FI84361C - Foerfarande och vaextmedium foer att foerbaettra vaexten hos mykobakterier. - Google Patents

Description

1 84361

Menetelmä ja kasvualusta mykobakteerien kasvun parantamiseksi

Esillä olevan keksinnön kohteena ovat menetelmä 5 mykobakteerien kasvun parantamiseksi ja kasvualusta, jossa mykobakteerien kasvuominaisuudet ovat parantuneet.

Viljely mikro-organismien kasvattamiseksi valmistamalla sopivat ravinto- ja ympäristöolosuhteet on hyvin tunnettu. Yleensä vaikuttaviin tekijöihin sopivissa kas-10 vatusolosuhteissa kuuluvat kasvualustan tuottamien ravin teiden luonne ja määrä, pH, lämpötila ja ilmastus. Muihin välttämättä hallittaviin tekijöihin kuuluvat alustan suolapitoisuus ja osmoottinen paine ja joissakin tapauksissa sellaiset erikoistekijät kuin valo fotosynteettisiä or-15 ganismeja varten.

Sopivan kasvualustan on sisällettävä kaikkia ravinteita, joita viljeltävä mikro-organismi tarvitsee. Yleensä saatavissa täytyy olla seuraavia ravinteita: (1) vetydonoreita ja akseptoreita; 20 (2) hiililähde; (3) typpilähde; (4) mineraaleja kuten rikkiä ja fosforia ja hivenaineita kuten kaliumia, magnesiumia, kalsiumia ja rautaa.

Lisäksi tiedetään, että tarvitaan tiettyjä kasvu-25 tekijöitä. Kasvutekijä on orgaaninen yhdiste, jota mikro- organismin pitää sisältää kasvaakseen, mutta jota se ei pysty syntetisoimaan. Monet mikro-organismit varustettuina yllä luetelluilla ravinteilla, pystyvät syntetisoimaan kaikki protoplasmansa orgaaniset aineosat mukaan 30 lukien aminohapot, vitamiinit, puriinit ja pyridamiinit, rasvahapot ja muut yhdisteet. Jokainen näistä välttämättömistä yhdisteistä syntetisoidaan erillisessä entsymaat-tisten reaktioitten jaksossa ja jokainen entsyymi tuotetaan tietyn geenin valvonnassa. Kun organismille tapahtuu 35 geenimutaatio, joka johtaa siihen, että jokin näistä ent- 2 84361 syymeistä lakkaa toimimasta, ketju katkeaa eikä lopputuotetta enää valmistu. Mikro-organismin on tällöin saatava tätä yhdistettä ympäristöstä ja yhdisteestä on tullut organismin kasvutekijä.

5 Eri mikro-organismit vaihtelevat suuresti ravinne- ja kasvutekijävaatimuksiltaan. Esillä oleva keksintö kohdistuu menetelmään ja alustaan, joka parantaa mikro-organismin kasvunopeutta ja kasvumäärää kasvualustassa, joka sisältää niiden kasvulle tarpeellisia ravinteita. Kek-10 sinnölle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa esitetään.

On tultu siihen tulokseen, että polyoksietyleeni-stearaatin lisääminen tietyn mikro-organismin ravinteita sisältävään kasvualustaan parantaa mikro-organismin kas-15 vunopeutta ja kasvumäärää nestealustassa. Kasvunopeuden lisäyksen lisäksi huomioituna visuaalisesti tai värjätyssä tippapreparaatissa tämä parannus voidaan huomata suurempana C02 tuotantona, joka on merkitsevä mikro-organismin kasvun toteamiseksi automaattisissa radioimmunomääri-20 tysjärjestelmisssä.

Ainoa kuvio on M. tuberculosis-kannan kasvattamiseen käytetyn kasvualustan graafinen esitys. Kasvualustaa kutsutaan nimellä BACTEC 12A. Graafisen esityksen alempi viiva esittää 12A alustan käytön sellaisenaan.

25 Graafisen esityksen ylempi viiva esittää 12A alustan käytön polyoksietyleenistearaatin yhteydessä.

Mykobakteerit yleensä ja M. tuberculosis ja M. bo-vis erityisesti ovat hyvin hitaasti kasvavia organismeja. Useimpien näiden organismien kasvaminen kestää noin 2-3 30 viikkoa tavanomaisesti käytetyissä viljelmäalustoissa. On tehty useita yrityksiä alustan tai aineen löytämiseksi, joka voi parantaa kasvua ja pienentää aikatekijää. Esitys RNA:n kiihottavasta vaikutuksesta mykobakteereitten kasvuun on johtanut Lowenstein Jensenin alustan Gruft muun-35 nelmaan (Gruft, H. 1971, Isolation of Acid-Fast Bacilli 3 84361

From Contaminated Specimens, Health Lab Science 8:79).

RNA: n aiheuttama kasvun parannus on kuitenkin vielä kyseenalainen eikä ole ollut mitään osoitusta merkitsevästä vaikutuksesta, joka aiheutuisi RNA-lisäyksen käytöstä 5 kasvualustassa.

Menetelmä bakteerien toteamiseksi käyttämällä radioaktiivisen 14C toteamista on kuvattu Yhdysvaltain patentissa nro 3 935 073, Waters. Kasvualusta, jota on käytettävä Watersin patentin kuvaamassa laitteessa ja jo-10 ka sopii mykobakteeriviljelmään, sisältää seuraavia ra vinteita esitetyissä määrin: 7H9 lihaliemiperusta 0,47 % (joka sisältää kalium- ja natrium-fosfaatteja, natriumglutamaattia, 15 natriumsitraattia, ammoniumsulfaat- tia, pyridoksiinia, rauta(III)-ammoniumsitraattia, magnesiumsulfaattia, sinkkisulfaattia, kupari-sulfaattia, biotiinia ja kalsium-20 kloridia, toimittaja BBL Micro biology Systems, Cockeysville,

Maryland) naudan seerumin albumiini 0,5 % kaseiinihydrolysaattia 0,1 % 25 katalaasi 96 yksikköä/pullo 14C merkitty substraatti 2 Ci/pullo deionisoitu vesi 2 qds.

lopullinen pH 6,8±0,1

Polyoksietyleenistearaatin lisääminen yllä määri-30 teltyyn kasvualustaan parantaa mykobakteerien kasvua merkitsevässä määrin. Yleensä polyoksietyleenistearaattia lisätään kasvualustaan pitoisuudessa 10 mikrogrammasta 10000 mikrogrammaan alustamillilitraa kohti. Parannus on suorassa suhteessa polyoksietyleenistearaatin väkevyy-35 teen. Erityisesti todetaan, että noin 50 - noin 500 mik- 4 84361 rogrammaa millilitraa kohti on edullinen alue, jolla kasvu ja 14C02 tuotanto paranee ilman negatiivista vaikutusta hapon kestävyyteen tai muihin organismien fysiologisiin ominaisuuksiin.

5 Polyoksitetyleenistearaatti liukenee vesipitoiseen kasvualustaan. Siitä johtuen polyoksietyleenistearaatin fysikaalinen muoto ei ole kriittinen. Polyoksietyleeni-stearaattia voidaan lisätä pellettien, rakeitten tai jauheen muodossa tai se voidaan suihkuttaa viljelypullon si-10 säpinnalle. Polyoksietyleenistearaattia voidaan käyttää sekä ravintoliuos- että agarkasvualustassa. Agarissa käytettynä polyoksietyleenistearaatti pitäisi liuottaa ennen agarin lisäämistä.

Esimerkkinä esillä olevan keksinnön menetelmän ja 15 seoksen kasvunparannusominaisuuksista valmistettiin kas vualusta, jonka aineosat olivat seuraavat esitetyissä määrin: 7H9 lihaliemiperusta 0,47 % naudan seerumin albumiini 0,5 % 20 kaseiinihydrolysaatti 0,1 % katalaasi 96 yksikköä/pullo 14C merkitty substraatti 2 Ci/pullo deionisoitu vesi 2 qds.

lopullinen pH 6,8±0,1 25 Yllä kuvattu kasvualusta jaettiin kahteen osaan.

Toiseen puoliskoon lisättiin polyoksietyleenistearaattia (raemuodossa) tasolla sata mikrogrammaa millilitraa kohti. Toinen puolisko kasvualustaa käytettiin lisäyksittä.

M. tuberculosis, kanta H37Rv suspensio, vastaten 30 MacFarland nro 1 normia, laimennettiin 1:500 ja 0,1 ml siirrostettiin jokaiseen pulloon, joka sisälsi 2 ml kasvualustaa. Kahdeksan pulloa kulloinkin kasvualustaa pelkästään ja kasvualustaa plus polyoksietyleenistearaattia siirrostettiin. Kaikki pullot luettiin laitteella, joka 35 oli samanlainen kuin edellä mainitussa Watersin patentissa. Lukemat otettiin päivittäin 12 päivän ajan. Laitteen muistiin merkitsemät päivittäiset kasvuindeksi (GI)-arvot 5 84361 näyttivät 14C02 tuotantoa alustassa läsnä olevasta 14C merkitystä substraatista. Lukemien tuloksia käytettiin kuvion 1 kahden graafisen esityksen valmistamiseen.

M. tuberculosis-bakteerin kasvua seurattiin myös 5 visuaalisesti samoin kuin valmistamalla tippapreparaatit ja värjäämällä Ziehl Neelsenin menetelmällä haponkestä-ville bakteereille.

Kuvion 1 graafisten esitysten perusteella on ilmeistä, että M. tuberculosiksen kasvukäyrä kasvualustas-10 sa, johon polyoksietyleenistearaattia on lisätty, on merkittävästi parantunut verrattuna kasvualustaan ilman tällaista lisäystä. Paranemisvaikutus M. tuberculosis-bakteerin kasvuun alustassa näkyy selvästi, kun kasvuindeksi saavuttaa suunnilleen arvot 100-150 päivänä 6 - päivään 15 8. Tässä pisteessä mykobakteerikasvun lisäys tulee hyvin äkkinäiseksi. Ekvivalentilla kasvuindeksilukemalla kasvun määrä visuaalisesti huomioituna on myös merkittävästi suurempi polyoksietyleeniä sisältävässä alustassa kuin tavallisessa 12A alustassa. Kun preparaatit valmistetaan 20 polyoksietyleenistearaattia sisältävästä kasvualustasta ja värjätään Ziehl Neelsen-menetelmällä, haponkestävät bakteerit ovat enemmän hajallaan pitkissä nuoramaisissa käärmenauhoissa ja niitä on lukumäärältään enemmän.

Tiedot mykobakteerien ensisijaisesta eristämisestä 25 (talteenotosta) kliinisistä näytteistä (yskös) sisältyvät taulukkoon 1. Positiivisen mykobakteeriviljelyn kasvun ja GI tulostuksen paraneminen polyoksietyleenistearaatin läsnä ollessa on ilmeinen näistä kahdesta esimerkistä. Päivän 7 jälkeen GI tulostus, joka myös esittää kasvun 30 nopeuden ja määrän, on merkittävästi suurempi 12A alustassa, joka sisältää polyoksietyleenistearaattia, verrattuna 12A alustaan ilman sitä.

Samanlainen paranemisvaikutus on huomattu M. bovis-bakteerilla ja monilla muilla mykobakteereilla kuin 35 M. tuberculosis (MOTT tai ei-tyypilliset mykobakteerit).

6 84361 H o g s s 1 w rH (N OI in u o Ή O ch in £

Lj co cn vo r? 5 σν r-i rf CO ^ Λ 3 ^ ^ N ? v o m cn Γ: A CO rH rH CN ^ >1 4-> -p VM O H ov ^ (0 Tn o- in in γ-h vji w -H 1-1

(0 S V

+j 2 tn -h 6 vo co o» ^ 3 m 0) Ό N H in π h tn -¾ <0 0) jj cn ^

B I

CN r H O O O '"i H.h O m H rH CN ^ m 2 ^ a» ci tn

O co -H

.* -Pm :<o ^ oo o

·* O M P -I

3 3 0 ti 3 * * > ro f'* H Ή

Eh O £ :<0 00 (NOO™

u \ A

s e 3.

fa •f) o

O CN i—l i—l r-i O

C0 rH

3 P :(Ö O »0

JC -P

•H »H rH CN r—I tH r-I

•H :(0 X tn

H CO CO

C tn ω ω

3 *ö o O

> e > A (X

tn a; -h < + < + (0 0 *0 CN < CN <

& -Γ-) A rH CN rH CN

»H «H

VO CTi

00 VO CN O' rH 00 rH CN i—t rH

aö aO ad aö E E E E

I—I r-H rH rH

a) a) o a) ro -r—) -Π ·(“) H H H H H Ή -H Ή > > > >

Claims (10)

1. Menetelmä mykobakteerien kasvun parantamiseksi, tunnettu siitä, että mykobakteeri lisätään vesi- 5 pitoiseen viljelyalastaan, joka sisältää tehokkaan määrän polyoksietyleenistearaattia ja naudan seerumialbumiinia ja viljelyalasta saatetaan olosuhteisiin, jotka ovat my-kobakteerin kasvulle sopivat.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että mainittua polyoksietyleenistearaattia lisätään mainittuun viljelyalastaan tasolle noin 10 - noin 10 000 mikrogrammaa millilitraa kohti alustaa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että mainittua polyoksietyleenistearaattia lisätään mainittuun viljelyalustaan tasolle noin 50 - noin 500 mikrogrammaa millilitraa kohti alustaa.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että albumiinia lisätään tasolle noin 0,1 - noin 1,0 paino-%.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu mykobakteeri on Mycobacterium tuberculosis.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu mykobakteeri on Mycobacterium bovis.

7. Kasvualusta, jossa mykobakteerien kasvuominai-suudet ovat parantuneet, tunnettu siitä, että se 30 käsittää viljelyalustan, joka sisältää tehokkaan määrän polyoksietyleenistearaattia ja naudan seerumialbumiinia.

7 84361

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen kasvualusta, tunnettu siitä, että polyoksietyleenistearaattia on läsnä viljelyalustassa tasolla noin 10 - noin 10000 35 mikrogrammaa millilitraa kohti alustaa. a 84361

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen kasvualusta, tunnettu siitä, että mainittua polyoksietyleeni-stearaattia on läsnä kasvualustassa tasolla noin 50 -noin 500 mikrogrammaa millilitraa kohti.

10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen kasvualusta, tunnettu siitä, että mainittua albumiinia on läsnä tasolla noin 0,1 - noin 1,0 paino-%. 9 84361