FI79343C - Foerfarande foer framstaellning av mikrobiologiska bekaempningsmedel. - Google Patents

Description

1 79343

Menetelmä mikrobiologisten torjunta-aineiden valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää biologisten insektisidi- ja/tai fungi-sidipreparaattien valmistamiseksi, joita voidaan käyttää kasvitautien ja/tai tuhohyönteisten torjumiseen maanviljelyksessä.

Mikrobeja, joita voidaan käyttää kasvitautien tai tuhohyönteisten biologisessa torjunnassa, tunnetaan ennestään useita. Näiden mikro-organismien kaupallinen hyödyntäminen on kuitenkin hyvin ongelmallista, koska mikrobipreparaattien teho perustuu siihen, että kyseinen mikrobi säilyy riittävän kauan elävänä preparaatissa. Tästä johtuen olisi edullista saada tuotetuksi itiöitä sisältäviä preparaatteja, koska itiöt ovat tunnetusti paljon kestävämpiä kuin vegetatiivieolut tai vegetatiivimyseeli. Preparaattien teollisen tuottamisen kannalta on lisäksi käytännössä välttämätöntä, että tuotteet ovat kuivatussa muodossa, koska kuivattuina mikrobien ja nimenomaan niiden itiöiden säilyvyys preparaateissa on huomattavasti parempi kuin kosteutta sisältävissä tuotteissa.

Biologisessa torjunnassa käyttökelpoisten mikro-organismien joukossa on useita, jotka kykenevät hajottamaan kasvualustan kitii-niä. Kitiini on valkoista tai väritöntä amorfista polysakkaridia, joka on hyönteisten, äyriäisten ja joidenkin muiden selkärangattomien tukirangan pääasiallinen rakennekomponentti. Kitiiniä hajottavista mikrobeista monien on todettu olevan fungisidisiä, kuten Streptomyces-sädesienet. Trichoderma- ja Gliocladium-sienet sekä eräät bakteerit. Hyönteispatogeeniset sienet ovat yleensä myös kitiinin hajottajia, mikä johtuu siitä, että niiden on kyettävä läpäisemään hyönteisten kitiinikuori. Tällaisia sieniä ovat esimerkiksi Beauveria bassiana sekä Metarhizium anisop- ii»a· 2 79343

Kitiinin ja sen johdannaisen, kitosaamn lisäämisen kasvien kasvualustaan on sinänsä todettu torjuvan kasvitauteja aiheuttavia sieniä ja nematodeja (Agric. Wastes, 4 (1982), s. 205; Phytopat-hol. 71 (1981), s. 569; US-patentti 4 536 207). Teho perustuu siihen, että kasvualustan sisältäessä kitiiniä sitä hajottavien mikrobien määrä kasvin juurten ympäristössä kasvaa, jolloin kilpailusta johtuen mahdollisuudet kasvitauteja aiheuttavien organismien lisääntymiselle pienenevät. Kitosaanin on myös todettu laukaisevan kasveissa tiettyjä puolustusmekanismeja tauteja vastaan (Plant. Physiol., 66 (1980), s. 205).

US-patentista 4 534 965 on ennestään tunnettua käyttää kitiiniä tai kitiinipitoieta jätettä kasvitauteja torjuvan Streotomvcea-sädesienen kasvualustan komponenttina. Kasvatus suoritetaan kuitenkin submerssiviljelynä eli käytetään kolloidista kitiinisus-pensiota sädesienen kasvualustana, jolloin ei muodostu kestäviä ilmaitiöitä vaan sädesieni kasvaa vegetatiivimyseelinä. Menetelmä perustuukin sille havainnolle, että kasvatettaessa sädesieniä ki-tiinipitoisella alustalla submeresiviljelynä saadaan kasvualustaan tuotettua fungisidistä ainetta.

Ennestään tunnettua US-patentista 4 713 342 on myös kasvitauteja torjuvien tai insektisidisten sienien kasvattaminen kiinteillä alustoilla. Käytetyt alustat ovat kuitenkin olleet sellaisia, joiden ainoana funktiona on runsaan mikrobimassan aikaansaaminen, eivätkä ne ole sisältäneet kitiiniä. Käyttökohteeseensa joutuessaan tällaiset alustat ovat minkä tahansa mikrobin, siis myös taudinaiheuttajien käytettävissä.

Nyt on yllättäen havaittu, että kasvitautien ja tuhohyönteisten torjuntaan tarkoitettujen mikrobien itiöitä saadaan tehokkaasti tuotettua kiinteällä kasvualustalla, joka sisältää kitiiniä.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä mikrobiantagonisteja kasvatetaan kitiinialustalla, jonka kuiva-ainepitoisuus on vähintään 10 paino-X. Tällöin kasvatus on ns. solidstate eli kiinteällä 3 79343 alustalle tapahtuva kasvatus. Kitiiniä hajottavat, lähinnä mysee-limäiset mikrobit kasvavat kitiinipartik ke 1 eiden pinnalla samaan tapaan kuin maaperässä ja muodostavat runsaasti ilmaitiöitä.

Kasvun parantamiseksi alustaan voidaan lisätä kaliumia ja magnesiumia sisältäviä ravintosuoloja. Runsaasti kalkkia sisältävänä k itiin ia 1 usta on yleensä emäksinen. pH lasketaan sopivalle tasolle lisäämällä happoa. Kun alusta on kasvanut täyteen, se kuivataan joko ilmakuivausta tai ky 1mäkuivausta käyttäen.

Menetelmän etuna on se, että mikrobi-itiöitä ei ole tarpeen eikä edes suotavaa erottaa k itiinia1ustasta, vaan kitiini toimii myös käyttökohteessa antagonistien selektiivisenä kasvualustana ja siis tuotteen aktiivisena komponenttina. Hyönteisten torjunnan kyseessä ollessa on lisäksi edullista, että hyönteisen kitiinikuoren läpäisemiseen tarvittavien entsyymien tuotto on indusoitunut jo antagonistin kasvatuksen aikana. Mikrobit eivät tuota, kitinolyyt-tisiä entsyymejä, ellei kitiiniä ole alustassa läsnä.

Mikrobiologisten torjunta-aineiden teollisen tuotannon kannalta keksinnön mukaisella menetelmällä on myös monia etuja tunnettui-hin menetelmiin verrattuna. Tuotteen vesipitoisuus on valmiiksi ‘ alhainen, joten vedenpoisto- ja kuivatuskustannukset ovat pienet.

Raaka-aineeksi kelpaa halpa kitiinipitoinen jätemateriaa 1 i , ku-: ten rapujen kuorijäte. Kitiiniä syntyy runsaasti kalastusteolli- suuden sivutuotteena ja sen saatavuus on hyvä. Kitiiniä hajotta-vat mikrobit käyttävät sitä sekä hiilen että typen lähteenään.

Keksintöä selostetaan alla lähemmin esimerkkien avulla.

Esimerkki 1

Streptomvces-sädesieni-itiöiden valmistus

Turpeesta eristettyä Streotomvces ariseoviridis -sädesientä kasvatettiin osittain puhdistetulla kitiinillä (Sigma 3387).

48 g suolaliuosta, jonka koostumus oli 4 79343 k2hpo4*3h2o i.o g/i

MgS04*7H20 °>2 9/1 imeytettiin 20 g:aan kitiiniä. Alusta steriloitiin autoklaavissa o (20 min, 121 C) 1 litran erlenmeyerpullossa. Jäähtyneeseen alustaan sekoitettiin 1,65 ml sädeeienen itiösuspensiota ja kasvatet-o tiin 2Θ C:ssa 7 vuorokautta. Kasvatuksen jälkeen koko kasvualusta itiöineen kylmäkuivattiin. Saadussa preparaatissa oli itiöiden 6 määrä noin 3*10 grammassa.

Esimerkki 2 Sädesienivalmisteen biologinen teho

Esimerkin 1 mukaan valmistettu sädesieni-itiö-kitiinipreparaatti jauhettiin. Erä kaalin siemeniä saastutettiin Alternaria-taimi-poltteella ja osa peitattiin sädesienikitiinivalmisteella siten, että yhtä siemenkiloa kohti käytettiin 15 g preparaattia. Siemenet kylvettiin astioihin lannoitetulle turvealustalle ja peittaa-mattomien siementen päälle kylvökerrokseen lisättiin preparaattia 0,5 g/1 alustaa. Kasvatusaika oli 15 vrk. Astioista määritettiin taimettuminen, taimien tuorepaino ja tautisuus. Kontrollina olivat terveet sekä saastutetut kaalin siemenet. Tulokset on esitetty taulukossa 1. Tuloksista nähdään, että preparaatti tehosi hyvin kaalin taimipoltteeseen. Siementen peittauksella saatiin parempi torjuntatulos kuin levittämällä preparaattia siementen kyl-vökerrokseen.

5 79343

Taulukko 1

Esimerkin 1 mukaisella menetelmällä tuotetun preparaatin teho kukkakaalin Alternaria-taimipoltteeseen.

koe taimettumie-% tuorepaino (g) tautieuueindekei (0-3) 1 92,5 56,6 0,38 2 35,0 29,6 2,51 3 65,6 53,2 0,53 4 60,8 51,0 0,68 1 * terve kontrolli 2 = taimipoltteella saastutetut siemenet 3 * saastutetut ja preparaatilla peitatut siemenet 4 = saastutetut siemenet, kylvökerros käsitelty preparaatilla tautisuusindekei: 0 = terve taimi, 1 = lievästi sairas, 2 = tautinen , 3 = kuollut

EelmaEkki 3

Ilmakuivatun sädesieni-itiöpreparaatin valmistus

Turpeesta eristettyä Streptomvcea ariseoviridis -sädesientä kasvatettiin ravun kuoresta valmistetulla kitiinillä (Sigma 3132). 20 g:sta kitiiniä tehtiin suspensio suolaliuokseen, jonka koostumus oli, kuten esimerkissä 1. Suspension pH säädettiin noin 6:ksi väkevällä suolahapolla. Ylimäärä suolaliuoksesta valutettiin pois lasivillaauodattimen läpi. Märkä kitiinialusta autoklavoitiin 1 l:n erlenmeyerpullossa ja jäähtyneeseen alustaan kaadettiin 1,5 ml sädesienen itiösuspensiota. Pulloa inkuboitiin huoneen lämpötilassa 7 vuorokautta, minkä jälkeen täyteen kasvanut alusta levitettiin ohueksi, noin 1 cm:n paksuiseksi kerrokseksi petri-maljoille. Maljojen annettiin kuivua huoneenlämpötilassa 2 vuorokautta. Saadussa preparaatissa oli sädesieni-itiöpitoisuus noin 10 grammaa kohti.

6 79343

Trichoderma-itjoiden valmistus

Fungisidistä Trichoderma-kantaa kasvatettiin ravun kuoresta valmistetulla kitiinillä (Sigma 3132). 20 g kitiiniä liuotettiin 200 ml:ssa 1 M suolahappoa noin puolen tunnin ajan. Happo dekan-toitiin pois ja kitiini pestiin 3*300 ml:11a esimerkissä 1 mainittua suolaliuosta. Viimeisen pesun yhteydessä suspension pH säädettiin noin 5:ksi 10 * KOH:lla. Ylimääräinen suolaliuos valutettiin pois lasivillasuodattimen läpi, märkä kitiinialusta au-toklavoitiin 1 l:n erlenmeyerpullossa ja jäähtyneeseen alustaan kaadettiin 1,5 ml Trichoderma-itiösuspensiota. Pulloa inkuboi-tiin huoneenlämpötilassa 7 vrk, minkä jälkeen alusta kuivattiin, kuten esimerkissä 3. Saadussa preparaatissa itiöpitoisuus oli 9 noin 10 grammassa.

Esimerkki 5

Gliocladium-it joiden valmistus

Fungisidistä G1iocladium-kantaa kasvatettiin, kuten Tricho- dermaa esimerkissä 4. Ilmakuivatussa preparaatissa oli itiöpi-9 toisuus noin 10 grammassa.

Esimerkki 6

Beauveria baasiana-itjoiden valmistus

Hyönteispatogeenista Beauveria bassiana-kantaa kasvatettiin ravun kuoresta valmistetulla kitiinillä (Sigma 3132) samoin kuin sädesientä esimerkissä 3. Sekä ilmakuivatussa että kylmäkuivatussa preparaatissa oli B. bassiana-itiöpitoisuus noin 10 grammaa kohti.

SeirogrKKi 7

Metarhizium anisopliae-itjoiden valmistus

Hyönteispatogeenista Metarhizium anisopliae -kantaa kasvatettiin, kuten Trichodermaa ja Gliocladiumia esimerkeissä 4 ja 5.

9

Ilmakuivatussa preparaatissa oli itiöpitoisuus noin 10 grammassa.

Claims (6)

7 79343

1. Menetelmä mikrobiologisten insektieidieten ja/tai fungi-sidisten preparaattien valmistamiseksi, jossa menetelmässä anta-gonistiorganismia kasvatetaan kiinteällä kasvualustalla itiöiden muodostamiseksi, minkä jälkeen alusta kuivataan ilman antagonis-tiorganismin tai sen itiöiden erottamista, tunnettu siitä, että antagonistiorganiemi on kitinolyyttinen ja kasvualusta sisältää kit i iniä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kitiiniä sisältävän kasvualustan kuiva-ainepitoisuus on vähintään 10 %.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että preparaatti kylmäkuivataan.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että preparaatti ilmakuivataan.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antagonistinen organismi kuuluu Streptomvces-. Trichoderma- tai Gliocladium -sukuun.

6· Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antagonistinen organismi kuuluu Beauveria- tai Metarhizium -sukuun.