmuutos, jonka havaitsemisesta ei haittaa mahdollinen Sx:n väri. Toivottavaa on, että S2:n molaarinen absorptiviteetti on mahdollisimman suuri. Substraatin S3 määrää muuttamalla voidaan menetelmä säätää osoittamaan tietyn raja-arvon ylittävää analyyttimäärää (Ared) näytteessä. Slred ja S2ox voivat myös reagoida keskenään:

E-PQQ

(!) Ar.d + Slox > Aox + Slred (2) slred + s2ox < slox + s2red

E-PQQ

(3) Ar # d + S2ox * A0 x + S2ted Tällöin reaktiotasapainon pitää olla erittäin voimakkaasti vasemmalla. Reaktiossa aluksi kuluu S3 , ja jos Ar,d:iä on ylimäärin, tapahtuu värinmuutos S2:n pelkistyessä.

Yllä esitetyissä reaktioissa (1)-(3) Sj voi olla jokin Fe(III):n kelaatti, edullisesti ferrisyanidi, S2 voi olla indofenoliväri, edullisesti DCIP (dikloorifenoli-indofenoli ) tai oksatsiiniväri, edullisesti Meldolasini.

Keksinnön mukaisen menetelmän toista suoritusmuotoa voidaan kuvata seuraavasti:

E-PQQ

Ared + Slox Aox + Slred

E-PQQ

(5) Ared + S2ox * Aox + S2red (6) S2r,d + S3ox S2ox + s3red S3 on ensimmäinen elektroniakseptori, joka kuluu loppuun ennenkuin S2 alkaa toimia hapettimena. S2 toimii tässä redoxkatalyyttinä Ared:n ja kromogeenin S3 :n välillä. Tässä 11 84625 suoritusmuodossa St voi olla jokin Fe(III):n kelaatti, edullisesti ferrisyanidi, tai indofenoliväri, edullisesti DCIP. S2 voi olla fenatsiiniväri, edullisesti PMS (fenatsiinimetosulfaatti), 1-metoksi-PMS tai PES (fenatsiinietosulfaatti), tai oksatsiiniväri, edullisesti Meldolasini. S3 voi olla tetratsoliumväri, edullisesti MTT (tiatsolyylisininen) tai INT (p-jodonitrotetratsolium-violetti), tai indofenoliväri (edellyttäen että S2 ei ole indofenoliväri), edullisesti DCIP.

Keksinnön mukaisen menetelmän kolmannessa suoritusmuodossa indikaatiokemiaa voidaan käyttää myös kolmen kilpailevan substraatin systeeminä, jolloin voidaan saada aikaan eri värejä ja värisävyjä testivyöhykkeessä.

Kaaviona tämä suoritusmuoto voidaan esittää seuraavasti:

E-PQQ

("7) Ar · d + ®lox * ^ox + ®lnd (E-PQQ) (8) Ar.d + S2ox “* Aox + S2r.d (tai slr.d + s2ox slox + s2r.d) (9) Ar · d + ®3ox * Ao x + 83red S2 ja S2 on väritön tai värillinen. S3:n määrä on reaktiossa suhteellisen pieni, ja sen pelkistyessä tapahtuu helposti havaittava värinmuutos, jonka havaitsemista ei haittaa mahdollinen S2:n ja S2:n väri. Substraatin S2 tai S2 määrää muuttamalla voidaan menetelmä säätää osoittamaan tietyn raja-arvon ylittävää analyytin määrää näytteessä. Aluksi reaktiossa kuluu ensimmäinen elektroniakseptori S2. Tämän jälkeen alkaa kulua toinen elektroniakseptori S2 ja lopuksi "huonoin" substraatti S3, joka on kromogeeni (tai redoxkatalyytti + kromogeeni), ja muuttaa pelkistyessään väriä. Edellytyksenä indikaation onnistumiselle on, että i2 84625 pelkistyneet St ja S2 eivät aiheuta S3:n värinmuutosta.

Sj voi olla tässä jokin Fe(m):n kelaatti, edullisesti ferrisyanidi, S2 voi olla indofenoliväri, edullisesti DCIP (dikloorifenoli-indofenoli), S3 voi olla yhdistelmä fenatsiiniväri (redoxkatalyytti) + tetratsoliumväri (kromogeeni), edullisesti PMS + INT (p-jodonitrotetratsolium-violetti ) .

Keksinnön mukaisen menetelmän tarpeelliset komponentit tai reagenssit saatetaan yhteen sopivassa väliaineessa, kuten esimerkiksi liuoksessa, mutta edullisimmin ne impregnoidaan kiinteään kantajaan. Tällaiset kiinteät kantajat ovat tunnettuja kirjallisuudesta. Tyypillisesti keksinnön mukainen testiväline tai reagenssiyhdistelmä analyytin määrittämiseen on kertakäyttöinen ja se sisältää kaikki yllä mainitut keksinnön mukaisen menetelmän tarpeelliset reagenssit ja entsyymit sekä kiinteän kantajan. Tyypillisesti testi suoritetaan saattamalla näyte yhteen kiinteän kantajan kanssa, joka sisältää tarpeelliset reagenssit ja entsyymit. Näytemateriaali voi olla kaasumainen tai nestemäinen, esim. elimistön neste, kuten sylki, plasma tai virtsa, tai uloshengitysilma, työpaikan tai asuinympäristön ilma.

Testissä raja-arvon ylitys tai alitus näkyy herkkänä ON/EI-tyyppisenä helposti tulkittavana värin muutoksena.

Värin muutos voidaan todeta silmämääräisesti, mutta myös sopivan instrumentaation avulla, esimerkiksi kolorimetrisesti tai fluorometrisesti.

Menetelmään kuuluvat reagenssit tai komponentit voidaan tunnetuilla tekniikoilla yhdistää kantajaan, esim. kuivata erilaisille pinnoille tai imeyttää huokoisiin materiaaleihin ennen kuivausta. Kuivaa reagenssivyöhykettä valmistettaessa voidaan lisäksi käyttää yleisesti tunnettuja inerttejä kuivausta helpottavia apuaineita, reagenssien liukenemista nopeuttavia aineita sekä entsyymin stabilaattoreita ja detergenttejä.

Testivälineeseen sopiviin kantajamateriaaleihin kuuluvat i3 84625 kaikki tämän tyyppisissä testeissä yleisesti käytetyt materiaalit. Tyypillisimpiä materiaaleja ovat lasi, puu, metalli, tekstiili, gelatiini, filtteripaperi, huokoiset selluloosatuotteet ja muovimateriaalit. Kantajan materiaali ei ole keksinnössä kriittinen, vaan periaatteessa se voi olla mikä hyvänsä materiaali, joka pystyy toimimaan kantajana systeemin reagensseille ja komponenteille.

Määrityksen suorittamista varten voidaan testivälineessä myös käyttää hyväksi tunnettuja järjestelmiä, joiden avulla kantajaan saadaan määrätty toisinnettavissa oleva määrä nestemäistä näytettä. Tällainen järjestelmä voi perustua esim. hydraatioon tai kapillaari-ilmiöön, ja niitä on esitetty mm. patenttijulkaisussa WO 88/04694. Toisaalta keksinnön mukaista menetelmää ja testivälinettä voidaan soveltaa myös siten, ettei kantajan kanssa kosketuksiin joutuvan näytteen määrän tarvitse olla vakiomittainen.

Tällöin määrityksessä seurataan, tapahtuuko testivälineessä värinmuutos tietyn aikavälin kuluessa. Tällaista sovellutusta voidaan tyypillisesti käyttää esim. ilman formaldehydipitoisuuden mittauksessa.

Keksinnön mukaisessa testivälineessä voi myös olla erillisiä kuivattuja indikaattorialueita, jotka osoittavat kukin erillistä määrättyä raja-arvoa. Eräs menetelmän sovellutus on aplikoida raja-arvon määrittävä reagenssi jatkuvasti muuttuvassa pitoisuudessa (pitoisuusgradientti) indikaattori-vyöhykkeeseen, jolloin alueen, jossa analyytin raja-arvo ylittyy ja alueen, jossa se alittuu, välille muodostuu värinmuutoskohta. Tällöin voidaan saada näytteen analyyttipitoisuuden tarkka numeerinen arvo vertaamalla värinmuutoskohtaa ennalta kalibroituun asteikkoon.

Keksintöä havainnollistetaan seuraavilla esimerkeillä rajoittamatta keksintöä kuitenkaan niihin.

14 84625

Esimerkki 1

Etanolin määritys Acetobacter acetin PQQ-alkoholidehydro-genaasilla (MBADH).

Sx eli raja-arvon asettajana toimiva ensimmäinen elektroniakseptori on ferrisyanidi ja kromogeeninä toimiva S2 on DCIP (dikloorifenoli-indofenoli). Ferrisyanidi ja DCIP ovat molemmat MBADH:n substraatteja ja sen lisäksi ne ovat redox-tasapainossa keskenään tasapainon ollessa voimakkaasti vasemmalla pH 6:ssa. Jos reaktiossa jää kulumatonta ferrisyanidia (ylimäärin etanoliin verrattuna) DCIP pysyy hapettuneessa muodossa S2ox, joka on voimakkaan sininen. Pelkistynyt muoto S2red on väritön. A.acetin PQQ-aldehydidehydrogenaasi (MBALDH) käyttäytyy kokeessa analogisesti.

Kyveteissä olivat seuraavat reagenssipitoisuudet: DCIP

0.16 mmol/1, etanolia 0.45 mmol/1, Mcllvainen puskuri pH

6.0 40 mmol/1, Triton X-100 1.3 %, MBADH 620 U/l sekä ferrisyanidia kyveteissä 1-6: 0, 0.31 , 0.94, 1.09, 1.25 ja 1.56 mmol/1. Kuvassa 1 on esitetty absorbanssimittauksen tulokset kyveteissä 1-6 mittausaallonpituuden ollessa 570 nm. Kyveteissä 1 ja 2 DCIP:n väri hävisi suhteellisen nopeasti, kyvetissä 3 väheni, mutta säilyi voimakkaana ja kyveteissä 4, 5 ja 6 säilyi voimakkaan sinisenä. Kyvetissä 2 ja 3 havaitaan viiveaika, jolloin DClP:n määrä ei muutu, mutta ferrisyanidia kuluu.

Esimerkki 2

Kun esimerkin 1 mukaiseen reaktioseokseen lisätään 0,3 mmol/1 PMS:ää tai 0,6 mmol/1 l-metoksi-PMS:ää, DCIP:n pelkistymisnopeus noin kaksinkertaistuu. Ferrisyanidin pelkistymisnopeuteen eivät fenatsiinivärilisäykset sen sijaan vaikuta.

15 84625

Esimerkki 3

Esimerkki kuvaa keksinnön mukaisen menetelmän toista suoritusmuotoa, jossa ensimmäisenä elektroniakseptorina S3 on DCIP, redoxkatalyyttinä S2 on PMS ja kromogeeninä S3 on INT. Kyveteissä olivat seuraavat reagenssipitoisuudet: PMS 0,3 mmol/1, INT 0,32 mmol/1, etanolia 0,5 mmol/1, Mcllvainen puskuri (pH 7) 40 mmol/1, Triton X-100 1,3 %, MBADH 700 U/l sekä DCIP:iä kyveteissä 1 - 6: 0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 ja 0,16 mmol/1. Kuvassa 2 on esitetty absorbanssimittauksen tulokset kyveteissä 1-6 mittausaallonpituuden ollessa 450 nm, jossa DCIP:n sininen väri ei vaikuta merkittävästi absorbanssiin. Kuvasta nähdään, että punaista 450 nm:ssä absorboivaa formatsaaniväriä muodostuu vasta kun sininen DCIP on kulunut reaktioseoksesta pois. Tämä voitiin havaita kyveteistä myös visuaalisesti.

Lisäkokeessa etanolin määrä laskettiin puoleen ja DCIP:n määrä nostettiin kolminkertaiseksi. Tällöin kun molaarinen DCIP/EtOH-suhde oli 1:1, saatiin vaalean ruskea siirtymäväri, joka muodostui alle 10 minuutissa ja oli stabiili vähintään 30 min. Kun DCIP-pitoisuus oli alle etanolipitoisuuden, reaktioseos muuttui nopeasti punaiseksi, ja määräsuhteiden ollessa toisinpäin reaktioseos jäi siniseksi. Nämä värit olivat stabiileja.

Esimerkki 4

Etanolin raja-arvokoe käyttäen MBADH/MBALDH-kombinaatiota.

Kyveteissä olivat seuraavat reagenssipitoisuudet: MTT 0.2 mmol/1, PMS 0.18 mmol, ferrisyanidia 43 mmol/1, 0.3 mol/1 meripihkahappopuskuri pH 4.5, Triton X-100 0.07 % sekä etanolia kyveteissä 1-6 9.7, 9.7, 10.2, 10.77, 11.3 ja 11.8 mmol/1. Entsyymiaktiivisuus kyveteissä oli: MBADH:ta 35000 U/l ja MBALDH:ta 5700 U/l. Kyvetissä 2 ei ollut ie 84625 entsyymiä. Kuvassa 3 on esitetty absorbanssimittauksen tulokset kyveteissä 1-6 mittausaallonpituuden ollessa 570 nm. Reaktion loputtua kyvetit 1, 2 ja 3 olivat värittömiä, kyvetissä 4 näkyi häivä sinistä ja kyvetit 5 ja 6 olivat voimakkaan sinisiä. Sinisen värin muodostuminen alkoi, kun neljä ferrisyanidimolekyyliä oli kulunut yhtä etanoli-molekyyliä kohti. Määrityssysteemissä etanoli muuttui etikka-hapoksi. Tässä esimerkissä pystyttiin visuaalisesti erottamaan alle 5 %:n etanolipitoisuuserot käytetyissä olosuhteissa.

Esimerkki 5

Etanolin raja-arvokoe lähes puhtaalla MBADH-preparaatilla.

•

Kyveteissä olivat seuraavat reagenssipitoisuudet: MTT 0.2 mmol/1, PMS 0.18 mmol/1, etanoli 1.95 mmol/1, 0.28 mol/1 sukkinaattipuskuri pH 4.5, Triton X-100 1.1 % ja MBADH-aktiivisuus 2300 U/l. Kyveteissä 1-6 vaihdeltiin ferrisyanidin määrää: 0, 1.11, 3.34, 3.89, 4.44 ja 5.56 mmol/1. Kuvassa 4 on esitetty absorbanssimittauksen tulokset kyveteissä 1-6 mittausaallonpituuden ollessa 570 nm. Kyveteissä 1, 2 ja 3 muodostui sinistä väriä sitä hitaammin, mitä enemmän ferrisyanidia oli. Kyvetissä 4 värinmuodostus oli hyvin hidasta ja kyveteissä 5 ja 6 ei muodostunut sinistä väriä.

Sinistä väriä alkoi muodostua kokeessa, kun etanolimolekyyliä kohti oli kulunut kaksi molekyyliä ferrisyanidia ja reaktioseoksessa oli vielä jäljellä etanolia. Etanoli hapettui reaktiossa asetaldehydiksi.

Esimerkki 6 17 84625

Asetaldehydin raja-arvokoe aldehydidehydrogenaasilla.

Kyveteissä olivat seuraavat reagenssipitoisuudet: MMT 0.19 mmol/1, PMS 0.17, asetaldehydi 0.42 mmol/11, 0.27 mmol/1 sukkinaattipuskuri pH 4.5, Triton X-100 1.1 % sekä aldehydidehydrogenaasiaktiivisuus oli 2000 U/l. Ferrisyanidin määrä oli kyveteissä 1-6: 0, 0.22, 0.67, 0.78, 0.89 ja 1.11 mmol/1. Kuvassa 5 on esitetty absorbanssimittauksen tulokset kyveteissä 1-6 mittausaallonpituuden ollessa 570 nm. Kyveteissä 1-4 havaittiin melko nopea voimakas värinmuodostuminen. Kyvetissä 5 alkoi muodostua pitkän viiveen jälkeen hitaasti hailakka sininen väri ja kyvetti 6 säilyi keltaisena.

Esimerkki 7

Formaldehydin määrittäminen aldehydidehydrogenaasilla nestemäisestä näytteestä.

Kyveteissä olivat seuraavat reagenssipitoisuudet: MTT 0.19 mmol/1, PMS 0.17 mmol/1, formaldehydi 0.42 mmol/1, 0.27 mmol/1 sukkinaattipuskuria pH 4.5, Triton X-100 1.1 % sekä kyveteissä 1- 6 aldehydidehydrogenaasiaktii-visuutta (määritettynä asetaldehydidehydrogenaasiaktiivi-suutena) 2100 U/l. Kyvetissä 7 ei ollut formaldehydia. Ferrisyanidimäärä oli kyveteissä 1 - 7: 0, 0.21, 0.64, 0.72, 0.85, 1.06 ja 0.21 mmol/1. Kuvassa 6 on esitetty absorbanssimittauksen tulokset kyveteissä 1-7 mittausaallonpituuden ollessa 570 nm. Kyveteissä 1-5 tapahtui sinisen värin muodostuminen. Absorbanssin hidas kasvu esim. kyveteissä 6 ja 7, joissa ei ollut sinisen värin muodostumista, johtui kyvetteihin muodostuneesta vaaleasta sakasta.

18 84625

Esimerkki 8

Etanolin raja-arvomääritys: kuivakemian sovellutus.

Polystyreenipinnalle aplikoitiin 13 μΐ reaktioseosta, joka sisälsi : sukkinaattipuskuria 0.5 mol/1 pH 4.5 760 μΐ MTT 8.7 mmol/1 30 μ PMS 7.8 mmol/1 30 μ ferrisyanidia 0.5 mol/1 58 μ

Triton X 100 10 % 10// MBADH 180000 300 μ Välittömästi reaktioseos ilmakuivattiin 40°:ssa ilmaa puhaltamalla.

Kuivattuihin reagensseihin pipetoitiin 13 μΐ etanoliliuoksia, joissa oli etanolia 8.3 ja 6.2 mmol/1. Ensimmäiseen muodostui sininen väri noin kahdessa minuutissa ja toiseen ei muodostunut sinistä väriä. Pitoisuus, jossa värinmuutos tapahtuu, on säädettävissä muuttamalla ferrisyanidin pitoisuutta ylläkuvatussa esimerkissä.

Esimerkki 9

Aldehydidehydrogenaasin käyttö ilman formaldehydipitoisuuden määrittämisessä. Värin muutosnopeuteen vakiotormaldehydipi toisuudessa voidaan vaikuttaa ferrisyanidin määrää muuttamalla tai kantajamateriaalin valinnoilla.

Koe 1

Formaldehydipitoisuus kammion ilmatilassa oli noin 130 mg/m3 (* 100 x HTP15 min formaldehydille).

Käytetyt liuokset: 19 84625

Sukkinaattipuskuri 0.5 mol/1, pH 4,5 MTT 3.6 mg/ml PMS 2,5 mg/ml Triton X 100 10 %

Ferrisyanidi 10 mmol/1 ALDH:ta 16000 U/l

Reaktioseos:

Sukkinaattipuskuri 125 μΐ

Triton X 100 25 " MTT 30 " PMS 10 " 38 //l:aan seosta lisättiin 20 μ\ ALDH: ta ja kulloinkin käytetty ferrisyanidimäärä (2 μΐ, 3 μΐ ja 4μ1). Tästä seoksesta otettiin PVC-muovissa olevaan kuoppaan (=TK), UltraBind MSV-450-paperiliuskalle (=UB) ja lasikuitu-paperiliuskalle <»LK) 5 μΐ.

Reaktioseoksen pipetoimisen jälkeen indikaattorivyöhykkeet asetettiin formaldehydia ilmatilassaan sisältävään kammioon. Värin muutosajat otettiin ylös. Tulokset on esitetty . taulukossa 1.

Taulukko 1 Värin muutosajat formaldehydin määrityksessä:

Ferrisyanidi/ Värin muutosaika/s

mmol x 10-6 koe UB LK TK

1.7 20 25 45 2.5 40 35 70 3.4 55 45 80

Vastaavassa kokeessa liuskaan, jossa ei ollut entsyymiä, ei muodostunut väriä. Taulukosta nähdään, että värin muutosaika on riippuvainen vakioformaldehydipitoisuudessa indikaattori- 20 84625 vyöhykkeen ferrisyanidimäärästä sekä käytetystä kantajamateriaalista.

Koe 2.

Tässä kokeessa testattiin indikaattorivyöhykkeen värin muutosnopeutta hyvin pienellä formaldehydipitoisuudella ilmassa. Formaldehydipitoisuus kammion ilmatilassa oli noin 1,3 mg/m3 (=HTP15 min formaldehydille).

Käytetyt liuokset olivat muuten samat, paitsi MTT:n pitoisuus oli 0.6 mg/ml ja PMS:n pitoisuus 1,20 mg/ml.

Reaktioseos:

Sukkinaattipuskuri 31,25 μΐ MTT 7,5 " PMS 2,5 "

Triton X 100 6,25 "

Ferrisyanidi 4,0 " ALDH 15,0 "

Yhteensä 66,5 μΐ

Reaktioseos voi sisältää lisäksi stabilaattoreita.

Näistä seoksista pipetoitiin 10 μΐ PVC-muovissa olevaan kuoppaan (»TK) ja 3 μΐ seuraaville paperiliuskoille:

Whatman 3 mm-kromatografiapaperi (=W)

UltraBind-paperi (=UB)

Lasikuitupaperi (»LK)

Paperiliuskat ja PVC-kuopat asetettiin formaldehydiä ilma-tilassan sisältävään kammioon. Värin muutosajat otettiin ylös. Tulokset on esitetty taulukossa 2.

21 84625

Taulukko 2 Värin rauutosajat formaldehydin määrityksessä käytettäessä erilaisia kantajamateriaaleja.

Kantajamateriaali LK UB W TK

min s min s min s min s Värin muutosaika 3 00 5 10 1 50 6 30

Esimerkki 10

Tämä esimerkki kuvaa keksinnön mukaisen menetelmän kolmatta suoritusmuotoa kolmen kilpailevan substraatin reaktiosysteemissä, jossa ensimmäisenä elektroniakseptorina Sx on ferrisyanidia, toisena elektroniakseptorina S2 on DCIP ja redoxkatalyytti+kromogeeni -yhdistelmänä on PMS + INT

(S3). Tässä systeemissä aluksi tapahtuu ferrisyanidin kuluminen ja sitten DCIP:n sinisen värin häviäminen (väri muuttuu sinisen ja vihreän kautta keltaiseksi). Jos etanolia on yli stökiömetrisen määrän, PMS/INT alkaa muodostaa punaista väriä. Väri muuttui tällöin puhtaan keltaisesta oranssin kautta punaiseksi. Esimerkki tämänkaltaisista värimuutoksista on esitetty kuvassa 7, jossa minuutin välein on ajettu spektrit (1-12) reaktioseoksesta, joka sisälsi:

Mcllvainen 0.1 mol/1 sitraatti/ fosfaattipuskuria pH 7 2 ml

Triton X 100 10 % 0.4 ml

Etanoli 0.2 % 0.15 ml DCIP 15 mmol/1 0.016 ml

Kaliumferrisyanidi 0.1 mol/1 0.030 ml PMS 7.8 mmol/1 0.1 ml INT 8 mmol/1 0.1 ml MBADH 120000 U/l 0.030 ml

Aluksi noin 420 nm:n kohdalla havaitaan ferrisyanidin 22 84625 vähenemisestä aiheutuva absorbanssin alenema. Kun ferrisyanidi on käytännöllisesti katsoen loppunut, DCIP:n sininen väri alkaa hävitä (maksimi lähellä 640 nm:ä). Kun DCIP on loppunut (jäljellä PMS:n keltainen väri), alkaa muodostua INTrstä punainen väri (katkoviivakäyrissä, maksimi lähellä 440 nm:ä).

Esimerkki 11

Esimerkin 10 reaktion värinmuutoksia seurattiin myös silmämääräisesti. Tässä kokeessa DCIP:n määrä oli kaksinkertaistettu ja entsyymin määrä 15-kertaistettu: t (s) väri 0 vihreä 10 sininen 30 vihreä 45 keltainen 60 oranssi 75 punainen

Keksintöä on kuvattu edellä viitaten tiettyihin edullisiin suoritusmuotoihin ja reagenssikombinaatioihin. On kuitenkin selvää, että alan ammattimiehelle ilmeisiä variaatioita, modifikaatioita ja reagenssien ekvivalenttista korvaamista voidaan suorittaa ilman kohtuutonta kokeilutyötä poikkeamatta keksinnön hengestä tai laajuudesta. Esimerkiksi kirjallisuuden perusteella on hyvin tunnettua, että fenat-siinivärit toimivat elektronikantajina useille väriaineille, joita voidaan soveltaa esitetyn kaltaisessa keksinnössä (kts. Michal, G. et ai., Methods of Enzymatic Analysis, Voi I, 197, toim. Bergfmeyer H.U., Verlag Chemie 1983).

Claims (18)

23 8 4 6 2 5

1. Menetelmä okso- tai hydroksiryhmiä sisältävän analyytin määrittämiseksi värisignaalin avulla, joka värisignaali syntyy analyytin määrän ylittäessä tietyn kynnysarvon, tunnettu siitä, että lisätään mittausseokseen, joka sisältää a) kromogeenin, jota analyytti PQQ-dehydrogenaasin läsnäollessa suoraan tai mahdollisen redoxkatalyytin välityksellä pelkistää aiheuttaen värinmuutosreaktion, b) ensimmäisen elektroniakseptorin, jota analyytti PQQ-dehydrogenaasin läsnäollessa suoraan tai mahdollisen redoxkatalyytin välityksellä pelkistää oleellisesti nopeammin kuin kromogee-niä, jolloin kromogeenin pelkistyminen ja värinmuutosreaktio estyvät kunnes ensimmäinen elektroniakseptori on kulunut loppuun ja c) PQQ-dehydrogenaasin, joka pystyy siirtämään elektroneja analyytiltä ensimmäiselle elektroniakseptorille ja/tai kromogeenille suoraan tai mahdollisen redoxkatalyytin välityksellä, määritettävää analyyttiä, jolloin PQQ-dehydrogenaasin substraattina toimiva analyytti reagoi kuluttaen ensimmäistä elektroniakseptoria tai sen loputtua kromogeeniä, ja toteamalla tapahtuuko värinmuutos.

2. Vaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että mittausseokseen lisätään lisäksi toinen elektroniakseptori, jota analyytti PQQ-dehydrogenaasin läsnäollessa suoraan tai mahdollisen redoxkatalyytin välityksellä pelkistää oleellisesti hitaammin kuin ensimmäistä elektroniakseptoria mutta oleellisesti nopeammin kuin kromogeeniä, jolloin kromogeenin pelkistyminen estyy kunnes ensin ensimmäinen elektroniakseptori ja sen jälkeen toinen elektroniakseptori on kulunut loppuun.

3. Reagenssiyhdistelmä okso- tai hydroksiryhmiä sisältävän analyytin osoittamiseksi näytteestä värisignaalin avulla, joka värisignaali syntyy analyytin määrän ylittäessä tietyn kynnysarvon, tunnettu siitä, että kiinteään kantajaan on yhdistetty seuraavat komponentit; 24 84625 a) kromogeeni, jota analyytti PQQ-dehydrogenaasin läsnäollessa suoraan tai mahdollisen redoxkatalyytin välityksellä pelkistää aiheuttaen värinmuutosreaktion; b) ensimmäinen elektroniakseptori, jota analyytti PQQ-dehydrogenaasin läsnäollessa suoraan tai mahdollisen redoxkatalyytin välityksellä pelkistää oleellisesti nopeammin kuin kromogeeniä; ja c) PQQ-dehydrogenaasi, joka pystyy siirtämään elektroneja analyytiltä elektroniakseptorille ja/tai kromogeenille suoraan tai mahdollisen redoxkatalyytin välityksellä.

4. Vaatimuksen 3 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnet-t u siitä, että se sisältää lisäksi toisen elektroniaksep-torin, jota analyytti PQQ-dehydrogenaasin läsnäollessa suoraan tai mahdollisen redoxkatalyytin välityksellä pelkistää oleellisesti hitaammin kuin ensimmäistä elektroniaHseptoria mutta oleellisesti nopeammin kuin kromogeeniä.

5. Jonkin vaatimuksista 3-4 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi sanotun redoxkatalyytin, joka PQQ-dehydrogenaasin läsnäollessa pystyy ottamaan vastaan elektroneja analyytiltä ja siirtämään ne kromogeenille ja/tai ensimmäiselle tai toiselle elektroniakseptorille.

6. Vaatimuksen 5 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnet-t u siitä, että redoxkatalyytti on fenatsiiniväri tai oksatsiiniväri.

7. Vaatimuksen 6 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnet-t u siitä, että redoxkatalyytti on PMS, 1-metoksi-PMS, PES, tai Meldolasini.

8. Jonkin vaatimuksista 3-7 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnettu siitä, että PQQ-dehydrogenaasi on membraaniin sidottu alkoholidehydrogenaasi (MBADH). Il 25 84625

9. Jonkin vaatimuksista 3-8 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnettu siitä, että PQQ-dehydrogenaasi on membraaniin sidottu aldehydidehydrogenaasi (MBALDH).

10. Jonkin vaatimuksista 3-9 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnettu siitä, että ensimmäinen elektroniakseptori on Fe(III):n kompleksi, kelaatti tai indofenoliväri.

11. Vaatimuksen 10 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnettu siitä, että ensimmäinen elektroniakseptori on ferrisyanidi tai DCIP.

12. Jonkin vaatimuksista 3-11 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnettu siitä, että kromogeeni on tetratsoliumväri, oksatsiiniväri tai indofenoliväri. t

13. Vaatimuksen 12 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnettu siitä, että kromogeeni on MTT, DCIP, INT tai Meldolasini.

14. Jonkin vaatimuksista 5-13 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnettu siitä, että ensimmäinen elektroniakseptori on ferrisyanidi, kromogeeni on MTT ja redoxkatalyytti on PMS tai 1-metoksi-PMS.

15. Jonkin vaatimuksista 5-13 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnettu siitä, että ensimmäinen elektroniakseptori on DCIP, kromogeeni on INT ja redoxkatalyytti on PMS tai 1-metoksi-PMS.

16. Jonkin vaatimuksista 4-13 mukainen reagenssiyhdistelmä tunnettu siitä, että ensimmäinen elektroniakseptori on ferrisyanidi, toinen elektroniakseptori on DCIP, kromogeeni on INT ja redoxkatalyytti on PMS tai 1-metoksi-PMS.

17. Jonkin vaatimuksista 3-16 mukaisen reagenssiyhdistelmän käyttö jonkin vaatimuksista 1-2 mukaisen menetelmän 26 8 4 6 2 5 suorittamiseksi .

18. Vaatimuksen 17 mukainen käyttö tunnettu siitä, että analyytti, joka määritetään, on alempi alkoholi tai alempi aldehydi. t li 27 84625