FI79553B

FI79553B - Foerfarande foer framstaellning av en heteropolysackarid och anvaendning av pao detta saett erhaollen heteropolysackarid.

Info

Publication number: FI79553B
Application number: FI843691A
Authority: FI
Inventors: John Dudley Linton; Andrew Richard Godley; Michael William Evans
Original assignee: Shell Int Research
Priority date: 1983-09-22
Filing date: 1984-09-20
Publication date: 1989-09-29
Also published as: RO89835A; FI79553C; AU3332984A; EG17982A; JPS60186294A; DE3484086D1; AU619281B2; IE58039B1; AU3370389A; JPH0642835B2; EP0138255A2; IL73009A0; NO160721C; ZA847394B; DK450684A; CA1232559A; NO160721B; FI843691A0; EP0138255B1; IE842400L

Description

1 79553

Menetelmä heteropolysakkaridin valmistamiseksi ja tällä tavalla saadun heteropolysakkaridin käyttö Tämä keksintö koskee menetelmää heteropolysakkaridin 5 valmistamiseksi määrätyn jakautuvan bakteerin aikaansaaman käymisen avulla.

On tunnettua, että heteropolysakkarideja voidaan valmistaa fermentoimalla hiilihydraattilähdettä määrättyjen mikro-organismien, kuten Pseudomonas sp. NCIB 11592-lajin 10 avulla, kuten on selostettu EP-patenttihakemuksessa 81200479.4.

Hakijat ovat nyt eristäneet uuden gram-negatiivisen, jakautuvan bakteerin, joka on talletettu laitokseen, nimeltään National Collection of Industrial Bacteria, Torry 15 Research Station, Aberdeen, talletusnumerolla 11883. Verrattuna mikro-organismiin Pseudomonas sp. NCIB 11592 esillä oleva mikro-organismi NCIB 11883 näyttää tuottavan polysakkaridia huomattavasti suuremmalla nopeudella.

Lisäksi tuottavuus sakeutusvaikutuksen muodossa il-20 maistuna viljelyliemen laimennuskertoimen avulla (määrä, johon viljelyliemi on laimennettava, jotta saataisiin liuos, jonka viskositeetti on 9,2 g cm"^s-^· 30°C:ssa 15 %:isessa suolaliuoksessa leikkausnopeuden ollessa 7,5 sek-^-) on huomattavasti suurempi kysymyksen ollessa kannasta NCIB 11883 25 kuin kysymyksen ollessa lajista Pseudomonas sp. NCIB 11592.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle heteropolysakkaridin valmistamiseksi on tunnusomaista, että viljellään kantaa NCIB 11883 kemiallisesti määritetyssä vesipitoisessa ravintoväliaineessa assimiloituvan hiilihydraatin ja typen 30 lähteen aerobisen käymisen avulla ja otetaan talteen hetero-polysakkaridi, joka sisältää 1,9-5,5 % palorypälehappoa, 2,4-10,1 % meripihkahappoa ja glukoosia ja galaktoosia glukoosi/galaktoosi-suhteessa 5:1 - 10:1. Menetelmä voidaan sopivasti suorittaa panosmenetelmänä, syötettynä panosmene-35 telmänä käyttämällä tai käyttämättä täyttöä ja poistoa tai jatkuvana menetelmänä.

2 79553

Tuottavuusnäkökohtien kannalta on jatkuva menetelmä tai täyttö- ja poistomenetelmä edullinen. Organismia kasvatetaan edullisesti ilman hiivauutetta kemiallisesti määritetyssä väliaineessa. Menetelmä toteutetaan edullisemmin 5 hiilen lähdettä sisältämättömän ravinnon osalta rajoittei-sissa olosuhteissa. Kemiallisesti määritetyn väliaineen käyttäminen on edullista, koska määrättyä tuottavuutta tai määrättyä lopullista solukonsentraatiota silmälläpitäen näyttää olevan helpompaa käsitellä typen lähdettä, kuten 10 natriumglutamaattia, ammonium- tai nitraattisuoloja kuin kompleksisia typen lähteitä, kuten hiivauutetta tai alkoho-litislauksen liukoista jätettä. Typen lähde on edullisesti ammoniumsulfaatti.

Esillä oleva keksintö koskee lisäksi keksinnön mukai-15 sella menetelmällä valmistetun heteropolysakkaridin käyttöä viskositeettia muuttavana aineena vesiliuoksessa.

Esillä oleva keksintö koskee myös porausnestettä, joka sisältää vettä ja 0,06-1,5 paino-% edellä mainittua hetero-polysakkaridia, ts. vesipitoista järjestelmää, joka on esil-20 lä olevan heteropolysakkaridin sakeuttamia. Tämä vesipitoinen järjestelmä kuuluu edullisesti ryhmään, joka käsittää täydennysnesteitä, kunnostusnesteitä, stimulointinesteitä sekä porausnesteitä. Stimulointinesteitä käytetään esim. hydrauliseen murtamiseen ja hapolla suoritettavaan murtami-25 seen. Useimmat täydennys-, kunnostus-, poraus- ja stimuloin-tinesteet sisältävät vähintään yhtä muuta lisäainetta, esim. suolaa (kuten kaikissa mahdollisissa suolaliuosväkevyyksissä) , nestehukkaa pienentäviä lisäaineita, saven stabilisaattorei-ta, happoja, emäksiä, pinta-aktiivisia aineita jne.. Sakeu-30 tettava vesipitoinen järjestelmä voi lisäksi olla myös painomuste tai jopa ranskalainen salaattikastike.

Esillä oleva keksintö käsittää myös keksinnönmukaisella menetelmällä valmistetun heteropolysakkaridin käyttöä poraus-reitän käsittelyn, jolloin porausreikään johdetaan vesipi-35 toista väliainetta, joka sisältää vettä ja 0,05-1,5 paino-% edellä mainittua heteropolysakkaridia. Vesipitoinen väliaine 3 79553 on sopivasti suolaliuos tai neste ja se voi sisältää haluttaessa lisäaineita.

Esillä oleva keksintö koskee vielä keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettua heteropolysakkaridia sisältä-5 vän vesiliuoksen käyttöä parannetussa öljyn talteenotossa (enhanced oil recovery = EOR). Käyttö EOR:ssa voi merkitä nesteen siirtämistä porausreiän ja/tai läpäisevän maanalaisen muodostuksen läpi, joka on yhteydessä porareikään, liikkuvuutta säädettäessä liikkuvuuden puskuriaineena, esim.

10 pinta-aktiivisessa misellaarisessa tulvimistapauksessa, profiilin kontrollissa käytettäväksi, porausreiän vesiannin pienentämiseksi, vesi/öljy-suhteen pienentämiseksi jne..

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävä kanta NCIB 11883 on erikoinen gram-negatiivinen jakautuva baktee-15 ri, joka ei näytä helposti liittyvän mihinkään tunnettuun taksonomiseen ryhmään. National Collection of Industrial Bacteria on luonnehtinut ja identifioinut tämän mikro-organismin .

NCIB 11883:n kuvaus ja identifiointi 20 Tulokset

Tulokset on saatu 30°C:ssa ellei toisin ole mainittu. Solun morfologia

Pienet sauvat, sivuiltaan yhdensuuntaiset tai hiukan suipentuvat, suorat tai hiukan kaarevat tai käyrät, bipolaa-25 risia faasista riippuvia tummia alueita vanhemmissa viljelmissä (CM 55, 30°, 8 päivää). Siimat ovat lateraalisia; solujen kasautuminen yhteen EM-verkoille.

Kolonioiden morfologia CM55 48 tuntia: harmahtava, läpikuultavasta puolihim-30 meään yhtenäinen, konvertti, sileä & kiiltävä, 1 mm, koloniat hiukan limamaisia siihen asti kunnes enemmän polysakkaridia on muodostunut glukoosia sisältävään väliaineeseen.

CM55 kolonian koko: 24 tuntia, 0,2 mm, 38 tuntia, 1,5 mm. 35 CM3 48 tuntia: hyvä kasvu, harmahtava, pyöreä, yhtenäi nen, kupera, sileä, kiiltävä, hiukan limainen, 1,5 mm.

4 79553 CM3 + 1,0 % glukoosia 60 tuntia: hyvä kasvu, harmahtava pyöreä, reuna hiukan epäsäännöllinen, sileä, kiiltävä, limamainen, 2,5 - 3 mm.

5 79553 _ ΰ 5 (0 VO -rl cd -n vö 3 5 e O rr T- 6 r- — rt O <n -n Ό · 3 rH O rt X >1 o a -h m 0> -h & b tn ^ O Λ rt i -h . h o x o -μ rt o m +> “ -h o rt

® p -h D i + rt I

•h <u S m ω g

0 P 00 o » o -h -H

>5 o · oo μ +> P

3 « c r- Τ3 rt P P

j ö Ji r- cQ <r> o lii rt rt I

3 o DHroTj· ue rt rt

•o Q) pj t/1 U TT -HtrtOO

P > · h u X σο > -P tn tn

_ -H t-D u :rt -rH 4J -P

rt+J Z :rt P tl) C G

grtrt E rH -P φ Φ 2 C « rH :(0ΐηΛΛ+1 P -H m D cd i i i tn -h -h -h

-· g 3 ui x -HT3tntn-H

p tn u >i ui jz x x g -Ptu-H P >000

5-Prt * -H :rt P P P

3 a),* -H -h rH a) :rt Ό Ό a)

1-1 Q rH rH rH -H 0a-P>1>1-P

. 3 OOrH-HOWXJXW

Ρμη-π A fi O C >·η I I O

<1> O OrtCrtPrHrtrtP

® a> ,*prtpi.*ppin P rH rH rH ΦΡΙ(1)·Η>·(1)Ι0(1)

® rt rH < g a> tn W tn E OcP

Z3 3 3 Ή C > P rt 3 >1 s tn 1 I · + + + O rt W σι r- :rt O 0 :rt »0 :rt O :rt ^ tn « m 0(n -Η λ; -n hh h •p tn c r- 0,— χ χ A X .*,*,*,*

>1 (D O ro P, h rH -rl -H rH i—I r—1 ·Η I rH

»Otng^j' rt i + trt a) 0 td :rt :rt a> ^ trt X ,* O X O -n A P + ·η + ·η·πχ; + ·η H o Ό -

Dl gj p .

X P dl rl ro D

»o tn n! to tn + ++ I+ + + + + i+ + + > C (¾ oo u * >i - Pr- ^ >3 > trt fl) r- Q) tn CQ <T> o C tr M P ffl X H m

OptUOHCnO^’* + + I + + I I I 1+ Ό αίφ tn-riuuxoooo p cq ,* c z P > rt φ P P :rt rH rH tn W — g

*rl rH Q) t— rH

rt 3 ·η · — Φ ++1+ + + + + + 1+ + •η > ρ >< x ,* η 3 »o · cn > rt X in -n X CJP -n rt •Η Ή rt in p rvH jj a) rt rt PC rt

PC -ri C

rt rt tn Ή -H O *H He Μ rt Ό τΐθΗΗΐη·Η·Ηΐη>;Ρ·Η -h oo Ρ£5·Ηΐηοιηιηοιηωο3Ρΐη·κ**ιη

® OOttOCOOOOOOrHrtO-H-ri-HO

r-1 l^i'no OHOOPOOHtJirtOtnDiinO

rH ΐΗο ΗΛί^ϋΡΗΛΟΡΡΟΟΟΗ

·ΗΡλ >,rt£33«lrtOPrtJ<OOOJ

® hojh tnprtnp>!£H(i)jiirtCPP-H

^ -H .* p X rt p Cn+H X ΦΗΛ!λ:η C ,¾ rH rl y -HOiiiiiirtPajirtrtrtrtrta) a XOlQ QrHrHrHQtn+JMNtnCPerHgg 6 79553 5 <0 <Ω

2 -<“> vo G

5 σ' φ § <“ φ § £ ~ +5 •ο ^ . c 2 *-1 ο ^ X >ι ο α ia “ t7> ·Η Λ fci £ Λ ο λ to ι w <« o a κ ° « “ -η υ e .5 V) ·Ρ Ο § s j Σ : s , +'♦ * * ' 1

3 S " " Ά — 4J

d ® <j> «- m<^o , ^ > , S u DHro^ Λ 2 :φμ3 ι0. Q> CQWU'i·^' ti 3 ijti ^ > · HUS^o> „5 + , + H + ,, (0 Tl n y _ -ΓΊ :r0

Girt^Z’c o <n 'O

§ 2 g s a -H

S S S a » & “ «S3 8 * § + + J2 *' 11 ® ® « M | ί 3 o ji d O . .

-H Q 3 B -r* 2 -

•-1 3 t0 * -K C G

+J uj .G, -k ·» -<H ·Η -H -H

φ o 10 X -H (C G -P -H -H

φ U -H ·Η Ή G "ΓΊ <0 -P E -H £

Jj . r tn G G -H O -H fO to fö G fö φ , ·Η ·Η ·Η -iH -H Q. G 4-1 G •Ή Ή ·Η

τ| S t -P -H C -H G a Ή O rH t0 ι—I -H ι—I

>rt d ζ -P G -H β O (0 -A -P -H -m >i E >i .β G G (OrO-H-H-HÄOaGQi^iG^i

>, S 3 tOrHi-tiji-PO-H^tOGin-PE

lÄ, iW(0tt5P<DG-PPP-ri.parö « m ω σ* _ ·Η|>(0Ε·ΗΦ^^·Ηβ>ιΐ >i φ o tn aa •® m g >J φ |

·* a: o KO

•H O Ό - ω Φ β -P Φ ,-h m d , , . , ., +, »0 mioooco + + + l li +l > G a oo u >1 - +» r- Jk ^ >1 Λ Φ r- •: Φ tn cq a\ o

GtPtnGCQDHrO-d* ΦΡΦΦηκο^^ ., , , l + 0)φω·Ηυο2σ^<τ> 11 1 1 1 +J m a: g z _, •fjj >ι *0 :r0 φ +J 4J :φ ή h tn tn Λ g Tj

. -H M <U - 5 S

•h>jhxda: m 1 1 2 . -H G :Φ . to >, 2, {“

® « -n K U u £ Q

a +> a g (0 rO -H -H Λ

β ·γί -P -P -P

•n o -P -P tn «o -h i-i a m <0 x -h -h

m -n +> > a <0 G O -P -P

00 O-P-Ptx-HrOPPP-P-P

00 tt rl Λ 4J

r-t Prt -P tO -P ,<*;.p.ppp>,rtiO

i-H tö -P G (0 OrOUlrOtOKl+J'H

KJfOOrO^rOAJ+J-PIAir-t

cq (0 (0 -H M P G O I I tö O

H > -P a >1 (OOM-O^-HAi O tn φ O -P f-l Ό I M I I >i

2 to tn p 3 nj >1 ·— 1) J J H

Kroaxi QEKQEQQ&> 7 79553 1 _ ® m « 2 -n U) S o' ° -r - g t- - 0 <p •g »- · 3 rH 0 2 >1 ° g* ad

“ CP -H & Cu 4J

Λ Ο Λ (0 1 ·Η ^ I—I O KO O)

“ O M -P

“ho w

“ M -H D -H

•H ¢) g; ro M >Ö 2 -P 00 O A Λ ^ ϋ · 00 W >, 3 <o c »- 'HpQO r- (Ώ CP O (fl + 2 O K H ro tr -h io<d m w u h· h· tn

P > · H u 2 ^ -H

_ -H (“3 U O

5 -P Z :<0 +> S »o (0 s -h H G w rH a

-P -H tn D <U -H

rj ε s ui m a + “mw u >1 a -h

•M 0) -H M >1 -P

® -P (0 -p +) ^ 0) Λ (0 1—1 Q Ή (0 (0 -LJ . 3 -H -H fi M <W -ro W G 0)

“ ° -H -H -P

S ® (0 -H o

Jl »H Ή rH (0 -p w JB rH -H +) β £ 2 E3 m o) (0 S g § »

>1 S W

I · o O (0 W <Ti v; P w ro m O «n ci f w e «- cu— -h >1 o o oo cu a +<u+ i :<0 01 g rf to I r·

M X O KO

•H o TO ·* CO <l) 2

-P (l) i—I ro D III I+ + +II

:«0 w id co ca (O

> c CU CO U -n >1 - -p r- Φ •e >1 - Il rH I + + I I +

0) W CQ CP O O

CtjiWMpQDMrorrjrtQ l> CU M QJ <D H W U •'i· <i)a)w-HuuK<Ptcp otj

£ « * 3 s a CP

hh >1 (0 n MO 0) -p +J :rO M <o rH M W W — £ 2 -2, | H rH <D r- rH ^

rH 3 -Π · -r Q) (rt <0 -rH

J £ Jh * 5 ·* -H I II ·η I + + I rH

H J3 Md · W >i m m O

KW-riKUM ·Η rH -H M

C O rH >i

(0 Λ -H O rH

(0 O rH M lp &i ·Η .y O £>ί ·η M Ή -P -H rH -P rH c O-P-P-PlO -H Q) +J ro -p -H -H W -H <|)

£ (OrOiOrOMrH-HO-HCH

“ -H(0C(0OO>H-HrH<U>i wgocaj-pomoo-p ^ -H-HAiOO-H-P-P-PrHd 1-1 (0rHl0AiWM-H I H >( J3

_ HdM(d>+»^OCO.I

S -rl^-pWi-HioMWOOfO

rl arD-HdJOMOQJOM-

y WrHWEa<UW8r0CUCN

Ä 8 79553

' H

“} Id <Χ>

2 -n yo IM

5 σ> -η <ΰ S'*·»- <d > S ^ ~ λ; μ 5 θ' -H (Ö g <- · 3 -ρ ? ιΗ Ο -π Μ S >ι O O, id “ en -η & tn 3 > Α Ο Λ (0 I 4-> ^ rH o X O -Ρ % o U α) —.

ω -η υ -ρ -ρ

“ Ρ ·Ρ D O (U

·£ (1) S η ω Μ O-P roUA C ^

g u ; co O O O

i ^ »—H rrt ^OQO)i-CQONO -P3 m DMn^r <D4J Si 2 0) D5 M U ^ \r en 2 -P > · M U !Z en σ> Ji-P £ ^ -H h> O O <U a

£ +> Z :<0 ι-j M jS

C <0 (0 E 3 -H

5 n w ιΗ -p cd e -Ρ -P M D 1) I ,_| " rj E 3 tn DM,3

2 p tn u >, wc.H

£ CU -H P cj S J

2 -p (o % d S <u -* td m Λ ° ^ -p >1 e e O i “ · id ω e ^ __ « w 3 § · i 3 3 f'· o. · 00 -H tn 5 S £j 3 3 2 s ^ 2 * m ^ S if1 Ä Ä O C ^ $

*> Π3 M oi ~ ^ ^ SS

P m id m O (M z. 2, m m ^ > -p

P M e r- a— O O S .^, tn «J

>10)0000,^ m «p p 3 l! sjjg-si · Os--! »81: z § « o ϊ Λί -Ρ Φ r-t ΓΟ ;d .. irtain -Pfa :rd m (d oo w ++ .i, M S -P 1 > C Oi 00 u A £ O >? ° e >, SO « «- .JS, mcd^s tl^tO tOC^Om f-i m I \ ‘P 33

CtPMPtODMro^r ,5 ·§, g ^ “ -P

ϊϊ: 5 5 5 §;: r* s| « f j i“^sz S ! “ .» 11 H H M W — E ^ Q ti (d jj *H rHQ) *— I—I frt I, I Cp

H 3 -rn · ^ Q) .5, " !" Γ; (UC

•P > P >i Z> M π++ c“m «g -P 3 :<Ö · W >i rd 5 ^ ^ £ Λ K M -n « υ P .2. JS n ·£ 10 ® O. · " 2 ·“ o 2 ^ i1 s » -S (0 υ Oi -h O -P >1 t— . .

.¾ QJ W S C Jh o Μ ή * -ptd 0)0)·^^ 00 Id -H M -m σι φ h n n

m -P Ή -H -h n p m " X

ζί Ρ O -P T) m Tru:<d 04 ·Ρ O >1 C td Ή rise rn OCPMd^iO-PO)^35 rj MCd)tniHM^ÄÄ u >ifÖW -PP1 U3>1 ^og

Z rHE>1 ZIP ZMJ-I

0 I rH ^ 01 Q en * X 0s 9 79553

Eristetty kanta NCIB

_1 T 8 8 3_

Inkubointilämpötila (°C)_30°_

Pyosyaniini 5 Fluoresenssi L-Arg CSU +

Betaiini CSU_

Glukoosi CSU + (yhtenäinen ketto)

Laktaatti CSU + (ei kettoa) 10 Asetaatti CSU - (ei kettoa)

Herkkyys (1 päivä)_

Penisilliini G 4 yiq -

Streptomysiini 25 pq heikko +

Kloramfeeni 50 pq + 15 Tetrasykliini_25 jug + + +_

Novobiosiini 5 ^ig +

Polymyksiini B 25 pq heikko + 0/129

Levan_ 20 Kasvutekijävaatimukset

Ureaasi Christiansen +

Lakmusmaito ruskea (pelkistynyt?) osittain peptonoitunut _(epäilyttävä tulos) 28_ 25 Kaasu glukoosi

ONPG

Arg Möller

Ly s Möller_-_

Orn Möller - 30 NO~ —>NO~ NO~ —>N2~kaasu + jäännös NO^ “ DNA-asi

Geelipystypinta 20° _ 28 35 Geelimalja - 7

Kaseiinimalja - 7 Tärkkelysmalja_- 7_ 10 79553

Eristetty kanta NCIB

_1 1883_

Inkubointilämpötila (°C) 30°

Lesitiininrnnankeltuaismalja - 7 5 Lipaasimunankeltuaismalja - 7 NH3 + 7

Indoli_- 7_ HS (TSI) - 7

Tween 80 Sierra heikko + 7 10 MR - 7 VP - 7

Arg Thorn ley_- 7_ CM3 kasvu C°:ssa (ilmainkubointilaitteet lukuunottamatta 4°) 5° 15 30° + 37° + CM1 (vesihaude) 41° heikko 45°_=_ 20 CM3 pH-säädetty kasvu pH-arvossa 3 5 3 + 7,2 3 + 8 3 + 25 9 3 + VO_3_+_

Kasvu NaCl-liuoksessa 2 % 3 + 3 % 3 + 30 4 % 3 + 5 %_-_ 3-ketolaktoosin muodostuminen - (De Ley'n menetelmä)________ 11 79553

Viitekirjallisuus 1. Bergey'n Manual of Determinative Bacteriology, 8. painos (1974). (R.E. Buchanan & N.E. Gibbons, toimitt.). Baltimore: Williams & Wilkins.

5 2. Cowan, S.J. & Steel, K.J. (1974). Manual for the Identifi cation of Medical Bacteria, Cambridge University Press. Valitut väliaineet ja menetelmät CM1 Oxoid CM1 ravintoiiemi CM3 Oxoid CM3 ravinto-agar 10 CM55 Oxoid CM55 veri-agar-perusaine

Mineraaliperusaine Palleroni & Doudoroff 1972 muunnettuna (PD) (A. Rev. Phytopathol 10, 73)

Na2HP04·12H20 6,0 g 15 KH2P04 2,4 g NH4C1 1,0 g

MgS04·7H20 0,5 g

FeCl3*6H20 0,01 g

CaCl2*6H20 0,01 g 20 Deionisoitua vettä 1 litra pH asettuu arvoon 6,8 Tämä on perusväliaineena hiilen lähteen hyväksikäyttö - (CSU)- kokeita varten.

PD mineraaliperusaine -)-0,1 % suodatin-sterlloitua 25 glukoosia (PPG)

Gelatiinipystypinnat

Ravintoliemi nro 2 (Oxoid) 2,5 %

Gelatiini (Difco) 12,0 %

Gelatiinimaljät 30 Ravinto-agar Oxoid CM3 2,8 %

Gelatiini 1,0 % i2 79553

Maitomaljat

Kuorittu maito (Difco) erikseen steriloituna 3 $

Peptoni (Difco) 0/1 %

Lihauute Lab-Lemco 0/1 % 5 NaCl 0/5 %

Agar 1/5 % pH 7,4 ennen autoklaavikuumennusta.

Kasvu suolan läsnäollessa

Perusainetta, joka sisälsi NaCl 2, 3, 4 ja 5 %:n vä-10 kevyyksinä, valmistettiin Hayward & Hodgkiss'in menetelmän (1961) mukaan. Viljelmiä haudottiin useita päiviä.

Kasvutekijävaatimuskoe

Alaviljelyt suoritettiin suoralla metallilangalla kolmesti PDG-väliaineessa, joka oli valmistettu käyttäen lasiasti-15 assa tislattua vettä. Tyydyttävä kasvu saavutettiin noin 4 päivässä, mikä osoittaa, ettei ollut mitään absoluuttista vaatimusta kasvutekijöiden osalta.

Hiilen lähteen hyväksikäyttö PD-väliainetta, joka sisälsi 0,1 % suodattimessa steri-20 loituja yksinomaisia hiilen lähteitä, ympättiin ja inkuboitiin 14 päivää.

Hapon valmistus hiilihydraateista

Hayward & Hodgkissfin (1961) hapetus-käymisväliainetta täydennettiin 1 %:lla suodattimessa steriloituja hiilen läh-25 teitä. Putket ympättiin ja niitäinkuboitiin 14 päivää.

The National Collection of Indrustrial Bacteria on tullut siihen johtopäätökseen, että NCIB 11883 on katsottava olevan eräs kanta mikro-organismi A. radiobacter tai A. tumefaciens riippuen kasvitaudin aiheutuskyvystä. Eristetty 30 aine on epätavallinen siinä suhteessa, ettei se tuota 3-keto-laktoosia.

Esillä olevaa keksintöä valaistaan lisäksi seuraavien esimerkkien avulla.

i3 79553

Esimerkki 1

Polysakkaridin valmistus jakautuvan bakteerin NCIB 11883 avulla_ Tämä esimerkki kuvaa polysakkaridin muodostusta aktiivisen kasvun aikana.

-1 5 Väliaineen koostumus gl (A) (NH4)2S04 0/75 g KH2P04 0/75 g (B) MgS04'7H20 0,4 g

FeS04 1 M liuos 0,05 ml 10 CaCl2-2H20 0,012 g IPP hivenalkuaineliuos 2,5 ml (C) Glukoosi 20 g -1 IPP hivenalkuaineperusliuos gl

CuS04*5H20 0,249 g 15 MnS04-4H20 0,223 g

ZnS04*7H20 0,287 g

CoC12-6H20 0,118 g H3B03 0,030 g

Na2Mo04'2H20 0,124 g 20 KI 0,083 g

Komponentit A, B ja C kuumennettiin autoklaavissa erikseen ja sekoitettiin jäähdytyksen jälkeen.

Bioteknisessä käymisastiassa ympättiin noin 3,2 litraa edellä mainittua väliainetta kannan NCIB 11883 10 %:sella ym-25 pillä, jota oli aikaisemmin viljelty pH-arvossa 6,8 MOD-D^-vä-liaineessa ravistus-pulloviljelmässä, jota oli inkuboitu 30°C:ssa pyörivässä ravistuslaitteessa 24 tuntia. MOD-D2~ väliaine on spesifioitu seuraavassa: 14 79553 MOD D_ väliaine pH 6,8 ^ -1 Yhdiste Konsentraatio 1 glukoosi ilmoitettu määrä (NH4)2S04 3,0 g 5 Na2HP04 3,0 g KH2P04 3,0 g

MgS04*7H20 0,2 g

FeS04 63,2 mg

CaCl2‘2H20 1,33 mg 10 ZnS04*7H20 0,36 mg

CuS04*5H20 0,32 mg MNS04*4H20 0,30 mg

CoCl2‘6H20 0,36 mg H3B04 0,20 mg 15 Na2Mo04*2H20 0,60 mg

Oxoid - puhdistettu agar L28 15,0 g Käymisastian sisältö pidettiin 30°C:ssa, pH-arvossa 6,8 ja sitä hämmennettiin nopeudella 1000 kierrosta minuutissa kahdella 6-siipisellä Rushton-siipipyörällä ja ilmastettiin 20 jatkuvasti käyttäen 1000 ml ilmaa minuutissa. Solunulkoista polysakkaridia muodostui kannan NCIB 11883 eksponentiaalisen kasvun aikana, joten tämä organismi näyttää kykenevän muodostamaan polymeeriä kahdessa vaiheessa, so. kasvun aikana ja sen jälkeen kun kasvu on lakannut.

25 Ennen kuin kasvu on lakannut oli muodostunut 2,5 g/litra (viljelyväliainetta) biopolymeeriä solutiheyden ollessa 2,5 g mikro-organismeja/litra (viljelyväliainetta) 12 tuntia kestäneen käymisen aikana. Sen jälkeen kun kasvu oli lakannut, oli lopullinen saanto 6,5 g/litra (viljelyväliainetta) 45 tunnin 30 kokonaiskäymisaikana.

is 79553

Esimerkki 2

Heteropolysakkaridin valmistuskinetiikan vertailu kantojen NCIB 11883 ja Pseudomonas NCIB 11592 välillä käymisas-tiassa 30°C:ssa ja 37°C:ssa eräviljelyssä sen jälkeen kun kasvu 5 on lakannut________ Väliaine KH2P04 0/68 gl"1

MgSO.·7H~0 0/49 gl"1 * z -1

MnSO.♦4H-0 0/44 mgl 42 -1 10 ZnSO.·7H00 0/57 mgl 4 L -1 H3B03 0/06 mgl

Na2Mo04.2H20 0,24 mgl"1 (NH4)2S04 0,79 gl"1

CaCl2‘2H20 7,05 mgl"1 15 CuSO.* 5H~0 0,25 mgl"1 ^ ^ —1

CoCl~·6H~0 0,23 mgl 1 z -1 KI 0,16 mgl

FeS04*7H20 14,0 mgl"1 glukoosi 25 gl 1 20 Edellä oleva väliaine on suunniteltu sellaiseksi, että typen lähde on kulunut loppuun siihen mennessä kun solutihey- -1 deksi on saavutettu suunnilleen arvo 1,6 gl . Kun tämä solu-tiheys on saavutettu, ei siis tapahdu enää enempää kasvua, vaikkakin polymeerin muodostuminen jatkuu sen jälkeen, kun 25 kasvu on lakannut.

Biotekninen käymisastia, joka sisälsi 2,5 litraa edellä mainittua väliainetta, ympättiinkannan NCIB 11883 tai Pseudomonas NCIB 11592 6 %:sella ympillä, joita oli kasvatettu 16 tuntia 30°C:ssa tai 37°C:ssa. Ilmaa puhallettiin käymisastian läpi 30 nopeudella 600 litraa minuutissa ja sekoitusnopeus pidettiin vakiona arvossa 500 kierrosta minuutissa. Sekoitin käsitti kaksi Rushton-siipipyörää, joissa kummassakin oli 6 siipeä.

Spesifisesti polymeerin tuotantonopeudet 0,137 gg'^^h-1 30°C:ssa ja 0,13 gg"^h”^ 37°C:ssa todettiin kannalle NCIB

79553 16 -1 -1 11883 verrattuna maksiminopeuteen 0,066 gg h , joka todettiin mikro-organismille Pseudomonas NCIB 11592. Mikä on vielä tärkeämpää, kuten edellä mainittiin, on se, että tuottavuus sakeutuskyvyn osalta laimennuskertoimella ilmaistuna 5 on huomattavasti suurempi kannalla NCIB 11883. Kuvio 1 osoit- -1 taa, että vertailukelpoisella solutiheydellä 1,6 gl se käy-misaika, joka vaaditaan tuottamaan lientä, jonka laimennus-kerroin on 25, lyhenee 160 tunnista, joka tarvitaan käytettäessä Pseudomonas 11592, 80 tuntiin käytettäessä NCIB 11883, 10 jota on viljelty 30°C:ssa, ja lyhenee edelleen 35 tuntiin käytettäessä NCIB 11883, jota on viljelty 37°C:ssa.

Polysakkaridin saannot ja polymeerituotannon tuottavuudet käytettäessä Pseudomonas NCIB 11592 ja NCIB 11883 on esitetty taulukossa 1.

1 5 Taulukko 1

Organismi Tuotantokyky Tuotantokyky Polymeerin -1 -1 (g polymeeri 1 h ) (laimennusker- saanto -1 -1 roin h ) (gg ) glukoosia_ 20 Pseudomonas NCIB 11592 0,064 0,156 0,43

Kanta NCIB

11883 30°C:ssa 0,15 0,31 0,57

Kanta NCIB

25 1 1883 3 7°C: ssa_0,14_0,71_0,52

Eräviljelyssä 30°C:ssa ja 37°C:ssa muodostuneen solun-ulkoisen polysakkaridin ominaisuuksia on esitetty taulukossa 2.

i7 79553

Taulukko 2 NCIB 11883 NCIB 11883 muodostunut 30°C:ssa muodostunut 37°C:ssa __ eräviljelyssä_erävil jelyssä_ 5 Suolaliuos (%)*_15_15_15_15_ Lämpötila (Qc)_JO_60_30_60__ 1 gl”^-pitoisen liuoksen viskositeetti (mPa s) arvolla 7,5 s-1 61 51 150 145 10 V* arvolla 23 s“* 32 27 60 58

Laimennuskerroinviskositeetissa 20 mPa s26,5 18,5 55_43_

Pseudomonas NCIB 11592 käyttäen 30°C:ssa eräviljelyssä 15 muodostuneen polymeerin ominaisuuksia on esitetty taulukossa 3.

* 15 % NaCl +1,5% CaCl2

Taulukko 3

Suolaliuos (%)_15_15_ Lämpötila (°c)_30_60_ 20 1 gl“l-pitoisen liuok sen viskositeetti (mPas) -1 _arvolla 7,5 s_79_55_ "_arvolla 23 s ^_41_32_

Laimennuskerroin viskositeetissa 20 (mPa s) 24,5 17,5_ 25 Esimerkki 3

Polysakkaridin eksponentiaalinen syötetty erävalmistus Väliaine oli muodostettu sellaiseksi, että se ylläpiti kannan NCIB 11883 kasvua suunnilleen arvoon 1,2 gl ^ kuiva-painoa asti. Tähän pisteeseen asti organismi kasvoi arvolla 30 ji maks (0,31 h 1). Lisäkasvua säädettiin syöttämällä (NH4)2SC>4 eksponentiaalisesti siten, että organismin kasvunopeutta voitiin kontrolloida ennakolta määrätyssä arvossa. Eksponentiaalinen syöttönopeus oli tietokoneen valvoma.

-1 18 79553 Väliaine gl (A) (NH.) SO 0/6 g 4 2 4 KH2P04 0,75 g (B) MgS04-7H20 0,4 g 5 FeS04 1 m 0,05 ml

CaCl2.2H20 0,012 g IPP hivenalkuaineita 2,5 ml (C) Glukoosi 20 g

Osat A, B ja C steriloitiin erikseen kuumentamalla auto- 10 klaavissa ja sekoitettiin kylminä.

Biotekninen käymisastia, joka sisälsi 2,5 litraa edellä mainittua väliainetta, ympättiin kannan NCIB 11883 10 %:sella ympillä (24 tuntia, ravistuspulloviljelmä MOD-D2, 30°C:ssa, pH-arvossa 6,8). Kasvu eteni eksponentiaalisesti maksimikasvu- 15 nopeudella siksi, kunnes oli saavutettu solutiheydeksi noin - 1 1,2 gl kuivapainoa. Ammoniakkimäärää käymisastiassa valvottiin ja eksponentiaalinen ammoniakin syöttö käynnistettiin, kun (NH4)2S04~konsentraatio laski alle 20 miljoonasosan. Syöt- tönopeutta kontrolloitiin eksponentiaalisen kasvunopeuden saami- -1 20 seksi arvoon 0,064 h . Käymisaika, mikä tarvittiin liemen -1 muodostamiseksi, joka sisälsi 10 gl solunulkoista polysakkaridia, oli noin 28 tuntia. Polymeerituotannon spesifinen nopeus -1 -1 oli 0,12 g polymeeriä g kuivapainoa h . Todettu kokonais- -1 -1 tuotantokyky oli 0,35 g polysakkaridia 1 25 Esimerkki 4

Jatkuva polysakkaridin valmistus käyttäen kantaa NCIB

11883_ Väliaine - sama kuin esimerkissä 1 käytetty. Kasvuolosuhteet 30 Kantaa NCIB 11883 kasvatettiin typpirajoituksin bio teknisessä käymisastiassa, jonka työskentelytilavuus oli noin 3,1 litraa. Lämpötila pidettiin 30°C:ssa ja pH pidettiin arvossa 6,8 lisäämällä 2 N NaOH + 2 N KOH. Käymisastiaan puhallettiin ilmaa nopeudella 1 litra/minuuttia ja sekoitettiin 35 jatkuvasti kahdella Rushton-siipipyörällä (6 siipeä kummassakin) i9 79553 nopeudella 1000 kierrosta/minuuttia. Organismia viljeltiin erilaisilla kasvunopeuksilla ja polymeerin muodostumisen kinetiikat merkittiin muistiin.

Pseudomonasta 11592 ja kantaa NCIB 11883 käyttäen saavu-5 tettuja polysakkaridin muodostusnopeuksia on verrattu kuviossa 2. Kannalla NCIB 11883 on spesifinen polysakkaridin muodos-tusnopeus, joka on noin 2-3 kertaa suurempi kuin Pseudomonasta 11592 käyttäen saavutettu. Sitäpaitsi polysakkaridin saanto kulutettua grammaa kohti glukoosia ja happea on myös huomatta-10 vasti korkeampi käytettäessä kantaa NCIB 11883 kuin käytettäessä Pseudomonas 11592, kuten taulukossa 4 on esitetty.

Taulukossa 4 on esitetty yhteenveto polysakkaridin tuotannon saannosta glukoosista ja hapesta laskettuna, solu-tuotannosta sekä kokonaishiilestä tasapainotettuna kussakin 15 pysyvässä olotilassa typpirajoitteisena.

20 79553

G

(0

G

G r- γιο cn co oo m vo r- ooooo ,ϋ i- Nr- vo o cm r-- m m in S ^ \ ^ N V · *» k ^ s

(0 O OO T- Ο Ο Ο ΟΟΊΓΟ 00 VO I CM CM

G o i- η πτ- 0 «-

-H P X G G

m o m OOincM <Ti oo cm cm cm in r- G o in r- t— void cm m oo en n- in n· m Φ S S S S S S S V S S H « S S v.

Ό o oo cm oo o o O'tf'S' cMinvo'S’ in 3 o t— n* cm t— σι 0) τ α 0 — G *~ 3 n< > m σ\ id ^ X r~ vo tt o cr\ cn σν o cm m m >tj· »— id o voo cm m rr in vo in n· mocMoj ^

4J — -- -. v » -. -. K — -- V

tn o oo <n oo o o o o cm r— r~- cr> σι -Η Ο T— VO r- <Tl cn T- λ; oo G - 0) io ·«· a O ffi o c a x

X <0 -G -nU

rH 0

G CO O

id P <n n1 cv oo m m

Encncnr-io cMinom r- cm •h :co o mo vo cm cn cm -rr oor^ vo oo r— m Q (/) V Si V % S S S S S S S S s s

Gwo oo t oo o o ooooo τ—οοΐσ> oo G >1 o vr Μ ΓΙΟ H T— to a) 0) -ι-l I ♦

P en I -H (d -PI

G Ή id cd O G to o>co>ac - d)>

C -P ·Η (0 ·Η <0 01 -H

G td 0) G > id -P G G

to w -π λ: -h a -h o -p cn m 3 to a) λ; oa>otri^;> -p 0'

G03 0 -H r- -P GcO-H

P -H A! cd tn G I 0 -H G P

-HQ) 3 (0 -P λ; w p :rd 3 cO-PO

0 4) rl Ή 01 10 3 P :c0 -P a P .G

H -p tr> W -H -P tyicn a) <0:<0 -P (d 0) <0 0 P -H 0 W 0) G ft H rt H Id > P 0 Ad cd 0 — O O O ·· CO Q)t- o- g e -h -h h oi gh ,¾ -o- -p O td cm -P ai ci -H 0) :td -H o) up 3 O ·Η id

λ; Cd I G G Ad -H O W O £ O Ä H G-Pxj-H I Ad td <d -H

cd P p id P G W ·· G -P (1)0-H iH O :cd O W a P

11 -rl - Id (TiH O O CM IllllJC(d4J4Jld-H ‘M P P Cd >1 >1 a tn tr> O P O -HOtdOO-P -H-H 3 p P p * >1 paw ,xc egpgpo>i.gp-h -h o o < a O >1 G G I O G cd 0 G-HO-nacP OP -H G G a o ft+) υ·Η (ji+jh m P h id G n) Q)P-0) :id G (l) ui h p α<ο ctnw g GapaGcucupEcöP o) a

O m O Ή id id G AI td Cd «JPP 3 >iPH 'P I I O

P 00 G P O Cd*- CCNld > G > A! P ΪΡΗ Hrl-H PH CO

0) 00 m cd g w 1 -h o o) g h h h nj id :cd o O G h o cd -ri -h > t- G Ad -H trip HGPGidPMMBiSjdUH^ C'-GAdcdGO'-GWAdOAdP CU n o ccdao)cdQ)iQ)CMo ai g a> acQQiaid-nOe tn-ηθ O'- S'- r- 0) E < PHg>,>GGi>iG^:i>illP >1 a

XUHH-rlH-HHld Hr- G ΟΉ P H

ixZGOGOcdOOOIP O -H O

p a x co oja c en Hu Ha tr> Hffi a * 21 79553

Taulukossa 5 on esitetty yhteenveto maksimisaannoista ja nopeuksista, jotka on todettu valmistettaessa polymeeriä käyttäen Pseudomonas NCIB 11592 ja kantaa NCIB 11883, joita on kasvatettu typpirajoitteisessa jatkuvassa viljelyssä.

5 Taulukko 5

Vertailu polysakkaridituotannon saantojen ja nopeuksien osalta Pseudomonas NCIB 11592:n ja kannan NCIB 11883 välillä, joita on kasvatettu typpirajoitteisesti jatkuvassa viljelyssä 30°C:ssa, pH-arvossa 6,8 10 NCIB 11592 NCIB 11883

Parametri_yksiköt_arvolla D(h~1) arvolla D (n-1)

Valmistuksen spesi- g g 1 kuiva- 0,09 0,04 0,30 0,047 -1 finen nopeus painoa h

Polymeerin tuotanto-15 kyky tilavuutta kohti gl’1h~1 0,13 0,03 0,46 0,047

Polymeerin saanto glukoosista laskien g(g glukoosia)”1 0,4 0,02 0,60 0,047

Polymeerin saanto 20 C^ssta laskien g g ^ Oj 0,92 0,03 3,2 0,047

Polymeerin suhde soluainekseen g g 1 kuivapainoa bakteereja 5,0 0,017 6,3 0,047 g g"1 solu- 8,2 0,020 12,8 0,047 25 _proteiinia___

Taulukossa 6 on esitetty tunnusmerkkejä polysakkaridista, joka on valmistettu käyttäen kantaa NCIB 11883 jatkuvassa viljelyssä typpirajoitteisesti arvolla D=0,034 h 1, 30°C:ssa, pH-arvossa 6,8.

22 79553

Taulukko 6

Suolaliuos (%)_15% 15% 3% 3% 0% Lämpötila (°C)___30_60 30 60 30 1 gl”^-pitoisen liuoksen visko- 5 siteetti (mPa s), arvolla 7,5 s~~*~ ~n Q 96 90 70 84 _"_, arvolla 23 s~1 50 45 42 35 38

Laimennuskerroin viskositeetissa 20 mPa s 7,5 s~1_16,5 4,9 5,5 3,9 5,6 D.F./ /P7dw(R-kerroin)_2,83 2,13 2,39 1 ,70 2,43 10 Suodatus 5 ^jM + esisuodatin_16,5 14,2 11,4 11,6 7,5

Seuraava 1,2 yuM_37,5 39 20,7 17,5 15,5

Aika 200 ml varten 0,8 μΜ_39,0 42,5 40 58,1 15,2

Taulukossa 7 on esitetty tunnusmerkkejä polysakkaridista, joka on valmistettu käyttäen kantaa NCIB 11883 typpirajoittei-

“ 1 Q

15 sesti jatkuvassa viljelyssä arvolla D=0,05 h , 37 C:ssa, pH-arvossa 6,8.

Taulukko 7

Suolaliuos (%)_0_3_1_5_ Lämpötila (°C)_30_30_30__ 20 1 gl-^-pitoisen liuoksen visko- siteetti (mPa s), arvolla 7,5 s ^ 135_1 38_130_ _"_, arvolla 23 s 1_56_58_54_

Taulukossa 8 on esitetty tulokset kannan NCIB 11883 avulla valmistetun polysakkaridin kemiallisesta analyysistä.

25

Taulukko 8

Glukoosi: Galaktoosi 5:1 - 10:1

Palorypälehappo % 1,9-5,5

Meripihkahappo % 2,4-10,1 30 Läsnä lisäksi muita happoja, mutta niitä ei ole identifioitu lukuunottamatta jälkiä asetaatista.

Claims

23 79553

1. Menetelmä heteropolysakkaridln valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään kantaa NCIB 11883 5 kemiallisesti määritetyssä vesipitoisessa ravintoväliai-neessa assimiloituvan hiilihydraatin ja typen lähteen aerobisen käymisen avulla ja otetaan talteen heteropoly-sakkaridi, joka sisältää 1,9 - 5,5 % palorypälehappoa, 2,4 - 10,1 % meripihkahappoa ja glukoosia ja galaktoosia 10 glukoosi/galaktoosi-suhteessa 5:1 - 10:1.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että typen lähde on ammoniumsul-faatti.

3. Porausneste, tunnettu siitä, että se 15 sisältää vettä ja 0,06 - 1,5 paino-% patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisella menetelmällä valmistettua heteropoly-sakkaridia.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisella menetelmällä valmistetun heteropolysakkaridln käyttö viskositeet- 20 tia muuttavana aineena vesiliuoksessa.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisella menetelmällä valmistetun heteropolysakkaridln käyttö porausreiän käsittelyyn, tunnettu siitä, että porausreikään johdetaan vesipitoista väliainetta, joka sisältää vettä 25 ja 0,05 - 1,5 paino-% patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisella menetelmällä valmistettua heteropolysakkaridia.

6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisella menetelmällä valmistettua heteropolysakkaridia sisältävän vesi-liuoksen käyttö parannetussa öljyn talteenotossa (E0R).